UNIVERSIDAD CENTRAL DELECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA QUIMICA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGIAINDUSTRIAL TEMA: INFORME

AISLAMIENTO, SELECCIN Y PRESERVACIN DE CEPAS LEVADURIFORMES DEGRADADORAS DEL BAGAZO DE CAA DE AZCAR

Integrantes: Arboleda Marcelo Cndor Beln Cueva Nathaly Gngora Estefana Curso: 9 ALIMENTOS

INDICE

1 TEMA:............................................................................................................... 3 2 INTRODUCCIN................................................................................................3 3 MARCO TEORICO..............................................................................................4 3.1 Bagazo de caa de azcar.........................................................................4 3.1.1 Propiedades fsicas y qumicas del bagazo .........................................4 3.1.2 Componentes principales de la materia prima....................................5 3.2 Empleo de substrato orgnico por los microorganismos............................7 3.3 Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradacin . . .8 3.3.1 Levaduras degradadotas de lignina .................................................8

4 MARCO METODOLOGICO..................................................................................9 4.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS..........................................................9 Muestreo......................................................................................................9 Preparacin de la muestra...........................................................................9 4.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS.........................................................9 4.2.1 Diseo del medio de cultivo ................................................................9 AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA....................10 PURIFICACION............................................................................................10 IDENTIFICACION.........................................................................................10 SELECCIN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES.....................10 4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluacin de la capacidad degradadora de lignina.................................................................................................11 PRESERVACIN..........................................................................................11 5 BIBLIOGRAFA ................................................................................................11 6 ANEXOS..........................................................................................................14 6.1 Composicin de medios de cultivo...........................................................14

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TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIN Y PRESERVACIN DE CEPAS LEVADURIFORMES DEGRADADORES DEL BAGAZO DE CAA DE AZCAR

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INTRODUCCIN

El bagazo de caa de azcar es un material lignocelulsico constituido principalmente por celulosa, hemicelulosa ligadas fuertemente a la lignina. Tradicionalmente en los centrales azucareros este desecho se quema como una forma de limitar la disposicin final de este desecho, desperdiciando un elemento de tan valiosa importancia para diversas industrias como la fabricacin de papel, produccin de alimentos balanceados para animales y elaboracin de aglomerados para la construccin, industrias donde se usa actualmente el bagazo de caa, pero no en todo su potencial. Se obtiene como subproducto o residuo en los centrales azucareros despus de la extraccin del jugo de caa de azcar y representa aproximadamente entre el 25 y 40 % del total de la materia procesada, dependiendo del contenido de fibra de la caa y la eficiencia en la extraccin del jugo. En el Ecuador existen cultivadas 79.913 Has. de caa de azcar, y una produccin bruta de 5 618 045 TM, con un rendimiento promedio de 70,30 TM/ha. El bagazo uno de los residuos agrcolas ms abundantes con una produccin anual estimada de 158 000 toneladas, obtenidas de los 6 ingenios azucareros existentes en el Ecuador y de otros productores pequeos. El bagazo de caa tiene en su composicin 20% de lignina, y 80% entre celulosa y hemicelulosa, por lo que varias investigaciones han propuesto el uso de diversos microorganismos, cepas fngicas degradadoras de lignina, un ejemplo de estos hongos es Phanerochaete chrysosporium, que crece en cultivo liquido y se ha demostrado que secreta enzimas ligninoliticas extracelulares que tienen la habilidad de degradar numerosos compuestos aromticos policiclicos; la Ceriporiopsis subvermispora es otro hongo filamentoso capaz de realizar la biodegradacin de la lignina. Un ejemplo ms es Panus tigrinus, microorganismo que ha sido estudiado debido a su capacidad de producir lacasas y peroxidasas que atacan a la lignina, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor, Trametes subectypus, Cariolopsis gallica y heterobasidion annosum, son algunos de los microorganismos estudiados debidos a su capacidad ligninocelulitica. Por lo que este proyecto va orientado al aprovechamiento de los residuos de la extraccin del jugo de la caa de azcar, al degradar la lignina en celulosa y hemicelulosa mediante organismos levaduriformes degradadores de este compuesto. Los objetivos del proyecto fueron:

Aislar levaduras con capacidad de degradar lignina a partir del bagazo de caa de azcar.. Seleccionar las mejores cepas, de acuerdo a las condiciones de pH, temperatura y otras en las que ellas van a degradar el bagazo de caa. Identificar macro y microscpicamente las levaduras seleccionadas, y adaptarlas a un medio estable. Evaluar la capacidad de degradacin de lignina de las levaduras aisladas del bagazo de caa. Preservar las levaduras seleccionadas mediante crocongelacin.

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33.1

MARCO TEORICOBagazo de caa de azcar

La caa de azcar crece en climas tropicales y subtropicales. El bagazo es el residuo fibroso que queda de la caa despus de ser exprimida y de pasar por el proceso de extraccin. Por lo general el bagazo se utiliza en los ingenios azucareros como combustible, sin embargo para la industria papelera representa una de las materias primas ms importantes. El bagazo, subproducto de la industria azucarera, conserva una posicin nica entre las fibras no leosas consiste en que el costo de su recoleccin, la extraccin de jugo y su limpieza, son cargo del ingenio azucarero. La temporada de procesamiento de la caa dura usualmente de cuatro a seis meses, pero se extiende hasta nueve meses en Hawai, Per, Mxico. Puede reunirse y almacenarse una cantidad adecuada de bagazo durante la temporada, con el fin de lograr una operacin continua en la fbrica de pulpa en tanto llega la caa.

3.1.1

Propiedades fsicas y qumicas del bagazo

El bagazo completo esta integrado por tres componentes principales: El recubrimiento, en el que se incluye la epidermis, la corteza y el periciclo. Los mazos de fibra vascular, entre los que figuran las clulas conductoras de pared delgada asociadas con fibras de pared relativamente con estrecho lumen. El tejido bsico (parnquima) o medula, con mazos de fibra distribuidos irregularmente.

La composicin qumica de las diferentes fracciones de bagazo, incluyendo el bagazo entero, la fibra separada y la medula se indican en la Tabla 1. Tabla 1. Propiedades qumicas de las fracciones del bagazo (2) Entero 0.25 4.1 2.5 20.2 26.7 76.6 38.1 1.67 Fibra 0.12 1.8 0.9 20.8 27.9 77.8 42.4 0.7 Medula 2.5 2.8 1.9 20.2 28.4 77.7 34.8 2.29

Solubilidad en ter (%) Solubilidad en alcohol-benceno (%) Solubilidad en agua caliente (%) Lignina (%) Pentosas (%) Hemicelulosa (%) Alfa celulosa (%) Ceniza (%)

3.1.2

Componentes principales de la materia prima

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Un material de inters en las paredes celulares de la planta de la madera, es el material ligninocelulsico, el cual esta formado por celulosas y hemicelulosas enlazadas mediante lignina, un polmero aromtico altamente oxigenado, con un esqueleto de fenilpropano que se repite. Sobre esta matriz se deposita una mezcla de compuestos de bajo peso molecular llamados extractivos. a) Celulosa Es el componente ms simple encontrado en el material ligninocelulsico de las plantas, es el ms abundante en la biosfera. Esta compuesto por un polmero de residuos de D-glucosa unidos por enlaces 1,4 , (Figura-1). Cada resto presenta una rotacin de 180 respecto a los restos contiguos, estabilizada por puentes de hidrogeno intramoleculares. Debido a su estructura, las cadenas de celulosa se unen por puentes de hidrogeno intermoleculares formando agregados (microfibrillas). La celulosa y el almidn pueden ser hidrolizados para formar glucosa, pero sus estructuras son muy diferentes. La celulosa es una molcula que da estructura y soporte a la planta. Las cadenas de glucosa estn arregladas de una manera que permite que se empaquen juntas formando un cristal que es impermeable al agua. Consecuentemente el polmero celulosa es insoluble y resistente a la hidrlisis.

Fig.1 Estructura qumica de la celulosa b) Hemicelulosa Las hemicelulosas forman cadenas cortas y son polmeros heterogneos que contienen tanto hexosas (azcares de 6 carbonos como glucosa, manosa y galactosa) como pentosas (azcares de 5 carbonos como xilosa y arabinosa). Dependiendo de la especies de la planta, estos azucares se asocian con cidos urnicos formando estructuras polimricas diversas, qu pueden est6ar relacionados cercanamente tanto con celulosa como lignina. Los tres polmeros principales son los xilanos, los mananos y los arabinogalactanos. c) Lignina La lignina es un polmero complejo, tridimensional, globular, irregular, insoluble y de alto peso molecular (>10,000), formado por unidades de fenilpropano cuyos enlaces son relativamente fciles de hidrolizar por va qumica o enzimtica. sta molcula tiene diferentes tipos de uniones entre unidades aromticas de fenilpropano (Figura 2).

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Fig.2 Estructura de la lignina En las plantas, la lignina se encuentra qumicamente unida a la hemicelulosa y rodeado a las fibras compuestas por celulosa. Es responsable de la rigidez de las plantas y des sus mecanismos de resistencia al estrs y a ataques microbianos. Es especialmente abundante (20-30% del peso de la pared) en clulas conductoras (vasos xilemticos) y estructuras (fibras) con engrosamiento secundario. En cuanto a su biosntesis, se sabe que los precursores de la lignina se forman por conducto de la ruta correspondiente al acido shiquimico. ste acido, formado por unin del acido fosfoenolpirvico y eritrosa-4-fosfato, se convierte en el principal escaln de la biosntesis de los aminocidos Ltirosina y L-fenilalanina, que estn formados por aminacin reductiva. Las enzimas desaminantes convierten a continuacin los dos aminocidos en sus respectivas contrapartes del acido shinamico. La hidroxilacin en etapas por hidroxilasa, y en su momento la metilacin por o-metiltransferasas, transforma los cidos shinmicos en los tres cidos para hidroxi-shinmicos conocidos como precursores de la lignina. Por el productor de pulpa y de papel, la lignina es un componente de la madera que ocasiona de los problemas que surgen durante la produccin de la pulpa. De no ser por la lignina no resultara necesario aplicar reactivos fuertes alcalinos o cidos para la deslignificacin qumica de la madera a fin de obtener pulpa y productos de papel. La deslignificacin es la meta ms importante en la produccin de papel. d) Extractivos Los extractivos son aquellas sustancias que se encuentran presentes en las diferentes fibras vegetales, pero que no son carbohidratos, tales como cidos grasos, terpenos, fenoles y resinas. Muchos de estos compuestos son solubles en agua o disolventes orgnicos polares como el metanol, etanol o acetona, por lo que se eliminan rpidamente en los procesos extraccin de celulosa.

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3.2

Empleo de substrato orgnico por los microorganismos

Todas las formas de vida, desde los microorganismos hasta los seres humanos toman del ambiente las sustancias que requieren para sintetizar su material celular, generar energa y efectuar un funcionamiento adecuado. Estas sustancias se denominan nutrientes o substratos y el consumo o degradacin de los mismos, depende de los siguientes factores: Composicin elemental, la estructura de las unidades bsicas de repeticin, los enlaces entre unidades de repeticin, los nutrientes presentes en el ambiente, la comunidad microbiana presente y las condiciones abiticas como pH, potencial de oxido-reduccin, O 2 , condiciones osmticas. Los principales substratos complejos que utilizan los microorganismos se resumen en la Tabla-3 Tabla 3. Caractersticas de los substratos orgnicos complejos que influyen en la descomposicin y la degradabilidad. Elementos presentes en gran cantidad Substrato Subunidad bsica Enlaces C H O N P Degradacin

Con

Sin

O2Almidn Celulosa Hemicelulosa Glucosa Glucosa Monosacridos C5 y C6

O2+ + +

(1 4)(1 6) +

+ + +

+ + +

-

-

+ + +

(1 4) (1 4) (1 3) (1 4)Enlaces C-C, CO

+ +

Lignina Quitina Protenas Hidrocarburos +Lpidos

Fenilpropano Nacetilglucosamina Aminocidos Aliftico, cclico, aromtico Glicerol, cidos grasos

+ + + +

+ + + + +

+ + + +

+ + +

+

+ + + + +

+ + +/-+ +

(1 4)Enlaces peptdicos

Esteres

+

La lignina es un caso especial en el que la biodegradabilidad depende la disponibilidad de oxigeno. A menudo no existe una degradacin sustancial porque la mayora de los hongos filamentosos que degradan lignina, pueden actuar solo en presencia de oxigeno.

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3.3

Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradacin

Como se menciono anteriormente, la pared celular de los tejidos vegetales esta constituida por lignina, una substancia difcil de degradar y que los hongos descomponen debido a que poseen enzimas que rompen dicha molcula y dependiendo de cmo los hongos lo ataquen, se clasifican en hongos de pudricin blanca y hongos de pudricin parda (o de color caf), Los hongos de pudricin blanca han sido ampliamente investigados como posibles organismos utilizados en la biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) y en la degradacin del polmero lignina . Estos hongos no pueden utilizar directamente lignina como su fuente de carbono y energa, por ello dependen de azcares mas digeribles como los monmeros precursores de fenilpropano. La funcin primaria de la ligninlisis es exponer estos monmeros al ataque del hongo con ayuda diferentes tipos de enzimas. En la mayora de los hongos se ha visto que la ligninlisis ocurre durante el metabolismo secundario, es decir bajo limitacin de nutrientes, lo que permite que el hongo solo sintetice y secrete agentes ligninoliticos que comiencen a fragmentar el polmero. Por otra parte se sabe que dos de las mas conocidas peroxidasas (enzimas que atacan a la lignina) son secretadas por diversos hongos entre ellos Pleurotus eryngii. Una de ellas es la enzima es la enzima de manganeso peroxidasa y la otra es la enzima lignina peroxidada. Este hongo ha sido muy estudiado debido a su capacidad de degradar lignina selectivamente cuando crece en substratos naturales y por lo tanto es un organismo considerado como modelo para estudios de biodegradacin de lignina y con aplicaciones biotecnolgicas. En trminos generales la degradacin de lignina es catalizada por un complejo enzimtico extracelular que poseen algunos hongos. Los mayores componentes de este sistema incluye a la enzima peroxidada (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y al enzima generadora de peroxido glioxal oxidasa (GLOX). Bajo condiciones de limitacin de nutrientes en el medio de cultivo, diversos hongos son capaces de secretarlas.

3.3.1 Levaduras degradadotas de ligninaComo se menciono anteriormente, la descomposicin de lignina la realizan principalmente basidiomicetos de pudricin blanca. Dichos hongos no tienen substrato especfico y pueden oxidar a una gran variedad de componentes incluyendo contaminantes ambientales. Sin embargo existen otros microorganismos aislados del suelo que pueden tener una actividad similar. La habilidad de algunas especies de levaduras para biodegradar lignina ha recibido poca atencin, en comparacin con los hongos basidiomicetos. Recientemente, se ha descrito que algunas especies de levaduras como Candida ingeniosa, Rhodotorula graminis y Rhodotorula mucilaginosa son organismos que degradan productos derivados de lignina.

CARACTERISTICAS

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Descripcin Fenotpica Hbitat Grupo trfico Fuente de Carbono y energa Grupo aceptor de electrones Frmula maestra del bioproceso

Caractersticas tpicas de levadura Bagazo de caa de azcar. Quimiorganotrfico Lignina (Hetertrofo) Lignina (Organtrofo)Levadura Lignina Clulosa

+ Hemicelulo sa

44.1

MARCO METODOLOGICOMETODOS GENERALES DE ANALISIS

Muestreo Las muestras se tomaran del residuo de la elaboracin de jugo de caa de azcar, del sector de Tambillo, esta ser representativa y recogida a diferentes tiempos, durante un da de produccin. Preparacin de la muestra Se molera perfectamente la muestra y se pesara 10 g de la misma, posteriormente se colocaran en un matraz con 90 ml de agua destilada estril, se agitar y se har diluciones que van desde 102 hasta 10-7.

4.2 4.2.1

METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS Diseo del medio de cultivo Medio minimal + Agar Compuesto K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4. 7H2O Solucin de elementos traza Lignina* Compuesto Agar K2HPO4 Gentamicina KH2PO4 Agua destilada (NH4)2SO4 pH=5 MgSO4. 7H2O Solucin de elementos traza Lignina* Agua destilada pH=5 Cantidad 1,73 g 0,68 g 0,83 g 0,10 g 1 ml 0,2 % Cantidad 15 g g 1,73 1 ml g 0,68 1000g 0,83 ml 0,10 g 1 ml 0,2 % 1000 ml

Medio minimal lquido

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*Se utiliza como fuente de carbono presentes en el bagazo de caa de azcar. Para inhibir bacterias.

AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA Las muestras obtenidas se sembrarn por el mtodo de extensin (asa de digrasky) en el medio minimal, tres cajas petri por dilucin, y se dejarn a temperatura ambiente durante cinco das en aerobiosis. El pH del medio minimal mas agar debe ser de 5 debido a que las levaduras que se van a aislar crecen mejor a ese pH y los otros microorganismos que no son de nuestro inters no. De las cepas levaduriformes que se reproducirn en el medio al cabo de cinco das, las enriquecemos nuevamente en un medio de cultivo lquido (medio base), las llevamos al shaker durante 24 horas a 37 C y 150 rpm. PURIFICACION Para evitar el crecimiento de bacterias y hongos filamentosos se sembrarn las diluciones enriquecidas en medios Saburoud (anexo 1) y otras en medio papa dextrosa (anexo1) adicionadas con tetraciclina para inhibir el crecimiento de los organismos mencionados anteriormente. IDENTIFICACION Anlisis de la morfologa micro y macroscpica A cada una de las cepas aisladas se les realizar tincin Gram para observarlas al microscopio. Y se observar como crecen en el medio de cultivo.

SELECCIN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES Parmetros de seleccin: Parmetros de seleccin pH 4,5 a 6,5 Temperatura 24 y 48C. Se utilizar un pH de 5 y una temperatura de 37C, para las levaduras de nuestro inters Concentracin de nutrientes La lignina es el principal compuesto para el crecimiento de este tipo de levaduras, el bagazo de caa de azcar tiene alrededor del 20%.

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Para la seleccin de las cepas con mayor poder degradador elaboraremos medios con las siguientes concentraciones de lignina 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la seleccin se efectuar en el medio de cultivo con estas concentraciones. Los microorganismos seleccionados sern puestos nuevamente en un medio minimal lquido y slido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendr como fuente de carbono el bagazo de caa de azcar que van a ser degradados. Despus de sembrar los microorganismos seleccionados estos debern permanecer por lo menos cuatro o cinco das a temperatura ambiente para su crecimiento 4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluacin de la capacidad degradadora de lignina Para verificar tanto el crecimiento de los organismos aislados como su capacidad de degradar lignina se emplea en medio minimal adicionado con lignina al 0,2% en forma de medio liquido en matraces de 250 ml, se sembraran las diferentes levaduras bajo las siguientes condiciones de crecimiento: pH = 5 , temperatura ambiente y agitacin a 150 rpm. Curva de crecimiento Para evaluar el crecimiento de las cepas se tomaran diariamente 1ml de medio de cultivo de cada uno de los matraces donde se sembraron las levaduras, se colocaran en tubos de ensayo que contengan 9 ml de agua estril, se mezclaran y a partir de estos, se realizaran diluciones hasta 107. Posteriormente cada dilucin se sembrara en caja petri con medio solido YEPD (anexo 1). Cada caja se incubara a 37C y una vez obtenido el crecimiento se contaran las levaduras. Degradacin de lignina Para analizar la degradacin se observaran diariamente los matraces con el fin de verificar el cambio de coloracin del medio de cultivo. PRESERVACIN Para la preservacin de las cepas puras que son de utilidad biotecnolgica se usara la tcnica de criocongelacin (crioviales con glicerol al 20%).

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BIBLIOGRAFA 1. www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf 2. home.aigonline.com/AIGEnvironmental/ind_profile/read_p0rofile/1,1990,MTYtL0FJR0Vudmlvb25tZW50YWwvSW5kdXN0c...-50k.

3. http://www.umbbd.ahc.umn.edu:8015/umbbd/servlet/pageservlet?ptype=pypathway_abbr=van-5k

4. http://www.fao.org/docrep/n5525S/n5525s01.htm. 5. http://www.fao.org/docrep/n5525S/lignin.htm. 6. http://www.bioxamara.tuportal.com.

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7. http://www.industry/.lignin.com. 8. http://www.nrel.gov/biotech_symposium/docs/abst1b-48.doc 9. http://www.bioplanet.net/magazine/bio_julago_2001_julago_industria.htm. 10. http://www.unsa.edu.ar/matbib/micagrip3.pdf

ANEXOS

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66.1 Composicin de medios de cultivo

ANEXOS

Solucin de elementos traza Compuesto CaCl2.H2O MnSO4.H2O FeSO4.7H2O EDTA.7H2O Agua destilada Compuesto Papa Glucosa anhidra Peptona de carne Agar Agua destilada pH = 5 Cantidad 1g 0.3 g 0.5 g 0.2 g 100 ml Cantidad 250 g 1% 1% 15 g 1000 ml

Medio glucosado Sabouraud Compuesto Medio de agar papadextrosa (PDA) Medio lquido YEPD Glucosa Peptona Compuesto Agar Extracto de levadura Agua destilada pH = 5 Peptona Glucosa Agua destilada pH = 5 Cantidad 20 g 10 g Cantidad 20 g 5g 1000 ml 5g 10 g 500 ml