Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Facultad de ingeniería

Microbiología

Dra. Yolanda Jasso Pineda

Tinción de células bacterianas

González Pérez Esaú

Miércoles 12 de febrero del 2014

INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el

microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la

rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden

emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de

determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso

llamado fijación. Para bacterias, la fijación por calor es lo más común, aunque también pueden

fijarse con sustancias químicas como formaldehidos, ácidos y alcoholes. La fijación produce

habitualmente un encogimiento de las células; la tinción por el contrario hace que parezcan

mayores. Después de la fijación viene la tinción. Los colorantes son generalmente compuestos

orgánicos que tienen afinidad específica por los materiales celulares, muchos están cargados

positivamente (catiónicos; azul de metileno, cristal violeta y safranina) y se combinan con

intensidad a los constituyentes celulares cargados negativamente (ác. nucleicos y polisacáridos).

Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones; eosina, rojo Congo, etc.) que se

combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas). La cantidad,

funcionalidad y especificidad de los colorantes es muy amplia. Si se desea aumentar el contraste,

son suficientes métodos simples de tinción. El azul de metileno es un buen ejemplo de tinción

simple pues no oscurece los detalles celulares.

Las tinciones son de gran utilidad pero pueden conducir a errores por la formación de “artefactos”

que asemejan estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales inducidas por

el colorante.

OBJETIVOS

Aprender la técnica de preparación de un frotis, fijación y coloración más utilizada en

microbiología

Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas y Gram negativas

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras de bacterias

Mechero Bunsen

Cerillos

Marcador indeleble

Portaobjeto

Juego de colorantes para tinción de

Gram

Puente para teñir las laminillas

Aceite de inmersión

Papel especial para limpiar lentes de

microscopio

1. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio y sin grasa una gota de agua destilada

si la muestra es sólida. Tomar una pequeña cantidad de cultivo con el asa o con un

hisopo y ponerla sobre la gota de agua. Dispersar el sólido con movimientos

circulares hasta que se observe una suspensión homogénea.

2. Extienda la muestra en el portaobjetos para facilitar el secado.

3. Para facilitar la fijación de la muestra al vidrio, pase varias veces éste por la llama

azul del mechero.

4. Colocar las laminillas en un puente, cubrir la muestra completamente con cristal

violeta y dejar reposar por 1 min. Enjuagar con agua.

5. Añadir solución de lugol (yodo) y dejar reposar 1 minutos. Enjuagar.

6. Agregar alcohol-acetona por 2 segundos. Enjuagar.

7. Añadir solución de safranina hasta cubrir la muestra y dejar reposar por 30

segundos. Enjuagar.

8. Después de secar observar al microscopio

Bacterias empleadas en la práctica:

Pseudomona sp

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Salmonella typhi

Citrobacter sp

RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Bacteria Gramm + Gramm -

Pseudomona sp

S. aureus

E. coli

S. typhi

Citrobacter sp

La técnica de tinción de Gram utilizada para clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram

negativas en función del grosor y la composición de la pared celular bacteriana, tiene una utilidad

indiscutible. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así

como para prevenir la lisis osmótica. La sustancia que forma la pared celular bacteriana que

confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en

varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente,

80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-

negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y

está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y

lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.

Los resultados de la tabla anterior fueron extraídos de la literatura puesto que la preparación de los

frotis probablemente se llevó a cabo de manera incorrecta y no se observó microorganismos en los

portaobjetos. En este reporte utilizamos el método descrito en el manual de prácticas sin embargo

en la literatura consultada se encontraron pequeñas variaciones en el procedimiento.

El Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución

Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona.

Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. En el párrafo

anterior se indica un reposo de 20 segundos únicamente después de agregar la safranina, pudiendo

esto afectar la tinción.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I₂; el KI simplemente hace soluble el I₂ en agua. El I₂ entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram-positivas como las Gram-negativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I₂-cristal violeta. Algunos organismos (Gram-positivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram-negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula . La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram-positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido). Después de la decoloración las células Gram-positivas son todavía azules, pero las Gram-negativas son incoloras. Habitualmente se usa un colorante de color rojo, como la safranina para contraste; después de la coloración de contraste las células Gram-negativas son rojas, mientras que las Gram-positivas permanecen azules.

Muy probablemente la mala ejecución de la tinción de Gram provocó que no se observaran bacterias en el microscopio a 10X, 40X y 100X.Esta mala ejecución se refiere a inexactitud en los tiempos de reposo y cantidad de agua para lavar el frotis. Una excesiva cantidad de agua puede arrastras los reactivos. Aunado a esto, los objetivos del microscopio se encontraban sin mantenimiento y sucios. Explicando así el porqué de los resultados.

CONCLUSIÓN

La tinción de Gram es muy útil en la microscopía siempre y cuando se lleve a cabo respetando los

tiempos de reposos, cantidad de agua con que se enjuaga el frotis y el equipo de laboratorio se

encuentre en buenas condiciones.

BIBLIOGRAFÍA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas

http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli

http://es.wikipedia.org/wiki/Fiebre_tifoidea

http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus

http://en.wikipedia.org/wiki/Citrobacter