Informe. Resumen. En este proyecto se abordaron varios aspectos en cuanto a la obtención de metabolitos de cianobacterias nativas, con el fin de evaluar su actividad biológica y evaluar si estos extractos son tóxicos para los organismos acuáticos, al realizar pruebas biológicas con células cancerosas cultivadas in Vitro se encontró que estos extractos producen una mortalidad elevada en estas células, por lo que se establecieron protocolos para determinar su actividad, así como su caracterización bioquímica, actualmente se prueba con varias líneas de células cancerosas para determinar el efecto de los extractos. Otra de los ensayos realizados fueron pruebas toxicológicas con cladóceros, encontrándose que los extractos de estos organismos pueden resultar potencialmente tóxicos a los organismos acuáticos que se encuentran en estos ambientes Así mismo en este proyecto se diseño y se construyó un fotobiorreactor airlift, para el cultivo de estos organismos, el diseño de este reactor aporta algunas innovaciones a los que se emplean actualmente para el cultivo de este tipo de organismos como: el diseño en sí de fotobiorreactor donde los difusores se diseñaron de tal forma que permite una mejor mezclado, así como el encendido y apagado de este que permite un mezclado de tipo airlift, este diseño se encuentra en proceso de patentamiento. Introducción. Las cianobacterias muestran una considerable plasticidad genotípica y fenotípica, lo que les permite desarrollar una amplia variedad de nichos ecológicos (Whitton, 2000). Estos microorganismos son comunes en todos los tipos de ambientes naturales y muchas especies son semicosmopolitas; algunas son con frecuencia componentes dominantes del plancton en lagos y océanos, otras son características de arroyos, ríos, estuarios, aguas termales o costas rocosas, algunas otras están bien adaptadas al ambiente terrestre y son particularmente abundantes en suelos tropicales y en campos inundados . Por otra parte, poseen una gran importancia en el ambiente, como colonizadores primarios tienen una impresionante capacidad para colonizar sustratos infértiles tales como ceniza volcánica, desiertos y rocas, otro carácter remarcable es su habilidad para sobrevivir en temperaturas extremas, así como ser importantes productores primarios. Otro papel trascendente que desempeñan en el ambiente, se debe a la gran variedad de interacciones ecológicas que desarrollan, ya que establecen relaciones simbióticas con una gran variedad de organismos entre los que se encuentran hongos, briofitas, pteridofitas, gimnospermas, angiospermas así como con animales marinos (esponjas y tunicados). Sin embargo, tal vez su mayor importancia resida en el papel que desempeñan en el proceso fundamental de la fijación biológica del nitrógeno ya que muchas de las cianobacterias de vida libre y aquellas que forman asociaciones simbióticas contribuyen significativamente con la disponibilidad del nitrógeno tanto en ambientes acuáticos como terrestres. Las cianobacterias son un componente común e importante del fitoplancton en ambientes acuáticos, sin embargo bajo ciertas condiciones puede verse favorecida la acumulación masiva de ciertas cianobacterias formando lo que se conoce como florecimientos algales o “blooms” , algunos de los géneros que comúnmente presentan este comportamiento son Microcystis, Oscillatoria, Anabaena Nostoc y Nodularia. Estos florecimientos masivos pueden aparecer rápidamente, inclusive en horas y sin haber sido advertida la presencia de estos organismos en el agua, esta pronta aparición se debe a la migración hacia la superficie de una población dispersa existente, y no al crecimiento celular. Su aparición esta también asociada con condiciones de calma y disminución de la turbulencia en la

columna de agua, condiciones que permiten a estos microorganismos flotar hacia la superficie, en consecuencia, un bloom de superficie ocurre solo si existe una población de cianobacterias, y esto depende en parte del tamaño de la población preexistente. A pesar de que el crecimiento masivo de estos organismos es un fenómeno natural, sobre todo en grandes lagos y estanques, la creciente eutroficación de los ambientes acuáticos como producto de la actividad humana ha elevado el riesgo de formación de florecimientos, por lo que su incidencia se ha convertido en un problema sanitario y ecotoxicológico a nivel mundial que afecta a todo tipo de cuerpos de agua, debido a las diversas consecuencias que traen consigo como lo son alteraciones en la calidad del agua (especialmente en el pH y oxígeno disuelto) y sobretodo por los efectos tóxicos agudos y crónicos, en plantas, animales acuáticos e incluso en el hombre, resultado de la liberación de productos tóxicos por parte de estos microorganismos,de hecho se estima que más del 50% de estos florecimientos son tóxicos. Varias especies de cianobacterias, pueden producir potentes endotoxinas conocidas como cianotoxinas, sin embargo, se sabe que dentro de la misma especie, pueden existir cepas productoras y no productoras de estos compuestos, así mismo algunas especies pueden ser genéticamente capaces de producirlas pero no bajo todas las condiciones ambientales. Se han descrita cerca de 40 especies toxigénicas basándose en una taxonomía morfológica. La mayoría pertenecen a los géneros: Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Aphanizomenon y Cylindrospermopsis. Otrasespecies producen compuestos citotóxicos que aunque no son Tóxicos para mamíferos, si lo son para aves peces, algas, bacterias y virus o bien tienen un efecto sobre las células tumorales de mamíferos, lo que ha permitido el empleo como antibióticos o anticarcinogénicos. De las especies de cianobacterias unicelulares Microcystis causa la mayoría de los problemas de toxicidad, probablemente por ser la más cosmopolita de las cianobacterias Las cianotoxinas son metabolitos secundarios que se acumulan en el citoplasma en determinadas situaciones, la producción de estas endotoxinas es máxima cuando las condiciones de crecimiento son óptimas, por este motivo, se observa una producción directamente proporcional al aumento de la biomasa, así mismo, cuando las condiciones ambientales son desfavorables, las cianobacterias mueren produciéndose la lisis celular y la liberación de las cianotoxinas al medio acuático. Metodología 1. Cultivo de cianobacterias. El cultivo de las cepas se realizó en medio BG-11 líquido, utilizando matraces de 1L, a una temperatura de 25 ± 2 oC, con un flujo de aire continuo de 1 vpm e iluminación constante (180 µE/m2 s) con lámparas de luz blanca. Todo el materialñ que se emplea se esteriliza a 121 oC y 15 libras de presión por 15 minutos. En cada matraz se inocula en condiciones de esterilidad 20 mL de un cultivo de la cepa. 2. Cepario Se empleo una muestra de Pseudanabaena tenius colectada del embalse de Valle de Bravo en Agosto del 2005. Situado al Oeste de la Ciudad de Toluca en el Estado de México, aproximadamente a 19˚, 11´, 36.68´´ de latitud Norte y 100˚, 07´, 42.39´´ de longitud Oeste. Este embalse forma parte de la cuenca alta del río Cutzamala y recibe aporte de los ríos Amanalco, Molino, Santa Mónica y Carrizal. También se utilizó una cepa de Spirulina aislada del exLago de Texcoco y una de Nostoc de arrozales, además de una cepa de Microcystis aislada de Zumpango. Las cepas de cianobacterias aisladas se encuentra depositada en el cepario del laboratorio de Fisiología Vegetal del Departamento de Botánica de la ENCB.

3. Obtención del extracto acuoso. A los 15 días de crecimiento se tomaron dos cultivos los cuales fueron sometidos a diferentes procesos; uno de ellos se filtró totalmente para obtener el medio de cultivo libre de células, dicho sobrenadante fue utilizado directamente en pruebas de toxicidad aguda con C. dubia y D. magna. El cultivo restante fue sometido a tres ciclos continuos de congelación a –20° C y descongelación a temperatura ambiente con el fin de lograr una lisis celular total de la cianobacteria; posteriormente el cultivo fue filtrado para la obtención del medio de cultivo más el contenido celular total de P. tenuis, de igual manera dicho filtrado fue utilizado directamente en las pruebas de toxicidad con ambas especies de cladóceros. 4. Extracción de ficobiliproteínas. Se cosechó la biomasa de la cianobacteria por filtración con papel Whatman o por medio de centrifugación a 548 g a 5˚C por 45 min. Posteriormente se pesó 1 gr del paquete celular obtenido y se resuspendió en 20mL de regulador de fosfatos 0.1M pH 7. La lisis celular se realizó por periodos recurrentes de congelación y descongelación. Posteriormente se agregó 1g de sulfato de estreptomicina, para precipitar los restos de membrana. Se dejó el extracto en refrigeración y protegido de la exposición a la luz, durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo se centrifugaron a 548 g a 5˚C durante 1 hora, para eliminar los restos celulares y recuperar el sobrenadante, el cual contiene las ficobiliproteínas. 5. Condiciones de conservación del extracto. Obtenido el extracto de PBPs, éste se sometió a dos métodos de conservación diferentes. Se evaluó la estabilidad de cada uno de los extractos en conservación semanalmente, durante el transcurso de un mes, por medio de espectrofotometría y espectrofluorometría. Tomando como criterio de elección su bajo costo y fácil acceso, los métodos de conservación fueron los siguientes: Refrigeración a 4˚C en refrigerador convencional, congelamiento a -20˚C en Revco 6. Cuantificación de la concentración de ficobiliproteínas por espectrofotometría- Para determinar la concentración de PBPs en el extracto crudo se determinó su absorbancia a 565, 620 y 650 nm por medio de un espectrofotómetro, utilizando como blanco el regulador de fosfatos y posteriormente calculando la cantidad de cada PBP por medio de las siguientes ecuaciones.

38.7)(7.0)/( 650620 AAmLmgPC −

= (1)

APC (mg/mL) = 65.15

)(19.0 620650 AA − (2)

FE (mg/ml) = 7.12

)(34.1)(8.2565 APPCA −− (3)

Además se realizaron barridos espectrofotométricos de 400 a 700 nm semanalmente, a cada uno de los extractos sometidos a los tres métodos de conservación. 7- Evaluación de la estabilidad del extracto de ficobiliproteínas por fluorometría. Previamente se realizó un barrido por espectrofotometría de 400 a 700 nm para obtener los picos de absorbancia de las ficobilibroteínas contenidas en el extracto y así poder evaluar

espectrofluorométricamente la estabilidad de los extractos de PBPs conservados por los métodos señalados. Las lecturas se realizaron semanalmente durante un mes, protegiendo a las muestras de su exposición a la luz. 8- Identificacion de ficobiliprotienas por electroforesis page-sds. El extracto de PBPs fue analizado por electroforesis continua en un gel de poliacrilamida PAGE-SDS67. Se prepararon 2 minigeles de 0.75 mm, con un gel concentrador de 5% y un gel separador de 13% de acrilamida en Tris-HCl/ SDS pH 8.8. La separación se llevó acabo en placa vertical y se corrió a 15 mA de manera continua. Al concluir la separación, las bandas proteicas fueron detectadas por tinción de plata en un gel y el otro gel por tinción con azul de Comassie. Se concentró 1 mL del extracto usando una membrana de diálisis de celulosa de 3.5 mm de diámetro marca Spectrum; empleando como agente dializante azúcar glass, mientras que 1mL del extracto se dejó sin concentrar. Tanto en el extracto concentrado como en el no concentrado se cuantificó la cantidad de PBPs depositadas en cada pozo, por método de Bradford68. Previo a depositar la muestras del extracto en los pozos, estas se calientaron durante 5 min en baño maría e inmediatamente se depositaron en hielo durante 1 min, favoreciendo la desnaturalización de proteínas. El diseño de las muestras a cargar en cada carril fué el siguiente:

• Carril # 1 : Marcador de peso molecular Bench Mark® de Invitrogen (cuenta con 10 proteínas con pesos moleculares que van desde los 10 a los 190 KDa, diseñado para geles Tris-Glicina).

• Carril # 2: Estandar de R-Ficoeritrina Sigma® (Obtenida de Porphyridium cruentum, considerando que el peso molecular (PM) de ficoeritrina reportado es de 24KDa)66.

• Carril # 3: Estandar de Ficocianina Sigma® (Obtenida de Spirulina sp. Considerando que el PM de ficocianina reportado es de 18.3 KDa).

• Carril del 4 al 6: Se depositarón 3, 6 y 9 µl del extracto sin concentrar, respectivamente, más de regulador Magie Mix (desnaturalizante para proteínas) agregando vol:vol a cada muestra.

• Carril del 7 al 9: Se depositarón 3, 6 y 9 µl del extracto concentrado, respectivamente, mas regulador Magie Mix agregando vol: vol para cada muestra.

Al concluir el corrimiento electroforético se procedió a realizar las tinciones de plata y Comassie para cada gel. Preparación del regulador Magie Mix. Se agregaron las siguientes soluciones en este orden: 2.5 mL de solución Tris 2.5M pH 6.8, 4.0 mLSDS al 10%, 2mL de Glicerol, 1.0mL de β- Mercaptoetanol y 0.25mg de Azul de Bromofenol. Tinción con azul de Comassie70: Se calentó por 12 seg. en microondas en colorante al 0.1% de azul de Coomassie. Se enjuagó el gel con agua corriente 2-3 veces hasta quitar el excedente de color. Calentando por 24 seg en microondas con solución para desteñir 1:1:8 (acético:metanol:agua), agitando 5 min, luego se retiró la solución y se cambió por nueva solución para desteñir, agitando, hasta aparecieron las bandas y se destiñó bien el gel. Tinción con Plata69: Se fijó el gel 10 min el etanol al 10% y ácido acético 0.5%, 50 mL y agitación Se incubo en solución de tinción de nitrato de plata al 0.2% por 5 min con agitación, disuelto en la misma solución de fijación. Se revelaron las bandas en hidroxido de sodio al 3%,

con 300 µL de formaldehído, por cada 100 mL de solución, con agitación hasta que aparecieron las bandas, sobre un fondo café. Se dejó en solución ácido acético al 5% hasta el día siguiente. Posteriormente se lavó con agua. 9. Separación de las diferentes ficobiliproteínas por cromatografia de intercambio ionico Se utilizó el método de cromatografía de intercambio iónico, debido a la necesidad de colectar cantidades suficientes de cada PBP separada, para posteriormente realizar con ellas pruebas biológicas. Se realizó de inicio una separación parcial del extracto de PBPs realizando el siguiente procedimiento. Primeramente se agregaron 8.6 gr de sulfato de amonio (saturación al 65%) a 20 mL de extracto de PBPs, dejándolo a 4˚C durante 24 hrs. Posteriormente se centrifugó a 548 g por 30 min, se recuperó el precipitado y se resuspendendió en 15ml de regulador de fosfato de potasio (KPO4) 5 mM pH 7, se procedió a dializarlo. El dializado se aplicó a la columna de cromatografía- Se utilizó una columna (3.1 x 33 cm) de DEAE – Celulosa preequilibrada con regulador KPO4 5 mM pH 7. Inicialmente se aplicaron 250 mL de regulador KPO4 5mM pH 7 para lavar la muestra y después se mantuvo a un gradiente lineal de regulador KPO4 5-200 mM pH 7 (hasta pasar 1000 mL finales de regulador). Se obtuvieron 89 fracciones durante la elusión las cuales fueron colectadas y leídas a 650, 620 y 565 nm por espectrofotometría, se obtuvieron los perfiles de elusión de las 89 fracciones y se seleccionaron 2 (correspondientes a las fracciones 48 y 49), en las cuales se observaron 3 bandas de absorción mejor definidas que las que muestran los estándares comerciales de PE y PC , a demás los máximos de cada banda correspondieron con los de PE, PC y APC El procedimiento será repetido nuevamente hasta obtener fracciones con el mayor grado de pureza posible de cada una de las PBPs. 10. Cultivo de células. Con las fracciones purificadas, se realizarán pruebas biológicas en tres líneas celulares de carcinoma epidermoide: Caski, CaLo, C33A, así como en células epiteliales sin cáncer. Cada línea celular será descongelada, se proliferará haciendo subcultivos y al tener aproximadamente 4 botellas al 100% de confluencia se congelarán para tener una reserva a utilizar durante el proyecto. Se descongelarán las líneas celulares colocando cada criotubo en baño de agua a 37ºC, agitando suavemente hasta que el contenido se descongele.Posteriormente se trabajará en la campana de flujo laminar con material estéril. Se transferirán 2 mL de las células a una botella de cultivo que contendrá 4 mL de medio Dulbecco Modificado Eagle (DMEM) complementado con suero fetal bovino (SFB) al 7% y se agitará suavemente durante 30 segundos y se agregará DMEM hasta alcanzar un volumen final de 16 ml, el cual se incubará a 36.5ºC durante 4 hrs, para luego cambiar por medio fresco y continuar incubando a la misma temperatura hasta obtener 100% confluencia. Al obtener 100% de confluencia se tripsinizaran las células con 2 mL de solución Tripsina-Verseno a 37˚C durante 5-10 minutos posteriormente se neutralizara la tripsina con 3ml de DMEM-SFB 7%. Finalmente, la suspensión célular se centrifugará a 548 g durante 5 minutos, para luego decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de medio fresco. A partir de este paso se realizará una cuenta viable, tomando10 µl de suspensión celular con 90 µl de azul de tripano, colocando dos gotas de la suspensión en la cámara de Neubauer realizando el conteo de células bajo el objetivo 40X del microscopio óptico. Para así determinar

el número de células viable en cada cuadrante y poder deducir un promedio se usará la siguiente fórmula: Células/ml = Promedio x 10 x 104. A partir de dicha cuenta se realizarán diluciones en función del número de pozos a preparar. El resto de las células del subcultivo serán congeladas y conservadas. 10. Cultivo primario. Se disectará piel humana, eliminando el tejido adiposo y zonas necrotizadas, cortando la piel en pequeños trozos y se colocará en un matraz Erlenmeyer, al que se agregarán 20 mL de tripsina al 2.5% y se mantendrá en agitación por 30 min. Transcurrido este tiempo se filtrará la suspensión a través de un embudo con organza y se centrifugará a 548 g durante 15 minutos, se decanta la solución clara y se resuspenderá el botón celular en 5 mL de DMEM. Se realizará cuenta viable y se sembrará en pozos. 11. Preparación de microplacas de 96 pozos. Al determinar la cuenta viable de los cultivos celulares, se utilizarán microplacas de 96 pozos, por duplicado para cada línea celular (Caski, CaLo, C33A y células sin cáncer). Se sembrarán 50,000 células en cada pozo, la placa será diseñada con pozos por cuadriplicado para: el blanco, el testigo de viabilidad, el testigo de irradiación y las fracciones de las PBPs obtenidas (figura 5). Habiendo preparado las placas en una de ellas solamente se expondrá a las células a distintas concentraciones de cada fracción de PBPs, sin irradiar, durante 24 horas, para poder determinar CL50 y dosis seguras. Mientras que en otra placa se seleccionará una de las dosis seguras y se evaluará si desarrolla fototoxicidad al aplicar la PDT.

Figura 5: Preparación de las microplacas. Se prepararán 2 microplacas a cada línea celular. Se muestra de maneta esquemática la preparación de los pozos. Designando la columna 1 para el blanco, 3 para el testigo viable, 5 para el testigo con radiación, 7 para el extracto crudo, 9 para PE, 11 para PC. En la siguiente microplaca: la columna 1 para la mezcla PE+PC, 3 para extracto con radiación, 5 para PE con radiación, 7 para PC con radiación y 9 para PE+PC con irradiación.

12. Aplicación de la pdt. Previa exposición de tres horas a las fracciones de PBPs, cada pozo será irradiado durante 20 minutos con un láser de argón a 127J/cm2. Posterior a la irradiación se incubará cada placa durante 24 horas

. 13. Determinación de viabilidad por las técnicas de rojo neutro y mtt. La viabilidad celular será estimada por el método espectrofotométrico de rojo neutro y por el método 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromidio ó MTT69. Pasadas las 24 horas de incubación con el extracto se eliminará el medio y se sustituirá con medio fresco con una concentración de 50 µg /mL de rojo neutro (previamente filtrado). Las placas se incubarán a 37ºC durante 3 horas. Sólo a los pozos que sirven de blanco no se les adicionará rojo neutro. Pasadas las 3 horas se elimina el medio y se lava rápidamente con una mezcla formol – calcio (formaldehído 40% y CaCl2 10% ,v/v 4:1). Se eliminará esta solución y se agregará a cada pozo 100µl de la mezcla ácido acético-etanol (ácido acético 1% y etanol 50% v/v 1:1) agitando la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta se pasará el contenido de cada pozo a un tubo de eppendorf previamente etiquetado y se leerá a 540 nm, por espectrofotometría. En el caso del MTT se empleará a una concentración de 25µg /ml. Las placas se incubarán a 37ºC durante 4 horas y a los pozos que sirven de blanco no se les adicionará MTT. Pasadas las 4 horas se eliminará el medio y a cada pozo se agregará 100 µl de isopropanol a pH 4, luego se agitará la placa unos segundos y se pasará el sobrenadante de cada pozo a un tubo eppendorf y se leerá a 570 nm por espectrofotómetro. Los cálculos se realizan refiriendo la absorbancia del testigo al 100% de sobrevivencia, para determinar que porcentaje le corresponde al problema. Los resultados de expresan como porcentaje de células viables.

14. Producción de organismos de prueba. Las cepas de Ceriodaphnia dubia y Daphnia magna fueron proporcionados por el cepario del Laboratorio de Hidrobiología Experimental de la ENCB las cuales se mantuvieron en agua dura reconstituida y fueron alimentadas con la microalga Selenastrum capricornutum. Con el fin de lograr la estabilización de lotes reproductores de ambas especies, se procedió a tener cultivos individuales colocando un individuo de C. dubia en tubos de ensaye de 10 mL con un volumen total de 5 mL de medio; Para el caso de D. magna se colocó un individuo en vasos de precipitado de 100 mL con un volumen total de 80 mL de agua dura más alimento. Se estableció una rutina de mantenimiento diario, con recambio de medio de cultivo y alimento cada dos días; el fotoperiodo fue de 16:8 (luz: oscuridad) a una temperatura aproximada de 25 ºC. Los días que no se realizó cambio se procedió a resuspender el alimento depositado en el fondo así como la eliminación de restos de mudas, ya que esto puede favorecer el crecimiento de protozoarios los cuales pueden ser dañinos para estos cladóceros. 15. Pruebas de toxicidad aguda. Las pruebas de toxicidad tuvieron una duración de 48 horas, y se utilizaron neonatos (< 24 horas de edad) de las especies C. dubia y D. magna. Para la primera especie, la prueba se preparó en vasos de precipitado de 50 mL, con un volumen de prueba de 40 mL; el agua de dilución fue dura reconstituida y para cada concentración se tuvieron tres replicas con diez organismos en cada una de ellas. Para el caso de D. magna, la prueba se preparó en vasos de precipitado de 100 mL con un volumen de 80 mL de agua de dilución más la respectiva concentración del medio de cultivo libre de células o del extracto del contenido celular total. En ambos casos se tuvieron tres réplicas de testigos los cuales solo contenían agua de dilución. Para las dos especies se llevó a cabo el registro de la mortalidad a las 24 y 48 horas de exposición.

16. Diseño del contenedor para el cultivo de cianobacterias. Se utiliza, en este prototipo, vidrio con un espesor mayor o igual a 0.25 cm debido a que el diseño en este material es apropiado para los esfuerzos del sistema, es traslúcido y se cuenta con la instrumentación para esterilizarlo (a vapor–presión). La iluminación del prototipo es interna al contenedor para aprovechar al máximo la luz radial de un tubo fluorescente. Dicho tubo puede ser intercambiado en cualquier instante sin alterar el medio de cultivo.

16.1. Mezclado. Se utiliza para mezclar el medio de cultivo el sistema airlift, que consiste en agitar el cultivo a través de líneas de burbujas. Los reactores con el sistema airlift poseen un gran potencial para bioprocesos industriales, en virtud de su bajo costo y la distribución homogénea que brinda su mezclado hidrodinámico.

16.2 Temperatura. Por una parte, aprovechando el sistema airlift, se enfría un poco el sistema; sin embargo no se enfría lo suficiente por lo que se emplea el método de enfriado por convección a través de un serpentín. Así se acota la temperatura adecuada (25 a 27ª C) para el óptimo desempeño del cultivo en el fotobiorreactor.

16.3- Iluminación. Se utiliza una ruta luminosa no mayor a los 10 cm. Pues la luz en trayectos más amplios no es bien aprovechada. Se emplean tubos fluorescentes debido a la distribución espectral que presentan estas lámparas. El control incluye dicho fotoperiodo.

17. Diseño del contenedor. Como puede observarse en la figura 3.2, se trata de dos cilindros (de vidrio) concéntricos. Está calculado para contener 4 litros aproximadamente a sus 43 cm. de altura. El cilindro interno es para soportar el tubo fluorescente; así mismo, el espacio

delimitado entre el cilindro interno y externo es para contener el medio de cultivo. La trayectoria de la luz será de 3 cm. En su tapa posee un escape. En el fondo: se sitúan los distribuidores neumáticos necesarios para el sistema airlift y en su centro hay una entrada para conectar un polo del tubo fluorescente. Si las 3 entradas neumáticas (A, B y C ) se activaran siempre al mismo tiempo, se trataría de un mezclado por columnas de burbujas y gran porción del cultivo tendería a ascender en la mayor parte del proceso. Al tenor de este caso, se ha diseñado un algoritmo de activación de las líneas neumáticas [designado como “algoritmo de mezclado airlift” (AMA)] tal que en ciertos instantes el cultivo experimente un retorno gravitacional en determinadas partes del reactor y en otras ascender impulsado por “árboles” de burbujas.

Figura 3.2. Dibujo del contenedor, acotación: cm.

17. 1 Algoritmo de mezclado airlift (AMA).

Línea neumática ‘X’ activa → 1 Línea neumática ‘X’ inactiva → 0 ‘k’ = constante de retardo.

Figura 3.. Algoritmo de mezclado airlift.

Línea A ← 0 Línea B ← 0 Línea C ← 0

Tiempo ← ‘k’

Línea A ← 1 Línea B ← 0 Línea C ← 0 Retardo(tiempo)

Línea A ← 0 Línea B ← 1 Línea C ← 0 Retardo(tiempo)

Línea A ← 0 Línea B ← 0 Línea C ← 1 Retardo(tiempo)

17.2 Circuito neumático del sistema airlift.

Las electroválvulas son activadas por una señal generada en un microcontrolador. Cada

línea, al activarse, se dispersa por 2 conos distribuidores.

A través de este circuito neumático y otro electrónico encabezado por un microcontrolador se lleva a la práctica el algoritmo de mezclado airlift.

Figura 3.9. Circuito neumático del sistema airlift.

17. 4 Circuito electrónico del control del sistema airlift.

Este sistema de control se vale de relevadores de 5V para activar las electroválvulas y la

fuente de luz (para controlar el fotoperíodo con ciclos de 16 horas de luz por 8 horas de sombra).

Figura 3.10. Circuito electrónico de control del sistema airlift.

17.5 Control de Temperatura.

Descripción. El sistema airlift por sí solo enfría al sistema, en virtud de la diferencia de temperaturas

que existe entre el aire y el medio de cultivo, y lo mantiene entre 28 y 30 ºC; sin embargo no es suficiente para la temperatura que se desea acotar (25 - 27 ºC) por lo que se apela al enfriamiento por convección; es decir, se utiliza un serpentín de poliuretano cuyo diámetro y longitud son de 8 mm. y 6 m. respectivamente. El serpentín abraza en su exterior al contenedor y se le inyecta aire a una temperatura promedio de 17.5 ºC. Experimentalmente, esto fue suficiente para acotar la temperatura entre los 25 y 27 ºC.

Otra opción para controlar la temperatura es suministrar aire frío (aproximadamente a

4.5 ºC) con un sistema de aire forzado, por orden de un microcontrolador, al detectar una temperatura mayor a los 27 ºC, sin embargo un sistema como este es mucho más costoso (se cotiza ariba de $1,500).

Imagen 3.1.Serpentín para el control de temperatura.

17.5 Iluminación. Para activar el tubo fluorescente se utilizó el circuito de la siguiente figura:

En los experimentos del sistema se emplearon 3 tubos distintos:

• Un tubo de luz de día de 15 w que emana una densidad de flujo de fotones de aproximadamente de 200 �E m-2 s-1¥, su espectro posee el comportamiento de la figura 3.14*.

• Un tubo fluorescente de 8 w que despide 36 �E m-2 s-1¥ y su espectro no es especificado por el fabricante.

• Un tubo Fluora de 15 w con una densidad de flujo de fotones de 123 �E m-2 s-1¥, cuyo espectro es el de la figura 2.7.

¥ Medido con un luxómetro marca Tenma, modelo 72-6693, y convertido de acuerdo a la tabla 2.5. * Tomado del catálogo de Silvanya, www.sylvania.com (06-04-2006)

Figura 3.13. Balastro electrónico.

Resultados

1. Evaluación de la conservación del extracto considerando la concentración de pbp por espectrofotometria. Se determinaron las concentraciones tanto del extracto congelado a -20˚C como del refrigerado a 4˚C. Determinando la absorbancia de cada extracto de PBPs a 565, 620 y 650 nm. La concentración en mg/mL de cada PBP (ficoeritrina, ficocianina y aloficocianina) se obtuvieron al sustituir las absorbancias en las ecuaciones usadas por Bermejo y cols. en el 2000. Observando que la concentración de PE en el extracto congelado disminuye de manera drástica un 96% a la tercera semana, mientras que las concentraciones de PC y APC no sufren modificaciones durante todo el mes (figura 1).

Figura 1.Determinación de la concentración de las ficobiliproteinas conservadas en congelación a -20°C.

Mientras que en el extracto refrigerado al transcurrir la primera semana se observa una disminución del 8.2 % de PE y al llegar a la tercera semana disminuye un 64% con respecto a la concentración de inicio, y de la misma manera que en el congelado, las concentraciones de PC y APC se mantienen estables (figura 2).

Figura 2.Determinación de la concentración de las ficobiliproteinas conservadas en refrigeración

a 4°C.

Semana

0 1 2 3 4 5 6

Con

cent

raci

ón (m

g/m

L)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

PEPCAP

Semana

0 1 2 3 4 5 6

Con

cent

raci

ón (m

g/m

L)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

PEPCAP

Esto pudiera indicar que la PE se comporta de manera inestable y que la estabilidad de la molécula pudiera estar relacionada con la integridad de sus unidades proteicas, que al paso del tiempo se degradan. Atribuyendo esa degradación probablemente a la congelación- descongelación semanal. Sin embargo el mismo efecto de observa en el extracto refrigerado pero disminuye de manera gradual.

2. Evaluación de la estabilidad del extracto por espectrofluorometria. Para evaluar la fluorescencia del extracto se realizaron barridos espectrofotometricos de 400 a 700 nm y se tomó como referencia el pico de absobancia de 565 nm que corresponde a PE. Se excitó a dicha longitud de onda y emitió a 580 nm; por lo cual se consideraron estos datos para realizar las lecturas semanales de los extractos de PBPs conservados en congelación y refrigeración. Los resultados obtenidos revelaron que ambos extractos pierden fluorescencia en el lapso de 1 mes. El extracto congelado pierde un 33 % de fluorescencia al concluir el mes, mientras que el extracto refrigerado pierde un 73%. Tabla 1: Evaluación de la estabilidad del extracto por exprectofluorometria. Se realizaron lecturas semanales de dos extractos sometidos a métodos de conservación diferentes (congelado -20˚C y refrigerado -4˚C). Para leer la fluorescencia de cada extracto se excitó a 565 nm y se leyó a 580 nm, las cifras obtenidas están dadas en Unidades Arbitrarias.

Semanas

Método de Conservación

1 2 3 4

Congelado 89 75 73 59

Refrigerado 70 47 29 18.5

Aunque la fluorescencia de ambos extractos no muestra una disminución drástica en una determinada semana. Esta pudiera estar relacionada con la degradación de las subunidades proteicas a lo largo del tiempo. Sin embargo el extracto que mejor conservo su fluorescencia fue el congelado.

3. Identificacion de las ficobiliproteinas por electroforesis PAGE- SDS. El extracto de PBPs fue analizado por electroforesis continua en 2 geles de poliacrilamida PAGE-SDS. Ambos geles fueron diseñados de igual manera, pero al revelarlos se utilizaron tinciones diferentes, la cuales fueron: Tinción con plata y tinción con azul de Comassie. Al revelar ambos geles se obtuvo mejor resolución con la tinción de Comassie (figura 3). En esta fotografía tomada por transiluminación podemos observar en los carriles 1 y 10 el corrimiento del marcador de peso molecular (Bench Mark® de Invitrogen) el cual contiene 10 proteínas de peso molecular que van de los 190 a los 10 KDa (de arriba hacia abajo). En el carril 2 y 3 se corrieron los estándares comerciales de PE y PC respectivamente. Mientras que en los carriles del 4 al 5 se corrió el extracto de PBPs sin concentrar y en los carriles del 7 al 9 se corrió el extracto dializado

. En el carril correspondiente a el estándar de PE se observa una banda mas marcada de aproximadamente 14 KDa y por arriba de ella una banda sin separar de 20 kDa. Sin embargo el estándar de PC describió una banda muy marcada entre los 20 y 15 KDa. Las bandas correspondientes al extracto sin concentrar se muestran mas tenues a comparación del concentrado, sin embargo en los carriles que corresponden a los extractos se aprecian dos bandas muy marcadas de 20 y 25 KDa que coinciden con los pesos moleculares de PE y PC respectivamente, reportados en la bibliografía. Entre los 120 a los 25 KDa se describe un patrón de múltiples bandas de baja intensidad que pudieran corresponder a subunidades proteicas agregadas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 3: Identificación de ficobiliproteínas por electroforesis.

Posteriormente se realizo una curva tipo por método de Bradford para conocer la cantidad de PBPs cargada en cada carril. Obteniendo que en los carriles 4, 5 y 6 la concentración de PBPs cargada fue de 2.5, 5, 7.5 µg respectivamete, mientras que en los carriles 7, 8 y 9 µL la concentración de PBPs fue de: 6.7, 13.5 y 20.2 µg. Lo cual pudiera explicar el suceso observado en los carriles del 7 al 9, donde se observa una mancha barrida al final que debido a la alta concentración de proteína cargada y el exceso de sales en el concentrado ocasionaron este fenómeno.

4. Separación de las diferentes ficobiliproteínas por cromatografia de intercambio ionico. Se inició la estandarización del la separación de PBPs por cromatografía de intercambio iónico en una columna de cristal de 3.1 x 33 cm empleando una resina de DEAE- Celulosa como fase estacionaria. Se mantuvo un gradiente lineal de regulador KPO4 5 a 200 mM pH 7. Se colectaron 89 fracciones de 3 mL durante la elusión, de estas se seleccionaron 2 fracciones

190 120 85 60 50 40 25 20 15

en las cuales se observaron 3 bandas parcialmente separadas, con máximos correspondientes a PE, PC, APC, (figura 4).

Figura 9: Fracción seleccionada de la purificación parcial del extracto de PBPs por cromatografía de intercambio iónico.

Posteriormente se decidió realizar barridos de 200 a 700 nm a los estándares comerciales para comparar los picos de pureza del estándar con las fracciones seleccionadas de la cromatografía realizada. Encontrando francas impurezas en el estándar (figura 5).

Figura 5 : Barrido de el estándar comercial de Ficoeritrina

400.0 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 7000.000

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

0.30

0.323

nm

A

48

651.94

620.97

560.93

200.0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700.00.06

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.56.74

nm

A

569.98

563.00554.95

542.95525.05

520.07

230.77

221.12

5. Determinación de la efectividad de la PDT utilizando estándares comerciales de ficoeritrina y ficocianina. Se determinó la efectividad de la PDT utilizando los estándares comerciales de PE y PC de laboratorios Sigma. El primero extraído de un alga roja Porphyridium cruentum y el segundo de la cianobacteria Spirulina sp. (referido en catálogo). Se decidió sembrar en microplacas de 96 pozos, 50000 células HeLa por pozo, por cuadruplicado y se expusieron a dosis altas de los estándares de PE y PC. Se emplearon las mismas dosis estudiadas por Vargas y Cols.64en un estudio previo en donde se utilizó un extracto el PBPs de Pseudanabaena tenuis sin purificar, como agente fotosensibilizante (Tabla 2 ). Una placa se sometió a irradiación con un láser de Argón a 127 J/ cm2.

Tabla 2. Dosis más altas reportadas por Vargas y Cols en el 2005, con las cuales se obtuvo muerte celular significativa, empleando el extracto de PBPs.

Ficobiliproteínas (mg/mL) % de mortalidad de células HeLa

PE PC APC Sin PDT Con PDT

0.0** 0.0** 0.0** 0.0±0.01 0.0±0.01

2,1e-3 1,46.e-3 9,61e-3 0,0±0.01 45,69±9.6 e-3*

4,3e-3 2,92.e-3 1,92e-3 6,47±0.037 46,51±0.013*

8,7e-3 5,84e-3 3,84e-3 17,4±0.008 48,18±0.012*

0,0174 2,34e-2 1.54e-2 6,47±0.022 46,51±3.8 e-3*

0,0696 4,68e-2 3.08e-2 23,38±0.01 57,1±0.0132* *Diferencia significativa (p<0.05), **Grupos controles.

Posteriormente se realizo prueba de viabilidad con método de Rojo Neutro a ambas placas. Al obtener los resultados no se observó muerte significativa de las células cancerosas (Tabla 3).

Tabla 3. Mortalidad de células HeLa con y sin PDT, empleando los estándares comerciales.

% de mortalidad de células HeLa Estándar de PB

Concentración Sin PDT Con PDT

PE 0.0696 14.54 13.62 PC 4.68 x 10-2 13.37 0

Esto probablemente se deba a que la PE y PC de los estándares provienen de un tipo de organismo diferente a a cianobacteria de nuestro interés y probablemente estas PBPs tengan algunas diferencias en su estructura que no favorezcan la formación de estados tripletes. 6. Pruebas con cladoceros Al realizar las pruebas con el medio de cultivo libre de células de P. tenuis, se observó que este no generó una respuesta tóxica aguda, ya que la mortalidad a las 24 y 48 horas de exposición fue de 0% para los neonatos de ambas especies. En cambio con la prueba de toxicidad aguda realizada con el contenido celular al 100%, con ambas especies se obtuvo el 100% de mortalidad a las 24 horas de exposición; por lo que se procedió a realizar diluciones del contenido celular total para obtener el valor de la Concentración

Letal Media (CL50) por medio del método Probit para los porcentajes de dilución empleados, obteniendo los valores promedio de tres bioensayos consecutivos. Para C. dubia se observó una mayor afectación a partir de las 24 horas de exposición al contenido celular total de P. tenuis (Fig. 1), y se obtuvo una CL50 del 2.92% con un intervalo de confianza al 95% de 9.84-10.70. Por otra parte, D. magna presentó una sensibilidad menor en comparación a los neonatos de C. dubia (Fig. 2), obteniéndose una CL50 de 10.28% con un intervalo de confianza al 95% de 2.64-3.27, a las 48 horas de exposición también con el método Probit. En las curvas de mortalidad (24 y 48 horas) para neonatos de C. dubia expuestos a diferentes concentraciones del contenido celular de P. tenuis se comprobó la existencia de diferencias significativas entre la respuesta de ambas especies utilizando como prueba estadística la U de Mann-Whitney, empleando los valores de las CL50 obtenidas. Dados los resultados, es importante mencionar que las cianobacterias producen una gran variedad de compuestos tóxicos conocidos como cianotoxinas, las cuales son metabolitos secundarios que se acumulan en el citoplasma en determinadas situaciones (Nandini, 2000). En cuanto a la interacción de los organismos del zooplancton con las cianobacterias en los sistemas acuáticos, se ha observado que estos generalmente no se alimenta de cianobacterias tóxicas, lo que les permite coexistir en el mismo ambiente, sin embargo, cuando no hay otra fuente de alimento estos organismos pueden utilizar a las cianobacterias como recurso alimenticio. No obstante, cuando esto ocurre, estos organismos intentan modular la cantidad que ingieren, asegurándose de evitar dosis letales (Ghadouani et al., 2003). Sin embargo, la producción de estas endotoxinas por parte de las cianobacterias es máxima cuando las condiciones de crecimiento son óptimas; por este motivo, se observa una producción directamente proporcional al aumento de la biomasa, así mismo, Roset et al., (2001) mencionan que cuando las condiciones ambientales son desfavorables, las cianobacterias mueren produciéndose la lisis celular y la liberación de estos productos tóxicos al medio, lo que fue confirmado en este trabajo al no observar mortalidad de los organismos al ser expuestos al medio de cultivo libre de biomasa, en cambio al provocar la ruptura celular por medio de congelación y descongelación se observó que la cianobacteria P. tenuis contiene compuestos que generan una respuesta tóxica aguda en los organismos de prueba empleados. Así mismo, con los resultados obtenidos se pudo observar que pese a que D. magna es una especie de referencia utilizada en protocolos de toxicidad aguda y crónica (Martínez-Jerónimo et al., 1994), los neonatos de C. dubia resultaron ser más sensibles a la exposición del material contenido en las células de la cianobacteria; este es un hecho relevante ya que esta especie ha sido reportada para el Embalse Valle de Bravo, lugar en donde se distribuye también Pseudanabaena tenuis, lo que puede indicar que si durante la presencia de un florecimiento algal las condiciones ambientales se tornan desfavorables y causan la ruptura de las células provocando la liberación de su contenido, los organismos del zooplancton pueden llegar a verse afectados y presentar tanto efectos tóxicos agudos como crónicos.

7. Tabla de resultados del cultivo en fotobiorreactor de Spirulina.

Prueba Cepa Tipo de

mezclado Flujo de

aire [L min-1]

DFF [µE m-2 s-1]

Lám_para

Vol. [L]

Bi [g]

Bf [g]

Días Productividad [g L-1 d-1]

1 N. Continuo 1.5 200 LD 2 21.65 7 1.30 2 S. m. AMA 0.8 200 LD 1.8 8.44 4 0.95 3 S. m. Continuo 0.8 200 LD 2 0.228 6.32 5 0.61 4 S. m. AMA 0.8 200 LD 2 0.228 6.93 5 0.67 5 S. m. Continuo 0.8 200 LD 2 0.228 4.93 5 0.47 6 S .m. AMA 0.8 200 LD 2 0.228 6.03 5 0.58 7 S .m. Continuo 5.57 200 LD 3 3.000 15.60 5 0.84 8 S.m. AMA 0.8 36 n.e. 2 0.228 1.51 5 0.12 9 S.m. AMA 0.8 123 F 2 0.228 4.95 5 0.47 10 S.m. AMA 0.8 200 LD 2 0.228 6.69 5 0.64 11 P.t. AMA 0.8

Impacto La presente investigación ha resultado con aportaciones interesantes para el conocimiento de estos organismos.

1. Se establecieron protocolos para la extracción, cuantificación y evaluación de metabolitos que son solubles en agua.

2. Se establecieron protocolos para la evaluación biológica de los extractos obtenidos. 3. Con los protocolos con cladoceros (invertebrados acuáticos) será posible de una

manera rápida y sencilla si estos organismos pueden ser potencialmente tóxicos en el ambiente en donde se desarrollan y establecer ensayos que nos permitan alertar sobre la presencia de cianobacterias y la producción de toxinas que pueden ser dañinas en estos ambientes.

4. Se establecieron cultivos en Vitro de células cancerosas con el fin de determinar si los extractos tienen actividad anticancerígena como se ha reportado en la literatura, encontrándose resultados alentadores para el tratamiento de algunos tipos de cáncer.

5. Se determinó la estabilidad de los extractos con el fin de un uso como anticancerígeno.

6. Se diseño un fotobiorreactor con el sistema de aireación controlado electrónicamente, que resultó innovador en el campo de fotobiorreactores y que se encuentra en proceso de patentamiento y que ha resultado de suma utilidad para el cultivo y producción de biomasa de estos organismos.

Tabla 4.1. Resultados. DFF: Densidad de flujo de fotones. LD: Luz de día. F: Fluora. Bi: Biomasa inicial. Bf:Biomasa final. N.: Nostoc sp. S.m.: Spirulina maxima. P.t.: Pseudanabaena tenuis. AMA: Algoritmo demezclado airlift.