EXTRACCIN Y ELECTROFORESIS DE ADN VEGETAL OBTENIDO DE ARVEJA

J. Carrillo-Morenoa, J.P. Jimnez-Moncadaa, L. Arias-Loperaa, M.E. Higuita-Ramrezaa Estudiantes Ingeniera Qumica, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia

Resumen

En el presente artculo se ilustra un proceso para la extraccin de una muestra de ADN vegetal obtenido de arveja por mtodos fsicos como maceracin y congelacin y mtodos qumicos mediante el uso de compuestos orgnicos como Tris, EDTA, cloroformo, CTAB, mercaptoetanol y alcoholes (isoamlico, etanol, isopropanol). Adems se muestran y justifican los resultados obtenidos a partir de datos experimentales como el peso y la absorbancia del ADN vegetal extrado del cual se obtuvo un valor de 1.324 que indica que hay contaminacin por protenas y una cantidad de 81.65 g de ADN de doble cadena en la muestra. Se presenta un anlisis cualitativo de la electroforesis de ADN realizada al ADN vegetal extrado en un gel de agarosa para la separacin de las macromolculas en la solucin donde se ve que hubo migracin de molculas a travs del montaje.

Palabras clave: extraccin de ADN, arveja, absorbancia, pureza, contaminacin, electroforesis de ADN, gel de agarosa.

Abstract

This article illustrates a process for extracting a DNA plant sample obtained from pea by physical methods such as macerating and freezing and chemical methods using organic compounds such as Tris, EDTA, chloroform, CTAB, mercaptoethanol and alcohols (isoamyl , ethanol, isopropanol). Also depicted and justify the results obtained from experimental data such as weight and the absorbance of the extracted plant DNA which was obtained a value of 1.324 indicates that there is contamination by proteins and an amount of 81.65 g of double stranded DNA in the sample. It presents a qualitative analysis of DNA electrophoresis on DNA extracted plant in an agarose gel for separation of macromolecules in solution where is seen migration of molecules through the assembly.

Keywords: DNA extraction, pea, absorbance, purity, contamination, DNA electrophoresis, agarose gel.

1. INTRODUCCIN

El ADN es la abreviatura del cido desoxirribonucleico (en ingls, DNA). Es una molcula presente en todas las clulas de los seres vivos y es la encargada de codificar todo lo que nosotros somos, desde el color del pelo hasta las protenas que tenemos en nuestra sangre. El ADN es una molcula cargada que est asociada a protenas y en el caso de los organismos eucariontes est encerrado dentro de un ncleo [1]. Existen diferentes mtodos fsicos y qumicos de extraccin de ADN, algunos ejemplos son: salting-Out, chelex y el mtodo de fenol-cloroformo; esta ltima es una tcnica que usa solventes orgnicos y permite obtener ADN de muy buena calidad y cantidad [2]. La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lpidos de las membranas celulares y las rompen. Un detergente es una solucin capaz de disolver las membranas y as permitir que stas se separen del resto de los componentes. Adems este detergente es capaz de unir las protenas que estn junto al ADN. La sal de mesa tiene un catin que se une a la molcula de ADN y hace que cambie sus propiedades qumicas, lo que evita la unin de las protenas al ADN. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa [3]. El alcohol adems disuelve los azcares y protenas [1]. La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propsitos analticos, pero puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas parcialmente antes de aplicar espectrometra de masas, PCR, clonacin o secuenciacin de ADN. [4] La electroforesis de cidos nucleicos es el mtodo habitual para separar, identificar y purificar molculas o fragmentos de DNA y RNA. Es un mtodo de separacin de mezclas de molculas biolgicas. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta. En los tampones habitualmente utilizados, los cidos nucleicos estn cargados negativamente y migran hacia el nodo. Cada molcula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relacin carga/tamao es prcticamente constante e idntica para todas las molculas, independientemente de su tamao (un nucletido tendr la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb). La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los cidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relacin carga/tamao), migran en funcin de su tamao y/o conformacin. Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeos de DNA (5-500pb), as como para la mayora de los RNA. Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulacin) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo elctrico constante; para separar fragmentos de tamao superiores a 50kb se utiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la direccin del campo elctrico cambia peridicamente. Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un colorante especfico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los cidos nucleicos, o la plata, para las protenas. Asimismo se emplean otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz ultravioleta (radiacin UV), se puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografa. Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirn separaciones paralelas. Cada separacin mostrar distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dar un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o ms componentes. Las bandas en diferentes separaciones paralelas que estn a la misma distancia del principio significa que contienen molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamao. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamao de la molcula [5]. En la prctica de laboratorio y el informe tenemos como objetivos utilizar una tcnica sencilla para poder extraer el ADN de un producto natural comprendiendo las etapas para el aislamiento de la molcula, determinar su pureza y familiarizarse con mtodos de separacin de cidos nucleicos mediante electroforesis en un gel de agarosa e interpretar los datos cualitativamente.

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1. Extraccin de ADNPara la degradacin de la pared celular se usaron mtodos fsicos, primero se debi congelar por 10 minutos, macerar el material de trabajo y posteriormente se pes una cantidad de ste. En la inhibicin de nucleasas se utiliz 1 mL de solucin buffer 1 que contiene: 50 mM Tris-HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 10% polyetilenglicol. Luego de una agitacin moderada se procedi a centrifugar a 5000 rpm por un tiempo aproximado de 10 minutos y a una temperatura de 4C; se descart el sobrenadante y para resuspender el slido y solubilizar la membrana celular se agreg 500 L una solucin buffer 2 que contiene: 50 mM Tris HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 1% Sodio Sarkosyl; 710 mM NaCl; 0.1% Centiltrimetilamonio (CTAB). En la desnaturalizacin y separacin de protenas se us una solucin de cloroformo-alcohol isoamlico en una proporcin 24:1. Se hizo uso nuevamente de la centrifugacin en el mismo intervalo de tiempo y temperatura y la fase acuosa fue transferida a otro tubo conservando y utilizando slo la solucin orgnica restante. En la etapa de precipitacin se utiliz 2 volmenes de isopropanol a una temperatura de -20C; para eliminarlo tambin se us el equipo de centrfuga. Hecho esto se lav con etanol al 70% y nuevamente se centrifug la solucin para eliminar el alcohol. Finalmente, se resuspendi el precipitado en 300 L de Tris-Edta y se ley la absorbancia en un espectrofotmetro a 260 nm. Para este procedimiento fueron indispensables otros materiales como bistur, mortero con el cual se macer la arveja objeto de estudio de la cual se extrajo el ADN, tubos de ensayo con tapa, balanza analtica para pesar el tejido luego de macerar la arveja, pipetas de 5ml y micropipetas, equipos y sistemas de refrigeracin como una centrfuga refrigerada y un bao de agua a 60C para la incubacin de la muestra, puntas para micropipetas y tubos eppendorf.

2.2. ElectroforesisLos reactivos utilizados fueron: solucin buffer de Tris-Borato (TBE) con pH 8.0 la cual se prepar con 54 g de Tris base, 27.5 g de cido brico y 20 mL de una solucin de EDTA 0.5 M, ajustando pH y volumen a 1L; gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE, el cual se agrega para cubrir el gel 1 mm por encima de su parte superior. Lo anterior fue realizado en el laboratorio por los monitores antes de comenzar la prctica. Adicionalmente se utiliz buffer de carga que est compuesto por una solucin de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en agua en una proporcin 1:1, para mezclar con las muestras de ADN y colocar la mezcla en los pozuelos del gel de agarosa ayudados por micropipetas. Posteriormente se aplic una corriente elctrica con el fin de impulsar la migracin de la molcula aproximadamente unos 10 cm en el gel; esto se observ por la migracin de color. En una solucin con bromuro de etidio de concentracin 0.5 g/mL el gel fue sumergido. Se utiliz un transiluminador UV para observar las bandas de ADN. Los materiales utilizados fueron placa de vidrio sobre la cual se prepar el gel horizontal, cinta de enmascarar, micropipetas con las cuales se midieron los volmenes y se adicionaron las muestras mezcladas dentro del gel de agarosa y mechero utilizado en la preparacin del gel.

Todos los implementos (reactivos e instrumentos) utilizados y anteriormente mencionados fueron facilitados por los laboratorios de la Universidad de Antioquia, lugar en el cual se realizaron los procedimientos.

3. RESULTADOS

Tabla 1. Datos de laboratorio y resultados

Peso muestra (mg)75.5

Absorbancia = 260 nm1.633

Absorbancia = 280 nm1.233

Pureza11.324

Cantidad de ADN2 (g)81.65

1 La pureza de ADN obtenido se calcula por la relacin 2 La cantidad de ADN de doble cadena se obtiene por la siguiente ecuacin [6]: ; para nuestro caso el factor de dilucin fue de 1 mL de H2O.

De acuerdo a los resultados obtenidos mediante la relacin para determinar la pureza del ADN obtenido podemos afirmar que hubo una posible contaminacin por protenas ya que el valor hallado se encuentra por debajo del rango de 1.7 [7], aunque podemos decir que el valor de pureza obtenido es aceptable ya que el resultado no est por debajo de 1.0 valor en el cual se considera que se presenta alta contaminacin por protenas. La cantidad de ADN calculada es coherente segn la cantidad de muestra que se pes en el laboratorio, ya que el orden de unidades de la cantidad de ADN calculada (g) es menor que el orden de la cantidad pesada de la muestra (mg).

Grfica 1. Imagen tomada en el laboratorio de la electroforesis de ADN en gel de agarosa.

De la imagen puede verse que no es posible hacer un anlisis cuantitativo de los pares de bases contenidos en el ADN vegetal, aunque el nmero de pares de bases de la arveja es de aproximadamente 3000. Sin embargo, cualitativamente puede verse que hubo una migracin de molculas en el carril donde se ubicaba el patrn y en uno de los carriles iniciales de izquierda a derecha. El factor luz tampoco permite que la imagen sea suficientemente ntida para hacer una caracterizacin, adems de otros eventos que antecedieron a la prctica de lo cual se hablar en la seccin de causas de error. 4. CAUSAS DE ERROR.

Muchas son las razones para justificar el resultado de pureza de ADN obtenido (1.324). Empezamos por las condiciones del material de inicio, suponiendo que los mtodos fsicos no fueron suficientes o correctamente realizados para romper las primeras barreras de extraccin y en esta etapa pudo haber contaminacin e interferencias por material biolgico humano [2]. En la etapa de extraccin mediante solventes orgnicos una cantidad significativa de clorofila qued disuelta en la fase acuosa cuando lo debido fue que hubiese quedado disuelta en la fase orgnica, por lo tanto, existe un factor de contaminacin por clorofila; esto lo pudimos deducir porque el pellet tena un color bastante verdoso, caracterstica del componente. Es posible tambin que la cantidad de solucin a la que lemos la absorbancia no haya estado bastante concentrada y se haya descartado una cantidad significativa con el sobrenadante. Aunque de la imagen es posible ver una migracin de molculas no nos es posible percibir un nmero de bandas. Un hecho que antecedi a la prctica fue que la nevera donde se almacenaba el patrn en el laboratorio no estuvo en funcionamiento durante un tiempo por causas propias del quehacer universitario por lo que el patrn pudo haberse daado o deteriorado y esto no permiti ver bandas definidas, adems del factor luminosidad UV mencionado en la seccin anterior, ya que para el uso de este tipo de luz se necesita un cuarto totalmente oscuro y haba gran filtracin de luz visible a la habitacin; lo anterior no permite que hagamos un anlisis cuantitativo del ADN vegetal extrado para hacerlo, sugeriramos en situaciones futuras usar mtodos electrnicos como el mtodo PCR que permite hacer una cuantificacin bastante ajustada sobre las bandas que se obtienen.

5. REFERENCIAS.[1] http://www.chilecientifico.cl/ciencia-divertida-informacion-general-103/187-extraccion-de-adn.html[2] http://www.slideshare.net/marcia_karina/extraccion-adn[3] http://www.educa.madrid.org/web/ies.antoniogala.mostoles/dep_bio_archivos/EXTRACCION_DE_ADN.pdf[4] http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel[5] http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2006/electroforesis/[6] http://sebbm.es/BioROM/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf[7] http://www.bancoadn.org/documentacion/extraccionADN.pdf