1

CAPÍTULO I

PLANTEAMIENTO METODOLÓGICO

1.1 DESCRIPCIÓN DE LA REALIDAD PROBLEMÁTICA

Puesto que en nuestra población peruana la medicina natural y alternativa esta en

apogeo y hay un mayor mal uso de estas plantas medicinales se ha visto por

conveniente realizar este trabajo de investigación por ello que en esta temporada hay

mas enfermedades aéreas se vio por conveniente realizar este trabajo para ver si

esta planta podría tener un efecto antibacteriano ante cepa de Staphylococcus

aureus.

1.2 DELIMITACIONES Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

1.2.1 DELIMITACIONES

A. DELIMITACIÓN ESPACIAL: La parte experimental del presente trabajo de

investigación se realizó en los laboratorios de la Universidad Alas Peruanas-

Filial Arequipa.

B. DELIMITACIÓN TEMPORAL: El presente estudio se llevó a cabo en los

meses de marzo, abril, mayo y junio.

C. DELIMITACIÓN SOCIAL:El presente trabajo de investigación beneficiara a los

estudiantes y especialmente a la población por el contenido de información

importante para el mejoramiento de la salud y el buen uso de estas plantas

medicinales.

2

D. DELIMITACIÓN CONCEPTUAL:

1. Área: Ciencias de la Salud.

2. Campo: Farmacia y Bioquímica.

3. Línea: microbiología, y biotecnología.

4. Tema General: Evaluación del efecto antibacteriano del Tarwi (Lupinus

mutabilis) ante cepas de Staphylococcus aureus.

5. Especificación del tema: Evaluación del efecto antibacteriano del extracto

acuoso de las semillas de Tarwi (Lupinus mutabilis) sobre cepas de

Staphylococcus aureus, en los laboratorios de Universidad Alas Peruanas

Arequipa 2013.

6. Problema a Investigar: El efecto antibacteriano del Tarwi (Lupinus

mutabilis).

1.2.2 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

El conocimiento de las propiedades curativas de las plantas ha sido y es un reto

constante que nos ha llevado por los caminos de la investigación para descubrir la

cura de enfermedades. Lupinus mutabilis (Tarwi) es una planta poco conocida, sin

embargo, es utilizada frecuentemente en la zona en la que crece, lo cual podría

ocasionar que se produzca un mal uso debido al desconocimiento en cuanto a la

composición química propia de la planta

1.3 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

1.3.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

¿El Tarwi (Lupinus mutabilis) tiene efecto antibacteriano sobre Staphylococcus

aureus?

1.4. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.4.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto antibacteriano del extracto acuoso de las semillas de Tarwi

(Lupinus mutabilis) sobre cepas de Staphylococcus aureus, Arequipa 2013.

3 1.4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar el pH, densidad, características organolépticas, del extracto acuoso

de las semillas de Tarwi.

Establecer el efecto bacteriostático del extracto acuoso deLupinus mutabilis,

sobre Staphylococcus aureus.

Determinar la actividad bactericida del extracto acuoso deLupinusmutabilis,

sobre Staphylococcus aureus

1.5. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN

Dado que las semillas del Tarwi presentan alcaloides dentro de su composición

fitoquímica, los mismos que generalmente poseen propiedades antimicrobianas, es

probable que el extracto acuoso de las semillas de Tarwi presente actividad

antibacteriana.

1.6. VARIABLES E INDICADORES

VARIABLE DIMENSION INDICADOR CATEGORIZACION

Actividad

Antibacteriana sobre

las Cepas de

Staphylococcus

aureus.

Método de

dilución

C.I.M.

C.M.B.

Cualitativo

Cuantitativo

1.7. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN

En la actualidad cientos de especies vegetales son utilizadas en la medicina; Sin

embargo, la ciencia moderna, analizando y estudiando los efectos terapéuticos de

las plantas, quiere precisar, comparar y clasificar las diversas propiedades, no con el

fin de disminuir la confianza en los productos naturales, sino más bien para agrupar

a las plantas de efectos similares con la finalidad de conocer los principios activos

responsables de la cura de enfermedades, de esta forma determinar sus estructuras

químicas y procurar su síntesis.

4

En el Perú existe una diversidad cuantiosa de especies vegetales que poseen

propiedades farmacológicas con fines terapéuticos diferentes, dado que posee

climas y microclimas variados, esto permite que se desarrollen diferentes principios

activos.

Dentro de la flora nativa del Valle del Mantaro, en Huancayo (Junín), Puno, Cusco y

Ayacucho, se encuentra el Tarwi (Lupinus mutabilis), especie utilizada por los

comuneros de la zona para tratar proceso infecciosos y otros fines terapéuticos;

Cabe resaltar que es importante el estudio las plantas nativas, asimismo que dichos

estudios presenten garantías científicas. Es debido a esto que en el presente

estudio, tiene como objetivo realizar la evaluación del efecto antibacteriano del

extracto acuoso de las semillas de Tarwi (Lupinus mutabilis) sobre cepas de

Staphylococcus aureus, por lo cual cabe significar un inicio o una base para el

desarrollo de futuras investigaciones sobre esta especie vegetal

1.9. TIPO Y NIVEL DE INVESTIGACIÓN

1.9.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN

El tipo de investigación fue descriptivo.

1.9.2. NIVEL DE INVESTIGACIÓN

El nivel de investigación fue de nivel básico.

1.10. MÉTODO DE LA INVESTIGACIÓN

1.10.1. INSTRUMENTOS

• Tubos de ensayo

• Gradilla

• Papel filtro y pabilo

• Balón de gas

• Mechero bunsen

• Trípode

• Malla de asbesto

• Autoclave

• Pipeta Pasteur

5

• Placas

• Matraz

• Tampón

• Asa de necrón

• Asa de digaski

• Vaso beacker

• Mechero y encendor

• Papel kraf

• Porta objetos

• Microscopio

• Gotero

• Fiola

• Jeringas de 1ml, 5ml, 20ml.

• Gasa y algodón

• Lapicero tinta indeleble

1.10.2. EQUIPOS:

• Autoclave (Allamerican, Modelo 1925X).

• Balanza analítica (Nahita, Modelo 5034/120).

• Incubadora (Nahita, Modelo 636/13).

• Refrigeradora (LG, GR-T342GV)

• PH metro (Fisher Scientific).

• Densimetro

1.10.3. REACTIVOS

• Reactivo de Mayer

• HgCl2

• KI

• Peróxido de hidrogeno

• Agar sangre

• Agua destilada estéril.

• Agar manitol salado.

• Agar Mueller Hinton.

6

• Agar baird Parker

• Plasma sanguíneo

• H2O2

• Tinción gram

1.10.4. ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

1. OBTENCIÓN DE LA PLANTA(LA PARTE DEL ESTUDIO)

La planta (semilla) de estudio Tarwi (Lupinus mutabilis) se obtuvó en el

mercado Túpac Amaru, Juliaca.

Se elegirá semillas sanas que no posean signos de infestación parasitaria.

2. LIMPIEZA DE LA SEMILLA DEL VEGETAL

Se limpiaran las semillas ya seleccionadas.

3. MOLIENDA

Se procederá a moler la muestra con el fin de almacenarla y conservarla para

los estudios de investigación, se utilizara un molino de grano domestico hierro

hasta obtener un grado de división de la semilla adecuado 0.5mm.

4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN

Para el almacenamiento se trabajó con cantidades adecuadas de muestra

(1kg), se utilizaran papel kraft, protegidos de la luz y la humedad.

1.10.5. MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL EXTRACTO POR COCCIÓN

Fundamento:

Se fundamenta en la extracción de los principios activos de un material

vegetal al poner en contacto la droga y el solvente (agua), a fuego lento

durante 15 minutos, después del hervor.

Se pesó 20gr. de semilla de Tarwi en 100ml. de agua (concentración a 20%).

CONSERVACIÓN DEL EXTRACTO

El extracto será conservado en un recipiente color ámbar previamente

esterilizado, verificando que el recipiente estuviera correctamente cerrado. El

extracto se mantendrá a una temperatura adecuada, en un lugar fresco y

oscuro para prolongar su estabilidad.

7 1.10.6. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS

1.10.6.1. IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES

a. Reacción de Mayer

Se colocara en un tubo de ensayo 2 mL del extracto acuoso, se adicionaron

20 gotas de HCl al 8% y luego se agitara suavemente hasta disolver. Se

calentara a baño maría por 5 minutos, para luego adicionar gota a gota el

Reactivo de Mayer (Preparado con bicloruro de mercurio y yoduro de potasio)

hasta observar cambios.

La aparición de un precipitado amarillento se considerara como prueba

presuntiva (+) de la presencia de alcaloides.

b. Reacción de Wagner

Se colocara en un tubo de ensayo 2 mL del extracto acuoso, se adicionaron

20 gotas de HCl al 8% y luego se agitara suavemente hasta disolver. Se

calentara a baño maría por 5 minutos, para luego adicionar gota a gota el

Reactivo de Wagner hasta observar cambios.

La aparición de un precipitado marrón se considerara como prueba presuntiva

(+) de la presencia de alcaloides.

1.10.6.2. IDENTIFICACIÓN DE SAPONINAS

a. Ensayo del índice afrosimétrico

Fundamento: Las saponinas se caracterizan porque al entrar en contacto con

el agua producen una espuma persistente, esta es formada debido a que los

saponósidos disminuyen la tensión superficial del agua.

Procedimiento: Se colocara en un tubo de ensayo 1 mL del extracto acuoso,

se le añadieron 5 mL de agua destilada (proporción 1:5) y se agitara

vigorosamente durante 3 minutos.

La formación de espuma mayor a 2mm de altura y con una duración mayor a 2

minutos se considerara como prueba presuntiva positiva (+) de la presencia

de saponinas.

1.10.6.3. IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES

a. Reacción de Shinoda

Fundamento: Cuando se ponen en contacto el magnesio metálico y el HCl

concentrado, el magnesio es oxidado, dando como productos el H2, que es

eliminado en forma de gas y el Cloruro de magnesio (MgCl2), que es el que

forma complejos con los flavonoides dando coloraciones características.

8

Procedimiento: Se colocara en un tubo de ensayo un trozo de magnesio

metálico, luego se añadirá 2 mL del extracto acuoso y unas pocas gotas de

HCl al 8% v/v por la pared del tubo, agitando suavemente.

La presencia de coloraciones que varían de amarillo a rojo, se considerara

prueba positiva (+) de la presencia de flavonas y flavonoles.

1.10.6.4. IDENTIFICACIÓN DE TANINOS

a. Reacción con FeCl3

Fundamento: Los taninos al ser mezclados con sales férricas, reaccionan

dando lugar a coloraciones o precipitados de color verde y azul intensos,

debido a la formación de tanato férrico.

Procedimiento: Se colocara 1 mL del extracto acuoso en un tubo de ensayo y

se le añadirá gota a gota FeCl3, luego se procederá a agitar suavemente.

La coloración verde a azul nos indicara la presencia de compuestos fenólicos,

sales férricas galotaninos y elagitaninos dan una coloración azul oscuro,

mientras que los taninos condensados dan positivo a coloración verde

parduzco.

1.10.7. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICO Y

FISICOQUIMICAS DEL EXTRACTO

1.10.7.1. Determinación de olor

Se tomó una tira de papel secante de aproximadamente 1 cm de ancho por 10

cm de largo y se introdujo un extremo en la muestra. Se deberá oler y determinar

si corresponde con la característica del producto.

1.10.7.2. Determinación del color

Se tomó un tubo de ensayo bien limpio y seco; se llenó hasta las tres cuartas

partes con la muestra de ensayo y se observó el color.

1.10.7.3. Determinación del pH

Se realizó con ayuda de un peachimetro y cinta reactivas introduciéndolo en la

muestra de ensayo.

1.10.7.4. Determinación e la densidad

Se realizó con ayuda del densímetro introduciéndolo en la muestra de ensayo.

9 1.10.8. IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS DE ESTUDIO

1.10.8.1. Prueba de la Catalasa1

Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2)

en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las

bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del

metabolismo aerobio de los azúcares.

Procedimiento: Se colocó una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego

se transferirá una porción de colonia, proveniente de un cultivo en agar Mueller

Hinton, sobre el H2O2 realizándose una emulsión.

La aparición de burbujas es prueba positiva para Estafilococos, la prueba

negativa indica la presencia de Estreptococos.

1.10.8.2. Prueba de la Coagulasa1

Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa:

Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está unida a la

pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la

formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana

con plasma citratado (test en lámina).

Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un

factor (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el

fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Procedimiento: Se emulsionaran varias colonias en un tubo con 0,5mL de

plasma sanguíneo. Se incubó a 37°C y se observara la formación del coágulo a

las 4 horas y a las 18 horas. La formación de un coágulo total o parcial se

considerara como test positivo.

1.10.8.3. Tinción Gram

1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:

• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que

enfríe un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta coger un poco

de muestra. - Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa),

hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para

depositar la muestra contenida en el asa.

• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a

realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos

10

giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la

extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina.

• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar

la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por

la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las

bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea

apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con

violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho

colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja

actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar

a una temperatura ambiente de 25 grados.

3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con

agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de

agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte

superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro

delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el

enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo.

4) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol

durante 1 minuto más.

• El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con

colorantes y determine su fijación a las bacterias.

5) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con

etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no

escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante.

Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste

salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido

azul.

6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la

lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma

anteriormente descrita.

7) Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez

se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar

actuar durante 1 minuto.

11

8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua,

se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

1.10.8.4. Prueba de Manitol Salado1

Fundamento: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el

aislamiento y diferenciación de estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de

muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de

importancia sanitaria.

El medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y

peptonas.

Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC, el crecimiento se

puede identificar por el viraje de color rojo a amarillo.

El S. aureus el crecimiento sin viraje, es por la alta concentración de sal inhibe

otros microorganismos excepto S. aureus (por lo tanto usar la placa para

identificación, no para aislamiento).

1.10.8.5. prueba de baird parker

Fundamento:En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el

extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de

levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el

crecimiento de los estafilococos.

Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al

cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante. La yema

de huevo permite demostrar la actividad lecitinásica.

Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan

colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo

produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una

zona clara más externa.

Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual características de

colonias pero sin la zona opaca y clara.

Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioquímicas.

Procedimiento

Siembra

- Directa, estriando la superficie del medio de cultivo.

12

Incubación

En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 a 48 horas.

Interpretación de los resultados

Observar las características de las colonias.

Bacterias que reducen el telurito de potasio: colonias de color grisáceo-negro.

Bacterias que no reducen el telurito de potasio: colonias del color del medio,

transparentes.

Bacterias con actividad lecitinásica: halo claro en el medio de cultivo alrededor de

la colonia. Puede existir también un halo opaco alrededor de la colonia con un

halo claro externo.

Bacterias sin actividad lecitinásica: ausencia de halo claro alrededor de la

colonia.

1.10.9. PREPARACIÓN DEL INÓCULO BACTERIANO1

Con un asa de kollé se tomaran 3 a 5 colonias de Staphylococcus aureus

provenientes del cultivo en agar Mueller Hinton; que se van a transferir a un tubo

con 5 mL de solución salina al 0.9%.

Se homogeneizaran las colonias y seguidamente se estandarizara el inóculo por

comparación de turbidez con el tubo 0.5 de la escala de Mc Farland que

corresponde a 108 células/ml.

1.10.10. DETERMIANCION DE LA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA

1.10.10.1. Método de Macro dilución en Caldo

Es un método referencial para la determinación de la sensibilidad a los

antimicrobianos. Se requiere de una serie de tubos con caldo a los cuales se les

agrega el antimicrobiano en distintas concentraciones, luego se inoculan con una

suspensión estandarizada del microorganismo en estudio y se incuban bajo

condiciones y tiempos recomendados.

Procedimiento:

Se prepara una suspensión del germen problema procedente de un cultivo de no

más de 24 horas. Se ajusta esa suspensión con el 0.5 de la escala turbidimétrica

de Mac Farland equivalente 108 UFC por ml

13

Se realiza una dilución posterio1:100 (fiola) para obtener una concentración de

106UFC/ ml.

Se realiza diluciones seriadas, el tubo n°10 no posee sangre de grado y sirve

como control de crecimiento (T)

Se agrega 1 ml de suspensión microbiana con 106 UFC/ ml a la serie de 10 tubos

y se incuba a 37 ° C durante 18 horas.

Una vez transcurrido dicho lapso se procede a la observación a simple vista de

los tubos y la interpretación de los resultados obtenidos

Primero se observa el tubo testigo (ultimo tubo de la serie) que debe tener

desarrollo bacteriano (turbidez), y que solo contiene caldo nutritivo y la

suspensión del microorganismo. Luego se observa cual es el primer tubo de la

serie que presenta turbidez, el tubo anterior a este (ultimo tubo de la serie que no

presenta turbidez) es el que corresponde a la concentración inhibitoria minina.

1.10.11. CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA

En el método de siembra incorporada o por inclusión se procede a depositar 1ml

de cada dilución en placas estériles, vacías y por duplicado. Posteriormente se

agrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, se agita moviendo

la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular. Así, la

muestra se mezcla con el medio de agar. En cualquiera de los casos luego de la

siembra es necesario llevar las placas a estufa para permitir el crecimiento de los

microorganismos.

Se incuba durante 18 horas.

Transcurrido dicho tiempo, puede determinarse el número real de UFC

delinoculo. Para obtener un resultado con precisión estadística suficiente se

aplica la siguiente fórmula:

N° de colonias obtenidas x el factor de dilución

ml sembrados en la placa

14 1.11. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN

1.11.1. TÉCNICAS

La presente investigación utilizó la observación laboratorial como técnica para la

recolección de los datos de la investigación:

- Recopilación bibliográfica (Técnica de macro dilución en caldo, CIM, CMB).

1.11.2. INSTRUMENTOS

Libros, tesis, artículos científicos.

1.12. COBERTURA DEL ESTUDIO

1.12.1. UNIVERSO

Cultivo de cepas de Staphylococcus aureus, cultivadas en medio Agar Mueller

Hinton.

1.12.2. MUESTRA

Colonias aisladas de Staphylococcus aureus que fueron utilizadas para la

preparación de los correspondientes inóculos.

15

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS

Roque. M, Tristán, M” flavonoides y alcaloides de Lupinus mutabilis c. p. Smith con

actividad antifúngica”. Instituto de química orgánica aplicada a la farmacia, unmsm.

Facultad de farmacia y bioquímica, instituto de microbiología. Unmsm. Facultad de

farmacia y bioquímica.

RESUMEN

Las hojas de Lupinus mutabilisde Smith, procedente de las zonas altas del

departamento de Lima, contiene entre otros metabolitos, flavonoides y alcaloides. El

espectro IR revela la presencia del alcaloide lupinina o hidroxilupanina. El flavonoide

y el alcaloide tienen marcada acción antibacteriana y el último muestra además una

actividad antifúngica.

Efecto antibacteriano del extracto alcohólico y del extracto acuoso de té verde

(Camellia sinensis) sobre bacterias orales de Importancia Estomatológica,

Streptococcus mutans, Streptococcus mitis y Streptococcus salivarius. UAP.2010

(Villalba).

16 RESUMEN

Las hojas de té verde que se utilizaron tuvieron actividad antibacteriana por la

cual utilizaron para evidenciar este efecto, la técnica de difusión en pozos la cual

se utilizó para realizar el presente trabajo de investigación.

2.2. MARCO CONCEPTUAL

2.2.1. TARWI

A. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Es una leguminosa herbácea erecta de tallos robustos, algo leñosa. Alcanza una

altura de 1,8-2 m. Se cultiva principalmente entre los 2.000 y 3.800 msnm, en climas

templados y fríos.

Tallo. Robustos algo leñosa.

Hojas. Las hojas tienen forma alargada, generalmente compuesta por ocho folíolos

que varían entre ovalados a lanceolados. Se diferencia de otras especies de Lupinus

en que las hojas tienen menos vellosidades. Referente las semillas de Tarwi, están

incluidas en número variable en una vaina de 5 a 12 cm y varían deforma (redonda,

ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm.

Flores varían en color desde el azul el morado y penden de las hojas para atraer a

los insectos polinizadores. Estas emiten un aroma parecido al de la miel. La vainas de

5 a 10 cms.de largo

Semilla. Contienen de 2 a 6 semillas ovaladas de 0.6 a 1 cm de diámetro.

B. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y HÁBITAT

Es una planta sudamericana, se encuentra en los países de Perú, Bolivia y Argentina

en mayor proporción, se desarrolla en cualquier época del año, habitat en suelos

areno-arcillosos, pedregosos, muy húmedos.

Su hábitat depende de la elevación, esta puede ser: Elevación extrema muy por

encima de la línea del bosque (la elevación absoluta depende de la latitud); o

elevación alta (cerca del límite del bosque), (la elevación absoluta depende de la

latitud).

Depende también de las condiciones de agua, donde el período seco sin

precipitaciones dura 6 - 10 meses. Las precipitaciones alcanzan 100 - 300 mm

anuales, concentrándose en invierno.

17

Respecto a las condiciones de luz esta planta se encuentra expuesta en Pleno sol sin

ninguna protección. Partes planas o laderas de exposición norte.

C. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden:Fabales

Familia: Fabaceae

Género: Lupinus

Especie:mutabilis

Nombre Científico:Lupinus mutabilis

Nombre Común: Tarwi.

D. COMPOSICIÓN QUÍMICA

El componente más importante, según antecedentes teóricos y al que se atribuye en

parte sus virtudes antibacterianas, es el alcaloide. Esta sustancia se encuentra en

una concentración mayor con relación a los demás metabolitos como son taninos,

flavonoides y saponinas presentes en la planta.

E. USOS

En algunos países como Perú, Bolivia y Argentina se le da un uso netamente

nutricional. La medicina tradicional le atribuye propiedades anti fúngicas para

infecciones micóticas, para ectoparásitos.

F. METABOLITOS SECUNDARIOS

Un aspecto metabólico que distingue el reino animal del vegetal es la capacidad de

las plantas para producir sustancias que no son esenciales para su supervivencia. A

esas sustancias se les denomina metabolitos secundarios, los animales superiores

raramente los producen, si acaso pueden ser encontrados ocasionalmente en

insectos y otros invertebrados.

El metabolismo secundario compromete aquellos procesos químicos que son únicos

para una planta dada, y no son universales. Dicho metabolismo es la química que

conduce a la formación de un producto natural.

18

Especies muy relacionadas taxonómicamente del mismo género pueden tener

distintos tipos de metabolitos secundarios, o si tienen los mismos, pueden

presentarlos en proporciones variables de uno a otro.

Las plantas están constantemente expuestas a numerosos patógenos microbianos,

principalmente hongos. Durante la evolución, algunas plantas han desarrollado

diversos sistemas para defenderse de sus atacantes microbianos, tales como

sistemas de defensa inducibles y constitutivos o mediante proteínas anti fúngicas,

polímeros estructurales resistentes a los patógenos y antibióticos. Las plantas

también utilizan los metabolitos secundarios como agentes de señalización durante la

interacción con patógenos.

Su potencial radica también en la importancia para la defensa de la planta frente a

microorganismos, los metabolitos secundarios también permiten atraer a

microorganismos simbiontes. Así es el caso de los flavonoides que producen las

leguminosas para atraer a las bacterias fijadoras de nitrógeno.

Las plantas han sido utilizadas por el hombre a lo largo de muchos años como fuente

para elaborar medicinas, conservantes, aromatizantes o pigmentos. Además de ser

importantes como medicamentos, también hay evidencias de que los metabolitos

secundarios son importantes para nuestro estado de salud en general.

G. ALCALOIDES

Los alcaloides son compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos de

nitrógeno, generalmente en anillo heterocíclico y con actividad fisiológica específica.

Son sustancias de origen biológico y sobre todo de origen vegetal. Por lo general

presentan un nitrógeno heterocíclico, como amina primaria (R-NH2), secundaria (R’-

NH) o terciaria (R’’-N).

Son particularmente activos en el Metabolismo vegetal. Se los considera como

depósitos para síntesis proteicas y estimulantes o reguladores de actividades como el

crecimiento, metabolismo y reproducción.

2.2.2. Staphylococcus aureus

A. GENERALIDADES

Conocido como Staphylococcus aureus o comúnmente Estafilococo dorado, es

una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva, productora de coagulasa, catalasa,

inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo.

19

Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia

física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la entero toxina

estafilocócica secretada por la bacteria.

En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante de

las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que

esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo

que permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrente

sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal

sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente.

Puede mantenerse viable por 6-14 semanas en pus y se necesitan 15 minutos de

exposición al alcohol de 70° para su eliminación.

B. DIVISIÓN TAXONÓMICA

Reino: Bacteria

Phillum: Fimicutes

Clase: Bacilli

Orden: Bacillales

Familia: Micrococcaceae

Género: Staphylococcus

Especie: S. aureus.

C. ESTRUCTURA ANTIGÉNICA

En la estructura de la pared celular, los estafilococos contienen polisacáridos,

proteínas antigénicas y también otras sustancias importantes. El peptidoglucano (un

polímero polisacárido formado por la unión de subunidades) suministra el

exoesqueleto rígido de la pared celular. La exposición a un ácido fuerte o a la

lisozima destruye a los peptidoglucanos. El peptidoglucano es importante en la

patogenia de la infección: induce la producción de interleucina-1 (pirógeno endógeno)

y de anticuerpos opsónicos en los monocitos; y puede atraer químicamente a los

leucocitos polimorfonucleares, posee actividad parecida a endotoxina, genera un

fenómeno de Shwartzman localizado y activa al complemento.

Los ácidos teicoicos, polímeros de glicerol o fosfato ribitol, están unidos al

peptidoglucano y pueden ser antigénicos. Los anticuerpos antiteicoicos detectables

mediante difusión en gel pueden observarse en pacientes con endocarditis activa por

S. aureus.

20

Algunas cepas del S. aureus poseen cápsulas que inhiben la fagocitosis por los

leucocitos polimorfonucleares a menos que se encuentren presentes anticuerpos

específicos.

D. ENFERMEDADES

Síndrome del choque tóxico (SST). Infecciones intrahospitalarias.

Durante la convalecencia, después de las intervenciones quirúrgicas o de

quemaduras graves, uno de los principales riesgos consiste en la infección de los

tejidos lesionados por microorganismos típicos del ambiente hospitalario cuyas más

destacadas características son su invariable virulencia y multirresistencia a los

antimicrobianos; las especies bacterianas más frecuentes en este rubro son

Pseudomonas aureginosa y Staphylococcus aureus. Una vez que el agente infectante

ha colonizado los tejidos dañados, puede penetrar al torrente circulatorio,

ocasionando septicemias y, consecuentemente endocarditis, artritis, meningitis, etc.

21

CAPÍTULO III

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

3.1. POBLACIÓN Y MUESTRA

3.1.1. POBLACIÓN:

Cultivo de cepa de Staphylococcus aureus, cultivadas en medio Agar Mueller

Hinton.

3.1.2. MUESTRA

Colonias aisladas de Staphylococcus aureus que fueron utilizadas para la

preparación de los correspondientes inóculos

3.2. NIVEL Y GRADO DE SIGNIFICANCIA

El nivel de confianza es de 95% y el grado de significancia es 0.05

3.3. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

CUADRO No. 1

Determinación fitoquímica y pH

Extracto acuoso de Tarwi

Color Amarillo claro

Sabor Amargo

Olor Característico

PH 6.7

Densidad 1.5

Fuente: Propia

22

CUADRO No. 2

Identificación de metabolitos con potencia

Metabolito Ensayo Resultado

Alcaloides R. Wagner +

R. Mayer +

Taninos R. Cloruro Férrico +/-

Flavonoides R. Shinoda +

Saponinas I. Afrosimétrico +

Leyenda: (+) Presenta; (+/-) presencia regular; (-) no presenta

Fuente: Propia

Interpretación: Según el cuadro No. 2 se pudo observar la presencia de alcaloides,

saponinas y flavonoides, y en regular presencia los taninos.

CUADRO No. 3

CIM (turbidez)

No. de tubo CIM (turbidez)

Extracto + agua

peptonada

-

1 (100 µg/ml) -

2 (50 µg/ml) -

3 (25 µg/ml) -

4 (12.5 µg/ml) -

5 (6.25 µg/ml) +

6 (3.12 µg/ml) +

7 (1.6 µg/ml) +

8 (0.8 µg/ml) +

9 (0.4 µg/ml) +

Inoculo + agua

peptonada

+

Fuente: Propia

Leyenda: (+) presencia de turbidez, inhibición de crecimiento bacteriano.

(-) no presencia de turbidez, crecimiento bacteriano.

23

CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

PRIMERA: Se concluye que el extracto acuoso de Tarwi presenta efecto antibacteriano

frente a Staphylococcus aureus.

SEGUNDA:Se determinó que el extracto de la semilla de Tarwi (Lupinus mutabilis)obtuvó

un pH de 6.7, densidad 1.5, color amarillo claro, olor característico, sabor amargo.

TERCERA:Se determinó que el extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) tiene

actividad bacteriostática, ya que se observó la presencia de turbidez en el tubo 5

(concentración de 6,25 µg/ml).

CUARTA:Se determinó que el extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) no tiene

efecto bactericida a una concentración del 20 %.

24

RECOMENDACIONES

1. Realizar estudios posteriores con concentraciones mayores a 20% para poder

determinan el efecto bactericida del extracto acuoso de semilla de Tarwi (Lupinus

mutabilis).

2. Se recomienda continuar con el trabajo, realizando estudios cuantitativos del efecto

antibacterianodel extracto acuoso de Tarwi (Lupinus mutabilis) frente a cepas de

Staphylococcus aureus.

25

BIBLIOGRAFIA

LIBROS

1. Diaz R., Gamazo C., Goñi I., Manual Práctico de Microbiología, 2° Edición, Editorial

Masson, 2006.

2. Kennethj. Ryan Md, C. George Ray, Md. Microbiology, Prescott, Harley Y Klein. Mc

Graw-Hill.Interamerican.2005

3. Martínez Miranda Migdalia; Cuéllar Cuéllar Armando. Farmacognosia y productos

naturales. 1° Ed. La Habana, Cuba: Editorial Félix Varela.

ARTICULOS Y REVISTAS CIENTIFICAS

1. AGUWA, C. C.; LAWAL, A. M., Pharmacologic studies on the active principIes of

Calliandra portoticensis leaf extracts. J-Ethnopharmacol. Jan; 22(1): 63-71, 2005.

2. ALARCÓN DE LA LASTRA, C.; LÓPEZ, A.; MOTILVA, V. Gastroprotección and

prostaglandin E2 generation in rats by flavonoids of Dittrichia viscose. Planta Med. Dec;

59(6): 497-501, 2002.

3. ALARCÓN DE LA LASTRA, C.; MARTÍN, M. J. Antiulcerogenicity of the flavonoid

fraction fron Bidens aurea: comparison with Ranitidine and Omeprazole. J.

Ethnopharmacology. May; 42(3): 161-8, 1994

4. Bucay Morocho, Luis Carlos. Estudio Farmacognóstico y actividad antimicrobiana

de la violetilla (Hybanthus parviflorus). Universidad de Chimborazo, Riobamba Ecuador.

2009

5. Sarmiento LA. Efecto antibacteriano del extracto alcohólico y del extracto acuoso

de té verde (Camellia sinensis) sobre bacterias orales de Importancia Estomatológica,

Streptococcus mutans, Streptococcus mitis y Streptococcus salivarius. UAP.2010. [Tesis

para optar al título de Cirujano Dentista]. Arequipa. Universidad Alas Peruanas. 2010.

26

ANEXO NRO 1

TITULO: Preparación del Material y equipos. (Fuente: Propia)

Figura 1 figura 2 figura 3 figura 4 figura 5

ANEXO NRO 2

TITULO: Preparación de agares y extracto (Fuente: Propia)

Figura 6 figura 7 figura 8

ANEXO NRO 3

TITULO: Plaqueado (Fuente: Propia)

Figura 9 figura 10 figura 11

ANEXO NRO 4

TITULO: Medición de pH y pruebas fitoquimicas (Fuente: Propia)

Figura12 figura 13 figura 14

TITULO: Inoculo y escala (Fuente: Propia)

27

Figura 15figura 16 figura 17

ANEXO NRO 5

TITULO: Pruebas experimentales (Fuente: Propia)

Figura 18 figura 19 figura 20

ANEXO NRO 6

TITULO: Crecimiento de cepas (Fuente: Propia)

Figura 21 figura 22 figura 23

ANEXO NRO 7

TITULO: Incubación y congelamiento (Fuente: Propia)

Figura 24 figura 25

28

ANEXO NRO 8

TITULO: Identificación y realización de CIM-CMB (Fuente: Propia)

Figura 26 figura 27 figura 28

C.E. C.I.

C.I.E.(-) C.I.E.(+)

Leyenda: C.E.= Crecimiento estéril (agua peptonada+extracto)

C.I.= Crecimiento de inoculo (agua peptonada+bacteria)

CIE= Crecimiento inoculo y extracto (agua peptonada+bacteria+extracto)