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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

Facultad de Ingeniera Ambiental

MICROBIOLOGA SANITARIA I

INFORME DE LABORATORIO N8

Ttulo:

CONTROL MICROBIOLGICO DE AGUAS. DETERMINACIN

DEL NMP DE COLIFORME TOTALES Y COLIFORMES

TERMOTOLERANTES POR LA TCNICA DE TUBOS MLTIPLES.

RECUENTO DE BACTERIAS HETERTROFAS EN PLACA.

Docente:

MSc. Martn Martnez Vila

Integrantes:

Vsquez Pea Julian Gustavo 20132141E

Flores Crdenas Karen Kimberly 20123502I

2015

INFORME DE LABORATORIO N8 2015

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I. OBJETIVOS

Determinar el nmero de microorganismos existentes en el agua de muetra.

II. MARCO TEORICO

Bacterias Indicadoras de Contaminacin

Las condiciones bacteriolgicas del agua son fundamentales desde el punto de vista

sanitario. La norma bacteriolgica de calidad establece que el agua debe estar exenta de

patgenos de origen entrico y parasitario intestinal que son los responsables de transmitir

enfermedades como salmonelosis, shigelosis, amebiasis, etc.

Los microorganismos indicadores de contaminacin deben cumplir los siguientes

requisitos: fciles de aislar y crecer en el laboratorio; ser relativamente inocuos para el

hombre y animales; y presencia en agua relacionada, cualitativas y cuantitativamente con

la de otros microorganismos patgenos de aislamiento ms difcil. Tres tipos de bacterias

califican a tal fin:

Coliformes fecales: indican contaminacin fecal.

Aerobias mesfilas: determinan efectividad del tratamiento de aguas.

Pseudomonas: sealan deterioro en la calidad del agua o una recontaminacin.

Desde el punto de vista bacteriolgico, para definir la potabilidad del agua, es preciso

investigar bacterias aerobias mesfilas y, coliformes totales y fecales.

La gran sensibilidad de las bacterias aerobias msfilas a los agentes de los agentes de

cloracin, las ubica como indicadoras de la eficacia del tratamiento de potabilizacin del

agua.

Las bacterias coliformes habitan el tracto intestinal de mamferos y aves, y se caracterizan

por su capacidad de fermentar lactosa a 35C. Los gneros que componen este grupo son

Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter y Edwardsiella. Todas pueden

existir como saprofitas independientemente, o como microorganismos intestinales,

excepto el gnero Escherichia cuyo origen es slo fecal.

Esto ha llevado a distinguir entre coliformes totales (grupo que incluye a todos los

coliformes de cualquier origen) y coliformes fecales (trmino que designa a los coliformes


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de origen exclusivamente intestinal) con capacidad de fermentar lactosa tambin a 44,5C.

La existencia de una contaminacin microbiolgica de origen fecal se restringe a la

presencia de coliformes fecales, mientras que la presencia de coliformes totales que

desarrollan a 35C, slo indica existencia de contaminacin, sin asegurar su origen.

Los enterococos fecales cuyo desarrollo ocurre a 35C se usan como indicadores

complementarios de contaminacin fecal.

La validez de todo examen bacteriolgico se apoya en una apropiada toma de muestra

(recipiente estril de boca ancha y metodologa precisa), y en las adecuadas condiciones

de transporte desde el lugar de la fuente de agua hacia el laboratorio (refrigeracin,

tiempo)

El sistema de conservacin de la muestra debe ser confiable, y la misma analizada

inmediatamente o al cabo de un corto perodo entre extraccin y anlisis.

El anlisis cuantitativo de bacterias indicadoras de contaminacin en una muestra de agua

puede realizarse por dos metodologas diferentes:

Recuento directo de microorganismos cultivables por siembra de la muestra sobre

o en un medio de cultivo agarizado.

Recuento indirecto (basado en clculos estadsticos) despus de sembrar diluciones

seriadas de la muestra en medios de cultivos lquidos especficos. Se considera, al

cabo de una incubacin adecuada, los nmeros de cultivos positivos y

negativos. Esta metodologa se denomina Tcnica de los Tubos Mltiples y los

resultados se expresan como nmero ms probable (NMP) de microorganismos.

Adems de otros mtodos, se puede recurrir a aquellos en los que se aplica biologa

molecular como por ejemplo, la tcnica de hibridacin in situ por fluorescencia (FISH)

utilizando sondas marcadas en base a secuencia nucleotdica del gen 16S.

En este captulo slo se describir el primer mtodo en el cual la muestra se concentra por

filtracin sobre membrana, denominada Tcnica de la Membrana Filtrante. En ella, se

procede a filtrar un volumen determinado de muestra (normalmente 100 mL) a travs de

membranas de steres de celulosa generalmente con dimetro de poros de 0,45 m y en

algunos casos de 0,22 m. Posteriormente, la membrana se deposita sobre un medio de

cultivo selectivo y bajo condiciones favorables (temperatura y tiempo de incubacin) y

sobre la membrana desarrollan colonias aisladas con aspectos caractersticos que permiten

la identificacin y el recuento. Conociendo el volumen de muestra filtrada es posible

determinar el nmero de UFC por unidad de volumen. La obtencin de resultados


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confiables requiere un intercambio de nutrientes a travs de los poros de la membrana, por

ello se debe evitar la filtracin de aguas con alto contenido de material en suspensin que

pueden obstruir las membranas. Adems, el nmero de colonias desarrolladas sobre la

membrana debe ser inferior a un determinado valor (variable segn los microorganismos

y la composicin del medio que condiciona el tamao de las colonias) generalmente

comprendido entre 80 y 100. A valores superiores, la proximidad de las colonias puede

conducir a resultados inexactos. Los medios de cultivos usados, las temperaturas y tiempos

de incubacin, y el color de las colonias tpicas de bacterias indicadoras de contaminacin

se detallan en la tabla 5.

Medio EC:

Uso

Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli

en agua, alimentos y otros materiales.

FRMULA (en gramos por litro)

E. C. Medio

Triptena...........................20.0.


4

Lactosa..............................5.0.

Sales biliares N 3..............1.9.

Fosfato dipotsico ............4.0.

Fosfato monopotsico ......1.5.

Cloruro de sodio ..................5.0.

pH final: 6.9 0.2

Instrucciones

Suspender 37,4 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar

con agitacin frecuente y llevar a ebullicin para su total disolucin. Distribuir en tubos de

ensayo que contengan campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15

minutos.

Caractersticas del producto

Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre deslizamiento.

Medio de cultivo preparado: color mbar claro.

Verde Brillante Bilis

Uso

Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la

tcnica del nmero ms probable.

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado

desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el

desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la

lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la

fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.

FRMULA (en gramos por litro)

Bilis de buey deshidratada.............................20.0

Lactosa............................................................10.0

Peptona............................................................10.0

Verde brillante...................................................0,0133

pH final: 7.2 0.2

Instrucciones

Suspender 40 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo

con campanita de Durham. Calentar a 100 C durante 30 minutos. No esterilizar en

autoclave.

Caractersticas del producto


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Medio de cultivo deshidratado: color verde, homogneo, libre deslizamiento.

Medio de cultivo preparado: color verde.

Caldo LST

Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los microorganismos

fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos. La triptosa es la fuente de

nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es el hidrato de carbono

fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene

el balance osmtico. Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el

desarrollo de la flora acompaante. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y

gas, ste ltimo se evidencia al utilizar las campanas Durham.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Nomenclatura de Coliformes Totales / Coliformes Fecales

Incubadora a 35C

Autoclave

Bao Mara 44.5 0.5C

Frascos con agua de dilucin (frascos con tapa rosca con 90ml de agua peptonada)

Caldo Lauril sulfatado triptosa (LST) Doble concentracin 2x, volumen 10ml en

tubos 16150 con tubos Durham invertidos 7510ml.

Caldo EC volumen de 10ml en tubos de 16150 con tubos Durham invertidos

7510ml.

Pipetas estriles 10ml.

Pipetas estriles 1ml.

Caldo Lauril sulfatado triptosa (LST) Simple concentrado (x) volumen 10ml en

tubos de 16150 ocn tubos Durham invertidos.

Recuento en Placa (BM)

Agar TSA.

Placas Petri grandes.

Pipetas.


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IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Numeracion de Coliformes totales / Coliformes fecales:


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Recuento de Bacterias Hetertrofas:


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V. RESULTADOS

DETERMINACION DEL NMP DE COLIFORMES:

Resultados de la prueba presuntiva

DILUCIONES RESULTADOS

10 (Doble concentracin [2X]) Formacin de gas en los 3 tubos

1 (Concentracin simple [X]) Formacin de gas en los 3 tubos

10-1 Formacin de gas en los 3 tubos



Resultados de la prueba confirmativa3 FORMACION DE GAS EN CALDO BRILA


10 [2X] Formacin de gas en los 3 tubos

1[X] Formacin de gas en los 3 tubos



10-3 Formacin de gas en un 1 tubo

FORMACION DE GAS EN CALDO EC:


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10 [2X] Formacin de gas en 2 tubos

1[X] Formacin de gas en 2 tubos



10-3 Formacin de gas en un 1 tubo

RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS

VI. CONCLUSIONES

- Se lleg evidenciar la presencia de coliformes totales al tener resultados positivos en los tubos del caldo brila. - Se lleg evidenciar la presencia de coliformes fecales al tener resultados positivos en los tubos deld caldo EC.

VII. RECOMENDACIONES

- Todos los materiales a trabajar debern ser estriles

- Todo proceso deber ser en presencia del mechero

- La muestra debe ser tomada en un recipiente estril

- Prestar atencin hacia los tubos positivos (con aire)

Dilucin Muestra original 101 102 103 10-4

N de colonias 220 44 21 - -


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VIII. BIBLIOGRAFIA

o MANUAL PRACTICO DE MICROBIOLOGIA MASSON Medios de cultivo

pg. 7-10

o http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lauril.htm

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