UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERIA

ESCUELA DE INGENIERIA QUIMICA

LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Josué Sánchez CI. 20077499

Yelibeth Ochoa CI. 20520989

RESUMEN

La cromatografía líquida de alta eficacia se utiliza para la separación y análisis cuantitativo

de una amplia variedad de mezclas, especialmente aquellas en las cuales sus componentes

no son volátiles o son térmicamente inestables. Esta técnica se empleó con el propósito de

separar y determinar cuantitativamente el fenol, tolueno y cafeína presentes en una muestra

problema, se empleó una columna C18, una fase móvil compuesta por metanol:agua y un

detector de absorción UV/Visible. La identificación de los compuestos presentes en la

muestra problema se realizó mediante una comparación con los cromatogramas obtenidos

para una solución estándar con los mismos componentes. Se optimizó el sistema

cromatográfico a fin obtener la mejor separación. Bajo estas condiciones se obtuvo el

cromatograma de la muestra problema, por el método de normalización de áreas, se calculó

la composición de la misma obteniéndose que la muestra problema presentó la siguiente

composición en los compuestos estudiados: 0.1193 g/l de fenol, 0.0248 g/l de cafeína y

1.0042 g/l de tolueno.

INTRDUCCION

En las cromatografías clásicas, en las que la fase móvil es un líquido que fluye a través de

un sólido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolución sería necesario emplear

columnas excesivamente largas, lo que se traduciría en un desarrollo muy lento de los

cromatógramas. Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografía de alta

resolución, en la que se trabaja con pequeñas columnas, muy empaquetadas y forzando el

paso de la fase móvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones

muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo. [2]

En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados a través de una

fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida.

Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los

componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su

interacción con las fases.[4]

Un término importante en la cromatografía liquida es la elución de los componentes de una

muestra, la cual comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a

través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. [1]

La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid

Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que

utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros muy

pequeños entorno a 3-10 µm, para aumentar la eficiencia, maximizando el tiempo y el área

de contacto entre el analito y las fases minimizando así la altura del plato, el diámetro. De

esta manera se ha conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10

mm de diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separación de minutos a 1h. [4]

Esta técnica es utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en

diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna

cromatógrafica. Además, la alta presión permite usar relleno de tamaño de partícula

reducido para lograr la separación de componentes a flujos razonables. [5]

El proceso cromatográfico puede ser considerado como un conjunto de fuerzas que

compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte,

fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los líquidos que

fluyen a través de la columna o fase móvil. Los distintos tipos de fuerzas entre fase

estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía. [3]

Tabla 1. Tipos de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). [3]

Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separación puede ser reparto,

adsorción, tamaño molecular (geles) e incluso cambio iónico, aunque los métodos más

utilizados están basados en reparto y adsorción. [2]

En la cromatografía HPLC, se deben cumplir cuatro reglas básica: Fase móvil y

estacionaria han de ser de polaridad opuesta, todos los solutos han de ser solubles en la fase

móvil (es decir, polaridad similar), todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella

(propagación) y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración

diferencial).[1]

El esquema fundamental de un cromatógrafo de alta resolución está constituido por un

deposito y un dispositivo de bombeo de la fase móvil que opera a elevada presión (hasta

500 atm.), un sistema de inyección de la muestra, columnas resistentes, generalmente e

acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un detector y un sistema de registro gráfico.

La columna y los detectores van introducidos en termostatos. Los detectores más utilizados

en esta técnica están basados en absorciometría UV y en medida de índices de refracción,

siendo los cromatógramas obtenidos semejantes a los de cromatografía gaseosa con

detector diferencial. En la figura se muestra el instrumental de la cromatografía HPLC. . [2]

Figura 1. Instrumental de la cromatografía HPLC (High Performance Liquid

Chromatografy). [4]

El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una

gráfica en función del tiempo, un cromatógramas, que consta de una serie de picos

simétricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto

cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los

componentes de la muestra. [3]

La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de

un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la

concentración. La cromatografía cualitativa se basa en la comparación de la posición de los

picos (tiempos determinados de retención) con cromatogramas estándares. [3]

La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos depende de las

velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia máxima para la

cromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la

eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de la partícula del empaque de la

columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la temperatura.[3]

Los experimentos de optimización tienen como objetivo reducir el ensanchamiento de

banda o bien modificar las velocidades relativas de migración de los componentes. Las

variables cinéticas incrementan la altura de plato de una columna producen un

ensanchamiento de banda. Por otra parte, las velocidades de migración son modificadas por

aquellas variables que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solución. [5]

Se dice que la operación es optima si tiene tiempo de análisis corto, alta resolución, alto

número de etapas y caída de presión mínima, para lograr estas condiciones se aplican

ciertos cambios como el de la polaridad de la fase móvil, de flujos, de pH, salinidad,

temperatura y viscosidad y por ultimo cuando nada de esto funciona se recurre al remplazo

de la columna. [1]

Se debe tener cuidados al aplicar cambios, por ejemplo no se puede disminuir y aumentar el

caudal de forma brusca porque se generan cambios de presión importantes. Al disminuir el

caudal se desplazan los picos en el tiempo. Una forma de mejorar la resolución es aumentar

el número de platos teóricos de la columna, este recurso es costoso en términos de tiempo, a

no ser que se aumente mediante una reducción de la atura de plato, lo cual se puede

conseguir variando el caudal, disminuyendo el tamaño de partícula y reduciendo la

viscosidad del disolvente. [1]

La cromatografía HPLC, es especialmente adecuada para compuestos poco volátiles ,

termolábiles e iónicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como

aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos,

plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de

sustancias inorgánicas. [3]

Entre algunos de los ejemplos de la gran aplicación de HPLC en la industria de alimentos

se tiene la detección y cuantificación de cafeína y teobromina que son alcaloides muy

importantes en el café, té y el cacao, especialmente por su acción estimulante, en la

determinación de azúcares y determinación cuantitativa de polisacáridos como el almidón,

las dextrinas, los dextranos, el glucógeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las

pectinas, así como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales. A

demás es usada en la separación de triglicéridos, para el estudio de aceites y grasas

adulteradas, y en la determinación de contenido de Vitaminas A y sus precursores (β

caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa, y del contenido en Vitamina D

en leche en polvo y cereales por fase normal. [3]

En la industria petrolera, es un método importante, para analizar las composiciones de casi

todos los productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas y separación de

impurezas presentes en estas, los compuestos orgánicos destinados a síntesis, entre otras

tantas aplicaciones, por lo que se puede decir que es una técnica muy versátil. [4]

Con la práctica de laboratorio se pretende conocer la aplicabilidad de la cromatografía

HPLC en la determinación de una serie de compuestos aromáticos especialmente la cafeína

presente en una muestra problema, estudiar las diferencias moleculares y en propiedades

fisicoquímicas que se aprovechan para la separación, así como también aprender a

seleccionar las condiciones de flujo y composición de la fase móvil a usar de manera de

optimizar la separación de los analitos en la columna cromatográfica.

METODOLOJIA EXPERIMENTAL

El equipo fue manipulado por técnico del laboratorio, el cual ya por adelantado había

preparado el equipo y las soluciones a emplear con el fin de agilizar la práctica y dado la

complejidad que tiene el uso del cromatógrafo, el técnico es el único encargado de su

manipulación.

RESULTADOS Y DISCUSION

1. Determinación del tiempo muerto por inyección de K2Cr2 O7.

El K2Cr2O7 es una especie que no es retenida por la columna, por lo tanto a partir de la

inyección de una pequeña muestra de esta especie es posible determinar el tiempo muerto, a

partir del cromatograma 1, se tiene que:

Donde Tm es el tiempo muerto.

Figura.1 Cromatograma de inyección de K2Cr2O7

2. Determinación de tiempo de retención ajustado, factor de retención, factor de

retención relativa, número de platos teóricos y resolución.

Estos parámetros se determinan para el cromatograma 2, el cual se muestra en la Figura.2

Figura.2 Cromatograma 2 Inyección de Mezcla Isocrática.

De este cromatograma se extrae la siguiente información:

Tabla 1. Datos Extraídos del Cromatograma para cada componente.

Compuesto Tiempo de retención

(min)

Ancho (cm)

K2Cr2O7 1,414 -

Cafeína 1,983 0,4

Fenol 2,301 0,30

Tolueno 5,676 0,5

Tiempo de retención ajustado.

Por lo tanto para la Cafeína

De igual manera se obtienen para los demás componentes.

Tabla 2. Tiempos de retención ajustado.

Compuesto Tiempo de

retención (min)

Tiempo de retención

ajustado (min)

A Cafeína 1,983 0,569

B Fenol 2,301 0,887

C Tolueno 5,676 4,262

Factor de Retención.

Para la Cafeína:

De igual manera se obtienen para los demás componentes.

Tabla 3. Factor de retención para cada unos de los componentes.

Compuesto Factor de retención

K’

Cafeína 0,402

Fenol 0,627

Tolueno 3,014

Factor de Retención relativa.

Donde B es el soluto que eluye de último entre dos solutos.

Para Cafeína y Fenol:

De igual manera se obtienen para los demás componentes:

Tabla 4. Factor de retención relativa para cada pareja de solutos adyacentes.

Componentes Factor de retención

relativa

Cafeína-Fenol 1,559

Fenol- Tolueno 4,805

Número de Platos teóricos.

(

)

Para la Cafeína:

(

)

De igual manera se obtienen para los demás componentes.

Tabla 5. Número de platos teóricos para cada componente.

Compuesto Número de

Platos

Cafeína 393,2

Fenol 941,3

Tolueno 2061,9

Resolución.

Para Cafeína y Fenol:

De igual manera se obtienen para los demás componentes:

Tabla 6. Resolución para cada pareja de solutos adyacentes.

Componentes Resolución

Cafeína-Fenol 0,91

Fenol- Tolueno 8,44

Resumen de Resultados para el cromatograma 2.

Tabla 7. Resultados para el cromatograma 2.

Compuesto Tiempo de retención

ajustado (min)

Factor de

retención

Número

de Platos

Cafeína 0,569 0,402 393,2

Fenol 0,887 0,627 941,3

Tolueno 4,262 3,014 2061,9

Componentes Factor de retención

relativa Resolución

Cafeína-Fenol 1,559 0,91

Fenol- Tolueno 4,805 8,44

El mismo procedimiento fue aplicado para el cromatograma 3,4 y 5, obteniéndose los

siguientes resultados.

Cromatograma 3.

Figura.3 Cromatograma 3 Inyección de Mezcla Gradiente. FM MeOH:H2O

(70:30)(80:20)

Resumen de Resultados para el cromatograma 3.

Tabla 8. Resultados para el cromatograma 3.

Compuesto Tiempo de retención

ajustado (min)

Factor de

retención

Número

de Platos

Cafeína 0,573 0,405 515,7

Fenol 0,873 0,617 929,8

Tolueno 3,924 2,775 2849,4

Componentes Factor de retención relativa Resolución

Cafeína-Fenol 1,524 0,92

Fenol- Tolueno 4,495 8,72

Cromatograma 4.

Figura.4 Cromatograma 4 Inyección de Mezcla Gradiente. FM MeOH:H2O (70:30)

Resumen de Resultados para el cromatograma 4.

Tabla 9. Resultados para el cromatograma 4.

Compuesto Tiempo de retención

ajustado (min)

Factor de

retención

Número

de Platos

Cafeína 0,575 0,407 516,7

Fenol 0,879 0,622 2103,1

Tolueno 2,746 1,942 4430,2

Componentes Factor de retención relativa Resolución

Cafeína-Fenol 1,529 1,11

Fenol- Tolueno 3,124 8,30

Cromatograma 5.

Figura. 5 Cromatograma 5.Inyección de muestra problema.

Resumen de Resultados para el cromatograma 5.

Tabla 10. Resultados para el cromatograma 5.

Compuesto Tiempo de retención

ajustado (min)

Factor de

retención

Número

de Platos

Cafeína 0,571 0,404 700,5

Fenol 0,876 0,620 1342,5

Tolueno 2,68 1,895 6704,3

Componentes Factor de retención relativa Resolución

Cafeína-Fenol 1,534 1,11

Fenol- Tolueno 3,059 8,02

3. Determinación de la concentración de la muestra problema.

Siguiendo el procedimiento que se describe a continuación para determinar la

concentración de los estándares.

Para la preparación de estándares debe pesar aproximadamente 0,6500 g de Tolueno, 0,156

g de Fenol y 0,0625 g de Cafeína, y disolver con Etanol en un balón aforado de 50 mL y

diluir a volumen. Tendrá solo tres estándares para la elaboración de la curva de calibración.

Para el primer estándar, tomar un volumen de 2 mL de la solución anterior en un balón

aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase móvil. Para el segundo estándar debe tomar

un volumen de 1 mL de la solución inicial, trasvasar a un balón aforado de 25 mL y diluir a

volumen con fase móvil. Tendrá solo tres estándares para la elaboración de la curva de

calibración.

Para el tercer estándar debe tomar un volumen de 0,5 mL de la solución inicial, trasvasar a

un balón aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase móvil.

Siguiendo las reglas de dilución y toma de alícuotas se determina la concentración de

patrón.

Para el Tolueno:

Del balón de 50ml se toman 2ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.

Para el Fenol:

Del balón de 50ml se toman 1ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.

Para la Cafeína:

Del balón de 50ml se toman 0,5 ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.

A partir del cromatografo 4, con los valores de área correspondiente al pico para cada

componente se calcula el factor de respuesta.

Tabla 11. Datos del Cromatograma 4

Componentes Pico Área

Cafeína 1 3320,33374

Fenol 2 359,51184

Tolueno 3 1466,08813

A partir del cromatografo 5, con los valores de área correspondiente al pico para cada

componente se calcula la cantidad inyectada de cada componente.

Tabla 12. Datos del Cromatograma 5

Componentes Pico Área

Cafeína 1 3295,03125

Fenol 2 343,83981

Tolueno 3 1415,76111

El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aplicada a una muestra de

Fenol, Cafeína y Tolueno, se realizó en una columna C18 (químicamente enlazada) y una

fase móvil compuesta por una mezcla de metanol-agua; por lo que se está en presencia de

una cromatografía en fase reversa. Así que, el primer compuesto en eluir es el que presenta

mayor afinidad a la fase móvil esto es, el más polar, cafeína luego el fenol y por último el

tolueno.

Figura 1 . Estructura del fenol, tolueno y cafeína respectivamente.

En los cromatogramas obtenidos se empleó como sistema de detección, luz UV/Visible,

porque los tres compuestos estudiados absorben a longitudes de onda cercanas a 254nm.

La identificación de los compuestos presentes en la muestra problema se realizó mediante

una comparación con los cromatogramas obtenidos para una solución estándar con los

mismos componentes, encontrándose que los factores de retención de cada componente

estudiado son: para el fenol 2880.7 l/g, la cafeína 132813.35 l/g y el tolueno 1409.70 l/g.

El sistema cromatográfico se optimizó a partir de un sistema de elución por gradiente, en

el cual la composición de la fase móvil cambia en el tiempo. Así que para optimizar el

sistema En primer lugar, se aumentó el flujo de fase móvil desde 0,8 a 1,5ml/min (Figura 5

Anexa), resultando que el componente más afín a la fase estacionaria (tolueno) eluye en un

menor tiempo, mejorando el sistema cromatográfico al disminuir el tiempo de análisis. En

segundo lugar, se modificó la composición de la fase móvil, de una relación metanol:agua

de 70:30 a 80:20, por lo que aumenta el poder eluyente de la fase móvil, disminuyendo

una vez más el tiempo al cual eluye la muestra menos polar (Figura 3). Bajo estas

condiciones se obtuvo un nuevo cromatograma a partir del cual, por el método de

normalización de áreas, se calculó la composición de la muestra problema. Es importante

destacar la eficiencia del método y su importancia a nivel industrial ya que este tipo de

cromatografía es muy utilizada para análisis en control de calidad en diferentes áreas como

alimentos, fármacos, contaminantes y otros.

CONCLUSION

Es posible separar compuestos aromáticos, tales como tolueno, fenol y cafeína, de

una muestra por medio de cromatografía liquida de alta precisión (HPLC).

La separación de los analitos por cromatografía HPLC puede optimizarse mediante

el uso de una elución en gradiente, variando el flujo y la composición de la fase

móvil.

Para el sistema estudiado se alcanzó una mejor separación en un menor tiempo, con

un mayor número de etapas y con menor altura de la etapa utilizando una mezcla

metanol: agua 80:20 y un flujo de 1,5ml/min.

La diferencia en la polaridad de las moléculas de fenol, tolueno y cafeína debido a

grupos sustituyentes en su estructura aromática, permite que puedan ser separados

mediante una cromatografía liquida HPLC.

En la separación de aromáticos como fenol, tolueno y cafeína por cromatografía

liquida es posible utilizar un detector de absorción de UV/visible, ya que dichas

moléculas absorben a longitudes de onda cercana a 259nm gracias a los grupos

insaturados que contienen dichas moléculas.

La cromatografía liquida de alta precisión (HPLC) tiene múltiples aplicaciones en la

industria química, farmacéutica, en medicina para control de calidad de los

productos, para caracterización de efluentes, para la determinación de gran cantidad

de compuestos presentes en la sangre, entre muchas más.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Skoog y Holler. (2001) Principios de Análisis Instrumental. McGraw-Hill

Interamenricana de España, S.A.U. Madrid, España. Capitulo 26.

[2] http://elac.uca.edu.ni/pd/karlschen/files/745/2416/Cromatografia.pdf

[3]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_teo_y_apli

caciones.pdf

[4]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_principios

_y_aplicaciones.pdf

[5] http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/trabajos09-10/trabajo4.pdf