Nutrición Nutrición microbianamicrobiana

Toda la naturaleza es, como se ha dicho, una conjugación activa y

pasiva del verbo comer

-William Ralph Inge

MetabolismoMetabolismoConjunto de reacciones catabólicas y Conjunto de reacciones catabólicas y

anabólicasanabólicas• Catabolismo:Catabolismo:

Conjunto de procesos que participan en la degradación de compuestos en productos más pequeños; las reacciones enzimáticas que toman parte de denominan reacciones catabólicas.

• Anabolismo:Anabolismo:Reacciones mediante las cuales los m.o. construyen o sintetizan sustancias químicas complejas a partir de moléculas simples; las reacciones enzimáticas que toman parte se denominan reacciones biosintéticas y requieren energía. El ATP formado en las reacciones catabólicas es empleado en el anabolismo.

NutriciónNutrición A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo, se les llama nutrientes.

Dicho de otro modo, para obtener energía y elaborar nuevos componentes celulares, los organismos tienen que disponer de materias primas o nutrientes.

Nutrientes:Nutrientes:Son sustancias que se emplean en la biosíntesis y producción de energía.Son necesarios para el crecimiento microbiano

Requerimentos de Requerimentos de nutrientes comunesnutrientes comunes

•Macroelementos.•Microelementos (llamados

también oligoelementos).

Macronutrientes o Macronutrientes o macroelementosmacroelementos

• Son captados por los m.o. en cantidades relativamente grandes.

• Más del 95% del peso seco de la célula microbiana esta constituido por C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg y Fe.

• C, O, H, N, S y P.Son componentes de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleícos. Son necesarios en cantidades de g/L de medio de cultivo.

• Carbono.Fuente de energía y/o compuestos para biosíntesis

• Nitrógeno y azufre*.Se encuentran en las células en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo; generalmente en forma reducida, aunque algunos m.o. los asimilan en forma oxidada. Sulfatos, nitratos, peptonas (N y S) y cisteina.Fijación de N2 (N2 NH3)

• K, Ca, Mg y Fe: se encuentran en la célula en forma de cationes, desempeñando varias funciones. Se utilizan en cantidades de mg.

– K+: necesario para actividad de enzimas, entre ellas algunas que participan en la síntesis de proteínas.

– Ca2+: contribuye a la termorresistencia de endosporas.

– Mg2+: actúa como cofactor de muchas enzimas, forma complejos con el ATP y estabiliza los ribosomas y las membranas celulares.

– Fe2+ y Fe3+: Forma parte de los citocromos y es cofactor de enzimas y de proteínas transportadoras de electrones.

Requerimientos de N, Requerimientos de N, P y SP y S

Se deben incorporar en grandes cantidades. Aunque pueden adquirirse a partir de los mismos nutrientes que aportan C, los m.o. suelen emplear también fuentes inorgánicas.

• N: necesario para sintetizar a.a., purinas, pirimidinas, algunos CHTOS y lípidos.

• P: presente en ácidos nucleicos, fosfolípidos, nucleótidos como ATP, varios cofactores, algunas proteínas y otros componentes celulares.

• S: necesario para la síntesis de sustancias como los a.a. cisteína y metionina, algunos CHTOS, biotina y tiamina.

Micronutrientes o Micronutrientes o microelementos microelementos u u

oligoelementosoligoelementos• Son aquellos que se requieren en cantidades tan

pequeñas, que los contaminantes presentes en agua, en los recipientes para el cultivo y en los componentes habituales del medio son a menudo suficientes.

• Normalmente son parte de enzimas y cofactores; facilitan la catálisis de reacciones y mantenimiento de la estructura de proteínas.

• Mn, Zn, Co, Mo, Ni y Cu deben estar disponibles en cantidades de g.

•Zn2+: se localiza en el centro activo de algunas enzimas.

•Mn2+: facilita a muchas enzimas la catálisis de la transferencia de los grupos fosfato.

•Mo2+: necesario para fijar nitrógeno.

•Co2+: componente de la vitamina B12.•Cu2+: tiene funciones en algunas

enzimas de óxido-reducción.

Factores de crecimientoFactores de crecimientoSon sustancias precursoras de ciertos constituyentes orgánicos de la célula que el m.o. es incapaz de sintetizar; generalmente se requieren en pequeñas concentraciones. Existen tres clases principales:

1.Aminoácidos síntesis de proteínas2.Purinas y pirimidinas síntesis de ácidos nucleicos3.Vitaminas normalmente forman la totalidad o

parte de los cofactores enzimáticos; constituyen grupos prostéticos o centros activos de ciertas enzimas.

Elemento Funciones fisiológicas Hidrógeno Constituyente de agua celular, materiales celulares orgánicos Oxígeno Constituyente de agua celular, materiales celulares orgánicos;

como O2, aceptor de electrones en la respiración de los aerobios Carbono Constituyente de materiales celulares orgánicos Nitrógeno Constituyente de proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas Azufre Constituyente de proteínas (como aminoácidos cisteína y

metionina), de algunas coenzimas (por ejemplo, CoA, cocarboxilasa).

Fósforo Constituyente de ácidos nucleicos, fosfolípidos, coenzimas Potasio Uno de los principales cationes inorgánicos de las células,

cofactor de algunas enzimas. Magnesio Importante catión celular, cofactor inorgánico en muchas

reacciones enzimáticas, incluyendo aquellas que requieren ATP; funciona uniendo las enzimas a los sustratos; constituyente de las clorofilas.

Manganeso Cofactor inorgánico de varias enzimas, a veces remplazando al Mg.

Calcio Importante catión celular, cofactor de algunas enzimas (por ejemplo proteasas)

Hierro Constituyente de citocromos y otras hemo o no hemoproteínas; cofactor de cierto número de enzimas.

Cobalto Constituyente de la vitamina B12 y de sus coenzimas derivados. Cobre, zinc, níquel, molibdeno

Constituyentes inorgánicos de enzimas especiales.

Requerimentos de C, H Requerimentos de C, H y Oy O

• Las necesidades de C, H y O suelen cubrirse simultáneamente.

• El carbono es necesario para construir el esqueleto de todas las moléculas orgánicas; las moléculas que sirven como fuente de C aportan también átomos de H y O, excepto el CO2.

Clasificación por Clasificación por requerimientos nutricionalesrequerimientos nutricionales

((Fuente de carbonoFuente de carbono))

• Autótrofos:Autótrofos:Son m.o. que pueden utilizar CO2 como principal y única fuente de carbono.

• Heterótrofos:Heterótrofos:Son organismos que utilizan moléculas orgánicas preformadas y reducidas como fuentes de carbono. La mayoría usan nutrientes orgánicos como fuente tanto de C como de energía. Este grupo incluye a todos los animales, hongos, protozoarios y la mayoría de las bacterias.

Requerimientos Requerimientos nutricionales debidas a nutricionales debidas a

mutacionesmutaciones..Las necesidades nutricionales de los m.o. varían según las especies; pueden cambiar en una misma especie debido a mutaciones.

• Protótrofo:Protótrofo:Es un m.o. que precisa de los mismos nutrientes que la mayoría de los miembros de su especie.

• Auxótrofo:Auxótrofo:Es un m.o. mutado que carece de la capacidad para sintetizar un nutriente esencial y por ello, debe obtenerlo, o a su precursor, del medio.

Requerimientos de Requerimientos de energíaenergía de los m.o. de los m.o.

• Todos los organismos requieren fuentes de energía, H y e- para poder crecer.

• Existen únicamente dos fuentes de energía disponibles para los organismos:– Energía lumínica captada durante la

fotosíntesis.– Energía derivada de la oxidación de

moléculas orgánicas e inorgánicas.

Clasificación Clasificación energéticaenergética de de m.o.m.o.

• Quimiótrofos:Quimiótrofos: Obtienen la energía a partir de la oxidación de compuestos químicos (orgánicos o inorgánicos).– Quimioautótrofos.– Quimioheterótrofos.

• Fotótrofos (o fotosintéticos):Fotótrofos (o fotosintéticos): Emplean la luz como fuente de energía.– Fotoautótrofos.– Fotoheterótrofos.

• Litótrofos:Litótrofos: (“que comen roca”) obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos como el azufre elemental (S0), el ión amonio (NH4

+), el hierro ferroso (Fe2+) o el H2.

• Organótrofos: Obtienen electrones o hidrógeno a partir de compuestos orgánicos.

Fuentes de carbono, energía e Fuentes de carbono, energía e hidrógeno/electroneshidrógeno/electrones

Fuentes de carbono

Autótrofos CO2 como única o principal fuente de carbono.

Heterótrofos Moléculas orgánicas preformadas, reducidas, a partir de otros organismos.

Fuentes de energía

Fotótrofos Luz.

Quimiótrofos Oxidación de compuestos orgánicos o inorgánicos.

Fuentes de hidrógeno o electrones

Litótrofos Moléculas inorgánicas reducidas.

Organótrofos Moléculas orgánicas.

Clasificación Fuente de carbono Fuente de energía

Autótrofos CO2 -------

Heterótrofos Compuestos orgánicos

--------

Quimiótrofos --------- Compuestos químicos

Quimiolitótrofos _______ Compuestos químicos inorgánicos

Quimiorganótrofos _______ Compuestos químicos orgánicos

Quimioautótrofos CO2 Compuestos químicos

Fotótrofos _______ Luz

Fotoautótrofos CO2 Luz

Fotoheterótrofos Compuestos orgánicos

Luz

Quimioheterótrofos Compuestos orgánicos

Compuestos químicos

Compuesto Bacteria (% base seca)

Levaduras (% base seca)

Hongos (% base seca)

Promedio Promedio Promedio Carbono 48 46-52 48 46-52 48 45-55 Nitrógeno 12.5 10-14 7.5 6-8.5 6 4-7 Proteínas 55 50-60 40 35-45 32 25-40 Carbohidratos 9 6-15 38 30-45 49 40-55 Lípidos 7 5-10 8 5-10 8 5-10 Acidos nucleicos 23 15-25 8 5-10 5 2-8 Cenizas 6 4-10 6 4-10 6 4-10

Composición típica de Composición típica de compuestos orgánicos e compuestos orgánicos e

inorgánicos de m.o. inorgánicos de m.o.

g/100 g en peso seco Elemento Bacteria Hongos Levaduras Fósforo 2-3 0.4-4.5 0.8-2.6 Azufre 0.2-1.0 0.1-0.5 0.01-0.24 Potasio 1-4.5 0.2-2.5 1-4 Magnesio 0.1-0.5 0.1-0.3 0.1-0.5 Sodio 0.5-1 0.02-0.5 0.01-0.1 Calcio 0.01-1.1 0.1-1.4 0.1-0.3 Fierro 0.02-0.2 0.1-0.2 0.01-0.5 Cobre 0.01-0.02 --------- 0.002-0.01 Manganeso 0.001-0.01 --------- 0.0005-0.007 Molibdeno -------- --------- 0.0001-0.0002 Total Cenizas 7-12 2-8 5-10

Composición típica de compuestos Composición típica de compuestos orgánicos e inorgánicos de m.o.orgánicos e inorgánicos de m.o.Constituyentes inorgánicos Constituyentes inorgánicos

SustratoSustratoss

S1

S2

Sn

CélulasCélulas

X

ProductosProductos

P1

P2

Pn

• Producto:Producto:Compuesto químico diferente de material

celular que es liberado al medio.

• Sustrato:Sustrato:Compuestos que son consumidos a partir

del medio como resultado de crecimiento celular o formación de producto.

Factores que limitan la Factores que limitan la formulación de medios de cultivoformulación de medios de cultivo:

– Algunos elementos del sustrato liberados como productos no asimilados a material celular.

– Velocidades limitantes y estequiometría, deben considerarse los rendimientos.

– Nutrientes específicos que pudieran ser limitantes, o productos específicos que pueden ser inhibitorios.

Factores que limitan la Factores que limitan la formulación de medios de formulación de medios de

cultivocultivo:

– Factores ambientales.– Factores de crecimiento.

Crecimiento microbiano: Descripción Crecimiento microbiano: Descripción químicaquímica

ACaHbOc + BO2 + DNH3 MCaHbOc Nd+

PCO2 + QH2O C

donde: A, B, D, P y Q son moles.CaHbOc fuente carbono-energía.M son moles de una unidad celular, CaHbOc Nd

Datos de composición Datos de composición celularcelular

• BacteriasC0.53 ; N0.12 ; O0.19 ; H0.07

• LevadurasC0.47 ; N0.075 ; O0.31 ; H0.065

aCHxOy + bO2 + cNH3 CHO N+ dCO2 + eH2O

C:C: a = 1 + dH:H: ax + 3c = + 2eO:O: ay + 2b = + 2d + eN:N: c =

RQ = moles de CO2 / moles de O2 = d/b

Rendimiento biomasa Rendimiento biomasa sustrato (Ysustrato (YX/SX/S))

YX/S Xs

Biomasa producida (Xf – X0)

Sustrato consumido (S0 – Sf)

=

Medios de Medios de CultivoCultivo

• Aunque todos los m.o. necesitan fuentes de energía, C, N, P, S y varios minerales, la composición precisa de un medio de cultivo adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar.

• Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar m.o. específicos, o para facilitar la identificación de una especie en particular.

• De acuerdo al estado físico, los medios de cultivo se clasifican en sólidos y líquidos.

Medio sintético o Medio sintético o definidodefinido

• Son medios en que se conocen todos los componentes.

• Los medios definidos se emplean ampliamente en investigación ya que con frecuencia se requiere conocer qué está metabolizando el m.o. en estudio.

Medio BG-11 para cianobacterias

Cantidad (g/ L)

NaNO3 1.5

K2HPO4.3H2O 0.04

MgSO4.7H2O 0.075

CaCl2.2H2O 0.036

Ácido cítrico 0.006

Citrato amónico férrico 0.006

Na2CO3 0.02

EDTA (sal de Na2Mg) 0.001

Solución de metales traza 1 mL/ L

Medios complejosMedios complejos

• Contienen algunos ingredientes cuya composición química se desconoce. Son medios suficientemente ricos para satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

• De gran utilidad cuando se desconoce los requerimientos nutricionales de un m.o. en particular.

Los medios complejos contienen Los medios complejos contienen peptonas, extracto de carne y de peptonas, extracto de carne y de levadura.levadura.

• Peptonas: hidrolizados de proteínas obtenidos de la digestión parcial de carne, caseína, harina de soya y otras proteínas. Sirven como fuente de C, N y energía.

• Extracto de carne: contiene a.a., péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, vitaminas y minerales.

• Extracto de levadura (de cerveza): fuente de vitaminas del complejo B, y de compuestos de N y C.

Agar MacConkey Cantidad (g/ L)

Peptona de gelatina 17.0

Peptona de caseína 1.5

Peptona de carne 1.5

Lactosa 10.0

Sales biliares 1.5

Cloruro sódico 5.0

Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.001

Agar 13.5

Tipos de medioTipos de medio

•Selectivos.•Diferenciales

Medios selectivosMedios selectivosContienen sustancias específicas que favorecen

el crecimiento de un tipo particular de m.o.

Las sales biliares o colorantes como la fucsina y el cristal violeta favorecen el crecimiento de Gram(-), inhibiendo el desarrollo de Gram(+).

Agar Salmonella-Shigella (SS), adicionado con sales biliares para inhibir coliformes. Se producen colonias incoloras por la incapacidad de fermentar lactosa.

Agar sulfito de bismuto (BS). Para aislar Salmonella typhi; colonias negras con tono metálico.

Agar sal manitol (MS), adicionado con 7.5% de sal. Se usa para aislar estafilococos.

Medios diferencialesMedios diferencialesContienen productos químicos para dar lugar a una

alteración visible del medio de cultivo

Diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de m.o. según las características biológicas. Ejemplo: agar sangre.

Agar Eosina azul de metileno (EMB). Contiene lactosa, sales y colorantes (eosina y azul de metileno), para diferenciar entre fermentadores y no fermentadores de lactosa. Ej. E. coli (fermentador) produce colonias oscuras o con brillo metálico.

Agar McConkey. Adicionado con sales biliares y cristal violeta. Para selección y recuperación de Enterobacteriaceae y bacterias Gram(-). Bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias rojas.

Agar entérico de Hektoen. Adicionado con elevada concentración de sales biliares como inhibidor. Para aumentar el rendimiento de Salmonella y Shigella.

Formulación de medios Formulación de medios de cultivode cultivo

• Consiste en la formulación cuantitativa del medio, tomando en cuenta todos los elementos o nutrientes requeridos.

• Los macronutrientes son los que controlan la velocidad de crecimiento.

• Los medios de cultivo deben prepararse con una formulación balanceada cualitativa y cuantitativa.

DISEÑO CUALITATIVO DEL MEDIOS DE CULTIVO :

DEFINICION QUIMICA

La definición del medio debe vincularse con los tipos microbianos:

Heterótrofos (simples) AutotótrofoGlucosa AmoniacoSulfato de amonio Sales de sulfatoFosfato monobásico de K Sales de fosfatoNaCl NaClCaCl2 Cationes (Cu, Mo…)

FORMULACION Y BALANCEO DEL MEDIO

Determinación de las concentraciones de los sustratos limitantes

La relación C/N como criterio de “balanceo”

C/N Tipo de Medio ____________________________________________

Proteína microbiana 18Orgaheterotrófico

Respiración 2-80 Litoautotrófico(desasimilativo)___________________________________________ _

Rendimiento biomasa Rendimiento biomasa sustrato (Ysustrato (YX/SX/S))

YX/S Xs

Biomasa producida (Xf – X0)

Sustrato consumido (S0 – Sf)=

Rendimiento de biomasa producida por fuente de carbono consumida

M.o. aerobio = 0.5 biomasa

M.o. anaerobio = 0.1 biomasa

Sustrato (S0)

50% Biomasa + 50% producción de metabolitos y mantenimiento celular.

10% Biomasa + 90% producción de metabolitos y mantenimiento celular.

m.o. m.o. anaerobioanaerobio

m.o. m.o. aerobioaerobio

Rendimiento = Y = 0.5

Rendimiento = Y = 0.1

Composición celularComposición celular

• Cantidad de C = 50%• Cantidad de N = 8%• Cantidad de P = 5%• Cantidad de S = 3%

El hidrógeno y el oxígeno constituyen el agua

Ejercicio 1Ejercicio 1Diseñar un medio de cultivo para un m.o. heterótrofo simple anaerobio.Fuente de C: glucosaFuente de N: cloruro de amonio, NH4Cl

Fuente de S: sulfato de magnesio, MgSO4

Fuente de P: fosfato ácido de potasio, KH2PO4

La célula bacteriana tiene 50% C, 8% N, 5% P y 3% S.

¿Qué cantidad de cada uno de los compuestos se tiene que añadir a 1 L de agua para producir 20 g/L de biomasa?

SoluciónSoluciónGlucosa20 g biomasa 0.5 g C 180 g Glucosa = 25 g/L L g biomasa 72 g C

NH4Cl20 g biomasa 0.08 g C 53.5 g NH4Cl = 6.1 g/L L g biomasa 14 g N

MgSO4

20 g biomasa 0.03 g C 120.3 g MgSO4 = 2.25 g/L

L g biomasa 32 g S

KH2PO4

20 g biomasa 0.05 g C 136 g KH2PO4 = 4.42 g/L

L g biomasa 30.9 g P

RendimientoRendimiento

Glucosa20 g biomasa 0.5 g C 180 g Glucosa =

25 g/L L g biomasa 72 g C

25 g Glucosa 10% biomasa (anaerobio)x 100% biomasa

x = 250 g Glucosa

Si el m.o. fuera aerobio, entonces se requieren 50 g Glucosa

Ejercicio 2Ejercicio 2Formular y diseñar un medio de cultivo para una bacteria mesofílica, heterótrofa simple y anaerobia estricta, basado en 100 g/L de fuente de carbono.¿Cuántos g/L de biomasa se producirán en 1 L de medio diseñado?Heterótrofa simple, anaerobia estricta.Fuente de C: glucosaFuente de N: cloruro de amonio, NH4Cl

Fuente de S: sulfato de magnesio, MgSO4

Fuente de P: fosfato de potasio, K2HPO4