ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

AMBIENTAL

Práctica No 1

DATOS GENERALES

Estudiantes: Código:

Stalin Flores 2188

Rodrigo Guerrero 2172

Denis Pilco 2167

Jose Latorre 1979

Nivel: Quinto ¨B¨

Fecha de realización: 24/10/2013

Fecha de entrega: 31/10/2013

1. TEMA: Columna de Winogradsky  

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General:

2.1.1 Comprobar con el uso de la columna de Winogradsky como los

microorganismos ocupan diferentes zonas para su desarrollo de acuerdo

a cada una de las necesidades que este requiera.

2.2. Objetivos Específicos:

2.2.1 Identificar a los distintos microorganismos dependiendo de las zonas en

las que se desarrollan. 

2.2.2 Identificar cuáles son los ciclos que realizan los microorganismos y la

interdependencia que llega a existir entre ellos.

2.2.3 Reconocer como es el tipo de interrelaciones que se dan en la Columna

de Winogradsky entre los microorganismos. 

3. MARCO TEÓRICO

Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el microbiólogo ruso Sergei Winogradsky

(1856-1953), quien usó la columna para estudiar los microorganismos del suelo.(4)

La columna de Winogradsky es un sistema que permite observar en el laboratorio el

proceso evolutivo de los microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los

diferentes ambientes empleando diferentes estrategias para la obtención de energía. (4)

Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se desarrollará una

sucesión de comunidades bacterianas interrelacionadas metabólicamente, de un modo

similar a lo que ocurre en la naturaleza, que se podrán observar fácilmente por su

distinta coloración. Además, la columna es un sistema anóxico en miniatura que puede

usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento

La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos

ocupan microespacios altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias

medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) e

ilustra como diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la interdependencia

que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo permite crecer a

otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclamiento,

mantenido sólo por la energía de la luz. (2)

Al pasar algunos días se diferenciación claramente la formación de tres estratos, se los

identifica debido a su color característico, los cuales presentamos a continuación:

Figura 1. (Columna Winogradsky)

ZONA AEROBIA (RICA EN OXÍGENO)

La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de

bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente

en los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos

contaminados, etc). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en

nuevas áreas. Puede desarrollarse también microorganismos fototrófos variados

procedentes directamente del agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de

la columna. La superficie del barro puede presentar en esta zona un ligero color castaño.

Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre. (1)

ZONA MICROAERÓFILA:

Es la zona en donde se guardan ambos gradientes, el oxigeno y el sulfuro de hidrogeno.

Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa, Thiothrix o Thiobaccillus,

que usan como fuente de carbono la materia orgánica, y oxidan el H2S que llega por

difusión desde las capas inferiores a azufre elemental. La reacción química que se lleva

a cabo es la siguiente: (1)

Son, por lo tanto, microorganismos mixotrofos. Estos géneros acumulan gránulos de

azufre en sus citoplasmas por oxidación del H2S que es muy baja, los gránulos de

azufre elemental intracitoplasmático presentes en estas bacterias empiezan a

desaparecer por oxidación total a sulfatos.(3)

ZONAS ANAERÓBICAS

Esta zona contiene H2S, en la zona anaeróbica superior predominan las bacterias

fotosintéticas anaerobias, y en la columna se observan una serie de bandas de colores

rojo y verdes: (1)

Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium o

Rhodopseudomona, son bacterias anaerobias fotoorganótrofas, que solo pueden realizar

la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico. Forman una capa de

color rojo-anaranjado.

Las bacterias verdes no del azufre son termófilas y, por lo tanto, no crecen en la

columna a temperatura ambiente.

Bacterias rojas del azufre (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa

roja-púrpura).

Bacterias verdes del azufre (Chloroblum, Pelodyctium). Estas bacterias son

fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica, no producen oxigeno ya que no

utilizan H2O como elemento reductor si no H2S, generando en este proceso sulfatos

(SO42-). La reacción que tiene lugar es la siguiente: (3)

Estos microorganismos aparecen como zonas de crecimiento en el lodo de la columna,

pero también pueden desarrollarse en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos.

En la zona anaeróbica más profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos

capaces de realizar respiración anaeróbica y fermentación.

Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter,

Desulfotomaculum, o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente

oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H2S que

reaccionará con el hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II),

que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos

acuáticos son frecuentemente negros.

La reacción sería la siguiente:

Bacterias fermentadoras

Utilizan la celulosa del papel aportado como fuente primaria para su metabolismo,

aparecen las bacterias del género Clostridium.

Clostridium: Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxígeno

desaparece del sedimento.

Figura 2. (Microorganismos caracteristicos de la Columna de Winogradsky)

4. MARCO PRACTICO

4.1. Materiales

Preparación de la Columna de

Winogradsky

Botellón de plástico

Lodo

Agua estancada

Huevo cocido

Hojarasca

Papel picado

Clavo

Papel film

Análisis de la Columna de

Winogradsky

3 Pipetas de 10mL

3 Tubos de ensayo

Centrífugador

Asa de siembra

Mechero

Microscopio óptico

Portaobjetos

Cubreobjetos

4.2. Reactivos

Preparación de la Columna de

Winogradsky

5g sulfato de calcio

5g carbonato de calcio

Azufre

Análisis de la Columna de

Winogradsky

Cristal violeta

Lugol

Decolorante

Safranina

Aceite de inmersión

4.3. Procedimiento:

Preparación de la Columna de Winogradsky

Análisis de la Columna de Winogradsky

Cortar una cuarta parte del botellón

Se adiciona al frasco el papel picado con los restos de hojas secas y el huevo cocido

Se adiciona el CaSO4, el CaCO3, el S y el clavo

Se adiciona el lodo, el agua y se llena el frasco completamente

Se tapa para evitar evaporación

Se incuba a temperatura de 28 a 30°C bajo luz incandescente por un mes

Observar con lentes de 10X, 40X y 100X

Realizar la Tinción Gram

Fijar las muestras en los portaobjetos en medio aséptico

Centrifugar las muestras a 2000RPM en 10 min.

Colocar en tres tubos de ensayo las muestras obtenidas hasta completar sus 3 cuartas partes

Obtener con las pipetas una muestra de cada estrato

5. GRÁFICOS

Foto1: Preparacion de la cama Foto 2: Añadicion de lodo y agua estancada

Foto 3: Sellamiento de la columna

Foto4: Extraccion de muestras de diferentes sustratos

Foto 5: Preaparacion de las muestras en la centrifuga

Foto 6: Muestras despues de la centrifugacion

Foto 7: Fijacion de las muestras

Foto 8: Fijacion de las Muestras

Foto 9: Tincion Gram de las muestras fijadas.

Foto 10: Sustrato 1 (40X) Foto 11: Sustrato 2 ( 40x) Foto 12: Sustrato 3( 40x)

6. ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS:

En el presente laboratorio se recreo el experimento de columna de Sergéi Winogradsky,

a partir de la misma se pudo demostrar principalmente la forma en cómo los

microorganismos ocupan "microespacios" o estratos los cuales son específicos para

cada microorganismo de acuerdo a los distintos limites y barreras que se simulan dentro

de la columna de Winogradsky, como por ejemplo los nutrientes, requerimientos de

oxigeno, la temperatura, la radiación, el PH, etc. De igual forma, su desarrollo debido a

las interrelaciones que se registraron en la columna. 

Mediante los conocimientos previos de el experimento de Sergéi Winogradsky se

esperaba que en la columna se diferenciaran por lo menos 7 estratos o 7 capas de

distintos colores correspondientes a una capa anaerobia(negro), capa de difusión(verde

oscuro), capa verde, capa purpura/rojiza, capa color herrumbre, capa color marrón, capa

de agua verde o transparente, sin embargo se visualizo únicamente tres capas muy poco

diferenciadas y desiguales: una capa profunda de color negro, correspondiente a la

anaeróbica, una pequeña capa intermedia de color rojizo y una capa superficial de color

verde oscuro, estos resultados se obtuvieron debido a diversos factores, entre los cuales

podemos citar: la falta de luz artificial o fuente lumínica, escases de nutrientes( hierro,

oxigeno, fosforo, carbonatos, azufre, etc.), o un fallo sistemático en la preparación de la

columna. De manera similar mediante conocimientos teóricos previos se esperaba

obtener 3 estratos o zonas distintas: una zona aerobia en la que se desarrollaran

microorganismos fototótrofos, cianobacterias y algas que son los primeros que toman la

fuente de energía en este caso la luz y el oxigeno y lo distribuyen a los demás gradientes

en formas más asimilables de manera que estos los puedan tomar, en la columna de

Winogradsky correspondiente a la práctica, efectivamente se logró distinguir en la

superficie la presencia de una delgada capa de color verde oscuro que se formo por la

acumulación verdosa como una especie de alfombra la misma que está conformada por

las cianobacterias y las algas. Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más

pobre en azufre. Además se observo gas en la columna de agua que podría corresponder

a O2 de la fotosíntesis de estos microorganismos. Mientras que en la segunda zona

denominada zona microaerofílica donde la concentración de oxigeno disminuye y la de

azufre aparece progresivamente, siendo a su vez la zona donde ambas zonas tanto

anaeróbica como aeróbica se sobreponen, se combinan o convergen, existiendo como

nutrientes oxigeno( en menor proporción) y el acido sulfhídrico H2S (le da el olor

característico de la columna ya que tiene un fuerte olor a huevo podrido, consecuencia

de la descomposición de la materia orgánica) también en baja proporción, aquí se

esperaba la presencia de algas más pequeñas debido a la escases de oxigeno, lo que

produce disminuye su desarrollo, bacterias gram positivas y negativas, bacterias

oxidadoras del azufre(Thiobacillus, Beggiatoa), debido a la ausencia de oxigeno y la

aparición de fuentes de H2S, las mismas que utilizan como fuente de energía a la

materia orgánica y oxidan el H2S, a esta clase de microorganismos se los denomina

mixotrofos, y provee de azufre elemental a la zona anaerobia, y a la zona aerobia de

oxigeno, correspondiendo a un ejemplo típico de protocooperacion con la zona

anaerobia porque ambos se dan nutrientes de azufre, y una relación de comensalismo

con la zona aerobia porque los mixotrofos toman el oxigeno de esta zona para su

desarrollo, pero no benefician ni perjudican a la zona aeróbica. Este estrato debe poseer

una coloración roja, obtenido por la formación de agregados de microorganismos

adheridos a las paredes del recipiente. Estos microorganismos serian las bacterias rojas

no del azufre. En la columna de Winogradsky correspondiente a esta práctica de

laboratorio, la zona microaerofílica era delgada y escasa, esto debido a que fuente de

azufre así como el oxigeno necesario para que se desarrollen adecuadamente los

microorganismos mixotrofos correspondientes a esta capa fueron deficientes.

Finalmente en el tercer estrato donde se asienta el lodo es decir el lugar en el cual hubo

una sedimentación de materia orgánica se preveía que se una coloración verde oscura y

roja en la parte superior de esta zona, y una coloración café y negra en la parte inferior,

la coloración roja se debe a las bacterias rojas del azufre que forman una capa roja–

anaranjada, la coloración verde en cambio se produce por las bacterias verdes del

azufre, estas bacterias son fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica,

generando en este proceso sulfatos (SO4)2 . En la zona anaerobia más profunda, de

color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiración

anaeróbica y fermentación( genero Amoebacter), estos microorganismos utilizan el

sulfato y lo convierten en acido sulfhídrico, que será tomado por las bacterias reductoras

del sulfato, también se distinguen las bacterias que degradan la celulosa(tiras de papel

periódico) como por ejemplo las bacterias del genero Clostridium, estas son anaerobias

estrictas así que necesitan la ayuda de otro tipo de bacterias que son las anaerobias

facultativas que reducen todo el oxigeno del medio para que dichas bacterias se

desarrollen normalmente y puedan convertir la celulosa en glucosa y posteriormente

mediante la fermentación de esta glucosa obtener su energía generando como producto

de desecho, formas simples de compuestos orgánico , los cuales son tomados por las

bacterias del azufre que necesitan compuestos orgánicos para su respiración, es el caso

de las fotosintéticas anoxigenicas que en escases de oxigeno utilizan estos compuestos

orgánicos para su fotosíntesis, a esta interrelación se la conoce como

(cometabolismo). Al visualizar la columna de Winogradsky de nuestra práctica se pudo

notar que la parte inferior de esta zona correspondiente a las bacterias que degradan

celulosa y microorganismos anaerobios es la más distinguible y amplia, lo que

demuestra que los requerimientos de dichos microorganismos fueron los adecuados, es

decir la cantidad de materia orgánica (lodo), fuente de celulosa (papel periódico) fue la

adecuada, sin embargo la parte superior de esta zona no presentó la coloración esperada

por lo que se comprueba lo dicho anteriormente, es decir que la fuete de azufre fue

escasa. Al observar al microscopio muestras de las tres zonas previamente fijadas y

después de realizar la tinción gram se logró observar distintos microorganismos siendo

las más notorias y abundantes las algas, cianobacterias y bacterias gram-positivas,

algunas bacterias gram-negativas y protozoos, las muestras tuvieron ciertos defectos

debido a errores en el momento de la toma de la muestra con la pipeta, por lo que en las

3 muestras se evidencio la presencia de algas o restos de materia orgánica.

7. OBSERVACIONES

7.1 Observaciones de la columna de Winogradsky

CAMBIOS DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKYFecha Descripción

19/09/2013 En el primer día se pudo observar una sola masa de lodo y agua de color grisáceo sobre aquella masa, del botellón se emanaba un olor pestilente

26/09/2013 Ya pasada una semana se pudo observar que el papel film estaba con presencia de pequeñas gotas de agua, se observaba una capa verde sobre el agua que conservaba el color grisáceo. Del botellón se emanaba un olor pestilente.

03/10/2013 Ya pasadas dos semanas el papel film tiene mayor presencia de gotas de agua, el agua sobre la capa de lodo tenia un color ladrillo con tendencia a rojo, en la superficie del agua la capa verde observada anteriormente se volvió más densa ya con presencia filamentosa de color verde obscuro. La capa de lodo comenzó a obscurecer su color. Del botellón se emanaba un olor pestilente.

10/10/2013 Ya pasadas tres semanas la coloración roja observada anteriormente parece sedimentarse con el lodo formando una capa roja muy delgada aproximadamente de unos 5mm. En el fondo de la capa de lodo comienzan a aparecer pequeñas manchas amarillas que siguen un patrón lineal de forma lateral. En la superficie de la capa de agua ya se presencia una capa muy densa formada por algas. Del botellón se emanaba un olor pestilente.

17/10/2013 Ya pasadas cuatro semanas la capa de agua se vuelve muy turbia tomando un color verde azulado muy intenso, la capa de lodo en su mayoría se vuelve de un color negro intenso manteniendo la coloración roja en la parte superior y también la coloración amarilla. Se mantiene la capa densa de algas. Del botellón se emanaba un olor pestilente.

24/10/2013 Ya pasadas cinco semanas la coloración verde azulada del agua parece sedimentarse formando una capa del mismo color sobre la capa roja antes descrita la misma que ha ido perdiendo sus propiedades ya que ha su coloración no es muy notoria. La coloración amarilla ha logrado ocupar más lugar en el fondo de la capa de lodo. La capa de algas comienza a sobre poblar la superficie de la capa de agua. Del botellón se emanaba un olor pestilente.

7.2. Observaciones de la columna en el microscopio

ZONA DE LA COLUMNA CARACTERISTICAS DEL

ESTRATO

MICROORGANISMOS

Y TINCION GRAM

ESQUEMA

40X 100X

Algas (de forma alargada

cilíndrica) y bacterias

fotosintéticas (de forma

redonda, cloroplasto

encargado de la fotosíntesis);

microorganismos eran de

color verde (fotosíntesis), se

observo también gran

cantidad de flagelados de

color verde, y células gram

positivas de color azul, y

gram negativas de color rosa-

morado.

Algas

fotosintéticas

Cianobacterias

Microorganismos de color

purpura, de forma redonda,

formando agregados

(bacterias purpuras del

azufre), la presencia de algas

pero eran de menor tamaño,

células fotosintéticas, en

menor densidad poblacional.

Ademas se puede distinguir

filamentos verdosos, nucleos.

Algunos protozoos, que son

mucho más grandes que las

bacterias

Chlorobium

(bacterias verdes

del azufre)

Cromatium

(bacterias

purpuras del

azufre)

Galionella

Protozoo

Algas mucho más pequeñas

(desarrollo mínimo debido a

la falta de luz),

Microorganismos gram

positivos y negativos, se pudo

observar además agregados de

color café, de forma redonda

que estaban muy dispersos,

siendo estos en realidad

fermentadores de celulosa o

productores de hidróxido de

azufre

Amoebacter

(bacterias

purpuras del

azufre)

Clostridium

Desulfovibrio

Algas

pequeñas

8. CONCLUSIONES

ZONAAEROBIA

ZONA MICROAEROF

ILICA

ZONA ANAEROBIA

Se logró identificar en la parte superior de la columna que es más rica en

oxígeno y más pobre en azufre abundantes poblaciones de microorganismos

aerobios ,en la zona microaerofílica que es la zona en la que los

microorganismos solapan ambos gradientes, el de oxígeno y el de sulfuro de

hidrógeno aparecen bacterias oxidadoras del azufre y en la zona anaeróbica

esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaeróbica

superior predominan las bacterias fotosintéticas anaerobias y en la zona

anaerobia más profunda, aparecen microorganismos capaces de realizar

respiración anaeróbica y fermentación.

Se pudo identificar como los microorganismos necesitan los unos de los

otros para poder existir ya que en la zona inferior de lodos se desarrollan

organismos que desarrollan procesos fermentativos que producen alcohol y

ácidos grasos como subproductos de su metabolismo y estos productos de

"desecho" son a su vez el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras

de sulfato, como resultado se liberan sulfuros que difunden a la zona

superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias

fotosintéticas que utilizan el azufre y por encima de esta zona pueden

desarrollarse las bacterias aerobias que no utilicen el azufre como suelen ser

las cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxígeno que

mantiene aerobia esta zona y así los microorganismos trabajan entre sí para

desarrollarse en óptimas condiciones. Aquí juega un papel fundamental la

exposición constante a la luz luz ya que empieza a penetrarse hacia la región

inferior anaeróbica, para facilitar el desarrollo de los microorganismos

fotosintéticos anoxigénicos que proveen de CO2 es decir materia orgánica a

los microorganismo de arriba que requieren de esta materia orgánica para su

desarrollo y así comienza la relación que estos microorganismos necesitan

para su desarrollo. 

Se logró reconocer como es que las bacterias se relacionan entre si para

poder desarrollarse sobre todo en el aspecto nutricional por ende se puede

decir que hay una relación de comensalismo al momento que las bacterias

que desarrollan procesos fermentativos proveen de sustratos a las bacterias

reductoras de sulfato dándose cometabolismo entre estos dos

microorganismos por lo general así se van a encontrar también relaciones de

comensalismo ya que algunas bacterias a partir del H2S lo convierten a

formas más complejas para que lo usen otros microorganismos sin pedir

nada a cambio aquí se da un comensalismo también se da sinergismo debido

a que todo el acido sulfhídrico fue desplazado hacia la parte inferior por

acción de los microorganismos formando sedimentos, y de ahí que mediante

las interrelaciones este fue subiendo para nutrir a los demás

microorganismos, también se elimino el oxigeno de la parte inferior por

parte de las bacterias anaerobias facultativas que ayudo a que anaerobias

estrictas se desarrollen.

9. RECOMENDACIONES

Recomendamos conseguir un buen lodo residual como agua estancada ya que de esto dependerán mucho el desarrollo de los diferentes tipos de microorganismos en nuestra columna.

Se recomienda triturar y homogenizar la hojarasca para poder dispersar por toda la superficie de la botella donde elaboraremos la columna posteriormente cuando se añada las demás sustancias incluyendo el lodo residual formar un mezcla, procurar que esta sea una mezcla homogénea.

Se recomienda que mientras más expuesto a la luz se encuentre la columna el desarrollo de los microorganismos será mucho más rápido.

Es recomendable rotar la columna con regularidad para que la fuente de luz sea homogénea en todas partes de esta y no solo se pueda observar de un solo perfil.

Recomendamos no agitar ni mover bruscamente la columna de winogradski al momento de trasladarla ya que podían mezclarse las zonas diferenciadas en la columna.

Se recomienda no acercar de manera exagerada la columna al foco ya que esta transpirara mucho por efectos del calor y esto será perjudicial en el desarrollo de nuestros microorganismos.

Se recomienda el uso de mascarilla ya que el olor emanado al ser la columna descubierta es algo desagradable.

Al momento de la extracción de muestras se recomienda pipetas rotas o con un ancho orificio ya que de no ser así se taponarán y no podríamos tomar buenas muestras.

Se recomienda no succionar con la boca al momento de tomar las muestras de la columna ya que estas contienen algunos gases como el metano o sulfatos que de ser absorbidos por nosotros serian perjudiciales en nuestra salud.

Se recomienda ser muy eficiente al momento de extraer las muestras con la pipeta para no mezclar el sustrato porque podríamos encontrar microorganismos

que no pertenecen a la muestra tratada. Se recomienda rotular las muestras con el número de grupo y de zona extraída

con el fin de no confundirlas. Es una recomendación importante al momento de la fijación en placa trabajar

cerca del área estéril para evitar contaminación con otros microorganismos provenientes del aire.

10. BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía:

1. Brock Biología de los microorganismos 10ª edición (2003). J. Parker, J.M.

Martinko,M.T. Madigan. Pearson Education.

 

2. Atlas, R. M., Bartha, R. 2002. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.

PEARSON EDUCACIÓN, S. A., Madrid, España.

Linknografía:

Figura 1. (Columna de Winogradsky Esquema)

3. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.htm

Microbiólogos Ilustres

4. http://microilustres.blogspot.com/2007/01/winogradsky-sergei-1856-1953.html

Figura 2. (Microorganismos representativos de la columna de Winograsky

5. http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html