Citocromo C Oxidasa El complejo IV cataliza la transferencia de electrones desde el citocromo c al oxigeno que es el aceptor electrónico terminal para formar agua en un mecanismo acoplado a la translocación de protones a través de la membrana. Este complejo enzimático con múltiples subunidades de la mitocondria de mamíferos contiene 13 subunidades con una masa molecular de 200000 Da y contiene como componente redox dos citocromos, a y a3 y dos centros de cobre conocidos como CuA y CuB . Solo tres subunidades del complejo IV de mamíferos están codificadas en el ADN mitocondrial. La subunidad I, el polímero mayor del complejo, contiene 12 hélices transmembrana pero carece de dominios extra membranosos significativos. Dos grupos hemo, a , a3 están unidos a la subunidad I de tal manera que el hierro del anillo de la protoporfina está coordinado con átomos de nitrógeno de residuos de histidina conservados. Los planos tanto del hemo a como del a3 son perpendiculares a la membrana. Además, la subunidad I contiene un átomo de cobre (CuB ) que con el hemo a3 forma un centro binuclear implicado en la transferencia de electrones desde el hemo a al oxígeno. La subunidad II de la citocromo c oxidasa tiene un dominio grande que sobresale del lado citosolico de la membrana interna, en donde se une el citocromo c reducido, y que contiene dos átomos de cobre (Cu A ) unidos a través de grupos sulfhidrilo a dos cisteínas. La subunidad III contiene siete hélices transmembrana sin prácticamente dominios extra membranosos negligibles pero no contiene ningún transportador redox. Las subunidades II y III están localizadas en lados opuestos de la subunidad I.

Lactato DeshidrogenasaEs una enzima tetrámera que pertenece a la clase oxido-reductasa. Se encuentra ubicada en el grupo de enzima no funcionales, que son enzimas que participan en el metabolismo intermedio, la concentración tisular de estas enzimas es miles de veces más alta que en plasma. (2) Esta enzima la podemos hallar en el corazón, hígado, músculos, eritrocitos, plaquetas y nódulos linfáticos. Su síntesis empieza desde dos genes individuales distintos, los cuales originan polipéptidos estructuralmente diferentes pero con la misma actividad catalítica. Existen 5 formas isoenzimáticas distintas codificadas por genes distintos.(1)

La función de esta enzima es reducir reversiblemente el piruvato a lactato.

Esta enzima está relacionada con el infarto de miocardio, hemólisis y enfermedades del parénquima hepático. Los niveles séricos aumentados de LDH se observan en muchas circunstancias como ser anemias megaloblásticas, infarto de miocardio y pulmonar, etc. El gran número de situaciones que aumenta la actividad de LDH hace relativa su utilidad diagnóstica. Sin embargo, es muy útil en el seguimiento de la quimioterapia del cáncer puesto que la respuesta en la terapéutica se acompaña por una disminución del nivel sérico de esta enzima. La determinación de la actividad de LDH es útil en el diagnóstico del infarto de miocardio y pulmonar. Son muy característicos los niveles de LDH elevados en los casos de infarto de miocardio y se observan valores altos ya a las pocas horas del comienzo del aparente infarto. Por si sola, la determinación de LDH no es determinante de lesión de ningún órgano en particular. Hay que tener en cuenta que es necesario evitar la hemólisis de la muestra de sangre, para una correcta determinación.

La LDH cataliza la reducción de piruvato a lactato y la simultanea oxidación de NADH a NAD+

Piruvato + NADH + H+ ↔ Lactato + NAD+El NADH absorbe en el rango de la luz ultravioleta (340 nm), propiedad utilizada para la determinación enzimática. La mezcla de reacción aporta piruvato y NADH, como sustratos, en un medio de pH adecuado (buffer). La reacción se inicia por el agregado de muestra en estudio que contiene la LDH a dosar. Utilizando un espectrofotómetro se mide la disminución de absorbancia a 340 nm, indicador del consumo de NADH. La velocidad de desaparición del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra.

LDH

Reacciones en las que esta enzima participa

Precursor Enzima Producto ciclo

Piruvato Lactato deshidrogenasa

Lactato Ruta 11: ciclo piruvato-isovalerato- isoleucina

Precursor Enzima Producto Ciclo

Lactato Lactato dehidrogenasa

Piruvato Ruta 11: vía piruvato-isovalerato-isoleucina

Precursor Enzima Producto CicloPiruvato Lactato

deshidrogenasaLactato Ruta 8: Ciclo de Krebs

1 mL1 mL0.5mL -

-1 mL

0.5 mL-

1 mL1 mL

-0.5ml

- 1 mL

-0.5 mL

Lactato de sodio 0,1 MSol. Azul de metileno

Homogenizado de hígadoHomogenizado de corazón

Parte ExperimentalEnsayo Nº 2:

Seguimiento de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa

1 2 3 4

Mezclar

1 2 3 4

1 mL 1 mL 1 mL 1 mLAceite mineral

Dejar en reposo hasta por 20 minutos en baño Maria y observar los resultados.

Agitar vigorosamente y observar.

Ensayo N° 3: Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa.

Agregar a cada tubo los reactantes que indican en el cuadro adyacente respectivamente, luego agitar vigorosamente, para favorecer la difusión del oxígeno dejar en reposo 30 minutos, agitando continuamente, observar la progresión de las reacciones y el comportamiento de cada uno de los sistemas.

Tubo 1:

ANTES DESPUES

Tubo 2:

ANTES DESPUES

Agitar

Agitar

REACTIVO CANTIDADSol. P- fenildiamina 1ml

Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4 1,5 ml

REACTIVO CANTIDAD

Homogenizado de corazón 1ml

Sol. P- fenildiamina 1ml

Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4 1,5 ml

Tubo 3:

ANTES DESPUES

Tubo 4:

ANTES DESPUES

Agitar

Agitar

REACTIVO CANTIDADHomogenizado de corazón 1mlCianuro de sodio 0,1 M (inhibidor)

0,5 ml

Sol. P- fenildiamina 1ml

REACTIVO CANTIDADHomogenizado de corazón 1mlMalonato de sodio 0,1 M (inhibidor)

0,5 ml

Sol. P- fenildiamina 1ml

1 2 3 4 5 6 7Azul de metileno (0,02%) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Buffer fosfato 0.1 M pH 7,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5Succinato de sodio 0.1 M 0,2 0,2 - 0,2 - 0,2 -

Agua bidestilada - - 0,2 - 0,2 - 0,2Malonato de sodio - 0,3 0,3 - - - -

Cianuro de sodio 0,1 M - - - 0,3 0,3 - -Ferricianuro de potasio 0.1 M - - - - - 0,3 0,3

Homogenizado de higado 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5Ensayo Nº 4: Seguimiento de la reacción catalizada por la succinato deshidrogenasa

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Aceite mineral

Dejar en reposo hasta por 20 minutos en baño Maria y observar los resultados.

Agitar vigorosamente y observar.

RESULTADOS

Ensayo N° 2:

Homogenizado Reacción catalizada por la LDHHígado +

Corazón ++++ Alta + media - baja

Figura 1. De izquierda a derecha: reacción catalizada por la LDH presente en el homogenizado de hígado y reacción catalizada por la LDH presente en el homogenizado de corazón.

Ensayo 3:

La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina en presencia del sistema de citocromos.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Homogenizado de corazón (contiene a los

citocromos y al citocromo c oxidasa).

Homogenizado de corazón (contiene a los

citocromos y al citocromo c oxidasa).

Homogenizado de corazón (contiene a los citocromos y al citocromo c oxidasa).

inhibidor inhibidorSol. p-

fenilendiamina Sol. p-fenilendiamina Sol. p-fenilendiamina Sol. p-fenilendiamina

La reacción se da con el oxígeno del medio

La p-fenilendiamina reacciona con el

citocromo c oxidado y con el oxígeno del

medio.

La p-fenilendiamina reacciona con el

oxígeno del medio y con casi nada

citocromo c oxidado.

La p-fenilendiamina reacciona con el oxígeno

del medio y con poco citocromo c oxidado.

Debido a la presencia del inhibidor la reacción se hiso demasiado lenta

Debido a la presencia del inhibidor la reacción se

hiso lenta

Color :palo roza – marrón

Color: azul-marrón oscuro Color: marrón

Color : azul claro-marrón oscuro

Tiempo en que se demoró para cambiar

de color: 3 minutos

Tiempo en que se demoró para cambiar

de color: 4 minutos

Tiempo en que se demoró para cambiar de color a lo esperado

que es azul: 30 minutos a más.

Tiempo en que se demoró para cambiar de color: 5

minutos.

Ensayo 4:

Inhibidor Inhibición de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Malonato ++Ferricianuro de potasio 0.1M +

Cianuro de potasio 0.1M -++ Alta + media - baja

Figura 2. De izquierda a derecha: tubo 1 – control, tubo 2 y 3 – inhibición del malonato, tubo 4 y 5 – inhibición del cianuro de potasio, tubo 6 y 7 – inhibición del ferrocianuro de potasio.

Discusiones1. La lactato deshidrogenasa es una enzima que tiene una estructura cuaternaria

tretamérica, resultante de la combinación de los monómeros H o M, que reciben esta denominación atendiendo a su localización preferente en el corazón (heart) o músculo (muscle). La LDH se encuentra ampliamente distribuida en el citoplasma celular de casi todos los tejidos, aunque es especialmente relevante su presencia en las células hepáticas. (4) El seguimiento de reacción de esta enzima mediante la observación de la decoloración de un indicador (azul de metileno) nos indica que existe mayor cantidad de LDH en el corazón (LDH1) que en el hígado (LDH5), contrastando este resultado con los resultados de electroforesis obtenidos en los trabajos de Wieland y Pflenderer (1961).

2. En el tubo 1 tenemos la solución p-fenilendiamina, se utiliza principalmente como un producto intermedio de colorante, y la solución buffer pH 7,4 que es para incrementar el volumen y darle el medio adecuado. La p-fenilendiamina es oxidada por el agente oxidante, que en este caso es el oxígeno que capta del medio por lo tanto transfiere electrones al oxígeno y éste se reduce. Esta reacción es lenta y reversible, por lo tanto es notable a medida de que sea mayor el tiempo de contacto de la p-fenillendiamina con el oxígeno ya que se intensifica el color de rosa palo a marrón.

En el tubo 2 La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina en presencia del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.La actividad del complejo citocromo c oxidasa es la de transferir un electrón de cada una de las moléculas de citocromo c al oxigeno molecular además contiene Cu el cual cambia su carga +2 a +1 en la reducción, el receptor final de electrones es el oxígeno. La subunidad II de la citocromo c oxidasa tiene un dominio grande que sobresale del lado citosolico de la membrana interna, en donde se une el citocromo c reducido para la transferencia de electrones. Los electrones se transfieren desde el citocromo c reducido al sitio CuA de la subunidad II y, a continuación, al hemo a de la subunidad I del complejo IV .Los electrones se transfieren a continuación al centro binuclear que está formado por CuB y hemo a3 en donde se produce la transferencia final de electrones al oxígeno. La p-fenilendiamina son aminas aromáticas primarias, derivados diamino del benceno. La citocromo oxidasa no reacciona directamente con la p-fenilendiamina pero oxida el

citocromo c, el que a su vez oxida al p-fenilendiamina. El compuesto básico de los reactivos, la fenilendiamina, es metilado. Cuando mas grupo metilados se introducen en el radical amino (NH2) el color es más azul; y si se introducen tres grupos fenilo en lugar del metilo, el color es aún más oscuro.

En el tubo 3 empleamos el homogenizado de corazón, donde la presencia del complejo citocromo C oxidasa es mucho mayor, este complejo contiene moléculas de citocromo oxidasa (enzima) que tiene hierro hémico (a y a3) y además cobre. El hierro hémico en el citocromo cambia de +3 a +2, al ser reducido, el cianuro de sodio es sustancia altamente toxica, cuando entra en contacto con la enzima citocromo oxidasa actúa como tóxico a través de la inhibición del complejo citocromo oxidasa, el cianuro forma un complejo estable con la citocromo oxidasa, ya que tiene afinidad por el Fe ´+3; pero tiene más afinidad por la metahemoglobina que por la citocromo oxidasa y juntos forman cianometaglobina(8,9). El cianuro actúa como un inhibidor de tipo no competitivo, la citocromo oxidasa es una oxido-reductasa; y como tal, contiene hierro en su núcleo porfirínico, este hierro puede ser afectado por el cianuro(10). Produce un bloqueo en la función de los citocromos (complejo citocromo-citocromo oxidasa), el cianuro se une de manera covalente y bloquea el ingreso de O2 a nivel intracelular. El cianuro es transportado a los tejidos, al llegar a la célula penetra y se libera el cianuro. Este tipo de inhibidor puede actuar de dos formas, puede interactuar con la enzima o con el complejo enzima-sustrato, esta inhibición no puede ser superada. Esto se evidencia al no cambiar el color del p-fenilendiamina que es rosa palo a marrón.

En el tubo 4 debido que presenta un inhibidor competitivo como es el malonato de sodio la reacción ya antes mencionada de la transferencia de electrones del citocromo c al oxigeno será más lenta debido a que el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de la enzima en el que también se une el citocromo c; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima disminuyendo su actividad es por eso que se tarda en cambiar de color.

3. La succinato deshidrogenasa, una enzima del ácido cítrico que actua en la conversión de succinato a fumarato, es inhibida en forma competitiva por el malonato, que tiene una estructura similar al succinato(11), los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de succinato. La inhalación por o la ingestión de ácido cianhídrico gaseoso o cianuro de potasio produce una rápida inhibición de la cadena de transporte elctronico mitocondrial a nivel de la citocromo oxidasa.(12) El cianuro es un inhibidor enzimático no específico (succinato deshidrogenasa, superóxido dismutasa, anhidrasa carbónica, citocromo oxidasa, etc.) inhibiendo su acción y de esta manera bloqueando la producción de ATP e induciendo hipoxia celular.(13) El seguimiento de la inhibición de la enzima causada por las sustancias utilizadas nos corrobora que el malonato es el que mejor inhibe a la succinato deshidrogenasa por encima del cianuro de potasio y ferrocianuro de potasio; sin embargo, se determinò que el ferrocianuro de

potasio es mejor inhibidor que el cianuro de potasio, no encontrándose información que respalde tal efecto, abriendo camino a posteriores investigaciones con respecto al efecto entre aquellas dos sustancias.

Conclusiones:1. Se pudo identificar satisfactoriamente, mediante un análisis cualitativo, la actividad del

lactato deshidrogenasa, en diferentes muestras de tejidos animales (Tejido hepático y cardíaco de res).

2. En este ensayo pudimos concluir que el cianuro es un inhibidor no competitivo que se une a la Hb formando Cianohemoglobina, actúa en la Citocromo oxidasa en la mitocondria de las células, por lo que éstas no pueden captar O2 y hay Hipoxia, Anoxia y Acidosis láctica. Actúa a nivel IV (citocromo oxidasa).El malonato es un inhibidor y actúa a nivel

3. Se determinó que el malonato tiene mayor inhibición que el cianuro y el ferricianuro. A su vez el ferricianuro tiene mayor actividad inhibitoria que el cianuro. El malonato actúa a nivel de segundo complejo; el cianuro al nivel del cuarto, por lo cual determinamos que las actividades de inhibición entre el malonato y los compuestos de cianuro no son las mismas debido a que actúan en diferentes niveles de la cadena trasportadora de electrones.

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8. Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/ Text and Color Atlas. Disponible en:http://books.google.com.pe/books?id=jyVQueKro88C&dq=citocromo+oxidasa+prueba+p-+fenilendiamina&hl=es&source=gbs_navlinks_shttp://wp.cedha.net/wp-content/uploads/2011/06/efecto_cianuro_en_la_salud_humana.pdf

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10. Evelyn Rodríguez Cavallini , “Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.”Editorial Universidad de Costa Rica. Disponible en: http://books.google.com.pe/books?id=vwB0fgirgN0C&pg=PA213&lpg=PA213&dq=citocromo+c+oxidasa+y+pfenilendiamina&source=bl&ots=xXvcy_qhxl&sig=KOVuWLndJAlQyzYWI1Ncxs2Zv_Y&hl=es&sa=X&ei=UXetUZDkB6b84APM-IHwBQ&ved=0CDUQ6AEwAw#v=onepage&q=citocromo%20c%20oxidasa%20y%20p-fenilendiamina&f=false

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