INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

81
INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN EL PRONÒSTIC I FISIOPATOLOGIA DE LA INSUFICIÈNCIA HEPÀTICA AGUDA SOBRE CRÒNICA I DE LA SÍNDROME HEPATORENAL Universitat de Barcelona Facultat de Medicina i Ciències de la Salut Departament de Medicina Línia de recerca: Fetge, sistema digestiu i metabolisme. Barcelona, 2019 Directors: Dr. Pere Ginès i Gibert Cap de Servei d’Hepatologia Institut de Malalties Digestives i Metabòliques Hospital Clínic de Barcelona Catedràtic del Departament de Medicina Universitat de Barcelona Dra. Elsa Solà Vergés Especialista del servei d’Hepatologia Institut de Malalties Digestives i Metabòliques Hospital Clínic de Barcelona Autora: Cristina Solé Martí Especialista en Hepatologia Institut de Malalties Digestives i Metabòliques Hospital Clínic de Barcelona

Transcript of INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

Page 1: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN EL PRONÒSTIC I FISIOPATOLOGIA DE LA INSUFICIÈNCIA

HEPÀTICA AGUDA SOBRE CRÒNICA I DE LA SÍNDROME HEPATORENAL

Universitat de Barcelona Facultat de Medicina i Ciències de la Salut

Departament de Medicina Línia de recerca: Fetge, sistema digestiu i metabolisme.

Barcelona, 2019

Directors: Dr. Pere Ginès i Gibert Cap de Servei d’Hepatologia

Institut de Malalties Digestives i Metabòliques

Hospital Clínic de Barcelona

Catedràtic del Departament de Medicina

Universitat de Barcelona

Dra. Elsa Solà Vergés Especialista del servei d’Hepatologia

Institut de Malalties Digestives i Metabòliques

Hospital Clínic de Barcelona

Autora: Cristina Solé Martí Especialista en Hepatologia

Institut de Malalties Digestives i Metabòliques

Hospital Clínic de Barcelona

Page 2: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …
Page 3: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

Aquesta tesi no hagués estat possible sense l’ajuda, la col·laboració i la

presència de vàries persones. M’agradaria expressar la més sincera gratitud.

Pere, en primer lloc gràcies per la confiança que vas tenir en mi, perquè em vas

deixar entrar al grup i des de llavors m’has guiat pel camí de la recerca i m’has

ensenyat a ser millor metge. Admiro l’immens coneixement que tens, la facilitat

en explicar i fer fàcil conceptes complexes, i la capacitat per capgirar els

problemes o resultats i fer-ne un repte. Alhora, tens en compte el valor de la

vida personal. De doctorands n’hi ha molts, però de mentor només se’n té un i

et marca per sempre. Així que moltes gràcies.

Elsa, m’has ajudat, has col·laborat i corregit tots els meus projectes, m’has

ensenyat recerca i estadística pas a pas, m’has fet part dels teus estudis i has

valorat sempre la feina que feia. Vaig tenir l’honor de substituir-te i gaudir de la

feina que fem, però també recordo el temps que passàvem juntes a la consulta

i a la RAE abans que marxessis. Vas marxar i hem seguit en contacte ja per

feina, per Skypes o trucades més personals. Ets la meva companya de

congressos i a més, una bona amiga. Moltes gràcies per tot.

Equip Helios (Patri, Isa, Glòria, Rebeca, Marta Carol, Roser, Nicki, Elisa, Núria,

Marta Cervera, Xavi i Sonia), sense cap dubte aquesta tesi no hagués estat

possible sense vosaltres. L’esforç, el treball, la dedicació i el granet de cadascú

de vosaltres fa que les coses es puguin dur a terme i a més, que surtin bé. Feu

també, que el dia a dia sigui agradable. Patri, co-becària, vam treballar molt,

però també recordo molt bons moments, de ball, de plors i riures. Gràcies a

tots!

Als becaris italians (Laura, Alessandro i Salvatore), ha sigut fantàstic tenir-vos.

Heu treballat com un més i m’heu acompanyat en moments vitals. Grazie mille!

Als del lab; gràcies per ajudar-me, per atendre tots els dubtes i col·laborar en

els projectes. Marta, gràcies per la paciència, per fer que entengués una mica

més el món de la microbiota, de la investigació i el laboratori en general.

Page 4: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

Als de digestiu de Bellvitge. A tots els adjunts i residents, que són companys i

amics, però en especial a l’Ari i a l’Alba, gràcies perquè vam compartir tota la

residència, inclòs l’últim any de decisions, que un d’ells era el repte d’embarcar-

se a fer la tesi. Em vau animar que l’emprengués i m’hi heu acompanyat fins

avui. Gràcies a més, per l’amistat que hem anat construint i que ara és tant

sòlida.

Lixa, Buxe, Cris, Maria, i a les de la uni (Heura, Mariona, Elba, Laura, Gemma i

Ana), perquè sou les millors amigues que algú es pot imaginar. M’heu escoltat,

m’heu preguntat i m’heu deixat explicar. Gràcies per compartir els dubtes, pors,

alegries i pel costat que sempre em feu. Gràcies.

Pare, Mare, Joan i Xavi, a vosaltres perquè sempre hi sou, perquè creieu en mi

i em feu creure que sóc capaç de tot, perquè m’heu fet sempre costat, perquè

m’aconselleu i m’escolteu, i en resum, perquè m’estimeu tant. Gràcies.

Clara, nina, tu m’has donat tota l’energia i empenta per poder acabar la tesi.

Ets el més bonic que ens ha passat mai. Així que gràcies també.

Carlos, aquesta tesi va dedicada especialment a tu, que m’has acompanyat en

tot aquest projecte personal, em vas recolzar i animar a emprendre’l, m’has

escoltat, m’has donat consells, sempre m’has encoratjat a que seguís i m’has

reforçat que la decisió que havia pres era la correcte. Sé la sort que tinc, ets la

millor parella i el millor company de vida que es pot tenir. T’estimo. Gràcies.

Page 5: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …
Page 6: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

ÍNDEX

AJUDES A LA INVESTIGACIÓ.......................................................................... 8

ABREVIACIONS................................................................................................. 9

1. INTRODUCCIÓ............................................................................................. 11

1.1. Generalitats............................................................................................ 12

1.2. Estadis de la cirrosi hepàtica.................................................................. 12

1.3. Fisiopatologia de la cirrosi...................................................................... 14

1.3.1. Teoria de la vasodilatació arterial.................................................. 14

1.3.2. Teoria de la inflamació sistèmica.................................................. 15

1.4. Insuficiència hepàtica aguda sobre crònica o acute-on-chronic liver

failure...................................................................................................... 17

1.5. Insuficiència renal aguda: síndrome hepatorenal................................... 19

1.5.1. Síndrome hepatorenal................................................................... 20

1.6. Estudi de la inflamació............................................................................ 22

2. JUSTIFICACIÓ I HIPÒTESIS........................................................................ 28

3. OBJECTIUS.................................................................................................. 30

4. RESULTATS................................................................................................. 33

4.1. Estudi 1................................................................................................... 34

4.2. Estudi 2................................................................................................... 45

5. DISCUSSIÓ................................................................................................... 56

6. CONCLUSIONS............................................................................................ 65

7. BIBLIOGRAFIA............................................................................................. 67

8. ANNEXES..................................................................................................... 77

Page 7: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …
Page 8: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

8

AJUDES A LA INVESTIGACIÓ

Els projectes que formen part d’aquesta Tesi Doctoral han estat finançats per

les següents ajudes:

Ayuda Predoctoral de Formación en Investigación en Salud 2014-2018

(FI14/00227). Instituto de Salud Carlos III. Candidata: Cristina Solé. Título del

proyecto: “Respuesta inflamatoria sistémica en la cirrosis hepática:

implicaciones en el pronóstico y en la fisiopatología del acute-on-chronic liver

failure”.

Beques personals:

Ayuda del Fondo de Investigación Sanitaria PI12/00330. Instituto de Salud

Carlos III. Título del proyecto: “Insuficiencia hepática crónica agudizada y

disfunción multiorgánica: mecanismos moleculares y evaluación de nuevos

métodos diagnósticos y terapéuticos. Período: 2013-2016. Investigador

Principal: Dr. Pere Ginès’’.

Projectes de recerca:

Ayuda del Fondo de Investigación Sanitaria PI16/00043. Instituto de Salud

Carlos III. Título del proyecto: “Síndrome de insuficiencia hepática crónica

agudizada en la cirrosis: relación con el microbioma y la inflamación sistémica.

Evaluación de nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos”. Período: 2016-

actualidad. IP: Dr. Pere Ginès.

L’estudi ha estat finançat en part per una beca Europea del programa

Horizon20/20; Grant/Award Number: H2020-SC1-2016-RTD; LIVERHOPE,

Grant/Award Number: 731875.

Page 9: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

9

ABREVIACIONS

TNF-α Tumor necrosis factor-alpha IFN-γ Interferon gamma G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor GM-CSF Granulocyte-Monocyte colony-stimulating factor IL-1RA Interleukin 1 receptor antagonist IL-1β Interleukin 1 beta IL-2 Interleukin 2 IL-4 Interleukin 4 IL-5 Interleukin 5 IL-6 Interleukin 6 IL-7 Interleukin 7 IL-8 Interleukin 8; CXCL8 IL-9 Interleukin 9 IL-10 Interleukin 10 IL-12 Interleukin 12 IL-13 Interleukin 13 IL-15 Interleukin 15 IL-17 Interleukin 17 IL-21 Interleukin 21 IL-23 Interleukin 23 IL-27 Interleukin 27 IP-10 Interferon-inducible protein-10; CXCL10 MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1; CCL2 MIP-1α Macrophage inflammatory protein-1alpha; CCL3 MIP-1β Macrophage inflammatory protein-1beta; CCL4 CX3CL1 Fractalkine Eotaxin CCL11 VEGF-A Vascular endothelial growth factor ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1 VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 RANTES Regulated on activation normal T cell expressed and secreted; CCL5 FGF-2 Fibroblast growth factor PDGF-BB Platelet-derived growth factor subunit B PIGF-1 Placental growth factor 1 HNA2 Redox state of circulating albumin

Page 10: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

10

LT Limfòcit T LB Limfòcit B NK Natural Killer Mf Macròfags PMN Polimorfonuclears Cels Cèl·lules MHC Complex Major d’Histocompatibilitat Ig Immunoglobulina PRRs Pattern recognition receptors DAMPs Damage-associated molecular patterns PAMPs Pathogen-associated molecular patterns PCR Proteïna C reactiva MELD Model of end-stage liver disease AKI Acute Kidney injury PBE Peritonitis bacteriana espontània ACLF Acute-on-chronic liver failure SHR Síndrome hepatorenal SHP Síndrome hepatopulmonar DILI Dany hepàtic per tòxics/ Drug incuced liver injury

Page 11: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

11

1. INTRODUCCIÓ

Page 12: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

12

1. INTRODUCCIÓ 1.1. Generalitats La cirrosi és la fase final de les malalties cròniques del fetge i és una causa

creixent de morbiditat i mortalitat en països desenvolupats1. Es considera

l’onzena causa de mort en adults a nivell mundial, causant 1.16 milions de

morts per any al món i aproximadament 150.000 morts per any a Europa2,3.

L’etiologia de la cirrosi varia segons l’àrea geogràfica, a Europa, les principals

causes són l’alcohol, el virus de la hepatitis C i B, destacant l’increment del

fetge gras no alcohòlic (NAFLD)2,3. La cirrosi i el carcinoma hepatocel·lular són

les indicacions més freqüents de trasplantament hepàtic, realitzant-se més de

5.500 trasplantaments hepàtics per any a Europa2,3.

La cirrosi es caracteritza per la formació de septes fibrosos i nòduls de

regeneració, i resulta de diferents mecanismes de lesió hepàtica que causen

necroinflamació, fibrogènesi secundaria a l’activació de les cèl·lules hepàtiques

estrellades, angiogènesi i extinció del parènquima hepàtic. Aquests processos

condueixen a la distorsió del parènquima hepàtic produint un augment de la

resistència vascular hepàtica. A més, també es produeixen uns canvis

funcionals a la microcirculació hepàtica (disfunció endotelial, remodelació

sinusoïdal i formació de shunts intrahepàtics) provocant una disminució de

factors vasodilatadors (òxid nítric, entre altres) i un augment de substàncies

vasoconstrictores (Tromboxà A2, entre altres). L’augment de la resistència

vascular intrahepàtica doncs, es produeix per alteracions en l’arquitectura

hepàtica i per un augment en el to vascular hepàtic, i són el factor inicial en el

desenvolupament de la hipertensió portal. Secundàriament a l’augment de la

resistència vascular intrahepàtica es produeix una vasodilatació arterial de la

circulació esplàncnica que augmenta el flux portal empitjorant i perpetuant la

síndrome de la hipertensió portal4,5.

1.2. Estadis de la cirrosi hepàtica La història natural de la cirrosi comprèn clàssicament diferents fases. Durant la

primera fase el pacient no presenta símptomes i la malaltia es diagnostica de

forma incidental; aquesta fase es coneix com a cirrosi compensada. La segona

Page 13: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

13

fase, coneguda com a cirrosi descompensada, es caracteritza per una fase

clínica en la que el pacient desenvolupa complicacions, especialment ascites,

edemes, hiponatrèmia dilucional, i síndrome hepatorenal, així com hemorràgia

digestiva per varices esofàgiques, infeccions bacterianes i encefalopatia

hepàtica6. Existeix una altra classificació que té en compte unes

característiques clíniques i proporciona informació pronòstica (Figura 1).

Aquesta classificació divideix la cirrosi en quatre estadis: 1) Estadi 1: absència

de varices i d’ascites, amb una mortalitat a l’any de l’1%. 2) Estadi 2: varices

esofàgiques sense antecedents d’hemorràgia gastrointestinal per hipertensió

portal ni ascites, amb una mortalitat del 3,4% a l’any. 3) Estadi 3: presència

d’ascites amb o sense varices, amb una mortalitat del 20% a l’any. 4) Estadi 4:

hemorràgia gastrointestinal per hipertensió portal, amb o sense ascites, amb un

57% de mortalitat a l’any7.

Figura 1. Història natural de la cirrosi hepàtica: probabilitat de progressió i mortalitat a 1 any segons l’estadi clínic. Adaptada de D’Amico G et al., J

Hepatol. 2006.

Page 14: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

14

Els estadis 1 i 2 corresponen a pacients en fase de cirrosi compensada i els

estadis 3 i 4 a pacients amb cirrosi descompensada6,7. En una proporció no

menyspreable de pacients, la cirrosi pot progressar a una tercera fase en que

es produeix, d’una forma relativament brusca, una descompensació aguda de

la malaltia associada a un fracàs important de les funcions hepàtiques

acompanyat de la disfunció de varis òrgans extrahepàtics, especialment el

sistema cardiocirculatori, els ronyons, el cervell i els pulmons. Aquesta situació

clínica constitueix la síndrome anomenada insuficiència hepàtica aguda sobre

crònica o acute-on-chronic liver failure (ACLF)8.

1.3. Fisiopatologia de la cirrosi

Existeix una àmplia evidència que la vasodilatació arterial perifèrica té un paper

clau en la fisiopatologia de la cirrosi i de les seves complicacions (teoria de la

vasodilatació arterial perifèrica)9–11. En els últims anys, s’ha proposat que la

inflamació sistèmica contribueix també en la fisiopatologia de la cirrosi (teoria

de la inflamació sistèmica)12,13. A la figura 2 es representen gràficament les

dues teories i com es correlacionen l’una amb l’altre i contribueixen en el fracàs

d’òrgans.

1.3.1.

Tal com s’ha comentat anteriorment, els pacients amb cirrosi hepàtica

presenten un augment de la resistència vascular intrahepàtica que provoca un

augment de la pressió en el flux portal, generant hipertensió portal que

condiciona la formació de colaterals porto-sistèmiques i una vasodilatació

arterial de la circulació esplàncnica i sistèmica. Aquesta vasodilatació és

causada per l’alliberació de substàncies vasodilatadores, fonamentalment òxid

nítric, monòxid de carbó i cannabinoids endògens, entre altres, a la circulació

esplàncnica9,14.

Teoria de la vasodilatació arterial

En fases inicials de la malaltia, quan la hipertensió portal és moderada,

l’augment del cabdal cardíac compensa la reducció de la resistència vascular

sistèmica, mantenint la pressió arterial i el volum arterial efectiu. A mesura que

la malaltia progressa, la vasodilatació arterial de la circulació esplàncnica és

molt severa i la resistència vascular sistèmica està marcadament disminuïda.

Page 15: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

15

En aquest punt el cabdal cardíac ja no pot compensar-ho, pel que existeix una

disminució del volum arterial efectiu, amb hipotensió arterial15. Aquesta dóna

lloc a l’activació dels baroreceptors, que per tal de mantenir la pressió arterial,

activen els sistemes vasoconstrictors: sistema nerviós simpàtic (SNS), renina-

angiotensina-aldosterona (RAA) i la secreció de vasopressina (AVP). Aquests

mecanismes compensatoris permeten mantenir la pressió arterial relativament

normal, però alhora tenen efectes nocius a nivell renal perquè condueixen a la

retenció de sodi, aigua lliure i la vasoconstricció renal i són els responsables del

desenvolupament de les complicacions de la cirrosi com l’ascites, hiponatrèmia

dilucional o la síndrome hepatorenal, respectivament9,10,14.

1.3.2.

En els últims anys s’ha posat en evidència que la cirrosi ocorre en el context

d’una inflamació sistèmica12,13,16. S’ha demostrat que els pacients amb cirrosi

presenten un augment dels reactants de fase aguda com la proteïna C reactiva

(PCR)17, d’algunes citocines proinflamatòries (com IL-6, TNF-α, IL-8)18–21,

marcadors d’activació macrofàgica22, augment del síndrome de resposta

inflamatòria sistèmica (SIRS)23, entre altres. Aquests marcadors es

correlacionen amb l’estadi de la malaltia i amb el pronòstic. En els pacients

amb ACLF, s’ha observat un augment de la xifra de leucòcits i de la PCR8.

Teoria de la inflamació sistèmica

La hipòtesi actual suggereix que els mecanismes responsables d’aquesta

inflamació sistèmica són16: 1) l’alliberació de components que expressen les

bactèries, els PAMPs (pathogen-associated molecular paterns), que provenen

de la translocació de bactèries viables o dels mateixos PAMPs des de la llum

intestinal a la mucosa. Els PAMPs (p. ex. lipopolisacàrids o flagelina) poden

quedar-se a la mucosa intestinal o ser alliberats a la circulació sistèmica, i tot i

que la majoria de PAMPs són eliminats per les cèl·lules immunitàries

intestinals, en ocasions es produeixen infeccions bacterianes que induirien a

més inflamació24. El segon mecanisme és: 2) l’alliberació de DAMPs

(damage/danger-associated molecular paterns) procedents del dany

hepatocitari, com per exemple heat-shock proteins (HSP) o high-mobility group

protein B1 (HMBG1)16,25,26. Els PAMPs i DAMPs interaccionen amb els

receptors de reconeixement de patògens (PRR; pattern-recognition receptors)

expressats a les cèl·lules immunes innates i en els epitelis. La unió genera

Page 16: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

16

l’expressió de gens que codifiquen per la síntesi de molècules implicades en la

inflamació (p. ex. TNF-α, IL-6, etc) tant a la mucosa intestinal com a nivell

hepàtic, i posteriorment poden estendre’s a la circulació sistèmica, generant

una marcada resposta inflamatòria sistèmica25.

Els mediadors inflamatoris alliberats, causarien una major vasodilatació arterial,

empitjorant la disfunció circulatòria existent. A més, els mediadors inflamatoris

podrien causar dany cel·lular i tissular directe provocant una fallida dels òrgans,

similar al que ocorre a la sèpsia13,27.

Figura 2. Fisiopatologia de la cirrosi i de les seves complicacions: teoria de la vasodilatació arterial perifèrica i teoria de la inflamació sistèmica.

Page 17: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

17

Figura 2. PAMPs, pathogen-associated molecular paterns; DAMPS, Damaged-

associated molecular paterns; SNS, sistema nerviós simàtic; RAA, renina-

angiotensia-aldosterona, AVP, vasopressina; SHR, síndrome hepatorenal; EH,

encefalopatia hepàtica; SHP, síndrome hepatopulmonar.

No obstant, la inflamació sistèmica a la cirrosi, ocorre en el context paral·lel

d’una immunodeficiència. La immunodeficiència es produeix per una disminució

de la vigilància immunològica hepàtica, disminució de la síntesis de reactants

de fase aguda i de PRR, i alteració de la funció de les cèl·lules immunitàries. A

més, a mesura que la malaltia progressa, sota una persistent estimulació de les

cèl·lules immunes per PAMPs, la resposta immunitària s’exhaureix, i predomina

el fenotip immunodeficient16,27. Així doncs, la cirrosi presenta una coexistència

dinàmica d’inflamació sistèmica i d’un estat d’immunodeficiència; aquestes

anormalitats del sistema immune que estan presents a la cirrosi es coneixen

com a síndrome de disfunció immune associada a la cirrosi (CADI; cirrhosis-

associated immune disfuntion)16.

1.4. Insuficiència hepàtica aguda sobre crònica o acute-on-chronic liver failure

En els darrers anys s’ha descrit una nova síndrome, la insuficiència hepàtica

aguda sobre crònica o acute-on-chronic liver failure (ACLF), que es va

descriure i definir a partir d’un estudi multicèntric Europeu amb més de 1.000

pacients amb cirrosi descompensada (estudi CANONIC)8. L’ACLF és una

síndrome caracteritzada per una descompensació aguda de la cirrosi,

associada al fracàs d’un o més òrgans i amb una elevada mortalitat a curt

termini8. Els criteris de fracàs orgànic per definir l’ACLF es determinen

mitjançant l’índex SOFA modificat (CLIF-C OF score); (taula 1)8,28. D’acord amb el número i tipus de fracassos orgànics segons l’índex CLIF-C OF

score, es defineix la presència d’ACLF i es classifica segons la gravetat en 3

graus (taula 2).

Page 18: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

18

Taula 1. Índex CLIF-C OF score pel diagnòstic d’ACLF.

Òrgan/sistema Subscore=1 Subscore=2 Subscore=3

Fetge, bilirrubina (mg/dL) <6 ≥6 - <12 ≥12

Ronyó, creatinina (mg/dL) <2 ≥2 - <3,5 ≥3,5 o TSR

Cervell, (West-Haven) 0 1 - 2 3-4

Coagulació, (INR) <2,0 ≥2,0 - <2,5 ≥2,5

Circulació, PAM (mmHg) ≥70 <70 Vasoconstrictors

Respiratori

PaO2/FiO2 o >300 o ≤300 i >200 o ≤200 o

SpO2/FiO2 >357 >214 i ≤357 ≤214

L’àrea gris descriu el criteri diagnòstic de fracàs de cada òrgan. *TSR, teràpia de substitució renal; INR; international normalized ratio, PAM Pressió Arterial Mitjana; FiO2, fracció d’oxigen inspirat; PaO2, pressió parcial d’oxigen arterial; SpO2 saturació d’oxigen.

Taula 2. Criteris diagnòstics d’ACLF.

No ACLF Sense fracàs d’òrgan.

1 únic fracàs d’òrgan, excepte fracàs renal, amb una creatinina

sèrica <1,5mg/dL i sense encefalopatia hepàtica.

ACLF grau 1 Fracàs renal únic.

1 únic fracàs d’òrgan associat a disfunció renal (creatinina

entre 1,5 i 1,9 mg/dL) i/o encefalopatia hepàtica grau 1-2.

ACLF grau 2 2 fracassos d’òrgan.

ACLF grau 3 ≥3 fracassos d’òrgan.

La prevalença global de l’ACLF en els pacients hospitalitzats per una

descompensació aguda de la cirrosi és del 30%, i la mortalitat a 28 i a 90 dies

és de 30 i 50%, respectivament. La mortalitat es correlaciona amb el nombre de

fracassos d’òrgans, essent l’ACLF grau 3 el que presenta pitjor pronòstic en

comparació amb els graus 1 o 28.

Els factors precipitants varien segons l’àrea geogràfica, a Europa, les infeccions

bacterianes i l’alcohol són les causes més freqüents. No obstant, en un número

significatiu de pacients (20-40%) no s’aconsegueix identificar cap agent

precipitant29.

Page 19: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

19

La patogènia de l’ACLF es desconeix, però hi ha dades indirectes que

suggereixen que ocorre en el context d’una resposta inflamatòria sistèmica. A

l’estudi CANONIC es va observar que els pacients amb ACLF presentaven una

elevació marcada de la PCR i de la xifra de leucòcits, ambdós marcadors

proinflamatoris, que a més es correlacionaven amb el pronòstic8. Hi ha pocs

estudis que avaluïn la inflamació en els pacients amb ACLF, i a més, únicament

determinen un nombre limitat de citocines30,31.

Actualment no existeix cap tractament específic pels pacients amb ACLF. El

maneig consisteix en identificar precoçment la síndrome, tractar els factors

precipitants (infeccions, hepatitis aguda alcohòlica, etc), i el tractament de

suport pels diferents òrgans. El trasplantament hepàtic (TH) és el tractament

definitiu dels pacients amb ACLF, però la utilització del TH en aquests pacients

és complexa ja que en moltes ocasions presenten contraindicacions32,33.

Així doncs, calen estudis per tal d'analitzar la resposta inflamatòria sistèmica

amb diferents tipus de marcadors inflamatoris, així com analitzar les vies

inflamatòries implicades en l’ACLF per tal d’aprofundir en la fisiopatologia i en

les possibles dianes terapèutiques d’aquesta síndrome.

1.5. Insuficiència renal aguda: síndrome hepatorenal La insuficiència renal aguda (AKI, acute kidney injury) és una complicació

freqüent dels pacients amb cirrosi, amb una freqüència del 20-50%

aproximadament dels pacients que ingressen a l’hospital per una complicació

de la malaltia34,35. En els últims anys, el Club Internacional d’Ascites (ICA) ha

canviat la definició de la insuficiència renal a la cirrosi; actualment es basa en

un increment de la creatinina sèrica (sCr) de ≥0,3mg/dL (≥26.5μmol/L) en un

període de 48 hores o un augment de ≥50% de la sCr respecte el valor de la

sCr basal que presumiblement ha ocorregut en els 7 dies previs36. Anteriorment

es definia la insuficiència renal aguda com un augment de la sCr ≥50% des del

basal amb un valor final de >1.5mg/dL37. L’AKI es classifica en diferents estadis

segons la intensitat del canvi de la sCr (taula 3)35,36.

Page 20: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

20

Taula 3. Definició i estadis d’AKI segons la classificació ICA-AKI

Definició d’AKI

Augment de la sCr ≥0,3mg/dL (≥26.5μmol/L) en 48h; o augment de la sCr

≥50% a partir del valor basal que presumiblement ha ocorregut en els 7 dies

previs.

Estadis d’AKI

AKI I Augment de la sCr ≥0,3 mg/dL (≥26.5 μmol/L) o augment de la sCr

≥1.5 a 2 vegades respecte el valor basal.

Estadi 1A: sCr al diagnòstic < 1,5mg/dl.

Estadi 1B: sCr al diagnòstic ≥1,5mg/dl.

AKI II Augment de la sCr entre 2 a 3 vegades respecte el valor basal.

AKI III Augment de la sCr més de 3 vegades respecte el valor basal, ò sCr

>4mg/dL (352.6 μmol/L) ò inici de teràpia de substitució renal.

Els pacients amb cirrosi poden presentar insuficiència renal per diferents

causes, però la més característica i única de la cirrosi és la síndrome

hepatorenal10,38.

1.5.1.

Síndrome hepatorenal

La síndrome hepatorenal (SHR) és una forma única d’insuficiència renal que

ocorre en les fases més evolucionades de la cirrosi10,11. Clàssicament la

síndrome hepatorenal es definia en dos subtipus. La SHR tipus 1, que es

caracteritzava per una insuficiència renal ràpidament progressiva amb un

augment del valor de la sCr superior al doble del basal amb una sCr final de

≥2,5mg/dL en un període inferior a dues setmanes; i la SHR tipus 2, que es

caracteritzava per una insuficiència renal moderada, en que la sCr es mantenia

relativament estable durant mesos, amb valors de sCr >1.5mg/dL39. La definició

de la síndrome hepatorenal ha canviat darrerament en el context de la

incorporació dels criteris d’AKI. Els nous criteris de SHR-AKI es presenten a la

taula 436. L’únic canvi entre la nova classificació de SHR-AKI i la definició

Page 21: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

21

clàssica de SHR és que s’ha eliminat el punt de tall fix del valor de creatinina

per poder diagnosticar i iniciar el tractament vasoconstrictor de forma més

precoç, i no esperar fins a valors de sCr de >2.5mg/dL per començar el

tractament, amb el que podria determinar una major probabilitat de resposta al

tractament40. Per tant, els pacients amb SHR tipus 1 s’inclouen en la nova

definició de SHR-AKI, però també els pacients que compleixen els criteris d’AKI

i la resta de criteris de SHR, però amb un valor de sCr <2.5mg/dL (non-type 1

SHR). Les característiques clíniques i evolució d’aquest subgrup de pacients

caldrà ser avaluat en futurs estudis.

D’altra banda, el terme SHR tipus 2 ha desaparegut i es considera una forma

d’insuficiència renal crònica (SHR-CKD).

Taula 4. Criteris diagnòstic de la síndrome hepatorenal segons els criteris ICA-AKI.

Criteris diagnòstic de la SHR-AKI

Cirrosi i ascites

Diagnòstic d’AKI segons els criteris de ICA-AKI: augment de la sCr ≥0,3mg/dL

en 48hores

Absència de xoc

Absència de resposta després de 2 dies consecutius de la retirada de diürètics

i expansió amb albúmina (1gr/kg de pes)

Absència d’ús recent de fàrmacs nefrotòxics (antiinflamatoris no esteroïdals,

contrast iodat, aminoglicòsids etc.)

Absència de signes de dany renal estructural, definit com:

- Absència de proteïnúria (>500mg/dia)

- Absència de microhematúria (>50 eritròcits per camp)

- Ecografia renal sense alteracions estructurals

La síndrome es produeix com a conseqüència de la disfunció circulatòria de la

cirrosi que causa una intensa vasoconstricció renal secundària a la

vasodilatació arterial esplàncnica produïda per la hipertensió portal, conduint a

una disminució del filtrat glomerular (figura 2)9,10,41. El tractament d’elecció de la

SHR són els fàrmacs vasoconstrictors, particularment la terlipressina,

Page 22: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

22

juntament amb l’albúmina42,43. El tractament té una taxa de resposta del 50%

aproximadament i s’associa a un augment de la supervivència44,45. El fet que el

tractament amb vasoconstrictors millori la funció renal en una proporció

significativa de pacients, confirma el paper de la vasodilatació arterial en la

patogènesis de la síndrome. En tot cas, el tractament definitiu dels pacient amb

SHR és el trasplantament hepàtic, doncs representa la cura de la malaltia

subjacent11.

No obstant, una proporció no menyspreable de pacients no responen al

tractament amb vasoconstrictors, pel que és possible que a part de la disfunció

circulatòria, altres mecanismes estiguin implicats en la fisiopatologia de la

malaltia. Tal com s’ha comentat anteriorment, en els últims anys, s’ha posat de

manifest que la cirrosi s’associa a una inflamació sistèmica i que augmenta

amb la progressió de la malaltia13. La relació entre la SHR i la inflamació s’ha

proposat perquè la presència de SIRS és més freqüent en pacients amb SHR

que en altres causes d’AKI46. També s’ha demostrat que els pacients amb SHR

i peritonitis bacteriana espontània (PBE) presenten valors més alts de IL-6 i

TNF-α que els pacients amb la infecció però sense SHR47. No obstant són

dades limitades i indirectes en condicions específiques de la SHR. Així, no hi

ha estudis que avaluïn la presència, extensió i pronòstic de la inflamació de

forma global i acurada en els pacients amb SHR amb i sense infecció. Donat

que la SHR ocorre en fases evolucionades de la malaltia i comporta una

elevada mortalitat, seria de gran interès obtenir una fotografia completa de la

inflamació per ampliar el coneixement de la patogènesi de les complicacions de

la cirrosi i identificar possibles dianes terapèutiques per prevenir la progressió

de la malaltia.

1.6. Estudi de la inflamació Breument, la resposta inflamatòria aguda causada per una infecció o per dany

tissular implica l’alliberació coordinada de components sanguinis (plasma i

leucòcits) cap al lloc de la infecció o del dany. Aquesta resposta inflamatòria és

desencadenada per la unió de PAMPs i DAMPs amb els receptors PRR que es

troben a les cèl·lules del sistema immune innat. Aquest reconeixement inicial

condueix a la producció de mediadors inflamatoris com quimiocines i citocines,

Page 23: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

23

entre altres productes, i l’efecte immediat d’aquests mediadors és generar un

exsudat inflamatori per tal d’eliminar els patògens i el dany48. Per tant,

citocines, quimiocines, factors de creixement endotelial (VEGF) i molècules

d’adhesió endotelial (VCAM-1 i ICAM-1) són claus en el procés de la inflamació

i els hem utilitzat per estudiar la inflamació sistèmica en els dos estudis

d’aquesta Tesi Doctoral. A la taula 5 es presenten de forma resumida tots els

marcadors inflamatoris que s’han determinat, les cèl·lules productores, les

cèl·lules diana i les funcions que realitzen; així com un resum de la informació

més rellevant d’aquests marcadors en els pacients amb cirrosi.

Taula 5. Llistat de marcadors inflamatoris analitzats en els estudis que comprenen aquesta Tesi Doctoral, amb les principals cèl·lules productores, cèl·lules diana i les funcions corresponents; i la informació més rellevant d’aquests marcadors inflamatoris a la cirrosi.

Marcador inflamatori

Pro / Anti-inflamatori

Cèl·lules productores

Dianes cel·lulars i funcions principals

Marcador inflamatori a la cirrosi

TNF-α49,50 Pro Mf, limfòcits, NK

-Cèl·lules (cels) endotelials: activació; promou la inflamació i la coagulació.

-Polimorfonuclears (PMN): activació. -Macròfags (Mf), vàries cels: estimula la síntesi de

citocines (IL-1, IL-6) i quimiocines. -Hipotàlem: febre. -Hepatòcits: síntesi de proteïnes de fase aguda. -Múscul i greix: catabolisme, caquèxia.

-Major concentració de TNF-α a major gravetat de la cirrosi18,20,30,31.

-Pacients amb PBE i SHR presenten més nivells de TNF-α que pacients amb PBE sense SHR47.

INF-γ51 Pro Limfòcits, NK

-Mf: activació clàssica, augment de funcions microbicides.

-Limfòcits B (LB): canvi d’isotip a subclasses de IgG opsonitzadores i fixadores de complement.

-Limfòcit T (LT): diferenciació a TH1. -Altres cels: més expressió de MHC I i II. Major

processament d’antigen i presentació a LT. -Pro-apoptòtic.

-L’INF-γ augmenta la inflamació, dany hepàtic i la fibrosi52.

Page 24: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

24

Factors d’estimulació de colònies

G-CSF

Pro

Mf, cels endotelials, fibroblasts

-Cels precursores del moll de l’os: maduració de granulòcits.

-El tractament amb G-CSF millora la supervivència dels pacients amb ACLF53.

GM-CSF54

Pro

Mf, cels endotelials, LT,

fibroblasts

-Cels precursores del moll de l’os: maduració de granulòcits i monòcits.

-Activació, proliferació de Mf, monòcits i PMN.

-GM-CSF pot tenir un paper en la prevenció

d’infeccions de pacients amb cirrosi55.

Interleuquines49,56

IL-1RA Anti Mf -LT, cels endotelials i epitelials: antagonista

competitiu de la IL-1.

IL-1β

Pro

Mf, cels endotelials, hepatòcits, fibroblasts.

-Cels endotelials: activació; promou la inflamació i la coagulació.

-Hipotàlem: febre. -Fetge: síntesi de proteïnes de fase aguda. -LT, cels endotelials: Inducció de citocines/

proteïnes proinflamatòries. -Diferenciació de TH17.

-Pacients amb cirrosi presenten nivells elevats de

IL-1β57.

IL-2 Pro LT, NK

-LT i LB: proliferació i diferenciació en cels efectores i de memòria. Promou el desenvolupament, supervivència i funció de LT reguladors.

-NK: proliferació i activació.

IL-4 Pro

LTH2, mastòcits, eosinòfils, basòfils

-LB: Canvi d’isotip a IgE. -LT: diferenciació i proliferació a TH2. -Mf: activació alternativa. -Adhesió i inflamació tissular.

IL-5 Pro LTH2

-Eosinòfils: activació i augment de l’activitat d’adhesió.

-LB: major generació de LB. Producció de IgA.

IL-6 Pro

Mf, cels endotelials, LT,

fibroblasts.

-Fetge: síntesi de proteïnes de fase aguda. -Leucòcits: activació i mobilització. -LT: diferenciació i activació. -LB: diferenciació i producció de IgG, A, M. -Hematopoesi.

-IL-6 està elevada en pacients amb cirrosi57. Valor elevats d’IL-6 s’associen a major mortalitat58, i amb la gravetat de la cirrosi31.

-Pacients amb PBE i SHR presenten més nivells de IL-6 que pacients amb PBE sense SHR47.

Page 25: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

25

IL-7 Pro Cels epitelials,

cels de medul·la òssia

-Progenitors immadurs: proliferació de primers progenitors de LT i LB.

-LT: supervivència de limfòcits verges i de memòria. -Síntesi i inducció de mediadors inflamatoris de

monòcits.

IL-8 o

CXCL8

Pro

Mf, monòcits, PMN, cels, endotelials i

epitelials

Quimiocina: -Quimioatracció de: PMN, NK, LT. -Mobilització de cels mare hematopoètiques. -Angiogènesi.

-Pacients amb cirrosi avançada presenten valors

més elevats de IL-830,31.

IL-9 Pro LTH2, mastòcits

-Mastòcits, LT CD8+, LB i cels tissulars: supervivència i activació.

-Producció de IgE.

IL-10 Anti Mf, monòcits, LT, LB

-Immunosupressió. -Mf, cels dendrítiques: inhibició de IL-12, de

coestimuladors i de MHC tipus 2.

-Pacients amb ACLF presenten valors més elevats

de IL-10 que pacient amb cirrosi sense ACLF30,31.

IL-12 (P70) Pro Mf, cel

dendrítica, PMN

-LT CD4+: diferenciació a TH1. -NK i LT CD8+: síntesi de INF-γ i augment de

l’activitat citotòxica.

IL-13 Pro LTH2,

-LB: Canvi d’isotip a IgE. -Cels epitelials: major producció de moc -Fibroblasts: síntesi de col·lagen. -Mf: activació alternativa. -Eosinòfils i mastòcits (protecció d’infeccions

parasitàries).

IL-15 Pro Mf

-NK: proliferació. -LT: supervivència i proliferació de CD8+ de

memòria.

IL-17A Pro LT; LTH17

-Cels endotelials/epitelials i Mf: major producció de quimiocines, citocines, GM-CSF i G-CSF.

-Reclutament de PMN.

IL-21 Pro LT; LTH17

-LB: activació, proliferació, diferenciació. -LTH17: més generació. -LT CD8+: activitat citotòxica.

IL-23

Pro Mf

-LTH17: augment de l’estabilitat i activitat inflamatòria de LT productors de IL-17.

IL-27 Pro Mf

-LT: inhibició dels TH1. -NK: síntesi de INF-γ.

Page 26: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

26

Quimiocines59–61

IP-10 o CXCL10 Pro

Monòcits, cels endotelials i

fibroblast

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Migració de Mf/monòcits, LT, NK. -Promou l’adhesió endotelial dels LT.

-En el fetge: profibrogènic59.

MPC-1 o

CCL2

Pro

Mf, cels

endotelials, fibroblast

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Migració i infiltració de monòcits i macròfags.

-En el fetge: proinflamatori i profibròtic59.

-Pacient amb cirrosi amb valors elevats de MCP-1 urinari presenten més probabilitat de mortalitat o reingrés hospitalari62.

MIP-1α o CCL3 Pro Mf, limfòcits

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Regula la migració transendotelial de monòcits,

cels dendrítiques i NK en el lloc de la inflamació. -Quimiotaxi de LT. -Atracció de PMN activats per INF-γ.

MIP-1β o CCL4 Pro Mf, limfòcits

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Regula la migració transendotelial de monòcits,

cels dendrítiques i NK en el lloc de la inflamació. -Quimiotaxi de LT.

Fractalkine o CXC3L1 Pro

Cels endotelials hepatòcits, cels

sinusoïdals

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -(Soluble) Atracció i migració de monòcits, NK, LT. -NK, LT CD8+, Mf: efecte citotòxic.

-Cels endotelials: molècula d’adhesió. -En el fetge: antiinflamatori i antifibròtic59,63.

Eotaxin

Pro

Cels epitelial endotelials, LT, Mf, eosinòfils

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Eosinòfils: atracció i activació.

RANTES o CCL5

Pro

LT, Mf,

plaquetes, cels epitelials

Quimiocina (citocines quimiotàctiques). -Reclutament de leucòcits al lloc de la inflamació

(LT, monòcits, NK, basòfils). -En el fetge: proinflamatori i profibròtic59.

-Pacients amb dany hepàtic per tòxics (DILI) i nivells

baixos de RANTES presenten un pitjor pronòstic64.

Vasculars

VEGF-A65

Pro

Cels endotelial, Mf, LT

-Angiogènesi i augment de la permeabilitat vascular. -Cels endotelials: proliferació i migració. -Promou la quimiotaxi dels monòcits.

-Pacients amb hepatitis fulminant els nivells de VEGF i PDGF es correlacionen amb la mortalitat66.

VCAM-167

Pro

Cels endotelials

-Leucòcits: rotar, unir i arrossegar-los; necessari per la transmigració endotelial fins el lloc de la inflamació.

VCAM està augmentat en pacients amb cirrosi. Es correlaciona amb la gravetat de la malaltia68,69.

Page 27: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

27

ICAM-167

Pro

Cels endotelials

-Leucòcits: rotar, unir i arrossegar-los; necessari per la transmigració endotelial fins el lloc de la inflamació.

ICAM està augmentat en pacients amb cirrosi. Es

correlaciona amb el pronòstic68.

Altres

FGF-270 Pro Cels

endotelials, Mf, LT, entre altres

-Factor de creixement. -Reparació i regeneració de teixits. -Varies cels: proliferació, supervivència, migració i diferenciació.

PDGF-BB

Pro

Plaquetes

-Estimulació de la replicació cel·lular (mitogènesi) -Cicatrització de ferides.

-Reclutament de cels inflamatòries. -Angiogènesi.

-Pacients amb DILI i nivells baixos de PDGF i RANTES presenten un pitjor pronòstic64.

-Pacients amb hepatitis fulminant els nivells de VEGF i PDGF es correlacionen amb la mortalitat66.

PIGF-171 Pro Cels endotelials

-Cels endotelials: creixement, supervivència i migració.

-Mf: quimioatracció. -Quimioatracció de progenitors hematopoètics. -Angiogènesi i cicatrització de ferides.

-En el fetge: proinflamatori i profibròtic.

Existeixen vàries formes de mesurar la inflamació mitjançant diferents mètodes

d’Elisa: sistemes simples que permeten quantificar una molècula individual, i

els sistemes múltiplex, que ens permeten mesurar simultàniament múltiples

marcadors inflamatoris solubles en una sola determinació i amb molt poca

quantitat de sang (25µl)72.

Page 28: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

28

2. JUSTIFICACIÓ I HIPÒTESIS

Page 29: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

29

2. JUSTIFICACIÓ I HIPÒTESIS

La cirrosi descompensada és un estadi avançat de la malaltia i es caracteritza

per la presència de complicacions. L’acute-on-chronic liver failure (ACLF) i la

síndrome hepatorenal (SHR) són entitats freqüents i característiques de la

cirrosi, i presenten una elevada mortalitat. Pel que fa als mecanismes

fisiopatològics de la progressió de la cirrosi i de les complicacions que se’n

deriven, se sap que la teoria de la vasodilatació arterial té un paper rellevant,

però hi ha dades creixents sobre la implicació de la inflamació sistèmica en la

progressió de la cirrosi. No obstant, la informació existent sobre la inflamació

sistèmica en la SHR i en l’ACLF és limitada, i/o amb dades indirectes referents

a la inflamació i/o amb determinats subgrups de pacients.

En aquest context seria interessant caracteritzar la resposta inflamatòria

sistèmica dels pacients amb fases evolucionades de la malaltia, en particular,

en pacients amb SHR i amb ACLF, per tal d’ampliar el coneixement de la

fisiopatologia de la cirrosi i de les seves complicacions, fet que ens permetria

plantejar noves opcions terapèutiques per tal de millorar el pronòstic d’aquest

pacients.

- A mesura que progressa la malaltia, augmenta progressivament la

inflamació sistèmica. Els pacients amb ACLF presenten una resposta

inflamatòria sistèmica que és més intensa que en els pacients amb

cirrosi però sense ACLF.

Hipòtesis:

- En els pacients amb ACLF, la inflamació sistèmica es correlaciona amb

la supervivència.

- Els pacients amb SHR presenten una resposta inflamatòria sistèmica

més intensa en comparació a altres causes d’insuficiència renal.

- En els pacients amb SHR, la inflamació sistèmica es correlaciona amb la

resposta al tractament i amb la resolució de la insuficiència renal.

- En els pacients amb insuficiència renal i particularment en els pacients

amb SHR, la inflamació sistèmica té un valor pronòstic.

Page 30: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

30

3. OBJECTIUS

Page 31: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

31

3. OBJECTIUS

L’objectiu general d’aquesta Tesi Doctoral és ampliar el coneixement sobre la

inflamació sistèmica en fases evolucionades de la cirrosi, particularment en

l’acute-on-chronic liver failure (ACLF) i en la síndrome hepatorenal (SHR),

mitjançant la determinació de panells de múltiples marcadors inflamatoris

plasmàtics, incloent citocines, quimiocines, factors de creixement i molècules

d’adhesió. I a més, investigar si la inflamació existent està relacionada amb el

pronòstic d’aquests pacients. Per desenvolupar aquests objectius s’han

dissenyat dos estudis diferents:

Estudi 1: Characterization of inflammatory response in acute-on-chronic liver failure and relationship with prognosis.

Avaluar l’existència i les característiques de la inflamació sistèmica en diferents

fases de la cirrosi hepàtica, específicament en l’ACLF, i determinar la seva

correlació amb el pronòstic.

Objectiu principal:

- Investigar la relació entre la inflamació sistèmica i la mortalitat dels

pacients amb ACLF.

Objectius secundaris:

- Investigar les vies implicades en la inflamació en els pacients amb

ACLF.

Estudi 2: Characterization of inflammatory response in hepatorenal syndrome. Relationship with kidney outcome and survival.

Analitzar la resposta inflamatòria sistèmica en els pacients amb síndrome

hepatorenal i investigar la seva correlació amb el pronòstic.

Objectiu principal:

Page 32: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

32

- Determinar i comparar la inflamació sistèmica en pacients amb cirrosi

descompensada i diferents tipus d’insuficiència renal.

Objectius secundaris:

- Determinar si la inflamació sistèmica està implicada en la resposta al

tractament amb terlipressina i albúmina.

- Investigar la relació entre la inflamació sistèmica i la resolució de l’AKI.

- Investigar la relació entre la inflamació sistèmica i la mortalitat en els

pacients amb cirrosi descompensada i particularment en els pacients

amb SHR.

- Investigar la relació entre la inflamació sistèmica observada en la SHR i

la presència d’ACLF.

- Comparar la inflamació sistèmica en els pacients amb insuficiència renal

i cirrosi amb la d’altres malalties inflamatòries sistèmiques.

Page 33: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

33

4. RESULTATS

Page 34: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

34

4. RESULTATS

ESTUDI 1

CHARACTERIZATION OF INFLAMMATORY RESPONSE IN ACUTE-ON-CHRONIC LIVER FAILURE AND RELATIONSHIP WITH PROGNOSIS

Cristina Solé, Elsa Solà, Manuel Morales-Ruiz, Guerau Fernàndez, Patricia

Huelin, Isabel Graupera, Rebeca Moreira, Gloria de Prada,

Xavier Ariza, Elisa Pose, Núria Fabrellas, Susana G. Kalko, Wladimiro Jiménez

and Pere Ginès

Sci Rep. 2016 Aug 31;6:32341

Page 35: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

1Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

www.nature.com/scientificreports

Characterization of Inflammatory Response in Acute-on-Chronic Liver Failure and Relationship with PrognosisCristina Solé1,2,3, Elsa Solà1,2,3, Manuel Morales-Ruiz2,3,4, Guerau Fernàndez5, Patricia Huelin1,2,3, Isabel Graupera1,2,3, Rebeca Moreira1,2,3, Gloria de Prada1,2,3, Xavier Ariza1,2,3, Elisa Pose1,2,3, Núria Fabrellas2,6, Susana G. Kalko5, Wladimiro Jiménez2,3,4 & Pere Ginès1,2,3

ACLF is characterized by a systemic inflammatory response, but the cytokines involved in this process have not been well studied. The aim of this study was to characterize the systemic inflammatory response in patients with cirrhosis and ACLF and its relationship with prognosis. Fifty-five patients with cirrhosis, 26 with ACLF, were studied prospectively. Systemic inflammatory response was analyzed by measuring a large array of plasma cytokines by using a multiplex kit. A principal component analysis show noticeable differences between ACLF and decompensated cirrhosis without ACLF. Patients with ACLF had significant abnormal levels of 12 cytokines compared to those without ACLF, including: VCAM-1, VEGF-A, Fractalkine, MIP-1α, Eotaxin, IP-10, RANTES, GM-CSF, IL-1β, IL-2, ICAM-1, and MCP-1. Cytokines showing the most marked relationship with ACLF were VCAM-1 and VEGF-A (AUCROC 0.77; p = 0.001). There was a significant relationship between some of inflammatory mediators and 3-month mortality, particularly VCAM-1, ICAM-1, and GM-CSF (AUCROC>0.7; p < 0.05). Functional Enrichment Analysis showed that inflammatory markers differentially expressed in ACLF patients were enriched in leukocyte migration, particularly monocytes and macrophages, and chemotaxis pathways. In conclusion, ACLF is characterized by a marked inflammatory reaction with activation of mediators of adhesion and migration of leukocytes. The intensity of the inflammatory reaction correlates with prognosis.

Liver cirrhosis is a chronic disease characterized by relentless deposition of collagen and disruption of the normal liver architecture that causes progressive portal hypertension and liver failure that eventually leads to complica-tions and death unless liver transplantation is performed1. There is increasing evidence supporting the existence of a systemic inflammatory reaction in cirrhosis that contributes to complications and disease progression2,3. This systemic inflammatory reaction is likely initiated by translocation of bacteria or bacterial products from the intes-tinal lumen to the mesenteric lymph nodes and then reaching the systemic circulation. This leads to increased levels of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) that stimulate pattern recognition receptors (PRRs), expressed on innate immune cells. Moreover, the generation of damage-associated molecular patterns (DAMPs) from the diseased liver may also stimulate immune cells. Once stimulated, PRRs induce a transcriptional response leading to synthesis of a number of pro and anti-inflammatory cytokines, chemokines, cell adhesion molecules responsible for an adaptive immune response4,5. It has been shown that treatments that reduce bacterial trans-location reduce the intensity of the immune response, while a number of complications, particularly bacterial infections are associated with an increased intensity of the immune reaction6,7. It is currently believed that such

1Liver Unit, Hospital Clínic de Barcelona, University of Barcelona, Barcelona, Spain. 2Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, Spain. 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBEReHD), Barcelona, Spain. 4Biochemistry and Molecular Genetics Department, Hospital Clínic de Barcelona, Barcelona, Spain. 5Bioinformatics Core Facility, IDIBAPS-CEK, Hospital Clínic, University de Barcelona, Spain. 6Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, University of Barcelona, Barcelona, Spain. Correspondence and requests for materials should be addressed to E.S. (email: [email protected])

Received: 01 June 2016

Accepted: 02 August 2016

Published: 31 August 2016

OPEN

Page 36: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

2Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

“chronic” inflammatory response may lead to a paralysis of the immune system, which in turn may be pathogen-ically related to the high frequency of severe infections that occur in patients with cirrhosis8,9.

There is growing interest among clinicians and researchers about acute-on-chronic liver failure (ACLF), a syndrome that occurs in patients with chronic liver diseases, particularly cirrhosis, which is characterized by development of failure of different organs and systems and high mortality rate10,11. The hypothesis has been raised that ACLF is associated with a remarkable inflammatory state that contributes to the pathogenesis and progres-sion of this syndrome10,12. This hypothesis is based on the findings of increased leukocyte count and C-reactive protein (CRP) levels in patients with ACLF compared to those of patients with cirrhosis without ACLF and their correlation with prognosis13. Yet bacterial infections are very common as precipitating events of ACLF, it has been suggested that the inflammatory reaction in ACLF may occur in the absence of bacterial infections, at least undetectable by current standard diagnostic methods10,13. Nonetheless, despite these suggestive findings, there is very little information on the type of inflammatory mediators that are increased in ACLF and its relationship with outcomes. Moreover, the few studies published have investigated only either single or limited number of cytokines9,14; therefore neither a complete picture about the characteristics of the inflammatory reaction nor the types of pathways involved are known. Therefore, the current study was aimed at addressing the issue of the inflammatory response and its relationship with ACLF and survival in patients with cirrhosis. A large number of cytokines was measured in patients with and without ACLF using a multiplex approach. Moreover, the results were analyzed with a principal component analysis and functional enrichment analysis to gain further insight on activated inflammatory pathways. Our findings demonstrate that the syndrome of ACLF is characterized by marked inflammatory reaction with activation of mediators of adhesion and migration of leukocytes, particularly monocytes and macrophages. Moreover, the levels of some of these cytokines are associated with prognosis, a finding that links the inflammatory reaction with outcome in ACLF.

ResultsBaseline characteristics of patients. The current study includes 55 patients with decompensated cirrho-sis, 26 with ACLF and 29 without ACLF, admitted to the Liver Unit of the Hospital Clínic in Barcelona for the management of complications of the disease. Demographic, clinical, and analytical data were collected prospec-tively at admission and during hospitalization. Blood samples for the measurement of cytokines were collected at the time of inclusion in the study. The characteristics of patients at time of inclusion in the study are shown in Table 1. As expected, patients with ACLF had greater frequency of ascites, hepatic encephalopathy, and shock compared to that of patients with acute decompensation of cirrhosis without ACLF. Moreover, liver function tests, Child-Pugh score and model of end-stage liver disease (MELD) score, serum creatinine, serum sodium, and mean arterial pressure were more markedly impaired in patients with ACLF than in those without ACLF. Of interest, neither the frequency of bacterial infections nor that of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) was significantly different among groups. Leukocyte count and CRP levels were higher in patients with ACLF but the difference did not reach statistical significance.

Cytokine levels and relationship with ACLF. An initial exploration of the concentrations of cytokines was performed using principal component analysis (PCA) including all cytokines with and without standard laboratory variables in all cirrhotic patients as well as in healthy subjects. Figure 1A shows a three dimensional scatter plot corresponding to the first three principal components including only cytokines. A relatively good distinction between healthy subjects, patients with acute decompensation of cirrhosis without ACLF, and patients with ACLF was observed. The group of healthy subjects was clearly separated from the other two groups. The group of patients with ACLF was scattered at the opposing end of healthy subjects, whereas patients with acute decompensation of cirrhosis without ACLF had a more heterogeneous distribution and some of them overlapped with patients with ACLF. A slightly better distinction between the 3 groups was observed when laboratory varia-bles were added to cytokines in the principal component analysis (Fig. 1B).

Table 2 shows the levels of different cytokines in patients with and without ACLF with their respective AUCROC curves. Patients with ACLF had significantly increased levels of vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), fractalkine, macrophage inflammatory protein 1-aplha (MIP-1α ), eotaxin, and interferon-inducible protein-10 (IP-10) compared to those of patients without ACLF. Levels of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were also higher in patients with ACLF but did not reach statistical significance. By contrast, levels of RANTES (Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted), Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin-1 beta (IL-1β ), and interleukin 2 (IL-2) were significantly lower in patients with ACLF compared to those of patients without ACLF. There were no significant differences in the levels of the remaining cytokines.

Figure 2 shows the individual values of cytokines showing statistical significance (including the two cytokines with p values between 0.05 and 0.10) in patients with and without ACLF. A group of healthy subjects was also included for comparison. Two main messages can be derived from a close observation of this figure. First, there was overlap in the levels of most cytokines between patients with and without ACLF. Second, despite this overlap there was a clearly progressive increase (or decrease) of median cytokine levels from healthy subjects to patients without ACLF and patients with ACLF, suggesting that disease progression from decompensated cirrhosis with-out ACLF to ACLF is associated with significant changes in cytokine pattern. Pathway enrichment analysis using cytokines that were statistically different among groups showed that the most significant functional terms were related to migration and chemotaxis of leukocytes. Interestingly, most of the pathways were related to monocytes and macrophages (Table 3).

To assess whether the abnormal cytokine pattern found in patients with ACLF could be related to presence of bacterial infections, we next compared cytokine levels in patients with ACLF with those of the subset of patients

Page 37: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

3Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

without ACLF but with bacterial infections. The cytokines that showed statistically significant difference between the two groups of patients were the same cytokines which were significantly altered in ACLF vs no ACLF, with the only exception of VEGF-A, which showed a trend towards statistical significance (p = 0.079) (Table 4). These findings suggest that the abnormal cytokine pattern of ACLF does not appear to be related, at least for the most part, to the presence of bacterial infections.

Cytokine levels and relationship with survival. At the end of the 3-month follow-up period, 15 patients (27%) had died, 3 (5%) had been transplanted, and the remaining 37 patients (67%) were still alive. Twelve of the 26 patients from the ACLF group died compared to only 3 of the 29 patients without ACLF (46% vs 10%, p < 0.001). The probability of survival of patients according to the presence or absence of ACLF is shown in Supplementary Figure 1. ACLF was the cause of death in all patients from the ACLF group, whereas the 3 patients from the no ACLF group died due to septic shock (two patients) and ACLF. The 3 patients transplanted belonged to the ACLF group.

Several cytokines showed an association with 3-month mortality. The cytokines with strongest association with mortality (AUCROC > 0.7) were VCAM-1, ICAM-1, and GM-CSF (Table 5 and Fig. 3). Increased levels of VCAM-1 and ICAM-1 were associated with increased mortality rate. By contrast, reduced levels of GM-CSF were associated with high mortality. In multivariate analysis including these 3 cytokines, only VCAM-1 was associated with independent prognostic value (Supplementary Table 1). The independent prognostic value of VCAM-1 was maintained even when individual variables known to have a powerful prognostic value, such as leukocyte count or bilirubin levels, were included in the multivariate analysis.

DiscussionThe findings of the current study indicate that ACLF syndrome is associated with an abnormal plasma cytokine profile, characterized by alterations of cytokines mainly related to chemotaxis and migration of leukocytes, par-ticularly monocytes and macrophages. These findings confirm the existence of a marked inflammatory reaction in the setting of ACLF. The abnormal plasma cytokine profile is already present in patients with decompensated cirrhosis but is markedly enhanced in patients with ACLF. Moreover, some of the cytokines correlated with prog-nosis, a finding that links the inflammatory activity with disease outcome.

The landmark CANONIC study shed light on the existence and clinical relevance of systemic inflammation in decompensated cirrhosis and ACLF syndrome. Main findings of this study were: 1/ systemic inflammation, as assessed by leukocyte count and CRP levels, seems to be an important pathogenic component of the ACLF syn-drome; 2/ systemic inflammation in ACLF is independent of the existence of bacterial infections; and 3/ systemic

All patients n = 55Acute decompensation without ACLF n = 29 ACLF n = 26 P*

Age (yr) 60 (51–68) 61 (52–72) 57 (51–65) 0.235

Male sex 42 (76) 22 (76) 20 (77) 0.926

Alcoholic cirrhosis 27 (49) 13 (45) 14 (54) 0.504

Presence of ascites 44 (80) 19 (66) 25 (96) 0.005

Presence of encephalopathy 14 (26) 2 (7) 12 (46) 0.001

Presence of bacterial infection 31 (56) 14 (48) 17 (65) 0.201

Presence of SIRS 32 (58) 18 (62) 14 (54) 0.537

Presence of shock 5 (9) 0 (0) 5 (19) 0.013

Serum bilirubin (mg/dL) 3.1 (1.6–8.6) 2.6 (1.5–3.2) 6.2 (2.2–16) 0.009

Serum albumin (g/L) 28 (25–31) 28 (25–31) 28 (25–32) 0.695

INR 1.6 (1.3–2.1) 1.4 (1.2–1.6) 2.0 (1.6–2.9) < 0.0001

Platelet count (×109/L) 76 (52–135) 114 (66–180) 60 (51–90) 0.009

MELD score 21 (13–29) 14 (11–18) 29 (26–33) < 0.0001

Child-Pugh score 10 (8–11) 9 (7–10) 11 (9–12) < 0.0001

Serum creatinine (mg/dL) 1.1 (0.7–2.1) 0.8 (0.7–1.0) 2.2 (1.5–2.8) < 0.0001

Serum sodium (mEq/L) 135 (131–137) 136 (132–139) 134 (128–136) 0.018

Mean arterial pressure (mmHg) 81 (71–90) 89 (82–96) 72 (62–78) < 0.0001

Leukocyte count (×109/L) 6.8(4.5–12.2) 6.1 (4.6–10.7) 8.9 (3.9–15.3) 0.337

Polymorphonuclear count (×109/L) 4.6 (2.5–9.7) 4.3 (2.4–8.6) 6.2 (2.8–12.6) 0.310

C-reactive protein (mg/dL) 3.2 (1.5–7.4) 2.8 (1.0–7.8) 4.9 (2.2–7.4) 0.219

CLIF-C ACLF score — 38 (31–43) 51 (37–55) < 0.0001

CLIF-C AD score — 49 (44–60) 68 (59–75) < 0.0001

Table 1. Demographic, clinical, and laboratory characteristics of patients included in the study. SIRS, systemic inflammatory response syndrome; INR, international normalized ratio; MELD, model for end-stage liver disease; CLIF-C ACLF score (CLIF Consortium ACLF score), CLIF-C AD score (CLIF Consortium Acute Decompensation score). Values are expressed as numbers (%) or median and IQR (in brackets). *Comparison between Acute decompensation without ACLF vs ACLF group.

Page 38: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

4Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

inflammation is associated with poor short-term mortality13. There is very little information about inflamma-tory cytokines in ACLF. Earlier studies showed increased serum levels of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 10 (IL-10) in patients with ACLF compared to those of patients with stable cirrhosis, in a manner similar to that reported in patients with severe sepsis8. However, this study used a definition of ACLF different from the cur-rently accepted definition. A recently published study, which investigated the expression of MERTK in immune cells showed greater serum levels of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α ), IL-6, IL-10, and interleukin 8 (IL-8) in patients with ACLF than in those without ACLF, but normal levels of Interferon gamma (IFN-ϒ ), transforming growth factor beta 1 (TGF-β 1), IL-1β , and interleukin 12 (IL-12)9, suggesting the existence of an altered cytokine profile in ACLF. The current study extends these observations by assessing a larger number of cytokines, using a multiplex approach, in a series of patients without ACLF and with well-defined ACLF. Our findings indicate that in decompensated cirrhosis without ACLF there is already an abnormal plasma cytokine profile compared to healthy subjects, which is further stressed in the setting of ACLF. The presence of abnormal plasma cytokine profile was suggested by using PCA approach and demonstrated by standard comparison of cytokine levels among groups (see Figs 1 and 2). An interesting observation of our study is that this abnormal plasma cytokine profile is not exclu-sively related to bacterial infections, because significant differences in cytokine levels persisted among groups when patients with ACLF were compared to the subset of patients with associated bacterial infections without ACLF.

A striking finding of our investigation was that most of the cytokines altered in patients with ACLF were related functionally with chemotaxis and migration of leukocytes, particularly monocytes and macrophages. This finding points towards an important role of monocytes/macrophages in the pathogenesis of ACLF. This observation is in keeping with previous studies showing impaired “sepsis-like” monocyte function in patients with ACLF. Wasmuth et al. showed that patients with ACLF have abnormal monocyte function as indicated by impaired ex-vivo produc-tion of TNF-α after stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and reduced HLA-DR expression, suggesting the existence of a functional impairment of the innate immune response8. More recently, it has been shown that ACLF is characterized by an increased number of monocytes and macrophages that express MERTK in circulation, liver, and lymph nodes, compared to patients without ACLF and healthy controls, which correlated with inflammatory response. These MERTK-positive immune cells have an impaired response to LPS stimulation and may likely contribute to ACLF progression and infectious complications9. Along the same lines, our study showed that ACLF was associated with reduced levels of GM-CSF. Moreover, reduced levels of GM-CSF correlated with mortality, further suggesting the important role of the monocyte/macrophage system in determining poor outcome in cir-rhosis. GM-CSF is member of a family of hematopoietic growth factors that mobilize immune cells from bone marrow and also enhances the activity of different types of leukocytes, including neutrophils and monocytes15,16. To our knowledge, there are no data on GM-CSF levels in cirrhosis and its relationship with ACLF and outcome. Interestingly, a recent study in patients and animals with experimental acute liver failure (ALF) showed that ALF is associated with reduced levels of CSF1 (also known as macrophage colony-stimulating factor, M-CSF), a growth factor that stimulates monocytes exclusively, which predicted poor outcome17. In the same study, it was shown that administration of CSF1 to animals with ALF improved liver regeneration. These findings are in keeping with recent studies showing that the administration of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) reduces bacterial infections and improves survival in patients with decompensated cirrhosis without ACLF as well as in ACLF18,19. Although these latter studies include a small number of patients and require confirmation in larger series, overall, these data point towards an important role of impaired monocytes/macrophages function in the pathogenesis of ACLF. Further studies are needed to investigate the cause of impaired monocytes/macrophages, as well as neutro-phils, function and whether colony-stimulating factors could be an effective approach to therapy of ACLF.

Figure 1. Principal Component Analysis (PCA) of all subjects included in the study with only cytokine data (Panel A) or cytokine and biochemical data (Panel B). Confidence region (95%) was indicated by an ellipsoid for each group. Each circle corresponds to one patient. Blue circles: healthy subjects; green circles: patients with acute decompensation without ACLF; Red circles: patients with ACLF.

Page 39: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

5Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

Another interesting observation of the current study was the markedly increased levels of VCAM-1 and ICAM-1 in patients with ACLF and their relationship with survival, so that higher levels were associated with reduced survival. VCAM-1 and ICAM-1 are molecules that are expressed in the endothelial cells, particularly in post-capillary venules, but also liver sinusoidal cells, that participate in the slow rolling, arrest and adhesion, crawling, transmigration, and diapedesis of leukocytes20,21. Because all these processes are essential initial steps in inflammation, these findings underscore the relevance of leukocyte chemotaxis and migration in ACLF and its relationship with prognosis. Similar findings of increased VCAM-1 and ICAM-1 levels have been observed in sepsis and correlate with prognosis in this condition22. Moreover, increased levels of ICAM-1 and VCAM-1 have been reported in patients with decompensated cirrhosis, particularly those with advanced liver failure, that correlated with prognosis23,24.

Because VCAM and ICAM are produced in endothelial cells, increased levels of these proteins have also been used as surrogate markers of endothelial dysfunction in sepsis as well as in cardiovascular diseases25–27. Therefore, our findings support the existence of endothelial dysfunction in ACLF.

It should be noted that despite that our study investigated a wide range of inflammatory mediators, there are still other potential interesting molecules (i.e., cytokines, chemokines) that could not be investigated as the number and type of measured molecules was limited to the multiplex kit selected. In this context, two recent studies have investigated the role of CXCL9 and CXCL11 in patients with cirrhosis receiving TIPS. Interestingly, results of these studies showed that increased levels of CXCL9 (monokine induced by human gamma interferon) and CXCL11 (Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant) were independent predictors of mortality in patients with cirrhosis receiving TIPS28,29. Therefore, it would be interesting to further investigate the role of these chemokines in the setting of ACLF in future studies.

The current study has some limitations that should be mentioned. First, the sample size is relatively low. However, patients included belong to two clearly differentiated clinical phenotypes of patients with and with-out ACLF, which makes the comparison between the two groups very accurate by avoiding clinical overlap. No patient without ACLF was in the process of rapid development of ACLF, which could have been a confounding factor. In fact, none of the patients without ACLF developed ACLF within one month after inclusion in the study. With respect to patients with ACLF, their characteristics were very similar to those of patients in the CANONIC study, with similar ACLF grades (50%, 31% and 19% of patients with grades I, II, and III in the current study vs 49%, 36%, and 16%, respectively, in the CANONIC study) and mortality (28-day and 90-day mortality of 27% and 46% in the current study vs 34% and 51%, respectively, in the CANONIC study). Second, plasma cytokine levels were measured exclusively at inclusion in the study; a second measurement at a later time point was not available. Therefore, assessment of changes in plasma cytokine levels according to certain outcomes, such as improvement/worsening of ACLF could not be made. However, plasma cytokines levels correlated with mortality which is the most important clinical outcome in ACLF. Finally, the use of a multiplex system allows the measure-ment of a large number of cytokines but is associated with some intrinsic limitations. The main limitation is that some of the cytokines included in the system could not be measured. This is probably related to cross-reading that

CytokineAcute decompensation without ACLF n = 29 ACLF n = 26 P AUCROC (95% IC)

VCAM-1 (ng/mL) 1263 (1063–2023) 2399 (1791–3501) <0.0001 0.780 (0.655–0.905)

VEGF-A (pg/mL) 74 (49–169) 201 (112–252) 0.001 0.771 (0.644–0.897)

Fractalkine (pg/mL) 4.4 (3.6–6.4) 6.7 (5.5–8.2) 0.001 0.756 (0.625–0.887)

MIP-1α (pg/mL) 3.7 (3.0–5.8) 5.7 (4.9–12.0) 0.002 0.749 (0.615–0.882)

RANTES (pg/mL) 396 (143–1124) 137 (71–208) 0.002 0.739 ( 0.603–0.874)

Eotaxin (pg/mL) 36 (29–51) 58 (38–69) 0.004 0.727 (0.589–0.864)

IP-10 (pg/mL) 38 (29–54) 69 (43–101) 0.004 0.724 (0.580–0.868)

GM-CSF (pg/mL) 46 (43–52) 42 (40–45) 0.008 0.709 (0.564–0.854)

IL-1β (pg/mL) 4.3 (3.2–5.6) 2.6 (1.8–3.7) 0.012 0.698 (0.554–0.842)

IL-2 (pg/mL) 21 (15–36) 15 (4–22) 0.015 0.691 (0.546–0.836)

ICAM-1 (ng/mL) 1315 (993–2393) 1831 (1317–2944) 0.087 0.635 (0.485–0.784)

MCP-1 (pg/mL) 18 (12–33) 27 (16–45) 0.086 0.635 (0.487–0.784)

PDGF-BB (pg/mL) 99 (37–245) 47 (16–121) 0.157 0.611 (0.459–0.763)

IFN-γ (pg/mL) 13 (9–28) 9 (5–21) 0.177 0.606 (0.452–0.760)

IL-6 (pg/mL) 45 (19–81) 59 (30–233) 0.175 0.607 (0.455–0.758)

IL-7 (pg/mL) 1.6 (1.5–1.7) 1.5 (1.5–1.7) 0.241 0.592 (0.436–0.748)

MIP-1β (pg/mL) 122 (95–160) 114 (77–160) 0.273 0.586 (0.432–0.740)

IL-10 (pg/mL) 2.1 (0.7–4.4) 1.1 (0.08–5.0) 0.300 0.582 (0.425–0.738)

G-CSF (pg/mL) 36 (22–65) 49 (22–83) 0.680 0.532 (0.376–0.689)

IL-13 (pg/mL) 4.8 (4.5–7.8) 4.8 (4.5–5.4) 0.495 0.446 (0.293–0.599)

Table 2. Comparison of plasma cytokine levels between patients with acute decompensation of cirrhosis without ALCF and patients with ACLF. AUCROC, area under the receiver-operating characteristic curves. Values are expressed as median and IQR (in brackets).

Page 40: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

6Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

may affect negatively the sensitivity of detection. This may explain why some cytokines that have been reported as increased in cirrhosis (i.e., TNF-α , IL-6) were not detected by the method used in the current study6,30.

In conclusion, the results of the current study show that the syndrome of ACLF is characterized by marked inflammatory reaction with activation of mediators of adhesion and migration of leukocytes, particularly mono-cytes and macrophages. The intensity of the inflammatory reaction correlates with prognosis.

MethodsPatient population and study design. The current study includes 55 patients with decompensated cir-rhosis, 26 with ACLF and 29 without ACLF, admitted to the Liver Unit to the Hospital Clínic in Barcelona for the management of complications of the disease. These patients were selected from a prospective database with biobank collection that includes consecutive patients with decompensated cirrhosis admitted to hospital for treat-ment of an acute decompensation of the disease. Patients were randomly selected from the database from the groups with or without ACLF. Exclusion criteria were: previous kidney/liver transplantation, chronic haemodial-ysis before admission, hepatocellular carcinoma outside the Milan criteria or any other advanced malignancy and lack of inform consent. Causes of admission in patients without ACLF were: infection, ascites, gastrointestinal bleeding, and hepatic encephalopathy (13, 10, 4, and 2 patients, respectively). Importantly, none of the patients without ACLF developed ACLF during at least one month after sample collection. All patients with ACLF met the criteria of ACLF at admission to hospital. Causes of admission in patients with ACLF were: acute kidney injury, infection, ascites, gastrointestinal bleeding, and hepatic encephalopathy (9, 6, 4, 3, and 4 patients, respectively). A group of healthy subjects was included for comparison of plasma cytokine levels.

Demographic, clinical, and analytical data were collected prospectively at admission and during hospitali-zation. All complications developing during hospitalization were recorded and managed according to protocols of the Liver Unit which are based on international treatment guidelines31,32. ACLF was defined according to the CANONIC study13. Patients discharged from hospital were followed-up for at least 3 months.

Figure 2. Individual values of plasma cytokines levels in healthy subjects (HS), patients with acute decompensation of cirrhosis without ACLF (AD) and patients with ACLF (ACLF). Cytokine levels are expressed in log scale.

Page 41: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

7Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

Blood samples were collected at the time of inclusion in the study. The median time between admission to hospital and collection of samples was 1 day (0 to 3 days). Blood was centrifuged at 2,000G, at 4 °C, for 10 minutes. Plasma was stored at − 80 °C until analysis. All samples were stored at the biobank as required by spanish law. All patients signed a written informed consent document and gave permission for samples to be used in the study following current national and institutional guidelines for sample storage and usage for research purposes. All the analysis and the sample collection were performed in accordance with relevant guidelines and regulations. This study was presented and approved by the Ethics Committee of Hospital Clinic registration number 2014/0577. The creation of the biobank collection was presented and approved by the Ethics Committee registration number (2011/6689).

Enriched processes/pathways Num Cytokines involved Types of cytokines P

Cell movement of monocytes 9 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL1-β ,IL-2,VCAM-1 8.44e−20

Leukocyte migration 10 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL-1β , IL-2, VCAM-1,VEGF-A 1.82e−18

Migration of phagocytes 8 MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL-1β , IL-2, VCAM-1 3.93e−17

Chemotaxis of mononuclear leukocytes 8 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL-1β , IL-2 1.25e−16

Chemotaxis of monocytes 7 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL-1β 1.45e−15

Migration of monocytes 6 MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IL-2,VCAM-1 7.58e−14

Migration of mononuclear leukocytes 7 MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IP-10, IL-2, VCAM-1 3.45e−13

Cell movement of natural killer cells 5 MIP-1α , RANTES, Fractalkine, IP-10, IL-2 5.88e−13

Activation of macrophages 5 MIP-1α , RANTES, GM-CSF, IL-1β , IL-2 1.97e−12

Transmigration of phagocytes 5 MIP-1α , RANTES, GM-CSF, IL-1β , VCAM-1 9.08e−12

Binding of professional phagocytic cells 5 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, IP-10, VCAM-1 2.62e−11

Neovascularization 4 GM-CSF, IL-1β , IL-2, VEGF-A 4.28e−11

Necrosis 9 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, Fractalkine, IL-1β , IL-2,VCAM-1, VEGF-A 8.39e−11

Chronic inflammatory disorder 9 Eotaxin, MIP-1α , RANTES, GM-CSF, IP-10, IL-1β , IL-2, VCAM-1, VEGF-A 9.40e−11

Cell viability 6 GM-CSF, IP-10, IL-1β , IL-2, VCAM-1, VEGF-A 3.46e−8

Table 3. Pathway enrichment analysis revealing specific immune inflammatory response pathways involved in acute-on chronic liver failure. Only the most significant enriched biological processes and pathways based on the p value are shown in the table. The number of cytokines (Num) and types of cytokines overlapping with the significant pathways are also shown.

CytokineAcute decompensation without ACLF

and with bacterial infection n = 14 ACLF n = 26 P

VCAM-1 (ng/mL) 1665 (114–2498) 2399 (1791–3501) 0.033

VEGF-A (pg/mL) 111(60–249) 201 (112–252) 0.079

Fractalkine (pg/mL) 4.4 (3.7–10.7) 6.7 (5.5–8.2) 0.040

MIP-1α (pg/mL) 3.9 (2.9–5.7) 5.7 (4.9–11.9) 0.008

RANTES (pg/mL) 439 (166–1628) 137 (71–208) 0.020

Eotaxin (pg/mL) 35 (30–50) 58 (38–69) 0.005

IP-10 (pg/mL) 34 (26–60) 69 (43–101) 0.023

GM-CSF (pg/mL) 46 (42–53) 42 (40–45) 0.025

IL-1β (pg/mL) 4.2 (3.2–5.9) 2.6 (1.8–3.7) 0.020

IL-2 (pg/mL) 29 (18–39) 15 (4.0–21) 0.017

ICAM-1 (ng/mL) 1422 (1001–2725) 1831 (1317–2944) 0.207

MCP-1 (pg/mL) 22 (11–33) 27 (16–45) 0.133

PDGF-BB (pg/mL) 101 (27–303) 47 (16–121) 0.233

IFN-γ (pg/mL) 14 (10–29) 9.1 (5.3–21) 0.305

IL-6 (pg/mL) 39 (19–107) 59 (30–233) 0.301

IL-7 (pg/mL) 1.6 (1.5–1.8) 1.5 (1.5–1.7) 0.255

MIP-1β (pg/mL) 122 (91–159) 114 (77–161) 0.514

IL-10 (pg/mL) 2.4 (0.7–4.9) 1.1 (0.08–5.0) 0.282

G-CSF (pg/mL) 36 (22–50) 49 (22–83) 0.487

IL-13 (pg/mL) 4.9 (4.5–7.2) 4.8 (4.5–5.4) 0.660

Table 4. Comparison of plasma cytokine levels between patients with acute decompensation of cirrhosis without ACLF with associated bacterial infections and patients with ACLF. Values are expressed as median and IQR (in brakets).

Page 42: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

8Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

Multiplex cytokine assay. The following 34 cytokines and growth factors were determined with the Procarta® Immunoassay Kit (Panomics, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA): IFN-γ , fibroblast growth factor (FGF-2), interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA), GM-CSF, Interleukin 4 (IL-4), IL-6, IL-8, IP-10, MIP-1α , mac-rophage inflammatory protein 1-beta (MIP-1β ), platelet-derived growth factor subunit B (PDGF-BB), TNF-α , eotaxin, IL-1β , IL-2, interleukin 5 (IL-5), interleukin 7 (IL-7), interleukin 9 (IL-9), interleukin 12 (IL-12p70), interleukin 27 (IL-27), interleukin 21 (IL-21), interleukin 15 (IL-15), MCP-1, placental growth factor-1 (PIGF-1), VEGF-A, interleukin 23 (IL-23), interleukin 17 (IL-17A), interleukin 13 (IL-13), IL-10, fractalkine, G-CSF, RANTES, VCAM-1 and ICAM-1. Briefly, 50 μ L of microparticles precoated with specific antibodies were added to each well with standards or 25 μ L of plasma samples and incubated for 60 minutes at room temperature in the dark. After washing the plate, 25 μ L of detection antibody solution was added and the plate was incubated for 30 minutes at room temperature in the dark. A mix with streptavidin-PE solution was added to the plate for 30 minutes and then the median relative fluorescence units from the antibody reactions was measured in 120 μ L of reading buffer using a Luminex 200 analyzer (Luminex, Austin, TX, USA) and the xPONENT software (v. 3.1; Luminex, Austin, TX, USA). The concentration of each analyte was calculated using five-parameter regression models. We only considered standard points with recoveries ranging from 70 to 130%. The intra-assay coefficient of variation was less than 8%. In individual samples with values below the detection limits, the lower level of detection was used in the calculation of the results. Cytokines in which the levels were below the detection limit in more than 30% of the samples (n = 14) were excluded from the analysis (the median number of samples below detection limits in this subset was 69%). These cytokines were: FGF-2, IL-1RA, IL-4, IL-8, TNF-α , IL-5, IL-9, IL-12p70, IL-27, IL-21, IL-15, PIGF-1, IL-23, and IL-17A.

Principal component analysis. This is a technique developed for simplifying a dataset, based on orthogo-nal linear transformations, that converts the data to a new coordinate system such that the greatest variance by any projection of the data comes to lie on the first coordinate (first principal component), the second greatest variance on the second coordinate, and so on33. By this way, it may be determined whether the variation of protein abun-dance represents defined patterns that correlate with the already defined sample groups. We performed PCA of the integration of multiplex cytokines abundance and other biochemical data in R platform (www.r-project.org) using “stats” and “rgl” packages. An ellipsoid from the covariance matrix was drawn to show the confidence region (95%) for each of the three plotted groups.

Statistical analysis. Categorical variables were compared with the Chi-Square test. Comparisons of par-ametric continuous variables between groups were made with Student’s T-test or ANOVA. Comparisons of non-parametric continuous variables between groups were made with Mann-Whitney U or Kruskal-Wallis tests. Alpha error was adjusted according to Bonferroni correction method in multiple comparisons. The area under the receiver-operating characteristic curves (AUCROC) was used to assess the relationship between each cytokine and outcomes, specifically: ACLF and 90-day transplant-free survival. Survival probability curves were calculated with the Kaplan-Meier method and compared with log-rank test. Multivariate Cox regression was performed to

Variables Alive (n = 37) Dead (n = 15) P Mortality AUCROC (95% IC)

VCAM-1 (ng/mL) 1263 (1072–2244) 2942 (1803–3471) 0.001 0.807 (0.690–0.925)

ICAM-1 (ng/mL) 1315 (978–1897) 2633 (1704–3178) 0.001 0.791 (0.667–0.915)

GM-CSF (pg/mL) 46 (42–52) 41 (40–43) 0.013 0.721 (0.557–0.884)

MIP-1α (pg/mL) 4.2 (3.2–6.2) 6.0 (4.9–17.01) 0.028 0.695 (0.540–0.851)

IP-10 (pg/mL) 41 (29–72) 64 (49–106) 0.040 0.683 (0.523–0.842)

RANTES (pg/mL) 287 (85–895) 125 (71–280) 0.077 0.658 (0.499–0.816)

IL-2 (pg/mL) 19 (14.6–36) 15 (4.0–27) 0.077 0.658 (0.479–0.836)

IL-1β (pg/mL) 4.0 (2.6–5.9) 3.2 (1.8–3.7) 0.108 0.643 (0.483–0.804)

MPC-1 (pg/mL) 17.8 (12.4–33.9) 27.6 (17.5–48.4) 0.138 0.632 (0.458–0.807)

IL-7 (pg/mL) 1.6 (1.5–1.8) 1.5 (1.5–1.6) 0.146 0.630 (0.471–0.789)

PDGF-BB (pg/mL) 84 (38–272) 46 (16–93) 0.183 0.619 (0.456–0.782)

IL-13 (pg/mL) 5.0 (4.5–6.3) 4.6 (4.5–5.1) 0.229 0.607 (0.450–0.764)

Fractalkine (pg/mL) 5.4 (3.8–7.3) 6.3 (5.1–7.6) 0.233 0.606 (0.456–0.757)

Eotaxin (pg/mL) 43 (33–58) 44 (32–81) 0.486 0.562 (0.367–0.757)

IL-10 (pg/mL) 2.1 (0.5–4.4) 1.3 (0.1–4.8) 0.525 0.557 (0.382–0.731)

VEGF-A (pg/mL) 140 (55–221) 163 (87–224) 0.538 0.555 (0.391–0.719)

MIP-1β (pg/mL) 122 (91–160) 116 (85–159) 0.754 0.528 (0.355–0.701)

G-CSF (pg/mL) 38 (25–69) 42 (15–83) 1.000 0.500 (0.312–0.688)

IL-6 (pg/mL) 47 (21–100) 45 (25–117) 0.976 0.497 (0.323–0.672)

IFN-γ (pg/mL) 11 (8–28) 15 (4.7–18) 0.777 0.475 (0.287–0.662)

Table 5. Comparison of plasma cytokine levels in patients included in the study categorized according to 3-month survival. AUCROC, area under the receiver-operating characteristic curves. Values are expressed as median and IQR (in brackets). The 3 patients transplanted during the 3-month follow-up period were excluded from the analysis.

Page 43: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

9Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

identify the independent factors associated with mortality. All statistical analyses were performed using SPSS 20.0 software. Results for continuous variables are expressed as median and interquartile range (IQR). Categorical variables are expressed as number and percentage. The significance level for all tests was set at 0.05 two-tailed.

Functional enrichment analysis. Functional analysis was analyzed through the use of QIAGEN’s Ingenuity Pathway Analysis (IPA® , QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity). The significance value associated with the functional enrichment analysis for a given dataset is a measure of the likelihood that the asso-ciation between a set of focus molecules in the experiment and a given process or pathway is not due to random chance. The p-value is calculated using the right-tailed Fisher Exact Test. We selected 1.0e−07 as the significance threshold.

References1. Tsochatzis, E. A., Bosch, J. & Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet 383, 1749–1761, doi: 10.1016/S0140-6736(14)60121-5 (2014).2. Úbeda, M. et al. Critical role of the liver in the induction of systemic inflammation in rats with preascitic cirrhosis. Hepatology 52,

2086–2095, doi: 10.1002/hep.23961 (2010).3. Albillos, A., Lario, M. & Álvarez-Mon, M. Cirrhosis-associated immune dysfunction: distinctive features and clinical relevance. J

Hepatol 61, 1385–1396, doi: 10.1016/j.jhep.2014.08.010 (2014).4. Chen, G. Y. & Nuñez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol 10, 826–837, doi: 10.1038/nri2873 (2010).5. Kumar, H., Kawau, T. & Akiras S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol 30, 16–34 (2011).6. Albillos, A. et al. Tumour necrosis factor-alpha expression by activated monocytes and altered T-cell homeostasis in ascitic alcoholic

cirrhosis: amelioration with norfloxacin. J Hepatol 40, 624–631 (2004).7. Navasa, M. et al. Tumor necrosis factor and interleukin-6 in spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: relationship with the

development of renal impairment and mortality. Hepatology 27, 1227–1232 (1998).8. Wasmuth, H. E. et al. Patients with acute on chronic liver failure display “sepsis-like” immuneparalysis. J Hepatol 42, 195–201 (2005).9. Bernsmeier, C. et al. Patients with acute-on-chronic liver failure have increased numbers of regulatory immune cells expressing the

receptor tyrosine kinase MERTK. Gastroenterology 148, 603–615, doi: 10.1053/j.gastro.2014.11.045 (2015).10. Arroyo, V., Moreau, R., Jalan, R. & Ginès, P. EASL-CLIF Consortium CANONIC Study. Acute-on-chronic liver failure: A new

syndrome that will re-classify cirrhosis. J Hepatol 62, S131–S143, doi: 10.1016/j.jhep.2014.11.045 (2015).11. Jalan, R. et al. Toward an improved definition of acute-on-chronic liver failure. Gastroenterology 147, 4–10, doi: 10.1053/j.

gastro.2014.05.005 (2014).

Figure 3. Survival probability curves of patients categorized according to median values of cytokines with prognostic value.

Page 44: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

www.nature.com/scientificreports/

1 0Scientific RepoRts | 6:32341 | DOI: 10.1038/srep32341

12. Bernal, W. et al. Acute-on-chronic liver failure. Lancet 386, 1576–1587, doi: 10.1016/S0140-6736(15)00309-8 (2015).13. Moreau, R. et al. Acute-on-chronic liver failure is a distinct syndrome that develops in patients with acute decompensation of

cirrhosis. Gastroenterology 144, 1437.e1421–1429, doi: 10.1053/j.gastro.2013.02.042 (2013).14. Metha, G., Moorkerjee, R. P., Sharma, V. & Jalan, R. Systemic inflammation is associated with increased intrahepatic resistance and

mortality in alcohol-related acute-on-chronic liver failure. Liver Int 35, 724–734, doi: 10.1111/liv.12559 (2015).15. Shi, Y. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don’t know. Cell

Res 16, 126–133 (2006).16. Hamilton, J. A. & Anderson, G. P. GM-CSF Biology. Growth Factors 22, 225–231 (2004).17. Stutchfield, B. M. et al. CSF1 Restores Innate Immunity After Liver Injury in Mice and Serum Levels Indicate Outcomes of Patients

With Acute Liver Failure. Gastroenterology 149, 1896–1909, doi: 10.1053/j.gastro.2015.08.053 (2015).18. Kedarisetty, C. K. et al. Combination of granulocyte colony-stimulating factor and erythropoietin improves outcomes of patients

with decompensated cirrhosis. Gastroenterology 148, 1362–1370, doi: 10.1053/j.gastro.2015.02.054 (2015).19. Garg, V. et al. Granulocyte colony-stimulating factor mobilizes CD34(+ ) cells and improves survival of patients with acute-on-

chronic liver failure. Gastroenterology 142, 505–512, doi: 10.1053/j.gastro.2011.11.027 (2012).20. Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nat. Rev. Immunol 15, 692–704, doi: 10.1038/nri3908 (2015).21. Kolaczkowska, E. & Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol 13, 159–175, doi:

10.1038/nri3399 (2013).22. Schuetz, P. et al. The association of endothelial cell signaling, severity of illness, and organ dysfunction in sepsis. Crit Care 14, R182,

doi: 10.1186/cc9290 (2010).23. Girón-González, J. A. et al. Adhesion molecules as a prognostic marker of liver cirrhosis. Scand J Gastroenterol 40, 217–224 (2005).24. Lo Iacono, O. et al. Serum levels of soluble vascular cell adhesion molecule are related to hyperdynamic circulation in patients with

liver cirrhosis. Liver Int 28, 1129–1135 (2008).25. Peters, K., Unger, R. E., Brunner, J. & Kirkpatrick, C. J. Molecular basis of endothelial dysfunction in sepsis. Cardiovasc Res 60, 49–57 (2003).26. Reinhart, K., Bayer, O., Brunkhorst, F. & Meisner, M. Markers of endothelial damage in organ dysfunction and sepsis. Crit Care Med

30, S302–S312 (2002).27. Blankenberg, S. et al. Circulating Cell Adhesion Molecules and Death in Patients With Coronary Artery Disease. Circulation 104,

1336–1342 (2001).28. Berres, M. L. et al. CXCL9 is a prognostic marker in patients with liver cirrhosis receiving transjugular intrahepatic portosystemic

shunt. J Hepatol 62, 332–339 (2015).29. Berres, M. L. et al. Chemockine Chemokine (C-X-C motif) ligand 11 levels predict survival in cirrhotic patients with transjugular

intrahepatic portosystemic shunt. Liver Int 36, 386–394 (2016).30. Girón-Gonzalez, J. A. et al. Implication of inflammation-related cytokines in the natural history of liver cirrhosis. Liver Int 24,

437–445 (2004).31. Jalan, R. et al. Bacterial infections in cirrhosis: a position statement based on the EASL Special Conference. J Hepatol 60, 1310–1324,

doi: 10.1016/j.jhep.2014.01.024 (2014).32. Ginès, P. et al. European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practice guidelines on the management of ascites,

spontaneous bacterial peritonitis, and hepatorenal syndrome in cirrhosis. J Hepatol 53, 397–417, doi: 10.1016/j.jhep.2010.05.004 (2010).33. Ringnér, M. What is principal component analysis? Nat Biotechnol 26, 303–304, doi: 10.1038/nbt0308-303 (2008).

AcknowledgementsThis study was funded by a grant awarded to P.G. (PI12/00330), from Fondos de Investigación de Salud Carlos III integrated in the Plan Nacional I + D + I and co-funded by ISCIII-Subdirección General de Evaluación and European Regional Development Fund FEDER. Cristina Solé was supported by a grant from the Instituto de Salud Carlos III (PFIS fellowship: FI14/00227). Isabel Graupera was supported by a grant from the Plan Estatal I + D + I and Instituto Carlos III (Rio-Hortega fellowship: CM14/00122). Patricia Huelin was supported by a grant from the University of Barcelona (APIF2015). P.G. is a recipient of an ICREA Academia Award and AGAUR (Agencia de Gestió d’Ajuts Universitaris I de Recerca) Award (2014/SGR 708). We thank Nicki Van Berckel for the administrative support during all the process of this project. We also thank the medical and nursing staff of the liver unit for their participation and the patients who participated in the study and their families.

Author ContributionsAll authors have contributed to this manuscript and approve the version of this submission. C.S. contributed to the conception and design of the study, acquisition of data, the analysis and interpretation of the data and drafting the manuscript; M.M.-R., G.F., P.H., I.G., R.M., G.d.P., X.A., E.P., N.F., S.G.K. and W.J. participated in the generation and collection of data, assembly of data, analyses of the results, interpretation of data, and/or critical revision of the manuscript for important intellectual content. P.G. and E.S. participated in the study concept, interpretation of the data, drafting the manuscript, critical revision of the manuscript for important intellectual content, obtained funding and study supervision.

Additional InformationSupplementary information accompanies this paper at http://www.nature.com/srepCompeting financial interests: The authors declare no competing financial interests.How to cite this article: Solé, C. et al. Characterization of Inflammatory Response in Acute-on-Chronic Liver Failure and Relationship with Prognosis. Sci. Rep. 6, 32341; doi: 10.1038/srep32341 (2016).

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license,

unless indicated otherwise in the credit line; if the material is not included under the Creative Commons license, users will need to obtain permission from the license holder to reproduce the material. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ © The Author(s) 2016

Page 45: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

45

ESTUDI 2

CHARACTERIZATION OF INFLAMMATORY RESPONSE IN HEPATORENAL SYNDROME. RELATIONSHIP WITH KIDNEY OUTCOME AND SURVIVAL

Cristina Solé, Elsa Solà, Patricia Huelin, Marta Carol, Rebeca Moreira, Unai

Cereijo, José-Manuel Mas, Isabel Graupera, Elisa Pose, Laura Napoleone,

Gloria dePrada, Adrià Juanola, Núria Fabrellas, Ferran Torres, Manuel Morales-

Ruiz, Judith Farrés, Wladimiro Jiménez and Pere Ginès

Liver Int. 2018 Dec 29.

Page 46: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

Liver International. 2019;1–10. wileyonlinelibrary.com/journal/liv | 1

Received:16August2018  |  Revised:21December2018  |  Accepted:24December2018DOI:10.1111/liv.14037

O R I G I N A L A R T I C L E

Characterization of inflammatory response in hepatorenal syndrome: Relationship with kidney outcome and survival

Cristina Solé1,2,3  | Elsa Solà1,2,3 | Patricia Huelin1,2,3 | Marta Carol2,5 |  Rebeca Moreira1,2,3 | Unai Cereijo6  | José‐Manuel Mas6 | Isabel Graupera1,2,3 |  Elisa Pose1,2,3 | Laura Napoleone1,2,3 | Gloria dePrada1,2,3 | Adrià Juanola1,2,3 |  Núria Fabrellas2,5 | Ferran Torres7 | Manuel Morales‐Ruiz2,3,4 | Judith Farrés6 |  Wladimiro Jiménez2,3,4 | Pere Ginès1,2,3

1LiverUnit,HospitalClínicdeBarcelona,UniversityofBarcelona,Barcelona,Spain2Institutd’InvestigacionsBiomèdiquesAugustPiiSunyer(IDIBAPS),Barcelona,Spain3CentrodeInvestigaciónBiomédicaenReddeEnfermedadesHepáticasyDigestivas(CIBEReHD)4BiochemistryandMolecularGeneticsDepartment,HospitalClínicdeBarcelona,Barcelona,Spain5FacultyofMedicineandHealthSciences,UniversityofBarcelona,Barcelona,Spain6AnaxomicsBiotech,Barcelona,Spain7MedicalStatisticsCoreFacility,IDIBAPS,HospitalClinicBarcelona&BiostatisticsUnit,FacultyofMedicine,UniversitatAutònomadeBarcelona,Barcelona,Spain

Abbreviations:CCL11,Eotaxin;CX3CL1,fractalkine;G‐CSF,granulocytecolony‐stimulatingfactor;ICAM‐1,intercellularadhesionmolecule‐1;IFN‐γ,interferongamma;IL‐10,interleu‐kin‐10;IL‐1RA,interleukin‐1receptorantagonist;IL‐1β,interleukin‐1beta;IL‐6,interleukin‐6;IL‐8,interleukin‐8;IP‐10,interferon‐inducibleprotein‐10;MCP‐1,monocytechemoattrac‐tantprotein‐1;MELD,modelofend‐stageliverdisease;MIP‐1α,macrophageinflammatoryprotein1‐alpha;MIP‐1β,macrophageinflammatoryprotein1‐beta;RANTES,regulatedonacti‐vationnormalTcellexpressedandsecreted;TNF‐α,tumournecrosisfactor‐alpha;VCAM‐1,vascularcelladhesionmolecule‐1;VEGF,vascularendothelialgrowthfactor.

CorrespondenceDrPereGinès,LiverUnit,HospitalClinicdeBarcelona,Barcelona,Spain.Email:[email protected]

Funding informationSomeoftheworkmentionedhasbeensponsoredbytheInstitutodeSaludCarlosIIIthroughthePlanEstataldeInvestigaciónCiéntificayTécnicaydeInnovación2013‐2016,PI12/00330andPI16/00043.ThisgrantwascofundedbytheEuropeanRegionalDevelopmentFund(FEDER).ThisstudyhasbeensupportedinpartbyanEUHorizon20/20Programme,Grant/AwardNumber:H2020‐SC1‐2016‐RTD;LIVERHOPE,Grant/AwardNumber:731875.SomeoftheinvestigatorsinvolvedhavebeensupportedbytheAGAURSGR‐01281Grant.PGisarecipientofanICREAAcademia Award.

HandingEditor:FrankTacke

AbstractBackground: Severallinesofevidenceindicatethatdecompensatedcirrhosisischarac‐terizedbythepresenceofsystemicinflammation.Hepatorenalsyndrome(HRS‐AKI)isauniquetypeofrenalfailurethatoccursatlatestagesofcirrhosis.However,confirmationofthepresenceandsignificanceofsuchinflammatoryresponseinHRS‐AKIislacking.Aim and Methods: Tocharacterizethesystemicinflammatoryresponse,asestimatedbymeasuringalargenumberofcytokines,in161patientshospitalizedforanacutedecompensationofcirrhosis:44patientswithoutacutekidneyinjury(AKI),63pa‐tientswithhypovolaemia‐inducedAKIand58patientswithHRS‐AKI.Results: HRS‐AKIwascharacterizedbyanalteredcytokineprofilecomparedtotheother twogroups, particularly IL‐6, IL‐8, TNF‐α,VCAM‐1, fractalkine andMIP‐1α. Theinflammatoryresponsewasnotrelatedtopresenceofbacterialinfection,con‐comitantacute‐on‐chronicliverfailureorseverityofrenaldysfunction.Patientswhorespondedto terlipressinandalbuminhadonlyadecrease inTNF‐αandRANTESaftertreatmentwithoutchangesinothercytokines.Interestingly,patientswithper‐sistentHRS‐AKI had higher levels of IP‐10 andVCAM‐1 compared to thosewith

ThisisanopenaccessarticleunderthetermsoftheCreativeCommonsAttribution‐NonCommercialLicense,whichpermitsuse,distributionandreproductioninanymedium,providedtheoriginalworkisproperlycitedandisnotusedforcommercialpurposes.©2018TheAuthors.Liver InternationalPublishedbyJohnWiley&SonsLtd

Page 47: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

2  |     SOLÉ et aL.

1  | INTRODUCTION

Hepatorenalsyndrome(HRS)isauniquetypeofacutekidneyinjury(AKI),currentlyknownas(HRS‐AKI),whichdevelopsinpatientswithdecompensatedcirrhosisandisconsideredaveryseverecomplica‐tionofthediseaseattheendofthespectrumofcomplicationsofcirrhosis.1,2

A large body of evidence demonstrating that circulatory dys‐functionplaysakey role in thepathophysiologyofHRS‐AKI.2‐4 Ithas been shown thatHRS‐AKI occurs as a consequence of an in‐tense renalvasoconstrictionwithmarkedreduction in renalbloodflow and glomerular filtration rate (GFR), which is pathogenicallyrelated to a striking splanchnic arterial vasodilatationwith activa‐tionofmajorvasoconstrictorsystems,asaconsequenceofportalhypertension.4,5 Administration of vasoconstrictors, particularlyterlipressin,inassociationwithalbumin,improvescirculatoryfunc‐tionandisabletoreturnrenalfunctiontobaselinevaluesinmanypatients,which confirms themajor roleof circulatorydysfunctionwitharterialvasodilationinthepathogenesisofkidneyimpairmentinHRS‐AKI.6,7

Inrecentyears,ithasbecomeincreasinglyevidentthatcirrhosisisaconditionwithmarkedsystemicinflammatorystate,whichappearstoincreasewithdiseaseprogression,fromcompensatedtodecom‐pensatedcirrhosis,andisrelatedtopatientoutcome.8,9Someclinicalstudieshaveassessed inflammationbymeasuring leucocytecountorC‐reactiveprotein(CRP)levels,10whileothershaveassessedtheprevalence of systemic inflammatory response syndrome (SIRS)11; however,thesemethodsarenotveryaccurateintheevaluationofinflammation. Besides, studies in experimental animals have alsodemonstratedtheexistenceofsystemic inflammationthat ismoreconspicuous in animalswith ascites compared to thosewithout.12 Finally,fewstudieshaveevaluatedalargenumberofinflammatorycytokinesandconfirmedthepresenceofsystemicinflammation,asestimatedbyincreasedplasmalevelsofrelevantcytokinesinvolvedininflammation,whichincreasewithdiseaseprogression.8,13,14Thehypothesis, therefore, has been raised that cirrhosis is a diseasecharacterizedbymarkedandprogressivesystemicinflammationthatmayplayaroleinthedevelopmentofcomplicationsofthedisease.15 However,sofarthereislackofinformationregardingthepresence,

extentand significanceof inflammation inpatientswithHRS‐AKI.GiventhatHRS‐AKI isconsideredthehallmarkofthedisease,thisinformationmayberelevantnotonlywithrespecttopathogenesisbutalsoforidentificationofpotentialtargetsoftherapytopreventdiseaseprogression.

Onthisbackground,theaimofourstudywastoassesstheex‐istenceofsystemicinflammation,asestimatedbyplasmalevelsofalargenumberof inflammatorycytokines, inpatientswithHRS‐AKIand investigate the relationshipbetween inflammationandkidneyandpatientoutcomes.BecausesystemicinflammationiscommoninACLFandpatientswithHRS‐AKIfrequentlymeetdiagnosticcriteriaofACLF,theroleofthislatterconditionaspotentialcauseofinflam‐mationinHRS‐AKIwasalsoassessed.

2  | PATIENTS AND METHODS

2.1 | Patient population and study design

One‐hundred and sixty‐five episodes of AKI occurring in 161 pa‐tientswithdecompensatedcirrhosisadmitted to theLiverUnitofHospitalClinicwereinvestigatedinthecurrentstudy.ThesepatientswereselectedfromaprospectivedatabasewithBiobankcollection

resolutionofHRS‐AKI.VCAM‐1wasalsoanindependentpredictorof3‐monthmor‐tality.AsystemsbiologyanalysisapproachshowedthattheinflammatorystatusofHRS‐AKIwassimilartothatofchronicnonhepaticinflammatoryconditions,suchaslupuserythematosusorinflammatoryboweldisease.Conclusion: Hepatorenalsyndromeischaracterizedbyamarkedsystemicinflamma‐torystate,reminiscentofthatofnonhepaticinflammatorydiseases,thatcorrelateswithpatientoutcomes.

K E Y WO RD S

AKI,cirrhosis,hepatorenalsyndrome,inflammation

LAY SUMMARY

• Hepatorenalsyndrome,atypeofrenaldysfunctionthatoccursattheendstageofcirrhosis,ischaracterizedbyamarkedsystemicinflammatorystate.

• Lackof resolutionof renal impairment and short‐termmortalityareassociatedwith increased levelsofsomeinflammatory markers; IL‐6, IL‐8, TNF‐α, ICAM‐1 andparticularly,VCAM‐1.

• A systems biology analysis approach showed that theinflammatorystatusofhepatorenalsyndromewassimi‐lar to that found in chronic nonhepatic inflammatorydiseases,suchaslupuserythematosusorinflammatorybowel disease.

Page 48: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

     |  3SOLÉ et aL.

thatincludesconsecutivepatientswithcirrhosisadmittedtohospi‐talfortreatmentofanacutedecompensationofthedisease.Threegroupsofsubjectswereidentifiedrandomlyfromthedatabase:(1)patientswithdecompensatedcirrhosiswithoutAKI(N=44),(2)pa‐tientswithhypovolaemia‐inducedAKI(N=63)and(3)patientswithHRS‐AKI(N=58).Forty‐oneofthe58patients(71%)withHRS‐AKImet the classical criteria of type‐1 HRS.16 Exclusion criteria werepreviouskidney/livertransplantation,chronichaemodialysisbeforeadmission,hepatocellularcarcinomaoutsidetheMilancriteriaoranyotheradvancedmalignancy,andlackofinformconsent.

Demographical, clinical and analytical datawere collected pro‐spectivelyatadmissionandatregularintervalsduringhospitalization,andpatientswerefollowedupforatleast3monthsafterdischarge.Bloodandurinesampleswerecollectedatthetimeofinclusioninthisstudy.Moreover,in27patientswithtype1‐HRS,sampleswerealsocollectedaftertreatmentwithterlipressinandalbumin(mediantimebetweenthetwosamplecollectionswasof7days).Bloodwascentri‐fugedat2000g,at4°C,for10min,andplasmawasstoredat−80°Cuntil analysis. All samples were stored at the Biobank as requiredbySpanishlegislation.ThisstudywasapprovedbytheInstitutionalReviewBoard of our centre, the research Ethic Committee of theHospitalClínicofBarcelona(HCB/2017/0285),andallpatientssignedawritteninformedconsentforparticipationinthisstudy.

2.2 | Multiplex cytokine assay

The following 18 cytokines and vascular adhesion moleculeswere determined in plasma with the Luminex® Immunoassay Kit(Panomics®, Affymetrix Inc, Santa Clara, CA, USA): eotaxin, G‐CSF,fractalkine,IFN‐γ,IL‐10,IL‐1RA,IL‐1β,IL‐6,IL‐8,IP‐10,MCP‐1,MIP‐1α,MIP‐1β,TNF‐α,VEGF,ICAM‐1,VCAM‐1andRANTES(seeSupplementarymaterials).UrineMCP‐1wasalso analysed (R&D®Systems,Minneapolis,MN,USA).CytokinesIL‐10,IL‐1RAandIL‐1β were excluded from statistical analyses because their levelswereoutofthedetectionlimitinmorethan30%ofthesamples.

2.3 | Definitions

AKIandACLFweredefinedaccordingtoICA1andCANONIC17defi‐nitionsrespectively(seeSupplementarymaterials).

2.4 | Statistical analysis

Comparisons of normally distributed continuous variables weremadewithStudent'st testorANOVA.Comparisonsofnon‐normallydistributed continuous variables were made with Mann‐WhitneyUorKruskal‐Wallis tests.Results for continuousvariables areex‐pressed asmedian and interquartile range (IQR). Categorical vari‐ableswereexpressedasnumberandpercentageandcomparedwiththechi‐squaretestorFisherexacttest.Survivalcurveswerecalcu‐latedwithKaplan andMeiermethodand comparedwith log‐ranktest.Duetothelackofpriorknowledgeontherelevanceofcut‐offlevelsforquantitativevariables,wedecidedtousetheunsupervised

criterionofthemedianvalue.MultivariateCoxregressionwasper‐formedtoidentifytheindependentfactorsassociatedwithmortal‐ity.Therewasnospecificcalculationofthesamplesize.However,basedonpreviousexperiencestudiesinpatientswithcirrhosis,14,18 itwasconsideredthatmorethan100patientshadtobeincludedinthisstudytoachieveasignificantnumberofoutcomesintermsoflackofAKIresolutionand3‐monthmortality.Allstatisticalanalyseswere performed using SPSS statistical package, version 23.0. Thesignificancelevelforalltestswassetat0.05two‐tailed.

2.5 | Systems biology analysis

We used a systems biology approach based on artificial neuralnetworks supervised algorithm (ANN algorithm) that measuresthestrengthofrelationshipsbetweengroupsofhumanproteins.19 Measuresarebasedonthetopologyofthenetwork,andthetrainingset isderivedmostlyfromdrugeffects.Theconditionsusedwerethose defined in BED (Biological Effectors Database, AnaxomicsBiotech, Barcelona, Spain) a hand‐curated collection of scientificknowledgerelatingbiologicalprocessestotheirmoleculareffectors.TheANNalgorithmprovidesapredictivescore(from0%to100%)that quantifies the amount and strengthof relationships betweentheevaluatedproteins.EachscoreisassociatedwithaP valuethatdescribes the probability of the results being a true positive re‐sult19,20(seeSupplementarymaterials).

3  | RESULTS

3.1 | Baseline characteristics of patients

Thebaselinecharacteristicsofpatientswithdecompensatedcirrho‐sisincludedinthisstudycategorizedinto3groups(noAKI,hypovol‐aemia‐inducedAKIandHRS‐AKI)areshowninTable1.Ofinterest,bacterial infectionsweremore common in patientswithHRS‐AKIcompared to the other two groups, a finding consistent with theknownroleofbacterialinfectionsastriggeringfactorsofHRS‐AKI.Asexpected,thefrequencyandseverityofACLFwerehigherinpa‐tientswithHRS‐AKIcomparedtothatofpatientswithhypovolae‐mia‐inducedAKI.

3.2 | Systemic inflammatory response and cytokine levels

TheprevalenceofSIRS,leucocytecountandserumCRPlevelswerehigherinpatientswithHRS‐AKIcomparedtotheothertwogroups(Table2).Withrespecttocytokinelevels,patientswithHRS‐AKIhadacytokineprofiledifferentfromthatintheothertwogroups,withstatisticallysignificantdifferencesinthelevelsofseveralcytokines,including higher urinary levels ofMCP‐1 and plasma IL‐6, TNF‐α, VCAM‐1,andIL‐8,andlowerlevelsofMIP1‐αandfractalkine.

TofurtherexplorethecytokineprofileofHRS‐AKI,weassessedwhethertheincreasedcytokinelevelsfoundinthesepatientscouldbe related to concomitant bacterial infections that were more

Page 49: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

4  |     SOLÉ et aL.

commoninthisgroupofsubjects.Withthisobjective,wecomparedcytokine levels inpatientswithHRS‐AKIcategorizedaccording topresenceorabsenceofinfection(42and16patients,respectively)(SupplementaryTable1).Outofthe5cytokinesthatweredifferen‐tiallyincreasedinpatientswithHRS‐AKI,onlyplasmaIL‐6wassig‐nificantlyhigherinpatientswithHRS‐AKIassociatedwithinfectionscomparedtothosewithoutinfections(59(21‐180)vs23(12‐55)pg/mL,respectively,P=0.02).However,itispossiblethatafurtherag‐gravationof the increased systemic inflammation duringHRS‐AKIassociatedwithbacterialinfectionscouldnotbedetectedduetothelownumberofpatientswithHRS‐AKIwithoutinfections.

Next,weanalysedwhetherseverityofkidneyimpairmentinHRS‐AKIcorrelatedwiththeintensityofsystemicinflammatoryresponse.As shown inSupplementaryTable2, categorizationofpatientswithHRS‐AKIinthosewhometthediagnosticcriteriaoftype‐1HRS,themostsevereformofHRS‐AKI,andthosewhodidnotmeetthesecri‐teria,showednosignificantdifferenceswithrespecttofrequencyofSIRS,leucocytecountandCRP,aswellascytokinelevels.IntheHRS‐AKIgroup,serumcreatininelevelsdidnotcorrelatedwithinflammatorybiomarkers,exceptforurinarylevelsofMCP‐1(r=0.420,P=0.002).

Wealso investigatedwhetherreversalofkidney impairment inpatientswithHRS‐AKIwasassociatedwithchangesincytokinepro‐file.Tothispurpose,wecomparedcytokinelevelsbeforeandafterkidneyfunctionimprovementin24patientswithtype‐1HRStreatedwithvasoconstrictors andalbumin.Asexpected, serumcreatininedecreased significantly after treatment (from 2.9 to 1.3mg/dL;

P<0.001).Outofall cytokinesevaluated,onlyplasmaTNF‐α and RANTESdecreasedsignificantlyandMIP‐1αincreasedwithreversalofkidneydysfunction(Table3).

SincemanypatientswithHRS‐AKImeetthecriteriaofACLF,weinvestigatedwhethertheincreasedlevelsofinflammatorycytokinesfound inHRS‐AKIwerepotentially related to thepresenceofcon‐comitantACLF.To thisaim,wecategorizedpatientswithHRS‐AKIaccordingtothepresenceorabsenceofACLF.AsshowninTable4,patientswithHRS‐AKIwithassociatedACLFhadlevelsofcytokinesthatweresimilar to thoseofpatientswithHRS‐AKIwithoutACLF.Moreover,thelevelsofcytokinesdidnotcorrelatewithACLFsever‐ity,exceptforhigherlevelsofIL‐8andICAM‐1inpatientswithACLFgrades2‐3vsthoseofpatientswithgrade1(Table5).Tofurtherex‐ploretherelationshipbetweenAKIandACLF,wecomparedinflam‐matorycytokinelevelsinpatientswithACLFcategorizedaccordingtoAKItype,eitherHRS‐AKIorhypovolaemia‐inducedAKI.PatientswithACLFassociatedwithHRS‐AKIhadhigherlevelsofIL‐6,TNF‐α andurinaryMCP‐1andlowerlevelsoffractalkineandMIP1‐α com‐paredtothehypovolaemia‐induceAKIcounterparts(datanotshown).

3.3 | Relationship of systemic inflammatory response and cytokine levels with kidney outcome and patient survival

Outofthe121patientswithAKI,resolutionofkidneyfunctionim‐pairmentwasobservedin86(71%),whereastheremaining35(29%)

TA B L E 1  Baselinedemographical,clinicalandlaboratorycharacteristicsofpatientsincludedinthisstudy

No AKI (N = 44)Hypovolaemia‐induced AKI (N = 63) HRS‐AKI (N = 58) P value

Age, years 62(56‐70) 62(54‐67) 59(53‐66) 0.556

Diabetesmellitus 14(32) 21(33) 16(28) 0.783

Malegender 30(68) 43(68) 45(78) 0.445

Aetiologyofcirrhosis:Alcohol/hepatitisC

24(55)/10(23) 26(41)/15(24) 28(48)/12(21) 0.558

Ascites 23(52) 44(67) 58(100) <0.001

Hepaticencephalopathy 3(7) 12(19) 28(48) <0.001

Bacterialinfection 22(50) 20(32) 42(72) <0.001

Serumcreatinine(mg/dL) 0.8(0.6‐1.0) 1.6(1.3‐1.9) 2.6(1.9‐3.1) <0.001

Serumbilirubin(mg/dL) 2.5(1.4‐3.9) 2.6(1.6‐5) 4.2(2.4‐11.2) 0.004

INR 1.5(1.3‐1.6) 1.5(1.3‐1.9) 1.9(1.5‐2.2) <0.001

Serumsodium(mEq/L) 137(134‐140) 135(132‐139) 131(127‐135) <0.001

Plateletcount(×109/L) 85(56‐140) 77(49‐110) 76(50‐103) 0.441

Meanarterialpressure(mmHg) 82(76‐92) 77(69‐87) 74(68‐84) 0.010

MELDscore 14(12‐18) 19(15‐24) 28(23‐34) <0.001

Child‐Pughscore 8(6‐9) 8(7‐10) 11(9‐12) <0.001

ACLF

Frequency 0 27(43) 49(84) <0.001

Grade1vs2/3 – 21/6 26/23 <0.001

INR,Internationalnormalizedratio;MELD,modelforend‐stageliverdisease.Valuesarenumberandpercentages(inbrackets)ormedianandinterquartilerange(inbrackets).

Page 50: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

     |  5SOLÉ et aL.

patientshadpersistentAKI.PatientswithpersistentAKIhadsignifi‐cantlyhigherbaseline leucocytecountandCRPlevelsandplasmaIL‐6andVCAM‐1compared to thoseofpatientswithAKI resolu‐tion. InthegroupofpatientswithHRS‐AKI,thosewithpersistentAKI(27patients,47%)showedsignificantlyhigherleucocytecountandplasmalevelsofIP‐10andVCAM‐1comparedtothosewhohadresolutionofHRS‐AKI(31patients,53%),yetdifferencesoftheselattertwocytokineswerebarelysignificant(Table6).

At the end of the 3‐month follow‐up period, 110 patients(69%)werealive,34(21%)haddied,and15(9%)hadbeentrans‐plantedand2were lost tofollow‐up. Interestingly,anumberofinflammatoryparametersandcytokinescorrelatedwith3‐monthmortality: leucocyte count, CRP levels and plasma IL‐6, IL‐8,TNF‐α, ICAM‐1 andVCAM‐1. Inmultivariate analysis, includingthoseinflammatoryvariablesthatwereassociatedwithmortalityintheunivariateanalysis,onlyplasmaVCAM‐1wasanindepen‐dentpredictivefactorof3‐monthmortality.PlasmaVCAM‐1wasalso the only inflammatory marker independently predictive of3‐monthmortality inthegroupofpatientswithHRS‐AKI (3156(2029‐4349)vs1944 (1535‐2829)ng/mL, forpatientswhodiedandsurvivedat3months,respectively;P<0.01),evenwhenad‐justedforthepresenceandseverityofACLF.Survivalprobabilityin patientswithHRS‐AKI according toVCAM‐1 levels is shownin Figure 1.

3.4 | Comparison of cytokine profile in HRS‐AKI with other chronic conditions using with systems biology approach

We used a systems biology approach based on artificial neuralnetworks that measures the strength of relationships betweengroups of human proteins in order to compare the extent of sys‐temic inflammationinHRS‐AKIwiththatofotherconditionschar‐acterizedbywell‐definedandmarkedsystemicinflammatorystatus.Interestingly,thecytokinepatternofHRS‐AKIwasrelatedtothatofanumberofinflammatoryconditions,includingcysticfibrosis,rheu‐matoidarthritis,systemiclupuserythematosus,Crohn'sdiseaseandulcerativecolitis(predictivevalue>70)(Figure2).

4  | DISCUSSION

TheresultsofthecurrentstudyshowthatpatientswithHRS‐AKIhave marked systemic inflammation with altered cytokine pro‐file compared to that of patients with decompensated cirrhosiswithoutAKIand,most interestingly, topatientswithAKIduetohypovolaemia. The systemic inflammatory response in HRS‐AKIdoesnot seem tobe related topresenceofbacterial infections,concomitantACLF or intensity of kidney dysfunction and is not

TA B L E 2  Comparisonofsystemicinflammatorymarkersandplasmaandurinecytokinelevelsbetweenthe3groupsofpatients

No AKI (N = 44)Hypovolaemia‐induced AKI (N = 63) HRS‐AKI (N = 58) P value

C‐reactiveprotein(mg/dL) 1.6(0.5‐3.9) 1.0(0.4‐2.2) 3(1.7‐6.1) <0.001

Leucocytecount(×109/L) 5(4‐7) 5(4‐8) 7(4‐11) 0.046

SIRS 7(16) 10(16) 17(33) 0.053

Plasma cytokines

IL‐6(pg/mL) 14(3‐46) 14(3‐46) 45(19‐104) <0.001

TNF‐α(pg/mL) 22(17‐39) 30(19‐50) 47(35‐61) <0.001

Fractalkine(pg/m) 111(19‐559) 363(88‐21924) 111(29‐377) 0.004

MIP1‐α(pg/mL) 2048(12‐3970) 41(13‐3970) 14(6‐52) 0.005

VCAM‐1(ng/mL) 1816(1249‐2662) 2184(1659‐2866) 2410(1850‐3731) 0.006

IL‐8(pg/mL) 25(12‐75) 45(18‐90) 56(37‐92) 0.009

VEGF(pg/mL) 453(75‐19,715) 179(104‐1681) 166(71‐539) 0.088

G‐CSF(pg/mL) 30(3‐82) 14(3‐41) 30(6‐58) 0.132

MCP‐1(pg/mL) 269(175‐376) 284(214‐444) 340(212‐472) 0.370

RANTES(pg/mL) 7458(1937‐23,962) 4515(2040‐17,985) 4399(1293‐20,774) 0.449

INF‐γ(pg/mL) 29(5‐88) 37(14‐129) 35(13‐122) 0.454

IP‐10(pg/mL) 961(592‐1671) 1000(594‐2067) 1206(690‐2014) 0.556

ICAM‐1(ng/mL) 269(215‐500) 279(215‐377) 306(234‐443) 0.596

Eotaxin(pg/mL) 115(78‐157) 101(68‐161) 109(84‐143) 0.772

MIP1‐β(pg/mL) 40(15‐91) 30(21‐72) 36(23‐80) 0.779

Urinary cytokines

uMCP‐1(pg/mL) 408(207‐1257) 443(193‐1340) 1292(689‐3356) <0.001

SIRS;Systemicinflammatoryresponse.Valuesarenumberandpercentages(inbrackets)ormedianandinterquartilerange(inbrackets).

Page 51: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

6  |     SOLÉ et aL.

normalized by improvement of kidney function with pharmaco‐logical therapy. Interestingly, the intensity of the inflammatoryresponseiscorrelatedwithkidneyandpatientoutcomesinsuchawaythatincreasedlevelsofsomeinflammatorymarkers,particu‐larlyVCAM‐1, are associatedwith lack of resolution ofAKI andmortality.

In the current study, a large number of consecutive patientswithcirrhosisandHRS‐AKIwereinvestigatedforthepresenceofsystemic inflammatory response as assessed by a large numberof inflammatoryandanti‐inflammatorycytokinesusingmultiplextechnology.Acontrolgroupofpatientswithdecompensatedcir‐rhosiswithoutAKIwas included forcomparison.Agroupofpa‐tientswithdecompensatedcirrhosiswithAKIduetohypovolaemia

wasalsostudied.ThistypeofAKIwasselectedascomparatorforHRS‐AKIbecauseinbothconditionsAKIisofprerenalorigin,yetthe underlying pathogenic cause is very different.While a con‐tractedbloodvolume is thecauseof renalhypoperfusion in theformer,the impairmentofkidneyfunctioninthe latter isrelatedtooppositecirculatoryfeatures,namelymarkedlydilatedvascularbed,particularlyinthesplanchniccirculation.2‐4Theresultsofthecurrentstudyclearlyshowthatasdecompensatedcirrhosispro‐gressestowardsHRS‐AKI,thereisprogressiveincreaseininflam‐matorystatuswithsignificantlyincreasedlevelsofsomepowerfulinflammatorycytokines.Previousstudieshaveshownthatplasmalevels of inflammatory cytokines are significantly increased indecompensated compared to compensated cirrhosis, suggesting

TA B L E 3  Systemicinflammatorymarkersandplasmaandurinecytokinelevelsinpatientswithtype1HRS‐AKIbeforeandaftereffectivetreatmentwithterlipressinandalbumin

Baseline (N = 24)Terlipressin and Albumin (N = 24) P value

Serumcreatinine (mg/dL)

2.9(2.6‐3.6) 1.3(1.2‐1.5) <0.001

C‐reactiveprotein(mg/dL)

4.9(2.5‐6.7) 1.3(1.2‐1.5) 0.008

Leucocyte count(×109/L)

7(2.9‐11) 5(3‐9) 0.246

Plasma cytokines

Eotaxin(pg/mL) 104(78‐130) 115(85‐144) 0.909

G‐CSF(pg/mL) 31(9‐68) 18(3‐41) 0.259

Fractalkine(pg/mL)

140(13‐679) 79(13‐835) 0.475

INF‐γ(pg/mL) 73(25‐165) 39(18‐111) 0.230

IL‐6(pg/mL) 73(16‐95) 32(7‐58) 0.128

IL‐8(pg/mL) 62(38‐78) 54(38‐94) 0.648

IP‐10(pg/mL) 1457(563‐2067) 884(519‐1258) 0.116

MCP‐1(pg/mL) 337(189‐401) 283(222‐384) 0.753

MIP1‐α(pg/mL) 10(6‐47) 46(9‐3970) 0.030

MIP1‐β(pg/mL) 50(18‐93) 31(14‐52) 0.073

TNF‐α(pg/mL) 48(33‐67) 30(22‐52) 0.007

VEGF(pg/mL) 181(87‐485) 163(58‐961) 0.223

ICAM‐1(ng/mL) 296(227‐403) 326(219‐370) 0.775

VCAM‐1(ng/mL)

2054(1748‐3009)

2162 (1604‐2598)

0.278

RANTES(pg/mL)

3897(1321‐13453)

2158(974‐5004) 0.013

Urinary cytokines

uMCP‐1(pg/mL)

3293(1113‐5204)

2193(1218‐4657)

0.193

Valuesarenumberandpercentages (inbrackets)ormedianand inter‐quartilerange(inbrackets).

TA B L E 4  ComparisonofsystemicinflammatorymarkersandplasmaandurinecytokinelevelsinpatientswithHRS‐AKIcategorizedaccordingtothepresenceofACLF

HRS‐AKI without ACLF (N = 9)

HRS‐AKI with ACLF (N = 49)

P value

C‐reactiveprotein(mg/dL)

3(2‐4) 3(2‐6) 0.552

Leucocyte count(×109/L)

7(5‐9) 7(4‐11) 0.991

SIRS 3(33) 14(33) 1.000

Plasma cytokines

Eotaxin(pg/mL) 114(85‐269) 108(82‐134) 0.439

G‐CSF(pg/mL) 30(4‐102) 30(8‐56) 0.880

Fractalkine(pg/L)

133(44‐662) 106(24‐307) 0.805

INF‐γ(pg/mL) 97(22‐302) 31(12‐94) 0.179

IL‐6(pg/mL) 21(19‐76) 47(18‐137) 0.629

IL‐8(pg/mL) 46(35‐83) 60(37‐99) 0.599

IP‐10(pg/mL) 1096(816‐2933) 1232(671‐1957) 0.660

MCP‐1(pg/mL) 265(148‐656) 344(216‐463) 0.755

MIP1‐α(pg/mL) 41(12‐2011) 13(5‐52) 0.218

MIP1‐β(pg/mL) 30(20‐87) 39(24‐75) 0.540

TNF‐α(pg/mL) 51(38‐53) 46(33‐62) 0.755

VEGF(pg/mL) 146(79‐10,184) 168(64‐394) 0.547

ICAM‐1(ng/mL) 285(217‐449) 314(239‐439) 0.739

VCAM‐1(ng/mL)

2242(1559‐3132) 2459(1825‐3895)

0.512

RANTES(pg/mL)

5706(2949‐69,961)

3369(1241‐17,941)

0.084

Urinary cytokines

uMCP‐1(pg/mL)

736(647‐1364) 1382(810‐3543) 0.213

SIRS;systemicinflammatoryresponse.Valuesarenumberandpercentages (inbrackets)ormedianand inter‐quartilerange(inbrackets).

Page 52: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

     |  7SOLÉ et aL.

the existence of an inflammatory driving force that occurswiththe progression of the disease.8,9 Whether this inflammatorydrivingforceiscauseorconsequenceofprogressionofliverdis‐easeisnotknown.Ourdataconfirmthatthisinflammatorystatusacrossdecompensated cirrhosis increases evenmore as thedis‐easeprogressestowardsHRS‐AKIwhichisconsideredoneofthelatest stages of cirrhosis, given its highmortality rate.Our datathereforeareinagreementwiththerecentlyproposedtheoryof

systemic inflammation driving the complications of cirrhosis.15 Further support to this theory comes fromour systems biologyanalysesshowingthatsystemicinflammationincirrhosisissimilartothatfoundinsomekeychronic inflammatoryconditions,suchasinflammatoryboweldiseases,rheumatoidarthritisorsystemiclupuserythematosus.

Onerelevantissueofthecurrentstudyiswhethertheincreasedinflammatorystateobserved inpatientswithHRS‐AKIwasdueto‘hepatorenalsyndrome’itselforthepresenceofconcomitantACLF,sinceithasbeenshownthatthelatterconditionischaracterizedbyamarkedsystemicinflammation.13,14Twolinesofevidencesuggest

TA B L E 5  ComparisonofsystemicinflammatorymarkersandplasmaandurinecytokinelevelsinpatientswithHRS‐AKIassociatedwithACLFclassifiedaccordingtoACLFseverity

ACLF 1 (N = 26)ACLF 2 and 3 (N = 23)

P value

C‐reactiveprotein(mg/dL)

3(1‐6) 3(2‐6) 0.855

Leucocyte count (×109/L)

6(3‐11) 7(4‐12) 0.400

SIRS 7(32) 7(33) 0.993

Plasma cytokines

Eotaxin(pg/mL)

101(79‐127) 118(100‐161) 0.123

G‐CSF(pg/mL)

39(12‐75) 21(6‐43) 0.212

Fractalkine(pg/L)

90(3‐428) 155(29‐280) 0.595

INF‐γ(pg/mL) 35(14‐94) 19(11‐124) 0.582

IL‐6(pg/mL) 45(12‐80) 56(21‐255) 0.207

IL‐8(pg/mL) 44(27‐69) 91(43‐202) 0.006

IP‐10(pg/mL) 898(634‐1941) 1267(778‐2162) 0.417

MCP‐1(pg/mL)

337(198‐397) 411(234‐712) 0.089

MIP1‐α(pg/mL)

10(6‐29) 25(3‐3970) 0.701

MIP1‐β(pg/mL)

37(23‐65) 42(28‐84) 0.548

TNF‐α(pg/mL) 46(31‐61) 49(34‐63) 0.749

VEGF(pg/mL) 169(69‐323) 144(44‐1675) 0.936

ICAM‐1(ng/mL)

273(221‐344) 411(251‐536) 0.019

VCAM‐1(ng/mL)

2050(1750‐3279) 3040(2120‐4044)

0.200

RANTES(pg/mL)

3835(1256‐26,358)

3369(890‐16,162)

0.417

Urinary cytokines

uMCP‐1(pg/mL)

1624(824‐4849) 1250(752‐2879) 0.274

SIRS;systemicinflammatoryresponse.Valuesarenumberandpercentages (inbrackets)ormedianand inter‐quartilerange(inbrackets).

TA B L E 6  ComparisonofsystemicinflammatorymarkersandplasmaandurinecytokinelevelsinpatientswithHRS‐AKIcalculatedaccordingtooutcomeofAKI

AKI resolution (N = 31)

AKI persistent (N = 27)

P value

3.9(2.6‐5.8) 2.2(1.7‐6.4) 0.358

Leucocyte count (×109/L)

5.6(3.0‐9.2) 7.8(6.4‐11.6) 0.016

SIRS 11(41) 6(24) 0.199

Plasma cytokines

Eotaxin(pg/mL)

103(79‐138) 110(96‐156) 0.761

G‐CSF(pg/mL) 27(4‐57) 39(6‐60) 0.742

Fractalkine(pg/mL)

117(28‐4022) 97(29‐223) 0.382

INF‐γ(pg/mL) 38(13‐122) 32(11‐124) 0.483

IL‐6(pg/mL) 41(17‐96) 57(21‐145) 0.459

IL‐8(pg/mL) 60(41‐80) 53(36‐152) 0.714

IP‐10(pg/mL) 915(538‐1875) 1267(807‐2564) 0.045

MCP‐1(pg/mL) 330(160‐402) 396(215‐550) 0.293

MIP1‐α(pg/mL)

14(8‐49) 18(5‐3970) 0.784

MIP1‐β(pg/mL)

33(20‐71) 43(25‐84) 0.370

TNF‐α(pg/mL) 47(32‐62) 46(35‐59) 0.726

VEGF(pg/mL) 172(67‐1311) 157(75‐291) 0.606

ICAM‐1(ng/mL)

278(228‐367) 345(236‐508) 0.129

VCAM‐1(ng/mL)

2132(1747‐2871) 3139(2005‐4266)

0.044

RANTES(pg/mL)

4668(2071‐16,146)

3369(1101‐26,588)

0.533

Urinary cytokines

uMCP‐1(pg/mL)

1148(716‐5069) 1164(661‐2007) 0.123

SIRS;systemicinflammatoryresponse.Valuesarenumberandpercentages (inbrackets)ormedianand inter‐quartilerange(inbrackets).

Page 53: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

8  |     SOLÉ et aL.

thattheincreasedinflammatorystateisnotrelatedtoACLF.Firstly,patientswithHRS‐AKIbutwithoutALCFhadplasmacytokinelev‐elsthatwerenotsignificantlydifferentfromthosefoundinpatientswith HRS‐AKI with ACLF.Moreover, cytokine levels were largelyunrelatedtoACLFgrade.Ontheotherhand,cytokineprofileofpa‐tientswithHRS‐AKIwasnoticeablydifferentfromthatofpatientswithACLF associatedwith hypovolaemia‐inducedAKI, suggestingthatcytokineprofilewasmostlyrelatedto‘hepatorenalsyndrome’andnottoACLF.Nevertheless,thesefindingsshouldbetakenwithcautionbecauseof the relatively lownumberofpatients included

whichpreventedperformingapropensityscorematchinganalysis.Furtherstudiesareneededtotrytodissectoutwhethersystemicinflammation is due to hepatorenal syndrome ‘per se’ or toACLF,orboth.

A final issue thatdeservesdiscussion is thatpatients inwhomHRS‐AKIpersistedshowedhigherlevelsofsomeinflammatorymark‐ers,themostimportantofwhichappearstobeVCAM‐1.Moreover,VCAM‐1wasalsoanindependentpredictivefactorofsurvivalinthewholeseriesofpatients.VCAM‐1isaninflammatorymediatorthatplaysacentralroleintriggeringtheprocessofsystemicinflamma‐tion in responsetoseveral stimulibyhelping recruit inflammatorycellsoutsideofthesystemiccirculation.21Fewpreviousstudieshaveshown thepotential relevanceofVCAM‐1asprognostic indicatorofpatientswithcirrhosis.22Ourresultsextendtheseobservationsby showing that among a large number of inflammatorymarkers,VCAM‐1 plasma levels are associated with lack of resolution ofHRS‐AKIandpoorsurvival.Theseresultstogetherwithfindingsofasimilarinflammatoryprofilecomparedtothatofsomeinflammatorydiseasesshed lightonthepotential roleofVCAM‐1andTNF‐α as therapeutictargetsinpatientswithadvancedcirrhosis.23

Thecurrentstudyhassomelimitationsthatshouldbeacknowl‐edged.Firstly,somecytokines,suchasIL‐10andIL‐1RA,wereout‐sideoftherangedetectionlimitestablishedforthemultiplexassayandcouldnotbeevaluated.Themultiplexmethodologyallowsthemeasurementofcytokinesinlittlevolumeandinthesamesamplewell.Toachieve thismultiplexing, thequantificationofanalytes isperformedwithserialdilutionsofacommoncalibrator.Therefore,the individualadjustmentofthedetectionlimitforeachanalyte isnotpossiblewiththeconsequentlostofquantificationinthecaseofsomecytokinesincludedinthemultiplexing.Thisproblemcouldbesolvedbyperforminghighsensitivityimmunoanalyticalmethodsforsingleanalytes,butduetolimitationsintheavailablesamplevolume,

F I G U R E 1  Probabilityof3‐monthsurvivalinpatientswithHRS‐AKIcategorizedaccordingtomedianlevelsofVCAM‐1

VCAM-1< 2372 ng/ml

VCAM-1 ≥ 2372 ng/ml ------

p = 0.023

Days

Surv

ival

F I G U R E 2  Relationshipbetweensystemicinflammatorypatterninpatientsincludedinthisstudyanddifferentpathologicalconditionsbasedonanetworkanalysis.Linkwidthanddistancetothecentralpointisproportionaltothepredictivescoreofthenetworkanalysisthatquantifiesthenetworkrelationshipsbetweentheevaluatedproteins.OnlymedicallyrelevantconditionswithapredictivescorecorrespondingtoP≤0.1aredisplayed.ConditionsasdefinedinBED(BiologicalEffectorsDatabase,AnaxomicsBiotech)

Page 54: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

     |  9SOLÉ et aL.

thisalternativestrategywasnotpossible.Secondly,giventherela‐tivesmallsizesofourstudypopulationsandtheexploratorynatureofthisstudy,wedecidednottoimplementmultiplicityadjustmentstrategies.ThisstudywillrequirefuturereplicationandthefindingsingeneralandtheP valuesinparticularshouldbeinterpretedwithcaution.Thirdly,although thenumberofpatientsstudiedmayap‐pearrelativelylow,itisaquitelargesampleofpatientsconsideringthedifficultytoperformclinicalstudiesindecompensatedcirrhosisand the sample sizeofpreviouspathogenic and therapeutic stud‐ies inpatientswithHRS‐AKI.Finally, levelsofcytokines inplasmamaynotreflecttheactualconcentrationsofthesamecytokinesintissues.However,thisisalimitationthatcanbarelybeaddressedinhumanstudies.

In conclusion, patientswithHRS‐AKI havemarked increase insystemicinflammatoryprofilecomparedtothatofpatientswithoutAKIandhypovolaemia‐inducedAKI,whichappearstobeindepen‐dentofassociatedACLF,andsimilartoinflammationobservedinkeysystemicinflammatorydiseases,suchaslupuserythematosusorin‐flammatoryboweldisease.Interestingly, inpatientswithHRS‐AKI,lackofAKIresolutionandsurvival is linkedtosomespecificcyto‐kines,particularly,VCAM‐1.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thankNicki VanBerckel for the administrative support.Wealso thank the faculty andnursesof the LiverUnit, and thepa‐tients who participated in this study and their families.We areindebtedtotheBiobankcorefacilityoftheIDIBAPSforthetech‐nicalhelpprovided.

CONFLICT OF INTEREST

PG reports Investigator Research grant andAdvisory BoardworkfromGrifols,InvestigatorResearchgrantandAdvisoryBoardfromGilead, Investigator Research grant from Mallinckrodt, AdvisoryBoardforPromethera,AdvisoryBoardforMartin‐Pharmaceuticals,grants from Ferring‐Pharmaceuticals, grants and Advisory BoardWorkfromSequana,outsidethesubmittedwork.Nootherauthorshaveanydeclaredinterests.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Theauthorshaveallcontributedtothismanuscriptandapprovetheversionofthissubmission.CScontributedtotheconceptionandde‐signofthisstudy,acquisitionofdata,theanalysisandinterpretationof the data and drafting themanuscript; PH,MC, RM,UC, JMM,IG,EP,LN,GDP,AJ,NF,MMR,JF,WJ,participatedintheanalysesoftheresults, interpretationofdata,and/orcriticalrevisionofthemanuscript.FTcontributedtostatisticalanalysisandinterpretationofdata.PGandESparticipatedinthisstudyconcept,interpretationof thedata,drafting themanuscript,critical revisionof themanu‐scriptforimportantintellectualcontent,obtainedfundingandstudysupervision.

ORCID

Cristina Solé https://orcid.org/0000‐0002‐6104‐8345

Unai Cereijo https://orcid.org/0000‐0003‐1557‐8836

Pere Ginès https://orcid.org/0000‐0003‐4657‐4504

REFERENCES

1. Angeli P, Ginès P, Wong F, et al. Diagnosis and management ofacute kidney injury in patients with cirrhosis: revised consensusrecommendations of the International Club of Ascites. J Hepatol. 2015;62(4):968‐974.https://doi.org/10.1016/j.jhep.2014.12.029.

2. Ginès P, Schrier RW. Renal failure in cirrhosis. N Engl J Med. 2009;361(13):1279‐1290. https://doi.org/10.1056/NEJMra0809139.

3. Angeli P, Bernardi M, Villanueva C, et al. EASL Clinical PracticeGuidelines for themanagement of patientswith decompensatedcirrhosis.J Hepatol.2018;69(2):406‐460.https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.03.024.

4. Ginès P, Solà E, Angeli P, Wong F, Nadim MK, Kamath PS.Hepatorenalsyndrome.Nat Rev Dis Prim.2018;4(1):23.https://doi.org/10.1038/s41572‐018‐0022‐7.

5. MartinPY,GinèsP,SchrierRW.Nitricoxideasamediatorofhemo‐dynamicabnormalitiesandsodiumandwater retention incirrho‐sis. N Engl J Med. 1998;339(8):533‐541. https://doi.org/10.1056/NEJM199808203390807.

6. Martín‐LlahíM,PépinM‐N,GuevaraM,etal.Terlipressinandalbu‐minvsalbumininpatientswithcirrhosisandhepatorenalsyndrome:a randomized study. Gastroenterology. 2008;134(5):1352‐1359.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2008.02.024.

7. SanyalAJ, Boyer T,Garcia‐TsaoG, et al. A randomized, prospec‐tive,double‐blind,placebo‐controlledtrialofterlipressinfortype1hepatorenal syndrome.Gastroenterology. 2008;134(5):1360‐1368.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2008.02.014.

8. Giron‐Gonzalez JA,Martinez‐SierraC, Rodriguez‐RamosC, et al.Implication of inflammation‐related cytokines in the natural his‐tory of liver cirrhosis. Liver Int. 2004;24(5):437‐445. https://doi.org/10.1111/j.1478‐3231.2004.0951.x.

9. Albillos A, Lario M, Álvarez‐Mon M. Cirrhosis‐associated im‐mune dysfunction: distinctive features and clinical relevance.J Hepatol. 2014;61(6):1385‐1396. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2014.08.010.

10. Cervoni J‐P, Thévenot T, Weil D, et al. C‐Reactive proteinpredicts short‐term mortality in patients with cirrhosis. J Hepatol. 2012;56(6):1299‐1304. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2011.12.030.

11. ThabutD,MassardJ,GangloffA,etal.Model forend‐stage liverdisease score and systemic inflammatory response are majorprognostic factors inpatientswith cirrhosis and acute functionalrenal failure. Hepatology. 2007;46(6):1872‐1882. https://doi.org/10.1002/hep.21920.

12. MuñozL,AlbillosA,NietoM,etal.MesentericTh1polarizationandmonocyteTNF‐αproduction:firststepstosystemicinflammationin ratswithcirrhosis.Hepatology.2005;42(2):411‐419.https://doi.org/10.1002/hep.20799.

13. ClàriaJ,StauberRE,CoenraadMJ,etal.Systemicinflammationindecompensated cirrhosis: characterization and role in acute‐on‐chronicliverfailure.Hepatology.2016;64(4):1249‐1264.https://doi.org/10.1002/hep.28740.

14. SoléC, SolàE,Morales‐RuizM,et al.Characterizationof inflam‐matoryresponseinacute‐on‐chronic liverfailureandrelationshipwithprognosis.Sci Rep.2016;6(1):32341.https://doi.org/10.1038/srep32341.

Page 55: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

10  |     SOLÉ et aL.

15. BernardiM,MoreauR,AngeliP,SchnablB,ArroyoV.Mechanismsof decompensation and organ failure in cirrhosis: from periph‐eral arterial vasodilation to systemic inflammation hypothesis.J Hepatol. 2015;63(5):1272‐1284. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2015.07.004.

16. ArroyoV,GinèsP,GerbesAL,etal.Definitionanddiagnosticcri‐teria of refractory ascites and hepatorenal syndrome in cirrho‐sis. Hepatology. 1996;23(1):164‐176. https://doi.org/10.1002/hep.510230122.

17. MoreauR,JalanR,GinesP,etal.Acute‐on‐chronic liverfailure isa distinct syndrome that develops in patientswith acutedecom‐pensation of cirrhosis. Gastroenterology. 2013;144(7):1426‐1437.https://doi.org/10.1053/j.gastro.2013.02.042.

18. Fagundes C, Pépin M‐N, Guevara M, et al. Urinary neutro‐phil gelatinase‐associated lipocalin as biomarker in thedifferential diagnosis of impairment of kidney function in cir‐rhosis.J Hepatol.2012;57(2):267‐273.https://doi.org/10.1016/j.jhep.2012.03.015.

19. Guillén‐GómezE,Bardají‐de‐QuixanoB,FerrerS,etal.Urinarypro‐teomeanalysisidentifiedneprilysinandVCAMasproteinsinvolvedin diabetic nephropathy. J Diabetes Res. 2018;2018:1‐12. https://doi.org/10.1155/2018/6165303.

20. Iborra‐EgeaO,Gálvez‐MontónC,RouraS,etal.Mechanismsofac‐tionofsacubitril/valsartanoncardiacremodeling:asystemsbiologyapproach.NPJ Syst Biol Appl. 2017;3:12. https://doi.org/10.1038/s41540‐017‐0013‐4.

21. Vestweber D. How leukocytes cross the vascular endothelium.Nat Rev Immunol. 2015;15(11):692‐704. https://doi.org/10.1038/nri3908.

22. LoIaconoO,RincónD,HernandoA,etal.Serumlevelsofsolublevascularcelladhesionmoleculearerelatedtohyperdynamiccircula‐tioninpatientswithlivercirrhosis.Liver Int.2008;28(8):1129‐1135.https://doi.org/10.1111/j.1478‐3231.2008.01763.x.

23. Vaglio A, Grayson PC, Fenaroli P, et al. Drug‐induced lupus: tra‐ditional and new concepts. Autoimmun Rev. 2018;17(9):912‐918.https://doi.org/10.1016/j.autrev.2018.03.016.

SUPPORTING INFORMATION

Additional supporting information may be found online in theSupportingInformationsectionattheendofthearticle.

How to cite this article:SoléC,SolàE,HuelinP,etal.Characterizationofinflammatoryresponseinhepatorenalsyndrome:Relationshipwithkidneyoutcomeandsurvival.Liver Int. 2019;00:1–10. https://doi.org/10.1111/liv.14037

Page 56: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

56

5. DISCUSSIÓ

Page 57: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

57

5. DISCUSSIÓ

L’objectiu general d’aquesta Tesi Doctoral és aprofundir el coneixement de la

inflamació sistèmica, mitjançant la determinació de múltiples marcadors

inflamatoris plasmàtics, en els pacients amb cirrosi descompensada en estadis

evolucionats de la malaltia. Per una banda, en pacients amb acute-on-chronic

liver failure (ACLF), i per l’altra, en pacients amb síndrome hepatorenal (SHR).

Estudi 1: Characterization of inflammatory response in acute-on-chronic liver failure and relationship with prognosis.

Aquest estudi s’ha dissenyat per tal d’investigar exhaustivament la resposta

inflamatòria en diferents fases de la malaltia, i especialment en l’acute-on-

chronic liver failure (ACLF). Els resultats de l’estudi indiquen que els pacients

amb ACLF presenten una alteració en el perfil de mediadors inflamatoris

plasmàtics, amb predomini d’elevació de marcadors proinflamatoris, que és

més intensa que la que s’observa en pacients amb cirrosi descompensada.

Aquesta inflamació està relacionada amb la quimiotaxi i migració leucocitària,

particularment dels monòcits i macròfags. I a més, està associada amb el

pronòstic dels pacients.

En els últims anys, existeix una evidència creixent que la inflamació està

implicada en la fisiopatologia i en la progressió de la cirrosi13. La fisiopatologia

de l’ACLF, que és una síndrome freqüent i amb una elevada mortalitat, no està

clara, però hi ha dades que suggereixen que la inflamació està present en

aquesta síndrome i hi podria tenir un paper. S’ha observat que els pacients

amb ACLF presenten un augment de la xifra de leucòcits i de PCR que

augmenta paral·lelament amb la gravetat de la síndrome8. No obstant, hi ha

poca informació sobre la resposta inflamatòria a l’ACLF. Per una banda, en un

estudi previ es va observar un augment dels nivells de IL-6 i IL-10 en pacients

amb ACLF en comparació amb pacients amb cirrosi estable, però aquest estudi

utilitzava uns criteris d’ACLF diferents dels acceptats actualment27. Per altra

banda, en els estudis de Bernsmeier et al. i de Mehta et al. es va observar que

els pacients amb ACLF presentaven nivells de IL-6, TNF-α, IL-10 i IL-8 més

elevats que els pacients amb cirrosi sense ACLF, suggerint una alteració del

Page 58: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

58

perfil de citocines en els pacients amb ACLF30,31. Així doncs, el nostre estudi

amplia de forma significativa el coneixement de la inflamació en els pacients

amb ACLF, mitjançant la determinació de múltiples marcadors inflamatoris

(citocines, quimiocines, factors de creixement i molècules d’adhesió) amb un

sistema múltiplex. Els resultats de l’estudi tant per anàlisi de components

principals (PCA) com per mètodes estadístics estàndards indiquen que els

pacients amb cirrosi descompensada sense ACLF presenten un alteració del

perfil de citocines, en comparació als individus sans, essent aquesta alteració

molt més intensa en els pacients amb ACLF. Un estudi recent publicat

paral·lelament al nostre, que avalua també la inflamació en el pacients amb

cirrosi mitjançant un sistema múltiplex en diferents estadis de la malaltia,

observa de la mateix forma, que la cirrosi descompensada s’associa a un

augment de la inflamació sistèmica i que aquesta encara és més marcada en

els pacients amb ACLF73. Ambdós estudis confirmen doncs, que la cirrosi

descompensada i especialment l’ACLF, ocorren en el context d’una resposta

inflamatòria sistèmica. Una observació interessant del nostre estudi és que

l’alteració del perfil de citocines no sembla exclusivament causada per la

presència concomitant d’infeccions bacterianes, ja que l’alteració observada es

manté quan es comparen els pacients amb ACLF amb pacients amb infecció

però sense ACLF.

Un aspecte important de l’estudi és que alguns dels marcadors inflamatoris que

estan significativament alterats en els pacients amb ACLF presenten correlació

amb la supervivència. Per una banda, els nivells elevats de vascular cell

adhesion molecule 1 (VCAM-1) i de intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)

estan associats a una pitjor supervivència. Aquestes són molècules

expressades a les cèl·lules endotelials i participen en l’adhesió, rotació i

finalment en la transmigració de leucòcits, pel que tenen un paper en les fases

inicials de la inflamació i en la quimiotaxi de leucòcits67. Amb concordança en

estudis previs en pacients amb sèpsia, els nivells de VCAM-1 i ICAM-1 es

correlacionaven amb la gravetat de la sèpsia i amb el pronòstic74. Altrament, els

nivells elevats de ICAM-1 i de VCAM-1 s’han observat en pacients amb cirrosi

descompensada i es correlacionen amb la gravetat de la malaltia i el pronòstic

d’aquests pacients68,69.

Page 59: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

59

Per altra banda, en els nostre estudi, els pacients amb ACLF presenten nivells

disminuïts de granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF) i els

nivells baixos de GM-CSF es correlacionen amb la mortalitat. El GM-CSF és un

factor de creixement hematopoètic que mobilitza les cèl·lules immunes des del

moll de l’os i augmenta l’activitat de diferents leucòcits, incloent monòcits75.

Fins aquest moment no hi havia estudis publicats en relació als nivells de GM-

CSF i la seva relació amb el pronòstic en pacients amb cirrosi i amb ACLF. De

forma interessant i en la mateixa direcció que el nostre estudi, s’ha observat en

pacients amb fracàs hepàtic agut que nivells reduïts de macrophage-colony

stimulating factor (M-CSF), un factor estimulant de monòcits exclusivament,

s’associen a una major mortalitat. En el mateix estudi però amb models

experimentals, l’administració del factor, induïa una infiltració i proliferació de

macròfags al fetge, promovent una regeneració i milloria de les funcions

hepàtiques76. També en la mateix línia, s’ha descrit que l’administració de

granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) en pacients amb ACLF, millora la

supervivència i disminueix l’aparició de complicacions53.

Així doncs, en el nostre estudi s’observa un augment de la inflamació sistèmica

amb elevació de marcadors proinflamatoris, però alhora també es troben

disminuïdes algunes molècules inflamatòries, com GM-CSF, indicant cert grau

d’immunosupressió, fet que s’ha proposat en els pacients amb fases

evolucionades de la cirrosi i en l’ACLF16. Els resultats doncs estan en

concordança amb l’estudi de Wasmuth et al. que va observar que els pacients

amb ACLF i amb sèpsia presentaven una disminució de producció ex-vivo de

citocines després de l’estimulació amb lipopolisacàrid (LPS) i una disminució de

l’expressió de HLA-DR dels monòcits en comparació a pacients amb cirrosi

estable27. Tanmateix, s’ha demostrat que els pacients amb ACLF presenten un

augment del número de monòcits/macròfags circulants que expressen MERTK

en comparació a pacients amb cirrosi sense ACLF i amb individus sans. Els

monòcits que expressen MERTK presenten una menor capacitat per produir

citocines amb l’estimulació de LPS ex-vivo, fet que podria estar implicat en la

progressió de l’ACLF i en les complicacions infeccioses30.

Page 60: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

60

Un punt interessant de l’estudi, ja que no s’havia analitzat mai prèviament, és la

realització d’un anàlisis d’enriquiment funcional mitjançant l’IPA® (Ingenuity

Pathway Analysis). Els resultats de l’estudi indiquen que les citocines alterades

en els pacients amb ACLF estan relacionades funcionalment amb la quimiotaxi

i migració dels leucòcits, particularment de monòcits i macròfags. Aquesta

troballa va en la mateixa direcció que la informació d’estudis previs en els que

els pacients amb ACLF presentaven una alteració de la funció dels

monòcits27,30. Així, els estudis realitzats fins l’actualitat suggereixen un rol

important dels monòcits i macròfags en la patogènesi de l’ACLF. S’ha de tenir

en compte però, que aquests inclouen un nombre limitat de pacients, pel que

caldran nous estudis per establir la causa de la disfunció macrofàgica i la utilitat

dels factors estimulants de colònies en els tractament de l’ACLF o de la cirrosi

descompensada.

El disseny de l’estudi té certes limitacions que cal considerar. En primer lloc, la

mostra és relativament petita, però els dos grups de pacients són clarament

diferents, fet que fa que la comparació sigui acurada evitant superposicions i a

més la mostra de pacients amb ACLF presenta les mateixes característiques

que les de la sèrie de pacients de l’estudi CANONIC, tant per la freqüència dels

graus d’ACLF (50%, 31% i 19% de pacients amb grau I, II, i III en el nostre

estudi vs 49%, 36%, i 16%, respectivament, a l’estudi CANONIC) com per la

mortalitat (a 28-dies i 90-dies de 27% i 46% en el nostre estudi vs 34% i 51%,

respectivament, a l’estudi CANONIC). En segon lloc, malauradament només

disposem d’una determinació de citocines, doncs els mediadors inflamatoris

només es van determinar a la inclusió, i no disposem d’una segona mostra per

estudiar l’evolució d’aquests. No obstant, els nivells de citocines es

correlacionen amb la mortalitat, que és el factor pronòstic més important.

Finalment, l’ús de sistemes múltiplex, tot i que permeten mesurar vàries

citocines amb molt poc volum de mostra, està associat a limitacions

intrínseques doncs vàries de les citocines incloses en el sistema no es varen

poder mesurar, tal i com està reportat en altres estudis de pacients amb

sèpsia77. Per analitzar els múltiples marcadors s’han de realitzar una sèrie de

dilucions d’un calibrador comú i no es pot ajustar individualment el límit de

detecció de cada molècula, implicant la pèrdua de quantificació d’algunes

Page 61: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

61

citocines. Aquest fet explicaria perquè algunes de les citocines que s’han

descrit que estan augmentades a la cirrosi (com TNF-α, IL-6) no s’han pogut

detectar en aquest estudi16,18. Tanmateix, altres mediadors inflamatoris no

inclosos al múltiplex, com CXCL9 o HNA2, també seria d’interès analitzar-los

en els pacients amb ACLF.

En resum, els resultats de l’estudi indiquen que la síndrome d’ACLF està

caracteritzada per una marcada reacció inflamatòria amb l’activació de

mediadors d’adhesió i de migració leucocitària, particularment de monòcits i

macròfags. La intensitat de la resposta inflamatòria es correlaciona amb el

pronòstic.

Estudi 2: Characterization of inflammatory response in hepatorenal syndrome. Relationship with kidney outcome and survival.

Com hem comentat anteriorment, hi ha evidència creixent que les

complicacions de la cirrosi ocorren en el context d’una resposta inflamatòria

sistèmica, però no hi ha estudis específics que caracteritzin de forma extensa la

inflamació en la síndrome hepatorenal. Pel que aquest segon estudi, realitzat

amb una població àmplia de pacients amb cirrosi i síndrome hepatorenal

(SHR), va dirigit a estudiar la inflamació sistèmica mitjançant la tecnologia

múltiplex amb l’avaluació d’un gran nombre de marcadors inflamatoris en

aquests pacients. Per aquest objectiu s’han inclòs tres grups de pacients; en

primer lloc pacients amb cirrosi i la síndrome hepatorenal, en segon lloc, un

grup de pacients amb insuficiència renal per hipovolèmia i finalment un grup de

pacients amb cirrosi descompensada sense insuficiència renal. El grup

d’insuficiència renal per hipovomèmia s’ha escollit com a comparatiu del grup

de pacients amb SHR, perquè en ambdós casos la insuficiència renal té un

origen prerenal tot i que la base fisiopatològica és diferent. En el primer grup

existeix una disminució de volum sanguini que causa la hipoperfusió renal,

mentre que en el segon es produeix una disfunció circulatòria amb una

vasodilatació arterial particularment de la circulació esplàncnica10,41.

Page 62: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

62

Els resultats d’aquest estudi demostren que en comparació amb pacients amb

cirrosi sense insuficiència renal o amb insuficiència renal per hipovolèmia, en

els pacients amb SHR, s’observa una inflamació sistèmica, amb un increment

significatiu de marcadors inflamatoris potents, destacant l’elevació de IL-6, IL-8,

TNF-α i VCAM-1. Aquests resultats van amb concordança amb els resultats

d’estudis previs que demostren que pacients amb cirrosi descompensada

presenten valors més elevats de IL-6 i TNF-α que pacients amb cirrosi

compensada16,18,31. També va en acord amb la recent teoria proposada de la

inflamació sistèmica com a causa de les complicacions de la cirrosi13.

Tanmateix, és interessant remarcar que utilitzant les dades de l’estudi s’ha

realitzat un anàlisis de biologia de sistemes. Aquest anàlisi també dóna suport

a aquesta teoria, doncs la inflamació observada en els pacients amb cirrosi és

similar a la inflamació present en els pacients amb malalties característicament

inflamatòries com el lupus eritematós sistèmic, l’artritis reumatoide o la malaltia

inflamatòria intestinal entre altres.

Un aspecte important de l’estudi és discernir si la inflamació observada en

aquest estudi és secundària a la síndrome hepatorenal o a la presència

concomitant d’ACLF, ja que en estudis previs, un dels quals inclòs aquesta Tesi

Doctoral, s’ha demostrat que l’ACLF es caracteritza per una marcada resposta

inflamatòria sistèmica73. Per una banda, hem comparat la resposta inflamatòria

dels pacients amb SHR segons la presència o no d’ACLF i hem observat que

no hi ha diferències significatives en els marcadors inflamatoris entre els

pacients amb SHR associat a ACLF i el grup de pacients amb SHR sense

ACLF. A més, els nivells de citocines no es relacionen majoritàriament amb el

grau d’ACLF. Per altra banda, els pacients amb ACLF els hem dividit segons la

causa d’insuficiència renal, objectivant que els pacients amb SHR i ACLF

presenten major alteració del perfil de citocines que pacients amb insuficiència

renal per hipovolèmia tot i la presència d’ACLF. Per tant, sembla que la

síndrome hepatorenal “per se” indueix una resposta inflamatòria sistèmica

marcada, independentment de la presència d’ACLF. De forma interessant hem

observat que els pacients amb SHR amb i sense infecció no presenten

diferencies globals en quant el perfil de citocines, excepte IL-6, pel que la

Page 63: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

63

inflamació objectivada en la SHR tampoc és causada únicament per la

presència d’infeccions bacterianes.

Un aspecte important de l’estudi és que algun dels marcadors inflamatoris

presenten correlació amb la supervivència i amb la resolució de la insuficiència

renal. El més rellevant és VCAM-1, que s’associa a la falta de resolució de la

insuficiència renal i de la síndrome hepatorenal i tanmateix, és un factor

predictiu independent de mortalitat tant en tota la cohort de pacients amb

insuficiència renal com en pacients amb SHR. El VCAM-1, és un mediador

inflamatori que té un rol important en el reclutament de cèl·lules inflamatòries,

provocant l’adhesió i facilitant la transmigració dels leucòcits des del torrent

sanguini cap a teixits afectats67. Les troballes van en concordança amb la

informació d’estudis previs, en que els nivells de VCAM-1 són un marcador

pronòstic dels pacients amb cirrosi68,69.

Una altra troballa rellevant de l’estudi és que la intensitat de la síndrome així

com la resposta a la terlipressina no sembla que estigui condicionada en major

mesura per la inflamació. Així, quan comparem pacients amb SHR tipus 1 vs

SHR que no compleixen els criteris de SHR tipus 1, no trobem diferències en

els marcadors inflamatoris. De la mateixa forma, els pacients que responen al

tractament amb vasoconstrictors no presenten una disminució significativa de la

inflamació a excepció del TNF-α. En aquest punt, cal destacar la possible

importància del TNF-α. Per una banda, els pacients amb SHR presenten nivells

més elevats de TNF-α que els pacients amb cirrosi sense insuficiència renal i

que els pacients amb insuficiència renal per hipovolèmia, indicant que ni la

cirrosi únicament, ni a priori la causa de la insuficiència renal són la causa

única d’aquesta elevació sinó que és una característica dels pacients amb

cirrosi avançada i SHR. De forma paral·lela, en estudis previs s’observen

nivells elevats de TNF-α en fases més greus de la malaltia i també en els

ganglis limfàtics dels pacients amb cirrosi descompensada, secundari a la

translocació bacteriana31,78. Per tant, el TNF-α podria empitjorar la

vasodilatació ja existent en aquests pacients, i contribuir en la fisiopatologia de

la síndrome79. Per altra banda, els pacients que responen al tractament amb

vasoconstrictors presenten una disminució significativa dels nivells de TNF-α,

Page 64: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

64

però no de cap altre mediador inflamatori, suggerint un rol en la patogènesi de

la SHR. De fet, en estudis experimentals, s’ha observat que el TNF-α és

responsable d’induir una vasoconstricció renal, que podria doncs causar un

empitjorament de la funció renal en els pacients amb SHR80. Altrament, hi ha

evidència que pacients amb cirrosi descompensada que es tracten amb

Pentoxifilina, un inhibidor de la síntesi de TNF-α, presenten menor probabilitat

de desenvolupar SHR en comparació a pacients tractats amb placebo81,82.

L’estudi presenta vàries limitacions que cal comentar. En primer lloc, de la

mateixa forma que ocorre a l’estudi 1, hi ha vàries citocines que no s’han pogut

determinar perquè estaven fora del límit de detecció establert pel sistema

múltiplex. En segon lloc, el número de pacients no és molt elevat. Però tenint

en compte la dificultat de realitzar estudis amb SHR, considerem que és una

mostra relativament gran de pacients amb SHR. En tot cas, calen nous estudis

per confirmar i replicar aquestes troballes. Finalment, les concentracions de

citocines en el plasma potser no reflecteixen les concentracions tissulars

d’aquestes. No obstant, aquesta limitació és difícil de solucionar en estudis en

humans.

Resumint, els pacients amb SHR presenten una marcada resposta inflamatòria

sistèmica en comparació amb els pacients sense insuficiència renal o amb

insuficiència renal per hipovolèmia. Aparentment, la inflamació no està

associada ni amb la intensitat de la insuficiència renal, la presència

d’infeccions, l’ACLF i no es normalitza completament amb la resposta al

tractament. De forma interessant, la inflamació està associada amb la falta de

resolució de la insuficiència renal i amb la mortalitat; alhora la inflamació

observada és similar a la de malalties característicament inflamatòries com el

lupus eritematós o la malaltia inflamatòria intestinal.

Tenint en compte els resultats dels dos estudis que comprenen aquesta Tesi

Doctoral, podem dir que s’amplia de forma significativa el coneixement de la

inflamació a la cirrosi hepàtica, donant més validesa a la teoria de la inflamació

a la fisiopatologia de la cirrosi i de les seves complicacions. Específicament

l’ACLF i la SHR es caracteritzen per una intensa resposta inflamatòria

sistèmica que a més es correlaciona amb el pronòstic d’aquests pacients.

Page 65: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

65

6. CONCLUSIONS

Page 66: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

66

6. CONCLUSIONS Les conclusions finals dels estudis que componen aquesta Tesi Doctoral són:

- La progressió de la cirrosi s’acompanya d’un augment de la resposta

inflamatòria sistèmica, de forma que en els pacients amb cirrosi

descompensada ja s’objectiva una inflamació sistèmica, però que és

molt més marcada en els pacients amb ACLF.

- En els pacients amb ACLF, alguns del marcadors inflamatoris es

correlacionen amb la mortalitat, sobretot VCAM-1, ICAM-1 i GM-CSF.

- Els macròfags i monòcits tenen un paper important en l’ACLF. La

inflamació observada en els pacients amb ACLF està implicada en la

quimiotaxi i migració leucocitària, particularment dels monòcits i

macròfags. - Els pacients amb síndrome hepatorenal presenten una marcada

resposta inflamatòria sistèmica en comparació a pacients amb cirrosi

descompensada sense insuficiència renal i a pacients amb insuficiència

renal per hipovolèmia. - La inflamació sistèmica observada en la SHR és aparentment

independent de la presència d’infeccions, de la presència d’ACLF i no es

relaciona amb la intensitat de la insuficiència renal.

- Els pacients que responen al tractament amb fàrmacs vasoconstrictors

no presenten una resolució completa d’aquesta inflamació.

- La inflamació sistèmica, particularment els nivells de VCAM-1, es

correlaciona amb la resolució de la insuficiència renal i amb la mortalitat.

- L’anàlisi amb biologia de sistemes demostra que l’estat inflamatori

observat en els pacients amb cirrosi és similar al que presenten algunes

malalties sistèmiques inflamatòries com el lupus eritematós o la malaltia

inflamatòria intestinal.

Page 67: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

67

7. BIBLIOGRAFIA

Page 68: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

68

7. BIBLIOGRAFIA

1. Global, regional, and national age–sex specific all-cause and cause-

specific mortality for 240 causes of death, 1990–2013: a systematic

analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet.

2015;385(9963):117-171. doi:10.1016/S0140-6736(14)61682-2

2. Asrani SK, Devarbhavi H, Eaton J, Kamath PS. Burden of liver diseases

in the world. J Hepatol. 2019;70(1):151-171.

doi:10.1016/j.jhep.2018.09.014

3. Pimpin L, Cortez-Pinto H, Negro F, et al. Burden of liver disease in

Europe: Epidemiology and analysis of risk factors to identify prevention

policies. J Hepatol. 2018;69(3):718-735. doi:10.1016/j.jhep.2018.05.011

4. García-Pagán J-C, Gracia-Sancho J, Bosch J. Functional aspects on the

pathophysiology of portal hypertension in cirrhosis. J Hepatol.

2012;57(2):458-461. doi:10.1016/j.jhep.2012.03.007

5. Tsochatzis EA, Bosch J, Burroughs AK. Liver cirrhosis. In: The Lancet.

Vol 383. ; 2014. doi:10.1016/S0140-6736(14)60121-5

6. Ginés P, Quintero E, Arroyo V, et al. Compensated cirrhosis: natural

history and prognostic factors. Hepatology. 7(1):122-128.

7. D’Amico G, Garcia-Tsao G, Pagliaro L. Natural history and prognostic

indicators of survival in cirrhosis: a systematic review of 118 studies. J

Hepatol. 2006;44(1):217-231. doi:10.1016/j.jhep.2005.10.013

8. Moreau R, Jalan R, Gines P, et al. Acute-on-chronic liver failure is a

distinct syndrome that develops in patients with acute decompensation of

cirrhosis. Gastroenterology. 2013;144(7).

doi:10.1053/j.gastro.2013.02.042

9. Schrier RW, Arroyo V, Bernardi M, Epstein M, Henriksen JH, Rodés J.

Peripheral arterial vasodilation hypothesis: a proposal for the initiation of

renal sodium and water retention in cirrhosis. Hepatology.

1998;8(5):1151-1157. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2971015.

Accessed April 3, 2018.

10. Ginès P, Schrier RW. Renal Failure in Cirrhosis. N Engl J Med.

2009;361(13):1279-1290. doi:10.1056/NEJMra0809139

Page 69: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

69

11. Angeli P, Bernardi M, Villanueva C, et al. EASL Clinical Practice

Guidelines for the management of patients with decompensated cirrhosis.

J Hepatol. April 2018. doi:10.1016/j.jhep.2018.03.024

12. Mehta G, Gustot T, Mookerjee RP, et al. Inflammation and portal

hypertension – The undiscovered country. J Hepatol. 2014;61(1):155-

163. doi:10.1016/j.jhep.2014.03.014

13. Bernardi M, Moreau R, Angeli P, Schnabl B, Arroyo V. Mechanisms of

decompensation and organ failure in cirrhosis: From peripheral arterial

vasodilation to systemic inflammation hypothesis. J Hepatol. 2015;63(5).

doi:10.1016/j.jhep.2015.07.004

14. Martin P-Y, Ginès P, Schrier RW. Nitric Oxide as a Mediator of

Hemodynamic Abnormalities and Sodium and Water Retention in

Cirrhosis. Epstein FH, ed. N Engl J Med. 1998;339(8):533-541.

doi:10.1056/NEJM199808203390807

15. Henriksen JH, Bendtsen F, Sørensen TI, Stadeager C, Ring-Larsen H.

Reduced central blood volume in cirrhosis. Gastroenterology.

1989;97(6):1506-1513.

16. Albillos A, Lario M, Álvarez-Mon M. Cirrhosis-associated immune

dysfunction: Distinctive features and clinical relevance. J Hepatol.

2014;61(6). doi:10.1016/j.jhep.2014.08.010

17. Cervoni J-P, Thévenot T, Weil D, et al. C-Reactive protein predicts short-

term mortality in patients with cirrhosis. J Hepatol. 2012;56(6):1299-1304.

doi:10.1016/j.jhep.2011.12.030

18. Giron-Gonzalez JA, Martinez-Sierra C, Rodriguez-Ramos C, et al.

Implication of inflammation-related cytokines in the natural history of liver

cirrhosis. Liver Int. 2004;24(5):437-445. doi:10.1111/j.1478-

3231.2004.0951.x

19. Albillos A, Hera A de la, Reyes E, et al. Tumour necrosis factor-alpha

expression by activated monocytes and altered T-cell homeostasis in

ascitic alcoholic cirrhosis: amelioration with norfloxacin. J Hepatol.

2004;40(4):624-631. doi:10.1016/j.jhep.2003.12.010

20. Byl B, Roucloux I, Crusiaux A, Dupont E, Devière J. Tumor necrosis

factor α and interleukin 6 plasma levels in infected cirrhotic patients.

Gastroenterology. 1993;104(5):1492-1497.

Page 70: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

70

doi:10.5555/URI:PII:001650859390361F

21. Buck M, Garcia-Tsao G, Groszmann RJ, et al. Novel inflammatory

biomarkers of portal pressure in compensated cirrhosis patients.

Hepatology. 2014;59(3):1052-1059. doi:10.1002/hep.26755

22. Waidmann O, Brunner F, Herrmann E, Zeuzem S, Piiper A, Kronenberger

B. Macrophage activation is a prognostic parameter for variceal bleeding

and overall survival in patients with liver cirrhosis. J Hepatol.

2013;58(5):956-961. doi:10.1016/j.jhep.2013.01.005

23. Cazzaniga M, Dionigi E, Gobbo G, Fioretti A, Monti V, Salerno F. The

systemic inflammatory response syndrome in cirrhotic patients:

relationship with their in-hospital outcome. J Hepatol. 2009;51(3):475-482.

doi:10.1016/j.jhep.2009.04.017

24. Wiest R, Garcia-Tsao G. Bacterial translocation (BT) in cirrhosis.

Hepatology. 2005;41(3):422-433. doi:10.1002/hep.20632

25. Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate

immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol. 2010;11(5):373-

384. doi:10.1038/ni.1863

26. Kubes P, Mehal WZ. Sterile Inflammation in the Liver. Gastroenterology.

2012;143(5):1158-1172. doi:10.1053/j.gastro.2012.09.008

27. Wasmuth HE, Kunz D, Yagmur E, et al. Patients with acute on chronic

liver failure display &quot;sepsis-like&quot; immune paralysis. J Hepatol.

2005;42(2):195-201. doi:10.1016/j.jhep.2004.10.019

28. Jalan R, Saliba F, Pavesi M, et al. Development and validation of a

prognostic score to predict mortality in patients with acute-on-chronic liver

failure. J Hepatol. 2014;61(5). doi:10.1016/j.jhep.2014.06.012

29. Solà E, Fernandez J, Ginès P. Acute-on-Chronic Liver Failure: The Role

of Precipitating Illness. Semin Liver Dis. 2016;36(2):117-122.

doi:10.1055/s-0036-1583204

30. Bernsmeier C, Pop OT, Singanayagam A, et al. Patients with acute-on-

chronic liver failure have increased numbers of regulatory immune cells

expressing the receptor tyrosine kinase MERTK. Gastroenterology.

2015;148(3). doi:10.1053/j.gastro.2014.11.045

31. Mehta G, Mookerjee RP, Sharma V, Jalan R. Systemic inflammation is

associated with increased intrahepatic resistance and mortality in alcohol-

Page 71: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

71

related acute-on-chronic liver failure. Liver Int. 2015;35(3).

doi:10.1111/liv.12559

32. Finkenstedt A, Nachbaur K, Zoller H, et al. Acute-on-chronic liver failure:

Excellent outcomes after liver transplantation but high mortality on the

wait list. Liver Transplant. 2013;19(8):879-886. doi:10.1002/lt.23678

33. Levesque E, Winter A, Noorah Z, et al. Impact of acute-on-chronic liver

failure on 90-day mortality following a first liver transplantation. Liver Int.

2017;37(5):684-693. doi:10.1111/liv.13355

34. Garcia-Tsao G, Parikh CR, Viola A. Acute kidney injury in cirrhosis.

Hepatology. 2008;48(6):2064-2077. doi:10.1002/hep.22605

35. Huelin P, Piano S, Solà E, et al. Validation of a Staging System for Acute

Kidney Injury in Patients With Cirrhosis and Association With Acute-on-

Chronic Liver Failure. Clin Gastroenterol Hepatol. 2017;15(3).

doi:10.1016/j.cgh.2016.09.156

36. Angeli P, Ginès P, Wong F, et al. Diagnosis and management of acute

kidney injury in patients with cirrhosis: Revised consensus

recommendations of the International Club of Ascites. J Hepatol.

2015;62(4):968-974.

37. Salerno F, Gerbes A, Ginès P, Wong F, Arroyo V. Diagnosis, prevention

and treatment of hepatorenal syndrome in cirrhosis. Gut.

2007;56(9):1310-1318. doi:10.1136/gut.2006.107789

38. Martín–Llahí M, Guevara M, Torre A, et al. Prognostic Importance of the

Cause of Renal Failure in Patients With Cirrhosis. Gastroenterology.

2011;140(2):488-496.e4. doi:10.1053/j.gastro.2010.07.043

39. Arroyo V, Ginès P, Gerbes AL, et al. Definition and diagnostic criteria of

refractory ascites and hepatorenal syndrome in cirrhosis. Hepatology.

1996;23(1):164-176. doi:10.1002/hep.510230122

40. Boyer TD, Sanyal AJ, Garcia-Tsao G, et al. Predictors of response to

terlipressin plus albumin in hepatorenal syndrome (HRS) type 1:

relationship of serum creatinine to hemodynamics. J Hepatol.

2011;55(2):315-321. doi:10.1016/j.jhep.2010.11.020

41. Ginès P, Solà E, Angeli P, Wong F, Nadim MK, Kamath PS. Hepatorenal

syndrome. Nat Rev Dis Prim. 2018;4(1):23. doi:10.1038/s41572-018-

0022-7

Page 72: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

72

42. Martín-Llahí M, Pépin M-N, Guevara M, et al. Terlipressin and albumin vs

albumin in patients with cirrhosis and hepatorenal syndrome: a

randomized study. Gastroenterology. 2008;134(5):1352-1359.

doi:10.1053/j.gastro.2008.02.024

43. Sanyal AJ, Boyer T, Garcia–Tsao G, et al. A Randomized, Prospective,

Double-Blind, Placebo-Controlled Trial of Terlipressin for Type 1

Hepatorenal Syndrome. Gastroenterology. 2008;134(5):1360-1368.

doi:10.1053/j.gastro.2008.02.014

44. Gluud LL, Christensen K, Christensen E, Krag A. Systematic review of

randomized trials on vasoconstrictor drugs for hepatorenal syndrome.

Hepatology. 2010;51(2):576-584. doi:10.1002/hep.23286

45. Facciorusso A, Chandar AK, Murad MH, et al. Comparative efficacy of

pharmacological strategies for management of type 1 hepatorenal

syndrome: a systematic review and network meta-analysis. Lancet

Gastroenterol Hepatol. 2017;2(2):94-102. doi:10.1016/S2468-

1253(16)30157-1

46. Thabut D, Massard J, Gangloff A, et al. Model for end-stage liver disease

score and systemic inflammatory response are major prognostic factors in

patients with cirrhosis and acute functional renal failure. Hepatology.

2007;46(6):1872-1882. doi:10.1002/hep.21920

47. Navasa M, Follo A, Filella X, et al. Tumor necrosis factor and interleukin-6

in spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: relationship with the

development of renal impairment and mortality. Hepatology.

1998;27(5):1227-1232. doi:10.1002/hep.510270507

48. Medzhitov R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature.

2008;454(7203):428-435. doi:10.1038/nature07201

49. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Inmunología Básica : Funciones Y

Trastornos Del Sistema Inmunitario. Elsevier; 2014.

https://booksmedicos.org/inmunologia-basica-funciones-y-trastornos-del-

sistema-inmunitario-abbas-4a-edicion/. Accessed January 9, 2019.

50. O’Shea JJ, Ma A, Lipsky P. Cytokines and autoimmunity. Nat Rev

Immunol. 2002;2(1):37-45. doi:10.1038/nri702

51. Tau G, Rothman P. Biologic functions of the IFN-gamma receptors.

Allergy. 1999;54(12):1233-1251.

Page 73: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

73

52. Knight B, Lim R, Yeoh GC, Olynyk JK. Interferon-γ exacerbates liver

damage, the hepatic progenitor cell response and fibrosis in a mouse

model of chronic liver injury. J Hepatol. 2007;47(6):826-833.

doi:10.1016/j.jhep.2007.06.022

53. Garg V, Garg H, Khan A, et al. Granulocyte Colony–Stimulating Factor

Mobilizes CD34+ Cells and Improves Survival of Patients With Acute-on-

Chronic Liver Failure. Gastroenterology. 2012;142(3):505-512.e1.

doi:10.1053/j.gastro.2011.11.027

54. Mathias B, Szpila BE, Moore FA, Efron PA, Moldawer LL. A Review of

GM-CSF Therapy in Sepsis. Medicine (Baltimore). 2015;94(50):e2044.

doi:10.1097/MD.0000000000002044

55. Xu D, Zhao M, Song Y, Song J, Huang Y, Wang J. Novel insights in

preventing Gram-negative bacterial infection in cirrhotic patients: review

on the effects of GM-CSF in maintaining homeostasis of the immune

system. Hepatol Int. 2015;9(1):28-34. doi:10.1007/s12072-014-9588-7

56. Akdis M, Burgler S, Crameri R, et al. Interleukins, from 1 to 37, and

interferon-γ: receptors, functions, and roles in diseases. J Allergy Clin

Immunol. 2011;127(3):701-21-70. doi:10.1016/j.jaci.2010.11.050

57. Tilg H, Wilmer A, Vogel W, et al. Serum levels of cytokines in chronic liver

diseases. Gastroenterology. 1992;103(1):264-274.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1612333. Accessed January 13,

2019.

58. Remmler J, Schneider C, Treuner-Kaueroff T, et al. Increased Level of

Interleukin 6 Associates With Increased 90-Day and 1-Year Mortality in

Patients With End-Stage Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol.

2018;16(5):730-737. doi:10.1016/j.cgh.2017.09.017

59. Marra F, Tacke F. Roles for Chemokines in Liver Disease.

Gastroenterology. 2014;147(3):577-594.e1.

doi:10.1053/j.gastro.2014.06.043

60. Zlotnik A, Yoshie O. The chemokine superfamily revisited. Immunity.

2012;36(5):705-716. doi:10.1016/j.immuni.2012.05.008

61. Luster AD. Chemokines--chemotactic cytokines that mediate

inflammation. N Engl J Med. 1998;338(7):436-445.

doi:10.1056/NEJM199802123380706

Page 74: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

74

62. Graupera I, Solà E, Fabrellas N, et al. Urine Monocyte Chemoattractant

Protein-1 Is an Independent Predictive Factor of Hospital Readmission

and Survival in Cirrhosis. PLoS One. 2016;11(6):e0157371.

doi:10.1371/journal.pone.0157371

63. Karlmark KR, Zimmermann HW, Roderburg C, et al. The fractalkine

receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling

differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology.

2010;52(5):1769-1782. doi:10.1002/hep.23894

64. Steuerwald NM, Foureau DM, Norton HJ, et al. Profiles of Serum

Cytokines in Acute Drug-Induced Liver Injury and Their Prognostic

Significance. Shoukry NH, ed. PLoS One. 2013;8(12):e81974.

doi:10.1371/journal.pone.0081974

65. Mor F, Quintana FJ, Cohen IR. Angiogenesis-inflammation cross-talk:

vascular endothelial growth factor is secreted by activated T cells and

induces Th1 polarization. J Immunol. 2004;172(7):4618-4623.

66. Takayama H, Miyake Y, Nouso K, et al. Serum levels of platelet-derived

growth factor-BB and vascular endothelial growth factor as prognostic

factors for patients with fulminant hepatic failure. J Gastroenterol Hepatol.

2011;26(1):116-121. doi:10.1111/j.1440-1746.2010.06441.x

67. Vestweber D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nat Rev

Immunol. 2015;15(11):692-704. doi:10.1038/nri3908

68. Girón-González JA, Martínez-Sierra C, Rodriguez-Ramos C, et al.

Adhesion molecules as a prognostic marker of liver cirrhosis. Scand J

Gastroenterol. 2005;40(2):217-224. doi:10.1080/00365520510011470

69. Lo Iacono O, Rincón D, Hernando A, et al. Serum levels of soluble

vascular cell adhesion molecule are related to hyperdynamic circulation in

patients with liver cirrhosis. Liver Int. 2008;28(8):1129-1135.

doi:10.1111/j.1478-3231.2008.01763.x

70. Detillieux KA, Sheikh F, Kardami E, Cattini PA. Biological activities of

fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovasc Res.

2003;57(1):8-19. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12504809.

Accessed January 29, 2019.

71. Li X, Jin Q, Yao Q, et al. Placental Growth Factor Contributes to Liver

Inflammation, Angiogenesis, Fibrosis in Mice by Promoting Hepatic

Page 75: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

75

Macrophage Recruitment and Activation. Front Immunol. 2017;8:801.

doi:10.3389/fimmu.2017.00801

72. Chiswick EL, Duffy E, Japp B, Remick D. Detection and quantification of

cytokines and other biomarkers. Methods Mol Biol. 2012;844:15-30.

doi:10.1007/978-1-61779-527-5_2

73. Clària J, Stauber RE, Coenraad MJ, et al. Systemic inflammation in

decompensated cirrhosis: Characterization and role in acute-on-chronic

liver failure. Hepatology. 2016;64(4):1249-1264. doi:10.1002/hep.28740

74. Shapiro NI, Schuetz P, Yano K, et al. The association of endothelial cell

signaling, severity of illness, and organ dysfunction in sepsis. Crit Care.

2010;14(5):R182. doi:10.1186/cc9290

75. Shi Y, Liu CH, Roberts AI, et al. Granulocyte-macrophage colony-

stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don’t

know. Cell Res. 2006;16(2):126-133. doi:10.1038/sj.cr.7310017

76. Stutchfield BM, Antoine DJ, Mackinnon AC, et al. CSF1 Restores Innate

Immunity After Liver Injury in Mice and Serum Levels Indicate Outcomes

of Patients With Acute Liver Failure. Gastroenterology. 2015;149(7):1896-

1909.e14. doi:10.1053/j.gastro.2015.08.053

77. Bozza FA, Salluh JI, Japiassu AM, et al. Cytokine profiles as markers of

disease severity in sepsis: a multiplex analysis. Crit Care.

2007;11(2):R49. doi:10.1186/cc5783

78. Genescà J, Martí R, Rojo F, et al. Increased tumour necrosis factor alpha

production in mesenteric lymph nodes of cirrhotic patients with ascites.

Gut. 2003;52(7):1054-1059.

79. Mookerjee RP, Sen S, Davies NA, Hodges SJ, Williams R, Jalan R.

Tumour necrosis factor alpha is an important mediator of portal and

systemic haemodynamic derangements in alcoholic hepatitis. Gut.

2003;52(8):1182-1187.

80. Shahid M, Francis J, Majid DSA. Tumor necrosis factor-α induces renal

vasoconstriction as well as natriuresis in mice. Am J Physiol Physiol.

2008;295(6):F1836-F1844. doi:10.1152/ajprenal.90297.2008

81. Akriviadis E, Botla R, Briggs W, Han S, Reynolds T, Shakil O.

Pentoxifylline improves short-term survival in severe acute alcoholic

hepatitis: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology.

Page 76: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

76

2000;119(6):1637-1648.

82. Lebrec D, Thabut D, Oberti F, et al. Pentoxifylline Does Not Decrease

Short-term Mortality but Does Reduce Complications in Patients With

Advanced Cirrhosis. Gastroenterology. 2010;138(5):1755-1762.e2.

doi:10.1053/j.gastro.2010.01.040

Page 77: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

77

8. ANNEXES

Page 78: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

78

8. ANNEXES

8.1. Publicacions relacionades:

A part dels dos articles originals publicats que formen part d’aquesta Tesi

Doctoral, durant aquest període he participat també en les següents

publicacions relacionades amb aquesta àrea d’investigació:

- Solà E*, Solé C*, Simón-Talero M, Martín-Llahí M, Castellote J, Garcia-Martínez R, Moreira R, Torrens M, Márquez F, Fabrellas N, de Prada G, Huelin P, Lopez Benaiges E, Ventura M, Manríquez M, Nazar A, Ariza X, Suñé P, Graupera I, Pose E, Colmenero J, Pavesi M, Guevara M, Navasa M, Xiol X, Córdoba J, Vargas V, Ginès P. Midodrine and albumin for prevention of complications in patients with cirrhosis awaiting liver transplantation. A randomized placebo-controlled trial. J Hepatol. 2018 Dec;69(6):1250-1259. doi: 10.1016/j.jhep.2018.08.006. *co-autores.

Articles originals

- Piano S, Schmidt HH, Ariza X, Amoros A, Romano A, Hüsing-Kabar A, Solà E, Gerbes A, Bernardi M, Alessandria C, Scheiner B, Tonon M, Maschmeier M, Solé C, Trebicka J, Gustot T, Nevens F, Arroyo V, Gines P, Angeli P; EASL CLIF Consortium. Association Between Grade of Acute on Chronic Liver Failure and Response to Terlipressin and Albumin in Patients With Hepatorenal Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 2018 Jan 31. pii: S1542-3565(18)30105-8. doi: 10.1016/j.cgh.2018.01.035.

- Graupera I, Coll M, Pose E, Elia C, Piano S, Solà E, Blaya D, Huelin P, Solé C, Moreira R, de Prada G, Fabrellas N, Juanola A, Morales-Ruiz M, Sancho-Bru P, Villanueva C, Ginès P. Adipocyte Fatty-Acid Binding Protein is Overexpressed in Cirrhosis and Correlates with Clinical Outcomes. Sci Rep. 2017 May 12;7(1):1829. doi: 10.1038/s41598-017-01709-0.

- Huelin P, Piano S, Solà E, Stanco M, Solé C, Moreira R, Pose E, Fasolato S, Fabrellas N, de Prada G, Pilutti C, Graupera I, Ariza X, Romano A, Elia C, Cárdenas A, Fernández J, Angeli P, Ginès P. Validation of a Staging System for Acute Kidney Injury in Patients With Cirrhosis and Association With Acute on Chronic Liver Failure. Clin Gastroenterol Hepatol. 2016 Oct 5. pii: S1542-3565(16)30869-2. doi: 10.1016/j.cgh.2016.09.156.

- Ariza X, Graupera I, Coll M, Solà E, Barreto R, García E, Moreira R, Elia C, Morales-Ruiz M, Llopis M, Huelin P, Solé C, Fabrellas N, Weiss E, Nevens F, Gerbes A, Trebicka J, Saliba F, Fondevila C, Hernández-Gea

Page 79: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

79

V, Fernández J, Bernardi M, Arroyo V, Jiménez W, Deulofeu C, Pavesi M, Angeli P, Jalan R, Moreau R, Sancho-Bru P, Ginès P; CANONIC nvestigators, EASL CLIF Consortium. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin is a biomarker of acute-on-chronic liver failure and prognosis in cirrhosis. J Hepatol. 2016 Jul;65(1):57-65.doi: 10.1016/j.jhep.2016.03.002

- Isabel Graupera, Elsa Solà, Núria Fabrellas, Rebeca Moreira, Cristina Solé, Patricia Huelin, Gloria de la Prada, Elisa Pose, Xavier Ariza, Alessandro Risso, Sonia Albertos, Manuel Morales-Ruiz, Wladimiro Jiménez, Pere Ginès. Urine Monocyte Chemoattractant Protein-1 Is an Independent Predictive Factor of Hospital Readmission and Survival in Cirrhosis. PLoS One. 2016 Jun 30;11(6):e0157371. doi: 10.1371/journal.pone.0157371.

- Solé C and Solà E. Uptade on acute-on-chronic liver failue. Gastroenterol Hepatol. June 2017. doi:10.1016/j.gastrohep.2017.05.012

Revisions

- Solé C, Pose E, Solà E, Ginès P. Hepatorenal syndrome in the era of Acute Kidney injury. Liver Int. 2018 May 30. doi: 10.1111/liv.13893.

- Cristina Solé, Elsa Solà and Pere Ginès. Acute on chronic liver failure: The syndrome. En: Vicente Arroyo and Mauro Bernardi. 1rst International Meeting. Systemic Inflammation and Organ Failure in Cirrhosis. The Acute-on-Chronic liver Failure Syndrome (ACLF). Spain: Elsevier; 2016. P. 11-14.

Capítols de llibre

- Cristina Solé, Andrés Cardenas and Pere Ginès. 2019. “Chapter 169. The patient with hepatorenal syndrome. In: Oxford Textbook of Clinical Nephrology. Edited by Neil N. Turner, Norbert Lameire, et al. 5th edition (Submitted).

Page 80: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

80

8.2 Comunicacions a congressos

Els projectes que formen aquesta Tesi Doctoral han generat les següents

comunicacions a congressos:

- Cristina Solé; Elsa Solà; Manuel Morales-Ruiz, Guerau Fernàndez;

Patricia Huelin; Isabel Graupera, et al. Caracterització de la resposta

inflamatòria de la síndrome de “Acute-on-chronic liver failure” (ACLF) i

relació amb el pronòstic. Categoria: pòster. XXV Congrés de la Societat

Catalana de Digestologia. Reus, Gener 2016.

Congressos nacionals:

- Cristina Solé; Elsa Solà; Manuel Morales-Ruiz, Guerau Fernàndez;

Patricia Huelin; Isabel Graupera, et al. Caracteritzación de la respuesta

inflamatoria del síndrome de “Acute-on-chronic liver failure” (ACLF) i

relación con el pronóstico. Categoria: poster. 41º Congreso (AEEH).

Madrid. Febrer 2016.

- Cristina Solé, E.Solà, M.Morales, et al. Caracterització de la resposta

inflamatòria sistèmica de la insuficiència renal aguda-síndrome

hepatorenal (AKI-SHR) a la cirrosi. Paper rellevant de la il-6, TNF-a i

VCAM. Categoria: pòster. XXVII Congrés de la Societat Catalana de

Digestologia. Lleida, Gener 2018

- Cristina Solé, E.Solà, M.Morales, et al. Caracterización de la respuesta

inflamatoria sistémica en la insuficiencia renal aguda-síndrome

hepatorenal (AKI-SHR) en la cirrosis. Papel relevante de la IL-6, TNF-Α y

VCAM.Categoria: poster. 43 Congreso Anual de la Asociación

Española para el Estudio del hígado (AEEH). Febrer 2018.

- Cristina Solé, Elsa Solà, Manuel Morales-Ruiz, Guerau Fernàndez,

Patricia Huelin, Isabel Graupera, Rebeca Moreira, Gloria De Prada,

Xavier Ariza, Elisa Pose, Núria Fabrellas, Susana Kalko, Wladimiro

Jiménez, Pere Ginès. Characterization of inflammatory response in

Acute-on-chronic liver failure (ACLF) and its relationship with prognosis.

Congressos internacionals:

Page 81: INFLAMACIÓ SISTÈMICA I CIRROSI HEPÀTICA. IMPLICACIÓ EN …

81

Category: poster (selected for poster tour). I was granted for the

membership of EASL for 2016-2017. The international Liver Congress.

(EASL congress). Barcelona, April 2016.

- Cristina Solé, Elsa Solà, M Morales-Ruiz. Et al. Characterization of

systemic inflammatory response in hepatorenal syndrome in cirrhosis. A

major role for il-6, TNF-alpha, and VCAM. Category: poster (selected for poster tour). The international Liver Congress. (EASL congress).

Paris, April 2018.