INFORME FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓNsappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070409_5642.pdf ·...
Transcript of INFORME FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓNsappi.ipn.mx/cgpi/archivos_anexo/20070409_5642.pdf ·...
1
INFORME FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
Caracterización molecular de la enfermedad Marchitez Manchada en tomate
(Lycopersicum esculentum)
Clave del Proyecto: 20070409
Director del proyecto: Dr. Sergio Medina Godoy
Institución: IPN, CIIDIR-UNIDAD SINALOA
Fecha de Inicio: ENERO 2007
Fecha de conclusión: DICIEMBRE 2007
2
Resumen
En México, el cultivo de tomate es un importante generador de divisas y de
empleos (Hernández y col., 2004). Sin embargo los rendimientos los cultivos se
ven mermados, por diversas enfermedades en México, particularmente la región
noroeste de México se ha detectado un nuevo virus infectando tomate que
pertenece a la superfamilia tipo picornavirus, siendo el objetivo de este trabajo
identificar por medio de la proteómica, proteínas de la cápside de virus ToANV en
plantas de tomate, así como identificar algunos cambios en el perfil de proteínas
de las plantas enfermas. Materiales y Métodos. Se utilizaron plantas de tomate
infectadas con el virus ToANV, se identificó el virus con la prueba
inmunoenzimática DAS-ELISA, utilizándose un anticuerpo policlonal donado por
Turina y col (2007), se extrajeron proteínas de la parte aérea de la plantas sanas
y enfermas por el método de extracción de proteínas del fenol y se separaron en
dos dimensiones (IPG strip pH 3-10), las proteínas se resolvieron en geles de
poliacrilamida al 10%, se fotodocumentaron con el sistema Gel-Doc (Bio-Rad) y
se analizaron los geles comparativos con el programa PDQuest (Bio-Rad), las
proteínas diferenciales serán identificadas por espectrometría de masas. Se
realizó Western blot en geles resueltos por peso molecular, obteniéndose los
siguientes resultados, las plantas enfermas son positivas por la prueba (DAS-
ELISA) contra el virus ToANV, se logran identificar de los geles comparativos
siete proteínas que están en plantas sanas y no en enfermas y el Western blot
reveló una proteína de aprox. 26 KDa que correspondería a una de las proteínas
del virus ToANV. Esta proteína se identificó como una proteína de Cápside, pero
los resultados no la identificaron como de virus ToANV, pero si de la familia
Potyvirae, lo que indica que esta es una nueva proteína que no se había
reportado de este virus. Conclusiones: Se logró detectar el virus ToANV en
plantas de tomate e identificar parcialmente la secuencia de una proteína de la
cápside del virus ToANV que no había sido previamente reportada, así como
otras proteínas diferenciales que en un futuro serán sometidas a estudios.
3
Introducción Actualmente se esta viviendo una gran problemática en el campo sinaloense
debido a la presencia de una gran cantidad de enfermedades no antes
detectadas en esta región del mundo. Uno de los principales agentes causantes
de estas enfermedades son los virus. Recientemente se ha identificado síntomas
de la enfermedad �Marchitez Manchada� en cultivos de tomate (L. esculentum).
En el ciclo agrícola pasado (Verano-invierno 2005) en distintos lotes de tomate se
observaron plantas presentando síntomas de Marchitez Manchada, sin embargo
la identificación del agente causal no pudo ser determinada, por lo que se
sospecha sea otro virus que no ha sido reportado en la región previamente. Ante
esta situación se presentó un proyecto a CECYT-Sinaloa, el cual tiene como
objetivo identificar al agente causal de Marchitez Manchada empleando técnicas
de electroforesis bidimensional: Proteómica, lo cual ha sido realizado para otros
virus en plantas (Yao y col., 2002; Cooper y col., 2003). Por lo que se esta
proponiendo el empleo de esta metodología para la identificación de virus en
plantas de tomate que presentan sintomatología de Marchitez Manchada. En la
presente convocatoria se solicita apoyo para tratar de dilucidar la respuesta de la
planta a esta enfermedad empleando esta misma metodología: Proteómica.
Actualmente diversas investigación abordan este problema desde hibridación in
situ con sondas de genes específicos hasta ensayos masivos de expresión
mediante transcriptómica (Whitman y col., 2006). Ensayos para distintas especies
de solanáceas como papa, tomate y chile se han realizado empleando
microarreglos de papa (Rensink y col., 2005) esto indica la existencia de bases de
datos de secuencias de DNA de estas especies. Dichas bases de datos también
son compartidas en proyectos proteómicos y ayudan a la identificación de
secuencias de proteínas obtenidas mediante espectrometría de masas.
Empleando técnicas de microarreglos en infecciones de virus de RNA en plantas
susceptibles de Arabidopsis thaliana se observo que se modifican genes que con
funciones diversas: Un tercio relacionados a rescate celular, defensa, muerte
celular y envejecimiento, así como genes relacionados a estrés (Whitham et al
2003). Cabe señalar que son poco los reportes existentes apoyados en las
técnicas de proteómicas. Perez-Bueno y col. (2004) reportaron una modificación
4
del sistema de transporte de electrones del fotosistema II en Nicotiana
benthamiana, empleando anticuerpos específico de este sistema monitorearon la
presencia o ausencia de algunos polipéptido que fueron modificados por la
infección de un tobamovirus. Ventelon-Debout y col. (2004) reportaron el estudio
mediante electroforesis bidimensional de plantas de arroz (dos variedades una
susceptible y una parcialmente resistente) al virus RYMV (Rice yellow mottle
virus) encontrando entre las dos variedades distintas proteínas reguladas que se
pueden relacionar a la susceptibilidad o resistencia.
La problemática de la región carece de información de primera mano en cuanto a
los cambios en la expresión genética que las infecciones virales están causando
en cultivos de alto valor agrícola como el tomate. La enfermedad Marchitez
Manchada en tomate generó junto con otras enfermedades pérdidas millonarias
al campo sinaloense en el ciclo agrícola pasado y actualmente se esta
presentando una situación similar. Lo anterior invita a conocer mejor nuestros
problemas para poder dar soluciones de fondo. Recientemente un grupo en Italia,
identificó un virus nuevo en muestras de Culiacán Sinaloa y de Obregón Sonora
cuyos síntomas corresponden a la enfermedad Marchitez Manchada, dicho virus
se denomina ToANV (Turina y col., 2007). Los autores de dicho reporte nos
proporcionaron anticuerpos para realizar pruebas tipo ELISA, para la detección,
mismo que empleamos para ensayos de inmunodetección tipo Western blot.
5
Objetivo General
Identificar las proteínas que se encuentran reguladas en plantas de tomate a
causa de la enfermedad Marchitez Manchada
Objetivos Específicos
• Establecer y mantener la sintomatología de la enfermedad Marchitez
Manchada en variedades de tomates bajo condiciones controladas.
• Realizar extracción de proteínas y resolverlas en geles bidimensionales.
• Realizar la comparación de perfiles de proteínas entre plantas sanas y con
síntomas de Marchitez Manchada
• Identificar las proteínas con patrón de expresión modificado mediante
espectrometría de masas.
6
Materiales y Métodos
• Mantenimiento de los síntomas de Marchitez Manchada
Semillas de tomate de la variedad Missouri y Gavilán se germinarán en semilleros
en el sustrato previamente descrito y a la edad de un mes se trasladaran a
maseta. Una vez establecidas las plantas con aproximadamente dos meses post-
germinación, se les colocará un injerto de una planta con síntomas, previamente
caracterizada. Las plantas se mantendrán en un cuarto de crecimiento con luz
artificial a 25 °C, hasta la presencia de síntomas.
• Extracción de proteínas
Método para la extracción de proteínas fenol de (Hurkman y Tanaka 1986). Cinco
gramos de tejido de plantas congelado, se pulverizarán en nitrógeno líquido
usando un pistilo y mortero, y se resuspenderán en 15 mL de buffer de extracción
1 (1% polyvinilpolypirrolidona (PVPP) 1%, sucrosa 0.7 M, KCl 0.1 M, Tris-HCl pH
7.5 al 0.5 M, EDTA 50 mM, PMSF 1mM, β-mercaptoetanol 2%). La mezcla será
extensivamente homogeneizada en frío usando un politron PT 10/35 con un SM
generador estándar, adicionando un volumen igual de Tris-HCl pH 7.5 fenol
saturado y vuelto a homogeneizar por 30 min. a 2 ºC y finalmente centrifugado a
10 000x g por 30 min. Se removerá la fase superior de fenol y se vuelve a extraer
dos o tres veces con buffer de extracción 1. Las proteínas precipitarán de la fase
final de fenol con cinco volúmenes de acetato de amonio saturado en metanol
toda la noche a -20 ºC y finalmente se obtiene la pastilla por centrifugación a
10000 x g por 30 min. La pastilla de proteínas a partir del protocolo descrito
anteriormente será lavado con metanol en frío, seguido de multiples lavados con
acetona en frio, y redisuelto en 125 ml de buffer IEF (Urea 7 M, CHAPS 4%, DTT
10mM, anfolitos pH 3-10 al 1.0 % peso/volumen). Una vez resuspendida la
pastilla se cuantificará empleando el reactivo de Bradford (Sigma, San Louis, MO,
EUA).
• Separación de proteínas por carga eléctrica [Electroisoenfoque (IEF)]
De manera analítica se emplearán 100 ug de proteína para rehidratar una tira de
gel de poliacrilamida en gradiente inmovilizado pH 3-10 (Ready Strip IPG Strip, Ph
3-10, 7 cm, BIORAD). Se permitirá la rehidratación por 12 h posterior a la etapa
de rehidratación las proteínas se enfocarán en el sistema Protean IEF Cell
7
(BIORAD) aplicando un total de 20000 Volts.h. Las tiras tratadas se almacenarán
a -80 °C hasta su aplicación en la segunda dimensión.
• Separación de proteínas por peso molecular (SDS-PAGE)
El paso de la segunda a la primera dimensión involucra 2 etapas: primero, la
reducción, y segundo la alquilación de los grupos sulfhídricos. Las tiras de IPG
serán equilibradas adicionando 2.0 mL de buffer de equilibrio I (Urea 6 M, SDS
2%, Tris/HCl 0.05 M, pH 8.8, Glicerol 20%, DTT 2%) para reducir los grupos
sulfhídricos, durante 15 min. en agitación. Posteriormente, se decantará y se
adicionará el buffer de equilibrio II (Urea 6M, SDS 2%, Tris/HCl 0.05M, pH 8.8,
Glicerol 20%, Iodoacetamida 2.5%) para alquilar los grupos sulfhídricos. Se
agitaran las tiras en el gel para correr en una segunda dimensión. Las proteínas
resueltas y equilibradas, se separarán en base a su peso molecular en geles
desnaturalizante en condiciones reductoras (SDS-PAGE). Se utilizará un
marcador peso molecular (BenchMark 10 a 220 kDa (Invitrogen, Carlsbad CA,
EUA)). La corrida electroforética se realizará en una cámara vertical (Mini Protean
3 System, Bio-Rad) a temperatura ambiente y 70 V, por 4 horas y en buffer de
electroforesis 1X (Tris 25mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1%). Para visualizar las
manchas de proteínas, los geles se teñirán con azul de Coomassie.
• Visualización de proteínas
La mayoría de las proteínas requiere el uso de compuestos que identifican los
enlaces peptídicos. El procedimiento que se utilizará en este caso será el método
de tinción con azul de Coomassie. La principal ventaja es que es un
procedimiento rápido y simple, produce geles teñidos mostrando las bandas o
manchas de proteínas en un color azul oscuro y un fondo transparente. Después
de realizar la corrida de SDS-PAGE, los geles serán teñidos con 50 ml de
solución de azul de Coomassie R-250 (10%), se agitarán a temperatura ambiente
por 30 minutos, se lavaran 2 veces con agua destilada para retirar el exceso de
solución de tinción. Los geles se destiñeron lavando con una mezcla de metanol
10%, ácido acético 10%, disuelto en agua, por al menos 3 horas en agitación.
Una vez teñidas las proteínas, se documentarán en el sistema Chemi Doc
(BioRad). Las imágenes de los geles bidimensionales se analizarán empleando el
programa (PDQUEST, BioRad), se analizarán al menos tres geles por condición.
• Ensayo de detección ELISA
8
La prueba de inmunoadsorción con enzimas ligadas o ELISA (Enzime Linked
Inmunosorbent Assay), es un método confiable y rápido para la detección de
agentes fitopatógenos, ya que hace posible la detección de cantidades muy
pequeñas de estos agentes en órganos de plantas y además permite estimar la
concentración de los fitopatógenos en el tejido enfermo.
El ensayo denominado sándwich de doble anticuerpo (DAS), es la variante más
comúnmente utilizada del ELISA (ver principio de la técnica) y consiste en la
adsorción de anticuerpos específicos a una placa de poliestireno seguida de la
adición de los antígenos o fitopatógenos los cuales reaccionan con los
anticuerpos adheridos a la placa. Para formar el sándwich se agregan
nuevamente anticuerpos ligados con enzimas que se adhieren a los patógenos
capturados en la placa.
1.- Sensibilización de la placa. Anticuerpo adsorbido a la placa.
2.- Adición de la muestra. Extracto a probar contenido al antígeno.
3.- Adición de la enzima conjugada. Añadir el conjugado enzima más anticuerpo.
4.- Adición del sustrato. Añadir el sustrato de la enzima.
5.- Reacción positiva. Cantidad de hidrólisis del sustrato es proporcional a la
cantidad de agente patogénico presente.
La conversión del sustrato se detecta con un espectrofotometro, donde se
registra la absorbancia tanto de controles como de muestras.
• Western blot
El Western blot es una poderosa técnica ampliamente usada para la detección e
identificación de proteínas usando anticuerpos, el proceso involucra la separación
de muestra de proteína por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La
transferencia de las proteínas separadas a partir del gel a una membrana delgada
de soporte, la membrana pega e inmoviliza las proteínas en los mismos patrones
que el gel original. La membrana (o blot) es luego expuesta a una solución
conteniendo anticuerpos que reconocen y se pegan a la proteína específica de
interés, los anticuerpos pegados a la membrana son detectados por cualquier
variedad de técnicas, usualmente involucrando tratamiento con algún anticuerpo
secundario.
9
1.- Cortar la membrana al tamaño del gel que se haya preparado.
2.- Activar la membrana con metanol 100% por 10 segundos. (Hybond P.
Amersham) life science Polivinildiel difluoride (PVDF) transfer membrane.
3.- Lavar con agua destilada.
4.- Equilibrar en buffer de transferencia durante 15 minutos.
5.- Armar el sándwich; en el siguiente orden:
cara negra, colocar esponja; papel filtro ( equilibrado), gel, membrana, papel
filtro, esponja.
6.- Colocar en la cámara para transferir Mini Trans-Blot Electroforetic transfer Cell
(Bio-Rad) por 1 hora a 50 volts, si son 2 geles, se pone por 1 hora 100 volts por lo
cual, (50 volts cada gel).
7.- Bloqueo: Se lava la membrana 2 veces por 10 minutos con TTBS (20 ml) a
temperatura ambiente, y con agitación suave.
8.- Se prepara el anticuerpo en 10 ml, por tanto se pone en 5ul de anticuerpo
conjugado con la fosfatasa alcalina, diluyéndose 50ul�7.5ml de TTBS, se diluye
en buffer de bloqueo, el cual consiste en (1% BSA en TTBS). Agitación suave por
2 hrs.
-Eliminar el buffer del anticuerpo conjugado con la fosfatasa alcalina, (este buffer
se recicla)
y lavar con TTBS 2 veces por 10 min.
9.- Lavar 2 veces con TTBS por 10 seg. con agitación.
10.-Lavar 2 veces con TBS por 10 min.
11.- Adicionar 10 ml de solución de revelado (100mM de NaCl, 5mM MgCl2,
100 mM de tris), se le adiciona 49.5 ul de BCIP, y 39.06 ul de NBT. Agitación
suave en oscuridad por aprox.10 minutos, en este caso se tiene que estar
observando cada 5 minutos.
12.- Detener revelado con H2O dd.
13.- Poner a secar la membrana y se escanea para fotodocumentar.
• Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas
Una vez realizada la comparación, se seleccionarán proteínas para ser
identificadas mediante espectrometría de masa (MALDI-TOF), para lo anterior se
realizará mediante un servicio externo en el Laboratorio de Proteómica del
10
CINVESTAV-Unidad Sinaloa. Se espera obtener mediante la huella de masa de
los péptidos, PMF (por sus siglas en inglés, PMF, péptide mass fingerprinter) la
identificación de las proteínas involucradas en la enfermedad Marchitez
Manchada.
Resultados
Mantenimiento de plantas con síntomas de Marchitez Manchada
Se mantuvieron en invernadero plantas de tomate variedad Gávilan y
Missouri, estas fueron inoculadas mediante una técnica denominada infiltración.
Esta consiste en triturar tejido de planta con síntomas y resuspenderlo en un
amortiguador de fosfatos de sodio (10 mM, pH 7.5), a una relación de 100 ug de
tejido fresco o congelado en 1 mL de solución. Se centrifugó a 4000 g para
eliminar tejido y el sobrenadante se pasó a una jeringa. Con la cual se infiltro el
extracto hacia el envés de las hojas de tomate. Se observaron lesiones en las
plantas inoculadas con tejido proveniente de plantas con síntomas, y no en
aquellas que se infiltraron solo con solución de fosfatos. En la Figura 1 uno se
observan imágenes de los síntomas inducidos en dos distintas variedades, los
cuales asemejan a los encontrados en campo. Desafortudamente no fue posible
obtener tejido de este material, dado que las plantas que se mantenían en
invernadero presentaron infección de otro tipo, debido a la contaminación del
invernadero por insectos. Por lo anterior, los análisis de proteínas se realizaron
sobre plantas obtenidas de campo con síntomas característicos de Marchitez
Manchada. En la Figura 2, se observan los síntomas caracteristicos de esta
enfermedad en plantas de tomate: a) marchites, b) ralladura en el tallo, c)
necrosis en las hojas, d) amarillamiento, y e) necrosis apical.
Estandarización de electroforesis bidimensional
Una de los puntos críticos para tener éxito en e la separación de proteínas es el
método de extracción mas adecuado para la separación de proteínas.
En la Tabla 1 se muestran los rendimientos de proteínas obtenidos. Donde se
observa que las muestras resultantes contaban con cerca de 2 ug/ul, y en total
11
cerca de 500 ug de proteína por 200 mg de tejido procesado, lo que nos permitirá
realizar hasta tres geles bidimensionales por extracción.
A B
Figura 1. Plantas de tomate inoculadas en invernadero. A. Tomate
variedad Missouri. B. Tomate variedad Gávilan.
12
a) Planta asintomática b) Planta sintomática
a)
b)
c) d)
e)
Figura 2. Comparación de planta asintomáticas vs planta con síntomas de
Marchitez Manchada.
13
Tabla 1. Rendimiento de extracción de proteínas
Método Modificaciones del método del fenol
(Hurkman, 1986).
mg proteína/g de muestra
fresca
I Fenol con lavados 2.955
II Fenol sin lavados 2.892
III Fenol/PVPP con lavados 2.389
IV Fenol/PVPP sin lavados 1.973
Una vez obtenidas estas muestras fueron separadas en base a su peso molecular
en un gel desnaturalizante (SDS-PAGE) al 12%. En la Figura 3 se observa el
patrón de proteína extraídas por los distintos métodos. Se observa que aun
cuando las proteínas fueron cuantificadas por el mismo métodos y se cargó en el
gel la misma cantidad de proteína, los patrones no se observan homogéneas
respecto a la cantidad. Esto se puede deber a la presencia de contaminantes que
reaccionan con el reactivo Bradford, generando un valor de la cuantificación
alterado. Pero en general las proteínas se separaron de manera correcta y
presentan un patrón electroforético muy homogéneo. Por lo que se decidió
continuar con el análisis de las muestras en geles bidimensionales el cual, fue el
criterio para la selección del método a emplear con el resto de las muestras.
Las muestras fueron separadas en tiras de pH inmovilizado de 7 cm Marca
BioRad de un rango de pH de 3 a 10 y posteriormente separadas en un gel SDS-
PAGE al 12%.
En la Figura 4 se muestran los geles bidimensionales representativos de los
distintos métodos de extracción evaluados. En el panel D) se observa que las
proteínas fueron correctamente enfocadas observándose los �spot� de las
14
proteínas de manera mas adecuados. Mientras que en las otras condiciones A),
B), C), no se resolvieron las proteínas de manera adecuada, tal vez a procesos
de oxidación, degradación o agregación.
MM 1 3 42
50
20
15
10
40
30
25
220
160
60
70
120
Figura 3. Primera dimensión en gel de acrilamida al 12% con 5 µL de marcador
molecular benchmark.
15
pH3
pH10
A)
pH3
pH10
B)Peso Molecular
Peso Molecular
pH3
pH10
C)
pH3
pH10
D)
Peso Molecular
Peso Molecular
Fi
gura
4.
Aná
lisis
bidi
men
siona
l de
prot
eína
s ob
teni
dos
de lo
s di
stin
tos
mét
odos
eva
luad
os. A
) M
étod
o X
, B)
Mét
odo
Y, C
) M
étod
o Z,
D)
Mét
odo
final
. 100
ug
de p
rote
ínas
resu
spen
dido
s en
buff
er d
e hi
drat
ació
n se
apl
icar
on a
una
tira
de
7 cm
rang
o de
pH
de
3 a
10 y
pos
terio
rmen
te
se se
para
ron
por p
eso
mol
ecul
ar e
n un
gel
al
12%
(SD
S-PA
GE)
. Las
pro
teín
as se
det
ecta
ron
con
azul
de
Coo
mas
sie
R-2
50.
16
Análisis de plantas con Síntomas de Marchitez Manchada
Detección del virus ToANV en plantas de tomate con síntomas de Marchitez
Manchada mediante el ensayo ELISA
Turina y col 2007 reportaron la presencia de un nuevo virus en Culiacán y
Obregón denominado ToANV. Este virus citan los autores genera los síntomas de
Marchitez Manchada que se presento recientemente en los cultivos de tomate en
Sinaloa incluyendo al Valle de Guasave. Empleando anticuerpos policlonales
generados con el virus purificado ToANV donados por el Dr. Turina, se logró
detectar la presencia del virus en las plantas colectadas en campo.
Los resultados de las pruebas de ELISA dieron positivos para las plantas
colectadas no así para las plantas asintomaticas, donde se encontró un alto nivel
de detección, por lo que se corrobora la presencia del virus ToANV o una variante
cercana de este en el material colectado. En la Tabla 2. Se observan los
resultados obtenidos de dos plantas sanas, dos plantas con síntomas y la planta
control enviada por el Dr. Turina, la cual es una planta que ha sido infectada en
con el virus ToANV. También se incluyeron en el ensayo unas plantas
ornamentales que presentaron síntomas característicos.
De cada muestra se hicieron por duplicado. Las muestras se consideran positivas
si los valores de densidad óptica son mayores a 3 veces la densidad óptica del
negativo y el control positivo es de aprox 0.20. En base a los resultados se
consideró como positivas la MM1, MM2, plantas de tomate de Culiacán y
Teresitas.
Las muestras que dieron positivas en el primer ensayo se repitieron en un
segundo ensayo, las negativas no.
17
Tabla 2. Se muestran las observancias obtenidas de algunas de las muestras
colectadas en campo
Muestra Absorbancia Absorbancia Promedio Desviación Estándar
Blanco 0.001 0.000 0.0005 0.00070711
Positivo 0.234 0.234 0.234 0
Negativo 0.004 0.004 0.004 0
Tomate Sano 1 0.006 0.005 0.0055 0.00040825
Tomate Sano 2 0.002 0.002 0.002 0
Tomate Machitez 1 0.312 0.352 0.332 0.00032321
Tomate Marchitez 2 1.124 1.288 1.206 0.11596551
Tomate Culiacán 1 0.134 0.126 0.130 0.04374103
Teresita Marchitez1 0.414 0.419 0.417 0.00353553
TeresitaMarchitez 2 0.396 0.404 0.400 0.00565685
En base a los resultados obtenidos se consideró como positivas aquellas
muestras mayores cuya absorbancia fuera dos veces mayor al blanco. Por lo que
podrías considerar que nuestras muestras presentan el virus ToANV o alguna
variante cerca de este, dado que la técnica de ELISA no genera resultados
contundentes, es posible obtener reacciones cruzadas entre virus similares. Por lo
que es necesario realizar más experimentos. En este caso optamos por el empleo
de la electroforesis bidimensional, que nos podrá generar información acerca de
la identidad del virus, así como los cambios a nivel de expresión de proteínas que
se presentan en plantas enfermas.
Análisis electroforeticos de los extractos de proteínas
De plantas sintomáticas y sintomáticas de tomate colectas en campo se
obtuvieron las proteínas y estas fueron analizadas mediante electroforesis
bidimensional. En la Figura 5 se muestran dos geles donde se separaron las
proteínas en un gradiente de pH de 4 a 7 y en un gel SDS-PAGE al 12 %. Se
observa el patrón de proteínas que se obtuvo de manera consistente en las
plantas analizadas (plantas con síntomas y sin síntomas) en tres replicas de cada
18
4 7pH 4 7pHkDa
160120100
50607090
40
30
20
kDa
160120100
50607090
40
30
20
10 10
1
234
5 6
7
Figura 5. Electroforesis bidimensional de extractos de proteínas de hojas
de tomate. A. Extracto de plantas asintomáticas; B. sintomáticas de la
enfermedad Marchitez Manchada. 100 ug de proteínas se enfocaron en una tira
de rango de pH de 4 a 7, posteriormente se resolvieron en un SDS-PAGE de 12%
y se visualizaron con azul de Coomassie.
Tabla 3. Proteínas que se encuentran de manera diferencial en plantas con
Síntomas de Plantas con síntomas de Marchitez Manchada.
Proteína pI PM
1 5.7 26.4
2 5.8 18.8
3 6.0 18.9
4 5.7 18.9
5 5.2 19.6
6 5.6 19.6
7 5.3 37.2
19
muestra. En las plantas �enfermas� se observó la presencia de siete proteínas
que no se encuentran en las plantas sanas, pero si en las plantas con síntomas,
en la Tabla 3, se muestra la relación de peso molecular y pI de dichas proteínas.
Ensayos Western blot
Conociendo que los anticuerpos contra el virus ToANV daban reacción positiva
con nuestras muestras, decimos determinar cual de las proteínas expresadas
diferencialmente en las plantas enfermas corresponden a proteínas del virus
ToANV y cuales a las de la planta de Tomate a causa de la enfermedad. Primero
se realizó un Western blot a un gel donde se resolvieron las proteínas en un gel
SDS-PAGE. En la Figura 6 se observa un gel teñido con azul de Coomassie
(Panel A) y el mismo gel pero decorado con el anticuerpo contra ToANV en el
panel B (Western Blot). Se observa que solamente una proteína de peso
molecular aproximado de 26 kDa fue identificada en las planta previamente
identificada positiva por la prueba ELISA (Carril 3, Panel A y B) y que tiene los
síntomas de Marchitez Manchada. En el caso de las plantas �asintomáticas�
(Carriles 1 y 2, Panel A y B). Por lo que se considera que esta es una proteína de
virus ToANV.
Para determinar si una de la siete proteínas identificadas previamente
(Figura 5 y Tabla 3) corresponde a la proteína de aproximada de 26 kDa, se
realizo un Western blot transfiriendo a membrana un gel resuelto en dos
dimensiones. En la Figura 7 se muestra que efectivamente una de las proteínas
identificadas como �diferenciales� corresponde en peso molecular (26.4 kDa) y pI
(5.7) a la detectada por los anticuerpos contra el virus. De lo anterior se puede
establecer que las otras seis proteínas muy probablemente correspondan a
proteínas que la infección esta afectando en el cultivo de tomate y por el tamaño
(menores a 30 kDa) podrían corresponder a proteínas reguladoras de expresión
genética. Desafortunadamente, la identificación de dichas proteínas se encuentra
en proceso.
20
M1 M2 1 2 M2 1 2 A) B)
Figura 6. Detección inmunológica de proteínas del Virus ToANV. A. Gel teniño
con azul de Coomassie. B. Western blot, empleando anticuerpos contra ToANV.
Carril 1, Planta sana; Carril 2, Planta con síntomas; M1, Marcador de peso
molecular BenchMark; M2, Marcador de peso molecular BenchMarck Pre-stained.
10 ug de proteína fueron cargados en cada carril.
21
64.2
48.8
30.1
25
19
4 75.7
~28 kDa
Figura 7. Western blot realizado a una muestra de síntomas de Marchitez
Manchada separada mediante 2D-SDS-PAGE, en un gradiente de 4-7. 100 ug de
proteína fueron aplicados a una tira IPG de 7 cm.
Identificación de proteínas mediante MALDI-TOF
La proteína no. 1 identificada como diferencial en plantas (Figura 5B) �con
síntomas� de Marchitez Manchada, misma que fue detectada mediante
anticuerpos contra el virus ToANV (Figura 7) fue seleccionada para ser
identificada mediante MALDI-TOF. En la Figura 8 se muestra el espectro de
masas obtenido al ser hidrolizada con pepsina. Los pesos moleculares de los
Péptidos obtenidos se emplearon para hacer una búsqueda en programas
específicos. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos de la búsqueda,
sorprendentemente no se identificó que esta proteína correspondiera a virus
ToANV, esto debido a que este virus no ha sido completamente caracterizado
22
(Turina y col., 2007), pero los resultados son consistentes, dado que todas las
proteínas corresponden a la misma familia de virus que pertenece el virus ToANV,
la familia Potyviridae. Estos resultados necesitan ser complementados con
secuenciación de novo, así como mediante secuenciación del N-terminal lo que
nos dará una idea mas clara de la proteína obtenida. Lo cual permitirá entender
de una manera mas clara como este virus funciona y en un futuro determinar
estrategias de control de esta enfermedad en el cultivo de tomate.
843.878131854.844262862.984389868.887714876.829693878.805906885.726006891.786541894.763013897.758597902.853168908.7547431044.8322571058.6964901065.8352831075.7848941081.7752481083.7577441085.7651731096.6492151101.6921901109.756931
A) ESPECTRO-MALDI B) MASAS OBTENIDAS Figura 8. Resultados de espectrometría de masas obtenido de la proteína no. 1
mediante MALDI-TOF
23
Tabla 4. Resultados obtenidos con el programa informático MASCOT.
Secuencias Probables Score CoberturaPeptide matches
Ornithogalum mosaic virus (OrMV) (Acc no. BAE92900)
35 28 % 9
Sweet potato feathery mottle virus
(SPFMV) (Acc no. NP_734318, Coat Protein)
39 20 % 9
Chilli veinal mottle virus (ChVMV) (Acc no. ABQ23265)
49 15 % 21
Impactos
Los resultados de este proyecto, servirán a investigadores del país e
internacionales a emplear esta metodología para entender más las interacciones
planta-virus. Además, abrirá nuevas propuestas de investigación para entender
con mayor precisión el mecanismo de acción del virus ToANV durante su
infección en tomate. Dado que al inició de esta investigación se ignoraba la
naturaleza de las proteínas del virus, y actualmente se ha aportado información
parcial de la identidad de unas de las proteínas del virus.
Conclusiones
• Se confirmó la presencia del virus ToANV en la región de Guasave o al
menos de una variante muy cercana a este mediante la técnica de ELISA.
• Se logró establecer una metodología de extracción de proteínas,
electroforesis bidimensional para la detección de proteínas expresadas
diferencialmente en plantas de tomate infectadas, este logro podrá permitir
en un futuro realizar ensayos similares para otras enfermedades que
afecten al cultivo de tomate.
• Se logró identificar una proteína del virus ToANV mediante Western blot
tanto en geles SDS-PAGE como en geles 2D-SDS-PAGE. Lo que nos dará
24
más herramientas al momento de contar con la información de las
secuencias de las proteínas identificadas.
• Se logró identificar seis proteínas que presumiblemente son alteradas por
la presencia del virus ToANV. Dichas proteínas podrían dar pauta al
entendimiento de la enfermedad y en un futuro establecer estrategias de
mejoramiento para evitar daños por el virus.
• Por espectrometría de masas (MALDI-TOF-PMF) y los anticuerpos anti-
ToANV se pudo caracterizar la proteína encontrada por homología con
proteínas de la cápside de la familia potyviridae.
Bibliografía
• Cooper B, Eckert D, Andon NL, Yates JR, Haynes PA. Investigative
Proteomics: Identification of an Unknown Plant Virus from Infected Plants
Using Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2003, 14, 736�741.
• De La Torre-Almaráz R, Cervantes-Díaz L, Houston HA, Valverde R.
Variación fenotípica de algunos aislamientos mexicanos del virus de la
Marchitez Manchada del tomate (TSWV). Agrociencia 2002 36: 211-221.
• Hernández-Martínez J., García-Mata R., Valdivia-Alcalá R., Omaña-
Silvestre J.M. (2004). Evolution of the competitiveness and profitabilidad in
red tomato (Lycopersicon esculentum L.) in Sinaloa, México. Agrociencia
38: 431-436.
• Hurkman y Tanaka (1986) Plant Physiol 81: 802-806.
• Turina M., M. D. Ricker, R. Lenzi, V. Masenga, and M. Ciuffo. (2007). A
Severe Disease of Tomato in the Culiacan Área (Sinaloa, Mexico) Is
Caused by a New Picorna-Like Viral Species. Plant disease 8: 932-941.
• Rensink, W. A., Lee, Y., Liu, J., Iobst, S., Ouyang, S. and Buell, C. R.
Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high
degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC
Genomics 2005 6:124.
• Ventelon-Debout M, Delalande F, Brizard JP, Diemer H, Van Dorsselaer A,
Brugidou C. Proteome analysis of cultivar-specific deregulations of Oryza
sativa indica and O. sativa japonica cellular suspensions undergoing rice
yellow mottle virus infection. Proteomics. 2004 Jan;4(1):216-25.
25
• Whitham SA, Yang C, Goodin MM. Global impact: elucidating plant
responses to viral infection. Mol Plant Microbe Interact. 2006
Nov;19(11):1207-15.
• Yao ZP, Demirev PA, Fenselau C. Mass Spectrometry-Based Proteolytic
Mapping for Rapid Virus Identification. Anal. Chem. 2002, 74,2529-2534