INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

(Enero 2008-Diciembre 2008)

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

PROYECTO

Efecto del estrés físico en la expresión de moléculas de adhesión en el NALT de ratones

PROGRAMA Estudio morfológico y funcional del tejido linfoide asociado a la

nariz

CLAVE PROYECTO 20080671

NOMBRE DEL DIRECTOR(A) DEL PROYECTO

Dra. María Elena Hernández Campos

RESUMEN

El sistema inmunitario de las mucosas comprende tejidos asociados con las

superficies de las mucosas respiratoria, digestiva y genitourinaria, los cuales

protegen al organismo de antígenos externos. El tejido linfoide asociado a la

nariz (NALT) representa un compartimiento inductor de la respuesta inmunitaria

y se localiza en piso de la nariz de algunos roedores; mientras que la lámina

propia de la mucosa nasal representa al compartimiento efector. El estrés,

provoca un incremento de la secreción de hormonas glucocorticoides y

catecolaminas por activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. Estas

hormonas interactúan con receptores de las células inmunitarias ocasionando

cambios en su respuesta. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos

del estrés físico en ratones adenalectomizados la expresión de integrinas: α4β1,

α4β7, y L-selectina en linfocitos del NALT mediante citometría de flujo y de las

moléculas de adhesión, MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 en este tejido

mediante inmunohistoquímica. Se utilizaron ratones Balb/c machos de 9

semanas de edad, divididos en un grupo control y un grupo problema, a los que

se aplicó 3 horas de ejercicio intenso durante 4 días.

En el análisis morfológico, no se observaron cambios en la arquitectura del

NALT, sin embargo durante el estrés de 4 días el volumen del órgano disminuyó

ligeramente, mientras que a los 8 días éste se incrementó. La expresión de

MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 fueron semejantes en los tres grupos de

estudio. La citometría de flujo mostró que en los linfocitos T se incremento la

expresión de las integrinas L-selectina, α4β7 y α4β1 del NALT posiblemente por la

influencia de las hormonas secretadas durante el estrés.

INTRODUCCION

Funcionalmente el aparato respiratorio se divide en tres segmentos: las

porciones conductora, respiratoria y de ventilación. La primera a su vez se divide

anatómicamente en vías aéreas superiores constituidas por: fosas nasales,

cavidad oral y faringe, mientras que las vías aéreas inferiores están

comprendidas por: laringe, tráquea, bronquios y bronquiolos preterminales y

terminales.

Las fosas nasales de acuerdo al tipo de epitelio de la mucosa que las

tapiza, se divide en tres zonas; 1) El vestíbulo, se encuentra situado en el

extremo anterior de las fosas nasales, presentando un epitelio plano estratificado

no queratinizado, con numerosos folículos pilosos, glándulas sebáceas y

sudoríparas 2) El área respiratoria, comprende la porción más extensa de las

fosas nasales; se localiza predominantemente en la parte anterior y piso de la

cavidad, con un epitelio que cambia a cilíndrico ciliado pseudoestratificado con

células caliciformes (epitelio respiratorio), que a su vez, también recubre la

trompa de Eustaquio, amígdalas y nasofaringe. Este tejido descansa sobre una

lámina propia que se continúa con el periostio o el pericondrio del esqueleto de

la nariz y está constituida por tejido conectivo laxo en el que se encuentran

células fijas y libres: fibroblastos, mastocitos, macrófagos, granulocitos, células

plasmáticas y linfocitos, además de glándulas mucoserosas. En la mucosa

respiratoria, también se encuentra una gran cantidad de células inmunitarias, las

cuales se distribuyen en la lámina propia en forma difusa, así como en

estructuras foliculares no encapsuladas, o constituyendo el tejido linfoide

asociado a la nariz (NALT), el cual forma parte de los tejidos linfoides asociados

a las mucosas (MALT). Entre las células del epitelio respiratorio que recubre el

NALT, también se encuentra gran cantidad de células M (membranosas o con

micropliegues), cuya principal función es la captura y la transitosis de los

antígenos desde la porción apical de la célula, hasta la porción basal, en donde

muestran el antígeno a las células presentadoras de antígenos. (Giannasca PJ y

cols 1997) 3) La porción olfatoria situada en la región posterior y techo de las

fosas nasales, presenta un epitelio cilíndrico pseudoestratificado alto.

En esta porción se distinguen 3 tipos celulares: de sostén, receptoras olfatorias y

básales. Las células de sostén son cilíndricas altas, su borde superior está

cubierto por microvellosidades, y tienen prolongaciones que rodean y separan a

las células olfatorias. Estas células de sostén se localizan en la porción luminal

del epitelio, en las caras laterales y están unidas por complejos de unión (zonula

ocluyente, zonula adherente y desmonsomas). Las células receptoras olfatorias,

son neuronas bipolares modificadas y su porción apical son dendritas

modificadas que se ubican en sentido perpendicular a la superficie de la

membrana nasal. La célula se estrecha a nivel de las uniones con las células de

sostén vecinas. Por encima de la zona estrecha, la dendrita se ensancha y tiene

la forma de un bulbo (vesícula olfatoria), la cual presenta varios cilios olfatorios

largos, no móviles. La porción basal de la célula se va adelgazando,

prolongándose en un axon (amielinico), siendo una fibra del nervio olfatorio. Las

células basales, son de aspecto cónico y se encuentran dispersas sobre la

lámina basal, se estima que son células madre pluripotenciales que se pueden

diferenciar en células de sostén o en células receptoras olfatorias. Por debajo

del epitelio en la lámina propia, se encuentran células pigmentarias, células

linfoides, además de una gran vascularización sanguínea y linfática que permite

la circulación y migración de células en el seno de la lámina propia, desde los

tejidos linfoides, así como del epitelio de revestimiento. La región olfatoria

presenta glándulas tubuloalveolares (Glándulas de Bowman), las cuales vierten

una secreción serosa. La mucosa además de continuarse con el periostio,

también presenta una gran cantidad de fibras colinérgicas y fibras adrenérgicas

(Geneser F 2002).

ARQUITECTURA HISTOLÓGICA DEL NALT

El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) forma parte del sistema

inmunitario de las mucosas (MALT). Es un órgano linfoide par que se desarrolla

en algunos roedores después de la primera semana de nacimiento (Mebius R

2003, Ying X et al 2005, Harmsen A et al 2002); tiene la forma de un cilindro de

aproximadamente 3 mm de longitud y descansa a ambos lados del tabique

sobre el piso de la cavidad nasal. (Asanuma et al 1997, Heritage et al 1998,

Sminia T y Kraal G 1999)

Debido a su localización anatómica, se considera un análogo del anillo de

Waldeyer humano (Boyaka NP et al 2000) y funcionalmente se compara con la

placa de Peyer por presentar características inductoras similares. (Kiyono H y

Fukuyama S 2004)

La función atribuida al NALT, es proporcionar un sistema de defensa en

las vías aéreas superiores (Csencsits et al 1999, Boyaka PN et al 2000). El

NALT es un compartimiento inductor y corresponde a la porción de células

linfoides organizadas. En este sitio se inicia la respuesta inmunitaria, además de

ser el sitio de cambio de isotípo de inmunoglobulina IgM+ por IgA+ (Shikina T et

al 2004); una vez terminado este proceso, las células plasmáticas productoras

de IgA, migran hacia la lámina propia sobre la que descansa el tejido

organizado, en este sitio que es la porción efectora, se lleva acabo la producción

de IgA secretora la cual se encuentra presente en el moco nasal.

En cuanto a su estructura, el NALT está compuesto principalmente por

linfocitos T (predominando los CD4+) y linfocitos B en cantidades similares. El

órgano se encuentra regionalizado de acuerdo al patrón de distribución de cada

tipo celular; los linfocitos B se localizan preferentemente en la porción central

del órgano, conformando la zona B o folicular, mientras que los linfocitos CD3+

se distribuyen en la periferia de la zona B, conformando la zona T o parafolicular.

Otras poblaciones presentes son células dendríticas y macrófagos (Asanuma H

et al, 1997). Además en el epitelio respiratorio que recubre el NALT, otra forma

de entrada de antígenos, está dada por endocitosis de las células epiteliales.

(Cleary PP et al 2004). Aunque algunos antígenos solubles como la toxina del

cólera, pueden atravesar las uniones estrechas entre las células epiteliales, lo

que provoca la respuesta inmunitaria tanto en el compartimiento inductor como

en el efector de forma directa. Otro tipo de células encontradas son los linfocitos

intraepiteliales CD3+CD4+ y CD3+CD8+, los cuales se encuentran incluidos en

todo el epitelio, no solo el que recubre al NALT.

El NALT presenta una red reticular que se distribuye en la totalidad del

órgano; no presenta irrigación linfática aferente ya que la entrega de antígenos

ocurre principalmente por los procesos de transitosis en las células M, sin

embargo el tejido presenta irrigación linfática eferente, la cual drena

predominantemente hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores, mientras

que el drenaje linfático de la mucosa nasal ocurre principalmente hacia los

nódulos linfoides cervicales superficiales. Además, debido a la expresión de

moléculas de adhesión en las vénulas de endotelio alto, a este componente se le

atribuye la función de permitir el ingreso, alojamiento y organización de las

células en el tejido (Drayton LD et al 2004).

El NALT juega un papel muy importante en el sistema de defensa del

tracto respiratorio alto en los roedores, ya que se ha demostrado que puede

provocar respuestas inmunitarias, tanto locales como sistémicas, por lo que se

ha considerado un modelo muy efectivo para inducir inmunidad. (Rojas-

Hernández S et al 2004).

EJE HIPOTALAMO-HIPOFISIS-ADRENAL

El hipotálamo es un centro de integración que recibe y monitorea

información acerca del ambiente, y además coordina las respuestas a través del

sistema nervioso central, autónomo y endocrino. Las principal información que

recibe es la visual, olfativa, auditiva y sensitiva.

Dentro de las funciones del hipotálamo está la de controlar la secreción

de hormonas hipofisiarias, controlar las acciones involuntarias por medio del

SNA (sistema nervioso autónomo) y regular la motivación y los instintos por

medio del sistema límbico. El núcleo paraventricular del hipotálamo secreta la

hormona corticotropina (CRH) dentro del sistema portahipofisiario, la cual regula

subsecuentemente la producción de hormona adrenocorticotrofica (ACTH) en la

glándula hipófisis anterior. La hormona ACTH a su vez actúa en la corteza de la

glándula suprarrenal provocando la secreción de cortisol. Durante los periodos

de estrés se produce una sobreestimulacion hipotalámica, lo cual provoca una

hipersecreción hormonal.

El sistema de estrés está constituido por el eje hipotálamo-hipófisis-

adrenal (HPA) y el sistema simpático sistémico, los cuales se encuentran

controlados por señales limbicas, circadianas, neurosensoriales y hormonales.

Las situaciones de estrés, tales como la hipoglicemia, procesos inflamatorios,

fiebre, trauma, ejercicio intenso, cirugía y problemas emocionales pueden activar

este sistema (Paca´k K y Palkovits M 2001).

ESTRÉS

Actualmente el estrés se define como un estado de amenaza para la

homeostasis, durante el cual se activa una respuesta adaptativa compensatoria.

(McEwen BS 1998). Cannon en 1929 fue el primer investigador en introducir el

término de homeostasis, el cual definió como un conjunto de mecanismos

fisiológicos coordinados que mantienen la mayoría de los procesos del

organismo en estados constantes. Cannon señala que el sistema nervioso

simpático es esencial para restaurar la homeostasis alterada por el estrés y para

promover la sobrevivencia del organismo, además mencionó la existencia de

respuestas al estrés, especificas para cada tipo de agente estresor.

Posteriormente, se introdujo el termino “Estrés” y se popularizó como una idea

científica. Dentro de sus principales efectos, describió una tríada patológica que

consiste en: hipertrofia suprarrenal, ulceración gastrointestinal e involución

timolinfática, la cual fue provocada por diferentes estresores. Debido a que las

diferentes respuestas específicas convergen en el estado de estrés, lo refirió

como un componente no especifico compartido. Posteriormente introdujo el

término de “síndrome de adaptación general” con sus tres fases sucesivas:

alarma, resistencia y agotamiento. Además propuso que la mayoría de los

estímulos agotadores, inducen dos tipos de respuestas: 1) respuesta general al

estrés, en la cual todos los agentes estresantes, implican el eje HPA. 2).- la

respuesta individual al estrés, mediada por factores condicionantes como la

predisposición determinada genéticamente.

Recientemente, McEwen BS (McEwen BS 1998) introdujo el término de

alostasis y la definió como la capacidad de adaptarse exitosamente a los

cambios. Durante este proceso activo de adaptación, se producen respuestas

que involucran el SNA y eje HPA, los cuales al ser activados, intervienen directa

o indirectamente en la producción de varios mediadores como el cortisol,

catecolaminas, citocinas, mediadores tisulares y genes de expresión temprana.

De acuerdo a la duración, el estrés se clasifica en:

Estrés agudo: En el sentido de la lucha, se considera simple, intermitente y de

exposición por tiempo limitado.

Durante el estrés agudo se produce una respuesta adaptativa, la cual

provoca que los procesos fisiológicos inhiban o estimulen varios sistemas y/o

sus componentes, para movilizar las reservas energéticas hacia órganos

prioritarios como los sistemas muscular y nervioso.

Estrés crónico: (carga de tensiones acumulativas); es la exposición a agentes

estresantes en forma prolongada y continua.

Los agentes estresantes se incluyen dentro de los principales

acontecimientos de la vida diaria y se pueden dividir en:

Físicos: frío, calor, ruido, vibración, ejercicio intenso, trauma, cirugía, radiación

etc.

Químicos: venenos, fármacos etc.

Psicológicos: procesos emocionales y cambios de comportamiento.

Sociales: desempleo, falla de relaciones interpersonales, nivel socioeconómico

etc.

Biológicos: enfermedades infecciosas.

El estrés por dolor y el estrés metabólico puede ser provocado por de

algunos de los agentes previos, como son el frío, el calor, el trauma, la cirugía,

químicos, venenos, fármacos, etc. (Paca´k K y Palkovits M. 2001)

En relación con la función inmunitaria se sabe que el estrés provoca un

incremento en la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas, las

cuales son reguladas por el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal; estas hormonas

interactúan con receptores de las células inmunitarias, provocando cambios en

su respuesta que incluyen, modificaciones en el tráfico y proliferación celular,

cambios en la secreción de citocinas y anticuerpos y en la actividad citolítica.

(Padgett DA y Glaser R 2003).

EFECTOS DEL ESTRÉS SOBRE EL SISTEMA INMUNITARIO

Frente al estrés, el organismo se protege a través del SNA-eje HPA, el

sistema inmunitario, cardiovascular y metabólico, por medio de respuestas

contra el estrés interno y externo. (Guyton AC 2003). El cortisol es el principal

glucocorticoide involucrado en la inmunomodulacion, el cual ejerce efecto sobre

prácticamente todas las células del sistema inmunitario. La hormona se une a

receptores citoplasmáticos, formando complejos hormona-receptor que entran al

núcleo y regulan la trascripción de diversos genes, lo que ocasiona efectos

inmunosupresores y anti-inflamatorios Además el SNA y el eje HPA provocan

supresión de las respuestas de fase aguda y de la inmunidad mediada por

células. (Padgett DA y Glaser R 2003).

El estrés agudo, provoca por un periodo de 3 a 5 días, efectos

inmunitarios que dependen de la secreción adrenal, lo que origina migración y

redistribución de macrófagos y linfocitos a través del cuerpo, con marginación

de las células en la pared de los vasos sanguíneos y otros compartimientos

como la piel, nódulos linfoides y médula ósea. Con esta respuesta, el organismo

establece un periodo de alarma, durante el cual posiblemente se incrementa la

vigilancia inmunológica y permite una mayor y más rápida migración celular a un

sitio de demanda. Si las señales hormonales disminuyen y no hay desafío, las

células regresan a la circulación. (Padgett y Glaser 2003)

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Identificar los efectos del estrés físico sobre las células del tejido linfoide

asociado a nariz en el ratón.

JUSTIFICACIÓN

La mucosa nasal es una vía de entrada y primer sitio de contacto para

múltiples antígenos. El NALT es una estructura linfoide organizada que se

encuentra situada estratégicamente en la porción del tracto respiratorio alto, que

tiene la capacidad de iniciar respuestas inmunitarias tanto locales como

sistémicas las cuales han sido poco estudiadas.

Por tal motivo la posible alteración en la morfología y función del NALT,

podría explicar el incremento en la susceptibilidad del tracto respiratorio a

enfermedades infecciosas provocadas por el estrés.

HIPÓTESIS

Si el estrés provoca un incremento en la secreción de hormonas

glucocorticoides y catecolaminas y si estas tienen influencia sobre las células

del sistema inmunitario asociado a la mucosa nasal, entonces los ratones

sometidos a estrés, presentarán modificaciones en las poblaciones de linfocitos

y moléculas de adhesión celular del NALT.

OBJETIVO GENERAL

En ratones adrenalectomizados con y sin estrés, determinar la expresión

de integrinas: α4β1, α4β7, y de la L-selectina en linfocitos del tejido linfoide

asociado a la nariz mediante citometría de flujo y de las moléculas de adhesión,

MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 en este tejido mediante

inmunohistoquimica.

MATERIAL Y METODOS

Animales. Se utilizaron ratones Balb/c machos con un peso entre 21-24 g

proporcionados por Harlan México, el manejo de los animales se realizo de

acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la ESM. Posteriormente se

les removieron las adrenales y se cuidaron durante días días. Los ratones se

dividieron en dos grupos de 7 animales cada uno; divididos en un grupo control y

un grupo problema, a los que se aplicó 3 horas de ejercicio intenso durante 4

días.

Tratamiento de estrés. Los animales fueron sometidos a un esquema de estrés

por ejercicio intenso en contenedores cilíndricos apropiados al tamaño del

animal (5 cm. de largo, 3 cm de alto y 3.5 cm de diámetro) con ventilación

adecuada. Antes y después del periodo de estrés, los animales se mantuvieron

en jaulas durante los días de tratamiento, ingiriendo agua y comida a libre

demanda. Los animales control se mantuvieron en las mismas condiciones.

Obtención y procesamiento del material biológico. Posterior al tratamiento,

los animales se anestesiaron profundamente con vapores de éter, se sangraron

por punción cardiaca directa y se sacrificaron por decapitación. Se procedió a

realizar lavado nasal con 2 ml de solución salina estéril, colocando un catéter en

la tráquea, para realizar infusión retrógrada y colectar el liquido de lavado nasal

en tubos Eppendorff, después se almacenó en congelación para cuantificar

posteriormente la sIgA (IgA secretora) mediante ELISA. Por último se realizaron

curvas de concentración y cuantificación de proteínas por el método de Bradford.

Para la obtención del NALT, después del lavado nasal se removió la piel

de la cabeza, se retiró el maxilar inferior y los tejidos blandos, como lo describen.

Las cabezas se inmovilizaron en una placa de cera, colocando el paladar

superior en posición ventral para su disección con la ayuda de microscopio

estereoscópico, para la cual se realizó se dos incisiones verticales con hoja de

bisturí desde el vértice del paladar por la parte interna de los dientes incisivos,

siguiendo las porciones laterales hasta la base del paladar por la parte interna

de los dientes molares. Enseguida el colgajo fue sujetado por el vértice, con

pinzas de punta fina y se realizó tracción hacia la base del paladar, retirándolo

por completo. El paladar extraído se colocó en contenedores de aluminio de 1

cm³, sobre una base de medio de inclusión hidrosoluble (Tissue-tek), con el

NALT en posición ventral, éste fue cubierto con una segunda capa de tissue-tek

y se congeló en isopentano. Las muestras fueron almacenadas a –70° C, hasta

su corte en criostato.

Después de extraído el NALT los cráneos fueron fijados por inmersión en

paraformaldehido al 4% por 24 horas. Después de lavado, se descalcificaron con

EDTA al 8% p.H 7.6, realizando un cambio diario durante 8 días. Al término se

procesaron para su inclusión en parafina.

Inmunohistoquimica. De las muestras del NALT congeladas se obtuvieron

cortes de 7 µm de espesor, se colocaron en series de portaobjetos previamente

tratados con gelatina la 1%. Algunos se fijaron en acetona durante 20 minutos y

otros en formaldehído al 4% durante el mismo tiempo.

Los cortes del NALT fijados en formaldehído y cortes de 7 µm de espesor,

obtenidos de las muestras incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina y

eosina para un análisis morfológico general.

Tinciones. En los cortes fijados en acetona se realizaron las tinciones

inmunohistoquímicas para identificar las siguientes poblaciones celulares: por

inmunohistoquímica indirecta se detectaron la expresión de MAdCAM-1, PNAd,

ICAM-1 y VCAM-1 en el endotelio y las vénulas del endotelio alto, utilizando los

respectivos anticuerpos monoclonales de ratón, conjugados con biotina

(Pharmingen). Posteriormente se aplicó estreptavidina conjugada con

peroxidasa (Jackson Immuno Reserch).

Previa a las tinciones la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó

incubando los cortes en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS,

durante 10 minutos. Los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios fue

de 1-2 horas y para la estreptavidina de 1 hora, ambos a temperatura ambiente y

en cámara húmeda. Después de cada incubación se realizaron lavados suaves

con PBS. La reacción de peroxidasa se revelo según el método de Karnovsky

con DAB (Pierce). Las muestras se contracolorearon con hematoxilina de Harris

(dilución 3:1 agua destilada/hematoxilina), se deshidrataron y cubrieron con

resina sintética. Para cada uno de los anticuerpos se realizaron tinciones control

siguiendo el mismo protocolo, excepto que el primer anticuerpo se sustituyó en

PBS.

Obtención de linfocitos para citometría de flujo. Después de remover el

NALT, la obtención de linfocitos se realizó de la siguiente forma: el paladar del

ratón, conteniendo el NALT se colocó en una caja de Petri con 10 ml de medio

RPMI-1640, se realizó un raspado suave con una espátula para separar el NALT

del paladar, después se disgregó el NALT con el émbolo de plástico de una

jeringa y se recuperó la suspensión celular, la cual se filtró en tela de organza de

10 × 10 cm. con una abertura de 1mm y se colocó en tubos cónicos de 15 ml. La

suspensión celular se centrifugó a 1500 rpm/10 min. a 4° C, se desechó el

sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 1 ml de RPMI-1640. Finalmente se

ajustó a 1x106 células, para realizar las diferentes inmunotinciones para

citometría de flujo.

Inmunotinción de linfocitos para citometría de flujo. La tinción de los

linfocitos se realizó con anticuerpos anti-ratón (Becton Dickinson Technologies,

Gaithersburg, MD) obtenidos de PharMingen (San Diego, CA) con fluorocromos

conjugados biotinilados. Para controles de isotipo, anticuerpos anti-IgG2a

marcados con Phicoerithrin (PE) y Ab anti-IgG2b con (FITC), PE-conjugado a

estreptoavidina; anti-LPAM-1 (complejo integrina α4β7) PE (DATK32); anti-

CD62L FITC (L-selectina, LECAM-1, Ly-22) (MEL-14); anti-CD29 FITC (integrina

β1 cadena) (Ha/2). Los anticuerpos se diluyeron 1:100 con amortiguador de

fosfatos con albúmina sérica bovina p.H 7.4 (PBA) (10 mg/ml) y se colocaron 10

µl de cada anticuerpo, por cada millón de células, incubando en oscuridad a 4°C

por 30 min. Al término de ese tiempo se lavaron con PBA y se desechó el

sobrenadante, al paquete celular se le agrego 400 µl de para-formaldehído al 1%

y se guardo en oscuridad a 4 º C hasta su lectura en el Citómetro de flujo

FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA), cada conteo se realizo en un

mínimo de 10,000 eventos. El análisis de resultados, se llevó a cabo mediante el

software (winMDI 2.8)

Análisis estadístico. Utilizando la prueba de ANOVA de una vía, se

compararon los grupos experimentales de cada protocolo con su respectivo

testigo. Los datos se analizaron mediante el software Sigma Stat y se graficaron

mediante el software Sigma Plot.

RESULTADOS Efecto del estrés en la morfología del tejido linfoide asociado a nariz.

En los cortes teñidos con H-E el NALT se observó como dos masas

ovoides situadas a los lados de la línea media en la cara nasal del paladar. Por

su forma, se pueden describir tres caras, la basal apoyada sobre el paladar, la

medial revestida por epitelio respiratorio, el cual en todos los grupos presentó

características normales y una cara lateral en relación con la pared lateral de la

nariz. En la estructura del NALT, no se identificaron nódulos linfoides típicos. En

relación a la irrigación se identificaron vénulas convencionales y de endotelio

alto (HEV) así como arteriolas. (Figura 1). Los animales de los grupos

estresados 3 horas durante 4 dias, no presentaron cambios en la morfología del

NALT comparados con el grupo control.

ER

CL

CB

LP

Figura 1. Morfología del NALT. ER epitelio respiratorio,

CL cara lateral, CB cara basal, LP lámina propia. H-e. 4x.

NALT

Molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1+).

Las inmunotinciones para esta molécula, mostraron en todos los animales

estudiados reacción positiva en la trama reticular del órgano y en el endotelio de

las vénulas de endotelio alto, las cuales se localizaron en las zonas de linfocitos

T y estuvieron ausentes en las zonas de linfocitos B. También se observó que

algunos linfocitos expresan en su membrana ICAM-1 (Figura 2)

Figura 2. Expresión de ICAM-1 en el NALT. Se observa la reacción positiva en la

trama reticular del NALT. (Flecha gruesa), las vénulas de endotelio alto (asterisco) muestran

reacción positiva, así como algunos linfocitos (flecha delgada). 40x

Para analizar posibles diferencias de intensidad en las vénulas del

endotelio alto y la trama reticular del NALT durante el estrés, se cuantificó con el

software Imagen Pro Plus, valorando la luminosidad de la muestra, así las zonas

con mayor reacción se observan mas obscuras y son las que muestran los

valores mas bajos. Los resultados de este análisis fueron: el grupo control

mostró una intensidad de 200±5.9 en un área de 12538 µm2, los grupos de

animales estresados 3 horas durante 4 días presentaron intensidades de

210±9.8 y 209±8.4 respectivamente. (Figura 3). El análisis estadístico no mostró

diferencias significativas entre los dos grupos de estudio (F2,15=1.676; P 0.220).

Sin embargo se puede decir que hay tendencia hacia una menor expresión de

la molécula en los animales sometidos a estrés.

3 hrs

Inte

nsid

ad %

de reaccio

n

0

50

100

150

200

250

CONTROL 4 DIAS

Figura 3. Reacción a la molécula ICAM-1 en el NALT. La gráfica compara los grupos

problema con el testigo, cuantificando cantidad de reacción positiva a la molécula ICAM-1. En el

análisis estadístico, la reacción fue similar en los tres grupos de estudio (DF2,15=1.676; P 0.220).

Con respecto al grupo control, la expresión de ICAM-1 no disminuye significativamente con el

estrés de 3 hrs y 4 días, en donde las barras fueron mayores ya que mostraron mayor

luminosidad.

En relación a las tras moléculas de adhesión analizadas no se observaron

diferencias en la entre los grupos controles y estresados físicamente 3 horas

durante 4 días. (datos no mostrados).

Expresión de moléculas de adhesión en animales control y estresados. Por

otra parte al analizar la expresión de los receptores de homing encontramos que

el estrés modificó de manera significativa su expresión. En la Fig. 4 observamos

que en los linfocitos T de ratones estresados aumento la expresión de L-

selectina de un 2% a un 35% en animales sometidos a estrés físico por tres

horas y en un 22% en los ratones estresados durante 4 días. En lo que respecta

a la expresión de α4β1 observamos el mismo comportamiento se incremento su

expresión de un 26% del grupo control a un 35% en los ratones sometidos a un

estrés físico por tres horas y un 50% en los animales estresados por cuatro días.

Interesantemente en la expresión de la integrina α4β7 se modifico su expresión

únicamente en los animales sometidos a estrés físico por 4 días de un 1% a un

5% (Figura 4).

Fig. 4. Efecto del estrés fisico en la expresión de L-selectina, αααα4ββββ7, y αααα4ββββ1 en

linfocitos del NALT. A partir de ratones control y estresados se obtuvo el NALT. Los

linfocitos purificados de estos compartimentos se tiñeron con anticuerpos monoclonales

anti-CD3+, L-selectina, α4β7 y α4β1, y su expresión fue analizada en linfocitos T por

citometria de flujo. Los números indican el porcentaje de las células positivas, se

realizaron tres experimentos con resultados similares.

Control Estrés 3 hrs

αα αα4ββ ββ7+

L-selectina

αααα 4 ββββ 1 +

Estrés 4 días

Control Estrés 3 hrs

αα αα4ββ ββ7+

L-selectina

αααα 4 ββββ 1 +

Estrés 4 días

DISCUSION

El estrés causo una disminución no significativa en el volumen del NALT

De acuerdo a los objetivos planteados en el presente trabajo, en primer

lugar se determinó la morfología y volumen del tejido linfoide asociado a nariz.

En la literatura solo se encuentra reportado que el NALT del ratón, presenta una

longitud de 3 mm, por 0.5 de ancho. (Heritage PL y cols 1997, 1998) y no se

menciona su volumen.

En el presente trabajo se encontró un volumen de 3 mm³ para el NALT de

los animales testigo; en relación a esta cifra el estrés fisico aplicado durante 4

días causó una disminución del volumen del órgano. Esta tendencia al cambio

del volumen del NALT puede explicarse por la influencia de las hormonas

relacionadas con el estrés, las cuales probablemente alteran el tráfico de

linfocitos, disminuyendo la retención o su entrada en el tejido. En la literatura se

encontraron reportes que apoyan lo anterior, en uno de ellos la aplicación de

hidrocortisona durante 14 días, provocó disminución en el tamaño de los nódulos

linfoides mesentéricos de la rata entre al día 5 y 7 de tratamiento. (Grigorenko

DE y Budushkina EE 1985).

En un modelo de estrés por inmovilización en ratones C57BL/6, se

observó involución del timo, bazo y nódulos linfoides, cuyo grado de disminución

dependió del tiempo de estimulación. En ese caso el timo mostró mayor

susceptibilidad, disminuyendo su tamaño más rápidamente durante el tercer día

de estrés y además presentó una recuperación mas rápida que el bazo y

nódulos linfoides después de retirado el estímulo, con un incremento 12% mayor

que en el grupo testigo. (Domínguez-GL y Rey MM 1997).

Entre las posibles causas de la disminución del volumen en el NALT, esta

el incremento en la secreción de glucocorticoides durante el periodo de estrés,

pues se ha reportado que el estrés por inmovilización en ratas, durante un

periodo de 5 horas, provoco hipertrofia de la glándula adrenal, además de

cambios destructivos en el timo y el bazo (Durnova GN y cols 1983). La

hipertrofia adrenal reportada, puede corresponder al incremento en la secreción

de glucocorticoides que algunos estudios refieren como una de las principales

causas de involución de los tejidos linfoides, apoyados por lo observado

después de adrenalectomía quirúrgica o química o con el uso de antagonistas

de los receptores de glucocorticoides, tratamientos que mostraron contrarrestar

los efectos provocados por el estrés, como la involución del timo, disminución de

las células CD4+, CD8+, B220+ y fragmentación del ADN tímico durante la

apoptosis dependiente de los glucocorticoides endógenos. (Tarcic N y cols

1998). El mecanismo de la disminución de volumen en el NALT, puede

encontrarse en el incremento de la apoptosis celular dependiente o

independiente del incremento de glucocorticoides, ya que algunos trabajos sobre

otros tejidos linfoides muestran esta relación; además de que el bloqueo de

receptores de glucocorticoides en la placa de peyer, inhibió la apoptosis. (Sudo

N y cols 2001). Aun los glucocorticoides provocaron cambios en la expresión de

moléculas de adhesión (Sapolsky RM y cols 2000), lo cual afecta la

redistribución celular. Por otro lado, es posible que la disminución del volumen,

también se haya debido al incremento de catecolaminas, ya que esta reportado

que las catecolaminas secretadas durante los periodos de estrés agudo,

ocasionan movilización de linfocitos hacia la circulación periférica, provocando

leucocitosis (Benschop RJ y cols 1996). Aunque en el presente estudio no se

realizo cuantificación de células periféricas. En el NALT, estudiado en este

trabajo, la respuesta fue semejante si se considera que a los 8 días (datos no

mostrados), los animales se recuperaron del estrés; el hecho de que los

resultados no tuvieran diferencias significativas, pueden deberse a que los

ratones Balb/c y los C57BL/6, tengan diferente susceptibilidad al estrés. Por otro

lado es posible que durante los periodos de estrés, haya ocurrido un periodo de

adaptación o habitación primaria, la cual se produce con la finalidad de ajustar el

desequilibrio provocado (Pacak K y Palkovits 2001). Sin embargo, ya que estos

cambios no son significativos, se sugiere que el NALT presenta mayor

resistencia que otros órganos linfoides, los cuales si se modifican

significativamente, con esquemas de estrés similares al utilizado en el presente

trabajo (Domínguez-Gerpe L y Rey-Méndez M 1997), por lo que se puede

concluir que la tendencia a los cambios en el volumen del NALT, tienen relación

con la modificación en la circulación de los linfocitos, debido a diferencias en la

expresión de moléculas de adhesión y/o sus ligandos, o bien a un incremento en

la muerte celular por apoptosis; todo esto debido a los efectos de las hormonas

del estrés.

El estrés no modificó la expresión de la molécula ICAM-1 en el NALT

Se sabe que la molécula ICAM-1, se expresa continuamente a nivel del

endotelio vascular alto de los tejidos linfoides secundarios y en células

endoteliales cercanas a los procesos inflamatorios, en donde su principal

finalidad es la de dirigir la diapédesis de los leucocitos (Shaw SK y cols 2004).

La expresión de ICAM-1 (CD54), se analizó para determinar su posible

relación con el tráfico de linfocitos desde otros compartimientos hacia el NALT.

A pesar de no encontrar reportes de la expresión de la molécula sobre este

órgano, esta molécula se identifico en las vénulas de endotelio alto y a nivel de

la trama reticular del NALT; el grado de expresión de ICAM-1 sobre estas

estructuras, fue prácticamente igual en los tres grupos de estudio.

Su expresión en el NALT, puede indicar su participación en la

redistribución de las células linfoides, al igual que MAdCAM-1 y PNAd se sugiere

permiten el tráfico, la organización y el alojamiento de los linfocitos en varios

tejidos linfoides secundarios (Csencsits KL 1999). Los resultados indican que

esta molécula no se afecta por el modelo de estrés utilizado y por tanto las

variaciones en la cantidad de linfocitos, puedan deberse a cambios en la

expresión de integrinas leucocitarias (ligandos de ICAM-1), como ha sido

reportado en humanos, en donde el estrés psicológico provocó disminución en

la expresión de antìgeno 1 asociado a función de linfocitos (LFA-1), el principal

ligando de ICAM-1, mientras que esta ultima no presentó cambios significativos

(Mills PJ y Dimsdale JE 1996).

CONCLUSIONES

1. Se comprueba la hipótesis de influencia del estrés sobre el tejido linfoide

del NALT.

2. El esquema de estrés utilizado, no provocó cambios significativos en el

tamaño y forma del NALT.

3. El esquema de estrés físico no modifico la expresión de moléculas de

adhesión endotelial, sin embargo si modifico la expresión de las integrinas

L-selectina, α4β7 y α4β1 de los linfocitos del NALT.

4. Se sugiere que los efectos del estrés sobre las poblaciones celulares del

NALT, se ejercen a través de la influencia de las hormonas,

catecolaminas y glucocorticoides, por mecanismos como apoptosis o a su

redistribución de las células inmunitarias debido a modificaciones en la

expresión de moléculas de adhesión y/o apoptosis.

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