INFORME PASANTIAS 2
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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL
“FRANCISCO DE MIRANDA”
ÁREA DE TECNOLOGÍA
NÚCLEO EL SABINO
PASANTÍAS INDUSTRIALES II
DISEÑO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIÓN DE
DIFERENTES MÉTODOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA APLICADOS EN
LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA DE LA UNEFM – SABINO
UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL
“FRANCISCO DE MIRANDA”
ÁREA DE TECNOLOGÍA
NÚCLEO EL SABINO
PASANTÍAS INDUSTRIALES II
Miquilena nava, Sugey Ramírez Quesada, Jorge Gutiérrez Barbuena, Julio
Autor Tutor Académico Tutor Industrial
C.I.: 21.158.385 C.I.: 13.554.159 C.I.: 13.106.111
[email protected] [email protected] [email protected]
PUNTO FIJO, JULIO 2015
DISEÑO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIÓN DE
DIFERENTES MÉTODOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA APLICADOS EN
LOS LABORATORIOS DE QUÍMICA DE LA UNEFM – SABINO
LUGAR: LABORATORIO DE QUIMICA C 4
FECHA DE INICIO: 26/05/2015 – 20/07/2015
DURACIÓN: 8 SEMANAS
INDICE GENERAL
p.p
Índice General i
Índice de Figuras ii
Índice de Tablas
Índice de Graficas
iii
Introducción
Planteamiento del Problema
Objetivo General
Objetivos Específicos
Justificación del Problema
Fases de la Investigación
Resultados y Análisis de resultados
Conclusiones
Recomendaciones
Referencias Bibliográficas
Apéndice
Anexos
ÍNDICE DE FIGURAS
Figur
a
p.p
1 Solución de Nitritos en frasco ámbar
2 Spectronic 20 D en reposo.
INDICE DE TABLAS
Tabla
s
p.p
1 Valores obtenidos de patrones para método Nitrito
1.1
2
2.1
3
4
5
5.1
6
6.1
Absorbancias Calculadas para nitritos
Valores obtenidos de patrones para método Cromo
Absorbancias calculadas para cromo
Valores obtenidos de patrones para método Sulfato
Muestra problema analizada
Valores obtenidos de patrones para método Hierro
Absorbancias calculadas para hierro
Valores obtenidos de patrones para método Fosfato
Absorbancias calculadas para fosfato
INDICE DE GRAFICAS
Tabla
s
p.p
1 Curva de Calibración para Nitritos
2
3
4
5
Curva de Calibración para Cromo
Curva de Calibración para Sulfato
Curva de Calibración para Hierro
Curva de Calibración para Fosfato
INTRODUCCIÓN
Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para
reconocer las sustancias químicas; al reemplazar el ojo humano por otros
detectores de radiación se puede estudiar la absorción de sustancias, no
solamente en la zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e
infrarrojo.
Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de
energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud
de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de
onda.
Para realizar estudios de espectrofotometría se da el uso de las
curvas de calibración generadas por los patrones leídos en el equipo
específico, este tipo de análisis genera mayor precisión en los ensayos a
distintas sustancias. Actualmente en el componente práctico no se dispone
de las curvas correspondientes para los distintos análisis relacionados a la
medición de las concentraciones de un soluto en sustancias problema.
Es por ello que el principal motivo por el cual se requiere solventar
esta problemática, recae en la simplificación del trabajo dentro del
laboratorio, el diseño de un manual que contenga las respectivas curvas de
calibración generadas por el equipo, facilitara a los estudiantes de ingeniería
química, la realización de estudios correspondientes a trabajos de grados o
pasantías. Los resultados se obtienen a través del espectrofotómetro marca
Spectronic 20 D.
Este trabajo surgió con la finalidad de fortalecer el complemento
práctico del laboratorio por medio de la propuesta de la realización de un
manual que será de gran utilidad y ayudara a la ejecución exacta de los
ensayos que requieren de este material para su estudio.
Para dar a conocer los aspectos desarrollados durante la ejecución de
la Pasantía Industrial II, que lleva por título“Diseño de un manual de curvas
de calibración de diferentes métodos por espectrofotometría aplicados en los
laboratorios de química de la Unefm – sabino” se empleó la siguiente
estructura para la elaboración del informe:
Planteamiento del problema, el cual describe de forma amplia la
situación de estudio de la investigación, la situación actual que caracteriza al
objeto de estudio y la presentación de alternativas para dar solución a dicha
problemática.
Objetivo general, para ofrecer resultados amplios relacionados con el
título de la investigación, y objetivos específicos que se refieren a situaciones
particulares que se llevaron a cabo para el cumplimiento del objetivo general.
Justificación del problema, con la finalidad de dar a conocer las razones por
las cuales se realiza la investigación y los aportes teóricos o prácticos que
ofrece; Fases de la Investigación, en las cuales se desglosan las normas,
procedimientos y/o actividades que fueron ejecutadas en cada uno de los
objetivos específicos de la investigación
Resultados y Análisis de Resultados, aquí se presentan todos los resultados
obtenidos durante los procedimientos ejecutados en cada una de las
actividades de la investigación, estableciéndose una comparación con
valores teóricos o estudios previos realizados.
Conclusiones, las cuales presentan en forma clara y sintética, todo el
conjunto de resultados obtenidos a lo largo de la investigación,
demostrándose que se han cumplido, o no, los objetivos propuestos;
Recomendaciones, es decir, las posibles mejoras que durante el estudio se
observaron pero no se llevaron a cabo y referencias bibliográficas, la cual
contiene el listado de cada obra consultada durante la investigación y citada
a lo largo del trabajo.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los Laboratorios de Química representan los componentes prácticos
de las distintas unidades curriculares, impartidas en el programa de
Ingeniería Química, cuyo objetivo es que el estudiante compruebe
experimentalmente los distintos métodos previamente estudiados en la parte
teórica, a través de la aplicación de técnicas básicas de laboratorio.
Los estudios que se ejecutan dentro del laboratorio, usualmente
corresponden a las prácticas que se encuentran a disposición del estudiante,
así como los métodos o guías que le permitirán resolver un problema en
estudio que dependerá de alcance del mismo.
En la actualidad el componente practico no posee un manual o guía
para los estudios que se aplican a determinadas soluciones problemas
(aguas residuales o sólidos en cuestión) con respecto a su evaluación en el
área de espectrofotometría, es decir, no se encuentran copilados los datos
correspondientes a las curvas de calibración de compuestos disueltos en
dichas soluciones.
Esto genera una fuerte problemática, ya que en el análisis de aguas
este tipo de estudio resulta ser fundamental al momento de caracterizar una
muestra, lo cual forma parte de análisis de mayor importancia, como lo es, un
trabajo de grado o pasantía.
Es por ello, que la finalidad de ésta pasantía industrial es el Diseño de
un manual de espectrometría correspondiente a distintos métodos de análisis
de muestras problema por medio del uso de curvas de calibración y
contribuir así con el laboratorio de química de la UNEFM y facilitar la
ejecución de los ensayos correspondientes.
OBJETIVO GENERAL
Diseñar un manual de curvas de calibración de diferentes métodos por
espectrofotometría aplicados en los laboratorios de química de la
UNEFM – Sabino
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes
métodos de espectrofotometría
Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.
Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes métodos
de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando la ley de
Lambert – Beer.
JUSTIFICACION DEL PROBLEMA
El propósito fundamental de este trabajo es que el estudiante tenga a
disposición un manual que le ayude a la ejecución de estudios en muestras
problema, y facilite su labor, además de aportar al componente practico dicho
complemento el cual permanecerá en el área para los futuros estudios que
se realicen.
A su vez, disminuirá el uso de las sustancias necesarias para el
análisis de las muestras, ya que, al copilar los resultados obtenidos en dicho
manual, evitara que gran cantidad de reactivos se desperdicien debido a las
repeticiones de los ensayos.
FASES DE LA INVESTIGACIÓN
1 –Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los
diferentes métodos de espectrofotometría
En esta fase se llevó a cabo la evaluación de los reactivos a utilizar en
los diferentes métodos, los cuales son:
Análisis colorimétrico de:
- Sulfatos
- Nitritos
- Cromo
- Fosfato
- Hierro
La cantidad de reactivos a utilizar fueron aportados por el almacén del
laboratorio C4-A, fundamentalmente se dispone de la realización de tres
sustancias en específico en cada uno de los métodos.
Corresponden básicamente a la solución madre del reactivo, a la
solución patrón y a solución intermedia.
La solución madre del reactivo se deriva de la combinación de la
sustancia correspondiente al método en conjunto a su disolución en agua
destilada, de esta muestra se tomara una alícuota de cierta cantidad del
reactivo, el cual se diluirá hasta un aforo comprendido en el rango de 25 a
100ml, seguidamente la solución patrón, conocida como aquella que dará el
color a la muestra, se combinara con la solución intermedia y se obtendrán
los patrones correspondientes para el respectivo análisis.
En base a esto se determino que la cantidad de reactivos necesarios
para los estudios se encuentra disponible.
2 -Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.
Se verifico la calibración mediante el uso de un blanco o sustancia
pura, principalmente agua destilada, en donde deben observarse los valores
de absorbancia, concentración y tramitancia, para una muestra blanco la
tramitancia debe estar en un rango de 100% respecto a la longitud de onda
a la cual el equipo quiere ser utilizado.
3 - Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes
métodos de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando
la ley de Lambert – Beer.
El procedimiento de elaboración del manual, consiste en la generación
de las curvas de calibración correspondientes para cada método, de acuerdo
a los utilizados, se obtuvieron 5 graficas, generadas por medio de 5 a 6
patrones previamente preparados, estos, fueron leídos en el Spectronic 20 D
a la longitud onda correspondiente, obteniéndose los datos de absorbancia,
concentración y tramitancia.
Se utilizaron los valores de los ppm para los patrones, y se graficaron
con respecto a la absorbancia obtenida. La curva debe representarse en
forma de recta, lo cual se comprueba con la ley de Lambert - Beer en donde
mediante una formula se permitió conocer si la precisión del
espectrofotómetro era exacta.
RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes
métodos de espectrofotometría.
Se realizaron las soluciones madres, intermedias y patrón para cada método.
Para el método Sulfato se prepararon las siguientes soluciones:
-Solución patrón de sulfatos
-Solución acondicionadora o intermedia de sulfatos
-Cloruro de bario.
Para método Nitritos:
- Reactivo de Zambelli
- Solución Madre de Nitritos
- Solución intermedia de Nitritos
- SoluciónPatrón de Nitritos
- Amoniaco Concentrado.
Para método Hierro:
- Solución estándar de hierro
- Agua oxigenada
- Solución intermedia de tiocionato
Para método Cromo:
- Solución de Difenilhidrazina
- Solución Intermedia y Madre de Cromo
- Solución de Ácido Sulfúrico
Para método Fosfato:
- Reactivo Vanado – molibdico
- Solución patrón de ortofosfatos
- Solución intermedia de ortofosfatos
Los reactivos utilizados fueron evaluados para cada uno de los
métodos, de acuerdo a su preparación, todos ellos, se almacenaron en
frascos ámbar, para de esta manera poder conservarlos y así estos se
encuentren disponibles para su uso en los próximos estudios.
Figura 1. Solución de Nitritos en frasco ámbar
Verificar la calibración y funcionamiento del Spectronic 20 D.
Al encender el espectrofotómetro se colocó la longitud onda
correspondiente y se llevó el valor de tramitancia a 0.0 en este instante el
haz de luz para una muestra se encuentra cerrado.
Se calibro utilizando un blanco o sustancia pura sin sólidos,
generalmente agua destilada, esta muestra debe leerse a la longitud de
onda en la cual se desea realizar el estudio, es por ello que en estas
condiciones el valor de la tramitancia debe estar en el rango de 100%, los
valores de absorbancia y la concentración se comprende en rangos de 0,01
a 0,09.
Para su funcionamiento el espectrofotómetro debió dejarse en reposo,
encendido y calibrado en un tiempo de 30 min a 1 hora, ya que su
sensibilidad al movimiento normalmente puede afectar los análisis
posteriores. Una vez pasado este tiempo, el equipo se encontraba listo para
la lectura de patrones.
Las celdas o tubos de ensayos, debieron limpiarse con el fin de
remover tanto suciedad como huellas digitales, ya que estas afectan la
lectura de los patrones correspondientes.
Figura 2. Spectronic 20 D en reposo.
Elaborar el manual de curvas de calibración de los diferentes métodos de espectrofotometría con sus respectivas graficas aplicando la ley de Lambert – Beer.
Para la elaboración del manual de curvas de calibración, se obtuvieron
los datos de cada uno de los patrones leídos por el espectrofotómetro, los
siguientes fueron resumidos en tablas para mayor apreciación.
Para Método Nitritos:
Para 0 - 0,200 ppmLongitud de Onda: 425 mn
Ppm Absorbancia Concentración Tramitancia
0 0,01 0 100
0,025 0,030 0,06 93,6
0,050 0,043 0,09 90,4
0,100 0,064 0,14 86,2
0,150 0,157 0,33 69,8
0,200 0,200 0,42 63,0
Tabla 1. Valores obtenidos de patrones para método Nitrito
Ahora se procedió a realizar la curva de calibración con los valores de
ppm vs absorbancia, como se ven subrayados en la tabla 1.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
f(x) = 0.968421052631579 x − 0.000736842105263161R² = 0.951606578137873
Nitritos
Ppm
Abso
rban
cia
Grafica 1. Curva de Calibración para Nitritos
Se realizó una regresión lineal a la curva para ver el rango de
desviación de la misma, para la comprobación de su tendencia, se utilizó la
ecuación de Lambert – beer, la cual plantea la comparación entre el valor de
absorbancia arrojado por el equipo y el calculado mediante una formula
empírica, esto con el fin de saber cuánta fue la precisión del equipo en el
momento del estudio.
Tomando como ejemplo las absorbancias de la curva nitritos reflejadas en la
tabla 1, se aplicó la siguiente formula:
Abs: 2 – Log (T)
En donde:
Abs: absorbancia
T: Tramitancia experimental arrojada por el espectrofotómetro
Sustituyendo tenemos:
Abs: 2 – Log (93,6) = 0,029
El resultado describe que la precisión del equipo era exacta, debido a
la similitud entre los valores ya tabulados. Esto se realizó para todas las
demás absorbancias de cada uno de los métodos.
Abs. Experimental Abs. Calculada
Nitritos
0,01 0
0,030 0,029
0,043 0,044
0,064 0,064
0,157 0,156
0,200 0,201
Tabla 1.1 Absorbancias Calculadas para nitritos
Para Método Cromo:
Para 0 - 0,200ppmLongitud de Onda: 540mn
Ppm Absorbancia Concentración Tramitancia
0 0,089 0,19 81,4
0,030 0,159 0,33 69,6
0,050 0,173 0,36 67
0,100 0,245 0,51 56,8
0,150 0,260 0,54 55
0,200 0,292 0,61 50,8
Tabla 2. Valores obtenidos de patrones para método Cromo
Graficando:
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
f(x) = 0.953467048710602 x + 0.118777077363897R² = 0.919128181212021
Cromo
Ppm
Abso
rban
cia
Grafica 2. Curva de Calibración para Cromo
La desviación de esta curva es significativa debido a distintos factores
que pudieron afectar la lectura de algunos patrones, aun así, la regresión
lineal de la misma, demuestra un alejamiento mínimo entre los puntos a la
recta.
Abs Experimental Abs. CalculadaCromo
0,089 0,0890,159 0,1570,173 0,1740,245 0,2460,260 0,2600,292 0,294
Tabla 2.1 Absorbancias calculadas para cromo
Para Método Sulfato:
Para 0 - 80 ppmLongitud de Onda: 420mn
Ppm Absorbancia
0 0,03
5 0,079
10 0,084
20 0,233
30 0,325
40 0,392
50 0,542
60 0,638
70 0,704
80 0,726
Tabla 3. Valores obtenidos de patrones para método Sulfato
Graficando:
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394
Ppm
Abso
rban
cia
Sulfato
Grafica 3. Curva de Calibración para Sulfatos
La tabla 3. No posee valores de concentración y tramitancia debido a
que estos patrones fueron realizados por un equipo de trabajo en el
laboratorio, es por ello, que se tomo una muestra problema y se analizo con
las soluciones patrones y madres. Se obtuvo los siguientes datos:
Ppm AbsorbanciaConcentración
Tramitancia
Muestra 1 28,5 0,314 0,66 48,4Tabla 4. Muestra problema analizada
Utilizando la Grafica 3. Se grafico el valor de absorbancia para obtener
los ppm de sulfato en la muestra problema, como se observa:
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394
Ppm
Abso
rban
cia
Sulfato
Grafica 3.1 Curva de Calibración para Sulfatos con punto en
absorbancia.
Para la muestra 1 el resultado fue de 28,5 ppm en concentración de sulfatos.
Para Método Hierro:
Para 0 - 0,0020ppmLongitud de Onda: 480mn
Ppm Absorbancia Concentración Tramitancia
0 0,018 0,04 95,8
0,0005 0,152 0,32 82
0,0010 0,245 0,4 65
0,0015 0,362 0,76 43,4
0,0020 0,390 0,82 40,6Tabla 5. Valores obtenidos de patrones para método Hierro
Graficando:
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.00250
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
f(x) = 190.8 x + 0.0425999999999999R² = 0.96595598349381
Hierro
Ppm
Abso
rban
cia
Grafica 4. Curva de Calibración para Hierro
Aplicando ley de Lambert – Beer a las Absorbancias:
Abs Experimental
Abs. Calculada
Hierro0,018 0,0190,152 0,0860,245 0,1870,362 0,3630,390 0,391
Tabla 5.1 Absorbancias calculadas para hierro
Para Método Fosfato:
Para 0 - 20ppmLongitud de Onda: 420mn
Ppm Absorbancia Concentración Tramitancia
0 0,027 0,06 93,8
3 0,132 0,28 73,6
5 0,179 0,37 66,2
10 0,307 0,64 49,2
15 0,406 0,85 39,2
20 0,564 1,18 27,4Tabla 6. Valores obtenidos de patrones para método Fosfato
Graficando:
0 5 10 15 20 250
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
f(x) = 0.0256681948424069 x + 0.0424309455587393R² = 0.99453222481023
Fosfato
Ppm
Abso
rban
cia
Grafica 5. Curva de Calibración para Fosfatos
Aplicando ley de Lambert – Beer a las Absorbancias:
Tabla 6.1 Absorbancias calculadas para fosfato
Abs Experimental
Abs. Calculada
Fosfato0,027 0,0280,132 0,1330,179 0,1790,307 0,3080,406 0,4070,564 0,562
De esta forma, todas las graficas fueron construidas con sus respectivos
datos, se comprobó la precisión del equipo mediante el análisis de las
absorbancias por la Ley de Lambert – Beer, determinando que los estudios
realizados fueron exactos para cada uno de los métodos.
CONCLUSIONES
Se evaluó la condición de los reactivos para los respectivos estudios
Se llevo a cado la verificación de la calibración del Spectronic 20 D a
su vez se comprobó su correcto funcionamiento.
Se obtuvieron los datos correspondientes para cada uno de los
métodos de espectrofotometría
Se graficaron las curvas de calibración de cada método de
espectrofotometría
Se comprobó la precisión del equipo y de los datos obtenidos
mediante la ley de Lambert – Beer
Se diseño el manual con sus curvas de calibración para los métodos
analizados.
RECOMENDACIONES
Mantenimiento adecuado al espectrofotómetro, para futuros análisis
Revisión del tiempo de duración de las soluciones madres e
intermedias para evitar la pérdida de las mismas
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Severriche, C., Castillo, M. y Acevedo, R. (2013). Manual de Métodos
Analíticos para la Determinación de Parámetros Fisicoquímicos
Básicos en Aguas. [Versión Electrónica]. Colombia. Recuperado el 22
de mayo de 2015 de
http://www.eumed.net/librosgratis/2013/1326/index.htm
Tierra, P. (2008). Trabajos prácticos de química analítica cuántica. .
[Versión Electrónica]. México. Recuperado el 4 de junio de 2015 de:
http://www.etpcba.com.ar/Documentos/Nivel_Medio/Especialidades/Q
uimica/Anexo/guia_de_analitica_instrumental.pdf
Harris, C. (2003). Técnicas avanzadas en química. México. [Versión
Electrónica]. Recuperado el 4 de junio de 2015 de:
http://ecovi.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/fosfatos.pdf
Brunatti, C. (2008). Introducción a la Espectroscopia de Absorción
Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. México. [Versión
Electrónica]. Recuperado el 16 de julio de 2015 de:
http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotometria.pdf
Apéndice:
Diseño de un manual de curvas de calibración de diferentes métodos por espectrofotometría aplicados en los laboratorios de química
UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL
“FRANCISCO DE MIRANDA”
AREA DE TECNOLOGIA
NUCLEO EL SABINO
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
MANUAL DE CURVAS DE
CALIBRACIÓN POR
ESPECTROFOMETRÍA
AUTOR:
MIQUILENA, SUGEY
JULIO 2015
INDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN
FUNDAMENTO TEÓRICO
CURVAS DE CALIBRACION DE:
NITRITOS
CROMO
HIERRO
SULFATO
FOSFATO
P.P
INTRODUCCION
El siguiente manual tiene como finalidad ayudar al estudiante de
ingeniería química a realizar los análisis a muestras problemas, que
necesiten de pruebas de espectrofotometría y así obtener los resultados
deseados.
La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más
utilizadas para la detección específica de moléculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido,
gas). El fundamento físico-químico de la espectrofotometría está relacionado
con la capacidad de las moléculas de absorber energía luminosa y
almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos
vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y
bacterias.
A continuación se muestra de manera ordenada el procedimiento a
seguir para el análisis de muestras y la correcta interpretación de los datos
obtenidos.
FUNDAMENTO TEÓRICO
La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se
basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de
una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz
incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de
la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede
estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta
del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para
formar una solución.
Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la
sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a
una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia
absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro
compuesto. (Fig. 1)
El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de Lambert y Ley de Beer.
1.- Ley de Lambert. :
Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio
homogéneo, la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es
proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de
la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el
espesor del medio absorbente (Fig. 2)
La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley: P / P0 = e –kb
Po: Intensidad de la luz incidente
P: Intensidad de la luz transmitida
b : Espesor del medio absorbente
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de
onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza
del medio.
2.- Ley de Beer:
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al
aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando
este haz pasa a través de un medio homogéneo (Fig. 3).
La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:
P / P0 = e -k’c
Donde:
Po: Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentración de la solución
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de
onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente,
de la naturaleza del medio.
Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer
log P0 / P = a b c ó A = a b c
A = log P0 / P = - log T
Donde:
a : Absortividad
b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentración de la solución P/Po= T : Transmitancia
Los términos absorbancia y Transmitancia son definidos a continuación
Transmitancia (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por
una muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía
radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud
de onda.
T = P / P0 = 10-abc ó %T = 100 P / P0
Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida
por la muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar
puede ser el liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco
analítico (solución que contiene todos los componentes de la solución problema
menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente.
Debido a que la transmitancia de este estándar no es necesariamente 100%,
es necesario especificar el estándar con el cual la muestra es comparada.
Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida
por una sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al
logaritmo negativo de la transmitancia. T, transmitancia expresada como
fracción decimal %T, Transmitancia expresada como porcentaje.
A = - log T = 2 – log %T
Pero.
T = P / P0 = 10-abc
Luego
A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc
A = a b c
Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la
concentración, donde a es una constante de proporcionalidad llamada
absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la
concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b
en centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ξ ) .
Luego
A = ξ b c
Mediciones de transmitancia y absorbancia.
Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparación
entre la muestra problema y un estándar arbitrario o referencia. Como la
referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es
llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.
Selección de longitud de onda de trabajo.
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de
onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y
recibe la denominación de Lambda máximo (λmax). Para seleccionar el λmax.,
se hace un espectro de absorción o curva espectral, y que consiste en una
gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de
concentración adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se
determina el λmax. (Fig.4).
Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda
donde se espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias
coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro
electromagnético (380 a 800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las
mediciones se realizan en la región ultravioleta del espectro electromagnético
(200 a 380nm).
Curva de Calibración.
Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una
muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de
calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco
soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de
cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max) (Fig. 5).
Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta
dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos
cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito.
Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de
máxima absorbancia (λmax.), para obtener una recta con la máxima pendiente
y así tener mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones. La medición
de la absorbancia de la solución problema debe hacerse a la misma longitud de
onda que fue hecha la curva de calibración.
Las siguientes curvas de calibración están diseñadas por los datos obtenidos
por el Spectronic 20 D, equipo espectrógrafo que se encuentra en los
Laboratorios de Química de UNEFM – SABINO.
Una vez analizado el fundamento teórico de espectrofotometría, procedemos a
la muestra de las curvas realizadas y la breve explicación de cómo aplicar los
métodos a las muestras problemas.
RECOMENDACIÓN ESPECIAL: PARA EL USO DEL SPECTRONIC 20 D, SE
RECOMIENDA EL ENCENDIDO DEL EQUIPO ANTES DE LA
PREPARACION DE MUESTRAS POR UN TIEMPO DE 30 MIN. DE ESTA
FORMA SE ASEGURA LA PRECISION DEL MISMO
PARA OBTENER EL VALOR DE PPM EN LA MUESTRA PROBLEMA, DEBE
BUSCARSE EN LA GRÁFICA EL VALOR DE LA ABSORBANCIA
OBTENIDO, SEGUIDAMENTE CHOCAR CON LA CURVA Y LEER HACIA
ABAJO LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA.
CURVAS DE
CALIBRACIÓN
CURVA DE
CALIBRACIÓN PARA
NITRITOS
SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacén de reactivos):
- Reactivo de Zambelli.
- Solución Madre de Nitritos
- Solución Intermedia de Nitritos
- Solución Patrón de Nitritos
Equipos:
- Spectronic 20 D
- Cubetas de paso óptico de 1 cm
Nota: Longitud de onda de este método: 425nm
PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
- Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada por membrana de 0.45
mm o sometida a centrifugación, en caso de ser necesario por presentar
alta turbiedad), a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 2 mL
de reactivo de Zambelli. Agitar para mezclar bien y esperar 2 minutos.
- Añadir 2 mL de amoníaco, agitar y esperar 5 minutos.
- Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua destilada.
- Leer en espectrofotómetro a 425 nm con cubetas de paso óptico de 1cm
respecto a la curva de calibración de nitritos.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
f(x) = 0.968421052631579 x − 0.000736842105263161R² = 0.951606578137873
Nitritos
Ppm
Abso
rban
cia
CURVA DE
CALIBRACIÓN PARA
CROMO
SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacén de reactivos):
- Solución de Difenilhidrazina: esta solución debe prepararse al momento
de uso: Habitualmente 10 mL son suficientes, lo que implica pesar 50
mg de 1,5-difenilcarbazida (difenilcarbohidrazida) y disolverlos en 10 mL
de acetona.
- Solución de Acido Sulfúrico 1:1
- Solución madre de cromos
- Solución intermedia de cromos
Equipos:
- Spectronic 20 D
- Cubetas de paso óptico de 1 cm
-
Nota: Longitud de onda de este método: 540 nm
PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
- Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada si la muestra lo amerita), aun vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 0.5 mL de ácido sulfúrico 1:1.
- Agitar para mezclar bien.
- Añadir 1 mL de solución de difenilcarbazida, agitar y dejar reposar 5 a 10 minutos para desarrollar color.
- Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua.
- Leer en espectrofotómetro a 540 nm con cubetas de 5 cm de paso óptico.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
f(x) = 0.953467048710601 x + 0.118777077363897R² = 0.919128181212021
Cromo
Ppm
Abso
rban
cia
CURVA DE
CALIBRACIÓN PARA
HIERRO
SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacén de reactivos):
- Solución estándar de hierro
- Agua oxigenada 30%
- Solución de Tiocianato de Amonio
Equipos:
- Spectronic 20 D
- Cubetas de paso óptico de 1 cm
Nota: Longitud de onda de este método: 480 nm
PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
- Transferir 1ml de solución problema a un matraz de100ml, agregar
suficiente nítrico (1: 1) asegurando un contenido total de 5ml. Diluir hasta
60ml con agua destilada.
- Agregar 1ml de agua oxigenada y mezclar.
- Agregar 20ml de tiocianato de amonio, diluir a la marca y mezclar.
- Transferir una porción adecuada al tubo de lectura y medir la
absorbancia a 480nm. Con el valor obtenido buscar en la curva de
calibración los miligramos de hierro presentes en la solución incógnita.
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.00250
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
f(x) = 190.8 x + 0.0425999999999999R² = 0.96595598349381
Hierro
Ppm
Abso
rban
cia
CURVA DE
CALIBRACIÓN PARA
SULFATO
SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacén de reactivos):
- Solución patrón de sulfato
- Solución acondicionadora de sulfato
- Cloruro de Bario concentrado
Equipos:
- Spectronic 20 D
- Cubetas de paso óptico de 1 cm
Nota: Longitud de onda de este método: 420 nm
PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
- Transferir 50 mL de muestra (en caso de turbiedad evidente,
centrifugarla o filtrarla) a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionar
2.5 mL de solución acondicionadora y agitar; adicionar una cucharilla de
cristales de cloruro de bario y agitar nuevamente en forma vigorosa.
- Leer antes de 5 minutos en espectrofotómetro a 420 nm con celdas de 1
cm de paso óptico respecto a la curva de calibración de sulfato. Si la
absorbancia de la muestra resultase mayor que la del mayor patrón, es
necesario repetir el proceso mediante la lectura de diluciones de la
muestra. Para esto, debe realizarse como mínimo dos diluciones, se
calculará el coeficiente de variación y si éste no supera 10 %, se
informará el valor promedio; en estos casos, es necesario multiplicar
previamente por el factor de dilución.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8f(x) = 0.0094446321717705 x + 0.0305709257303766R² = 0.985650554990394
Ppm
Abso
rban
cia
Sulfato
CURVA DE
CALIBRACIÓN PARA
FOSFATO
SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacén de reactivos):
- Reactivo de vanado-molibdico
- Solución patrón de ortofosfato
Equipos:
- Spectronic 20 D
- Cubetas de paso óptico de 1 cm
Nota: Longitud de onda de este método: 420 nm
PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
- Pipetear 5 ml de la disolución problema y pasarlos a un matraz aforado
de 25 ml.
- Añadir 10 ml de la disolución vanado-molibdato y enrasar con agua
destilada.
- Repetir este procedimiento otras 2 veces más para tener 3 muestras
problema.
- Dejar reposar 10 minutos
0 5 10 15 20 250
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
f(x) = 0.0256681948424069 x + 0.0424309455587393R² = 0.99453222481023
Fosfato
Ppm
Abso
rban
cia
ANEXOS
Patrones preparados
Lecturas en espectrofotómetro.