INFORME TÉCNICO FINAL DEL PROYECTO SIP 2006 (Clave de Registro SIP: 20060189)

“Estudio del sistema inmune del ostión japonés (Crassostrea gigas) cultivado en La Pitahaya, Bahía de Macapule, Sinaloa”

Responsable: Dr. Antonio Luna González. Institución: Centro Interdisciplinario de

Investigación para el Desarrollo Integral Regional-IPN (Unidad Sinaloa)

Dirección: Bulevard Juan de Dios Bátiz Paredes

#250. Colonia San Joachin. C. P. 81100. Guasave, Sinaloa.

Correo electrónico: aluna@ipn.mx, tonol69@yahoo.com Teléfono: 687 87 2 96 26 extensión 87621. Fecha de inicio: Febrero de 2006. Periodo que se reporta: Febrero-Diciembre de 2006. NOTA: DEBIDO A QUE EL PROYECTO CONSTA DE UN CICLO DE 13 MESES, SE TERMINARÁ EN FEBRERO DE 2007. EL ARTÍCULO INTERNACIONAL SE ANEXARÁ EN CUANTO SEA ACEPTADO (2007). PARA ENVIAR EL ARTÍCULO LO ANTES POSIBLE, NO SE PRESENTARÁ ESTE TRABAJO EN EL CONGRESO COMPROMETIDO.

Resumen

Se realizó un cultivo de ostión japonés Crassostrea gigas en el estero La

Pitahaya, municipio de Guasave, con el fin de analizar la influencia de la estación en

el sistema inmune y condición fisiológica de los organismos. Mensualmente, y a lo

largo de 11 meses, se muestrearon animales del cultivo. Además, se determinó la

mortalidad, los factores fisicoquímicos y la cantidad de alimento disponible en el

área de cultivo. Para el análisis del sistema inmune, se sangraron los animales y se

determinó la actividad de las enzimas hidrolíticas lisosomales. La temperatura y

salinidad se determinaron mensualmente. Los parámetros fisiológicos que se

analizarán fueron longitud, peso seco de la carne e índice de condición. La proteína

de las muestras de hemolinfa se determinó por medio del método de Bradford.

Mensualmente se hizo una determinación de la cantidad de materia orgánica

disponible como alimento para los ostiones en cultivo. La variación de la temperatura

fue estacional. Sin embargo, la salinidad no mostró un patrón estacional debido al

aporte de agua dulce de los sistemas de riego agrícola. La mortalidad acumulada

hasta el mes de diciembre fue de 27.5 % y muestra una correlación directa con la

temperatura del agua. Los resultados muestran un estrés fisiológico (están “flacos”)

de los organismos en los meses donde ocurren los cambios de temperatura y en los

meses cálidos. La concentración de la proteína de la hemolinfa muestra una relación

directa con la condición fisiológica de los organismos y con la temperatura. Trece

enzimas hidrolíticas lisosomales están presentes en la hemolinfa de C. gigas y se

observa una clara influencia de la temperatura en su actividad. Sin embargo, la

salinidad, que es otro factor ambiental que también afecta el sistema inmune, no

mostró relación evidente.

En este trabajo se demuestra la influencia de la temperatura en la condición fisiológica y el sistema inmune de C. gigas y se recomienda sembrar los animales en noviembre y cosecharlos en abril-mayo.

Introducción

En México, la acuicultura de moluscos bivalvos se basa principalmente en el

cultivo de las ostras Crassostrea virginica y C. gigas. En el 2001, la producción total

del país fue de 50,565 toneladas, de las cuales C. virginica aportó 49,000 toneladas y

C. gigas 1,500 toneladas (SAGARPA 2001).

En general, se considera que el principal problema que enfrenta el cultivo de

moluscos bivalvos son las enfermedades provocadas por bacteria y virus que afectan

a los organismos, principalmente en verano (julio, agosto y septiembre) (Barbosa et

al. 2001), estas enfermedades son difíciles de detectar en su medio natural, por lo

que en muchos casos estos agentes infecciosos han sido poco estudiados (Barbosa

et al. 2001).

El estrés provocado por las altas densidades de los organismos en cultivo y

las variaciones de los parámetros fisicoquímicos (temperatura, salinidad, oxígeno

disuelto, etc.) puede incrementar el riesgo de incidencia de enfermedades,

posiblemente por la inducción de una inmunosupresión, aumentando el riesgo del

ataque de patógenos como las bacterias (Harvell et al. 1999).

Las bacterias forman parte de la flora autóctona de los organismos marinos y

de su ecosistema, llegando a representar hasta un 60% de la población de

microorganismos totales en algunas lagunas costeras (Simudu y Tsukamoto 1985).

Sin embargo, una proliferación excesiva de bacterias ligada a una inmunosupresión

en los organismos en cultivo, puede provocar enfermedades y altas tasas de

mortalidad.

La incidencia del género Vibrio es considerado el problema más común y serio

de sanidad en los sistemas de cultivo de moluscos, ya que causa enfermedades y

mortalidades masivas (Elston 1984, Tubiash y Otto 1986, Sindermann 1988). Se ha

corroborado que diferentes especies de bacterias de este género como Vibrio

alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. natriegens, V. pectenicida, V. tapetis, V.

splendidus y V. anguillarum pueden provocar mortalidades masivas de algunos

invertebrados marinos, lo que ocasiona un deterioro en los sistemas de cultivo. Se

considera que en el mar, los vibrios pueden alcanzar en promedio la cantidad de 1 x

103 células/mL (Utting 1986).

Para defenderse del ataque de microorganismos que viven en su entorno,

todos los organismos multicelulares poseen mecanismos de defensa contra los

microorganismos invasores (Muta e Iwanaga 1996). Estos mecanismos de defensa

son esenciales para su supervivencia y perpetuidad. Los invertebrados, los cuales no

tienen inmunoglobulinas ni memoria inmune, han desarrollado mecanismos únicos

de detección y respuesta contra antígenos microbianos. Las células efectoras de

invertebrados pueden reconocer patrones moleculares más que estructuras

particulares en el patógeno. Existen moléculas asociadas a patógenos que no son

encontradas en organismos multicelulares como lipopolisacáridos, peptidoglucanos y

ácido lipoteicoico de bacterias, β-1,3-glucanos de hongos y ARN de doble cadena en

virus (Muta e Iwanaga 1996, Song y Huang 2000). En invertebrados la coagulación

de la hemolinfa (Iwanaga 1993, Muta e Iwanaga 1996) y la formación de melanina

son esenciales para dicha respuesta (Aspan y Söderhäll 1991, Söderhäll et al. 1994,

Fujimoto et al. 1995, Kawabata et al. 1995).

En particular, el sistema inmune de los moluscos está representado por

hemocitos, proteínas plasmáticas y reacciones que involucran componentes

celulares y humorales (Vargas-Albores y Barracco 2001).

La distribución uniforme de dichos componentes a través de todo el organismo

se logra debido a que los moluscos bivalvos tienen un sistema circulatorio abierto

compuesto por senos, lo cual optimiza su respuesta inmune (Allam y Paillard 1998).

La defensa inmediata de este grupo de organismos se da mediante la acción

de los hemocitos, la cual consiste, principalmente, de la fagocitosis, el

encapsulamiento (cuando los patógenos son demasiado grandes para ser

fagocitados), o bien, removiéndolos del huésped por migración a través de las

membranas epiteliales (diapédesis) (Fisher 1988). Los hemocitos participan en la

eliminación de material extraño en los moluscos bivalvos principalmente a través de

la fagocitosis (Cheng et al. 1975, Rodrick y Ulrich 1984, Anderson et al. 1992,

Carballal et al. 1998).

Las enzimas lisosomales dentro de los hemocitos, matan y degradan las

partículas fagocitadas y si es necesario son liberadas de la célula al plasma u otros

tejidos (Cheng et al. 1975, Cajaraville et al. 1995, Bachère et al. 1995) donde pueden

modificar la conformación molecular de la membrana celular y con ello favorecer su

reconocimiento y fagocitosis (Cheng 1981,1983, Cajaraville et al. 1995).

Durante el proceso de fagocitosis, el hemocito destruye las partículas

fagocitadas por medio de moléculas que incluyen enzimas hidrolíticas, péptidos

antimicrobianos y radicales libres (mecanismos oxidativos). Así, en los moluscos

bivalvos, los mecanismos de defensa constan, además de los hemocitos y enzimas

hidrolíticas, de mecanismos oxidativos como las reacciones intermedias de oxígeno

(IRO) y nitrógeno (IRN), la profenoloxidasa (proFO), péptidos antimicrobianos (PAM)

y lectinas (Luna-González 2003).

Los efectores celulares y moleculares han sido estudiados como indicadores

de la capacidad inmune en muchas especies de bivalvos (Cheng 1976, Moore y

Gelder 1985), el entendimiento de la respuesta inmune de C. gigas al ataque de

infecciones bacterianas, puede ayudar a diseñar estrategias para el control de

enfermedades causadas en los cultivos de esta especie.

La densidad de los hemocitos puede ser un parámetro cuantificable de la

respuesta inmune de los moluscos bivalvos debido a estrés fisiológico o patológico.

El presente proyecto de investigación pretende determinar la influencia de las

condiciones medioambientales sobre los parámetros fisiológicos e inmunológicos de

C. gigas en cultivo.

Objetivo General Contribuir al conocimiento del efecto estacional en el sistema inmune y

fisiología de organismos adultos de C. gigas, cultivados de manera experimental. El

conocimiento generado permitirá contribuir al establecimiento de estrategias de

manejo de los cultivos comerciales.

Objetivos Específicos

1. Estudiar el efecto estacional en el sistema inmune y parámetros fisiológicos de

organismos adultos de C. gigas a lo largo de 12 meses.

2. Determinar la concentración de alimento disponible para los organismos en el

área de cultivo durante un ciclo anual.

Materiales y Métodos

Obtención y cultivo de juveniles de C. gigas

El cultivo constó de 1500 animales adultos triploides (talla, 120.90±19.47) en

un sistema de cultivo Long Line en La Pitahaya, Bahía de Macapule (Guasave,

Sinaloa, México). Los módulos se mantuvieron en una línea madre de un cultivo

comercial de aproximadamente 1.5 x 106 organismos. Los módulos se limpiaron cada

15 días para eliminar los organismos adheridos (biofouling).

Determinación de los parámetros fisicoquímicos Para medir las variaciones en la temperatura mensual en el área del cultivo se

utilizó un termómetro de cubeta y el sensor de temperatura de un potenciómetro

digital (Hanna).

La variación de la salinidad en el área del cultivo se determinó con un

refractómetro (Sper Cientific) cada 30 días.

Registro de mortalidad La mortalidad se registró mensualmente y se sacó el porcentaje acumulado.

Parámetros fisiológicos Cada mes se colectaron 10 organismos adultos (talla,120.90±19.47) al azar,

para determinar los parámetros fisiológicos longitud, peso seco de la carne, concha e

índice de condición. En el laboratorio, a cada uno de los ostiones colectados se le

determinó la talla y se separó la carne de la concha. La carne y la concha se

pusieron en papel aluminio por 48 h en un horno a 60 °C y después se pesaron. El

índice de condición (IC) se calculó como sigue, IC= (peso seco de la carne/peso seco

de la concha) x 100 (Mann y Glomb 1978). La medición de la longitud correspondió a

la máxima longitud anterior-posterior (mm).

Efecto de la estación en el sistema inmune de C. gigas

Colecta de organismos del sistema de cultivo

La colecta se realizó cada mes durante 12 meses. En total, se colectaron 12

ostiones (talla, 120.90±19.47). Estos ostiones se trasladaron vivos en una hielera,

con agua del área de cultivo, a las instalaciones del CIIDIR-Sinaloa. En el Laboratorio

de Acuacultura, los animales, se sangraron a través del músculo aductor. También

se medió el eje anterior-posterior para determinar su talla.

Extracción de la hemolinfa

A cada uno de los 12 organismos se le extrajo una muestra de hemolinfa (1.5

mL) del músculo aductor con una jeringa (29G x 13 mm) estéril de plástico de 1 mL

preenfriada. Las muestras individuales se colocaron en tubos Eppendorf estériles

preenfriados en hielo y se conservaron en frío durante todo su manejo.

Hemolinfa

La hemolinfa (plasma y hemocitos) se congeló a -85 °C, congelando y

descongelando 2 veces para el rompimiento de las membranas celulares. El

homogenizado se centrifugó a 21,000 x g por 30 min a 4 °C y el sobrenadante del

lisado de hemocitos (SLH) se usará en los ensayos posteriores.

Determinación de actividad de las enzimas hidrolíticas

Para la determinación de las enzimas hidrolíticas se utilizó el kit comercial API

ZYM (BioMérieux). El kit es un método colorimétrico semicuantitativo que detecta 19

enzimas hidrolíticas y que ya ha sido satisfactoriamente usado en moluscos bivalvos

(Carballal et al. 1997, López et al. 1997, Luna-González et al. 2002, 2004). El kit

determina las siguientes enzimas: proteasas (leucil arilamidasa, valilarilamidasa, cistil

arilamidasa, tripsina, α-chymotrypsin; lipasas (lipasa esterasa C8, lipasa C14);

glucosidasas (α-galactosidasa, β-galactosidasa, β-glucuronidasa, α-glucosidasa, β-

glucosidasa, N-acetyl-β-glucosaminidasa, α-mannosidasa, α-fucosidasa; esterasas

(esterasa C1); y fosfatasas (fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, naftol fosfohidrolasa).

El kit se usó de acuerdo al las instrucciones del manual del fabricante. Con las

12 muestras individuales, se hicieron 2 mezclas (pools) de 6 animales. Se pusieron

65 µL de muestra por pozo y las tiras de reacción se incubaron a 37 °C por 4 h.

Después de la incubación, se añadieron los reactivos y se dejaron incubando a

temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) por 5-10 minutos. El color resultante

se estimó bajo luz del son por 20 s y se registró con números de 0 a 5 con base a la

escala de color dada por el fabricante. Esta escala se transformó a nanomoles (nM)

de sustrato hidrolizado. La actividad enzimática se expresó como unidades de

sustrato hidrolizado por miligramo de proteína (U de sustrato hidrolizado/mg de

proteína). Todas las determinaciones se hicieron por duplicado (2 tiras/mezcla de 6

animales).

Detección de la actividad de la lisozima

Debido a que el Kit API ZYM sólo detecta 19 enzimas hidrolíticas, se realizó

un ensayo estándar adicional en caja de Petri para detectar la actividad de la enzima

hidrolítica lisozima. Para esto, se preparó una solución de 4 mg/mL de agua destilada

de la bacteria liofilizada Micrococcus luteus (Sigma). También se preparó un búfer

(Tris-HCl 50 mM, pH 5.2), con el cual se preparó agarosa al 1 %. La agarosa fundida

en el búfer se dejó reposar hasta que se enfrió a 40 °C. A 14 mL del búfer Tris–

agarosa se le agregaron 1 mL de la solución bacteriana y se mezcló perfectamente.

Una vez hecha la mezcla, se vació la solución en una caja de Petri para que

solidifique. Cuando la mezcla se solidificó se hicieron 8 pozos de 6 mm de diámetro.

Los pozos se llenaron con 30 µL de cada una de las 2 mezclas y un control positivo

(saliva de humano diluida 1:9 en solución salina 0.1 % NaCl). Como control negativo

se usó el búfer. Después de 24 h de incubación a 27 °C se medió el diámetro del

halo de lisis.

El diámetro del halo de lisis se obtuvo midiendo el diámetro total menos el

diámetro del pozo. Los resultados se expresaron en unidades (0.1 mm = 1 U/mg de

proteína (U/mg de proteína). Cada una de las mezclas de 6 animales constó de 3

replicas (3 pozos por caja de Petri).

Determinación de la proteína del plasma y SLH

La proteína de las muestras de plasma y SLH se determinó por medio del

método de Bradford (1976), usando albúmina de suero de bovino como estandar.

Concentración de alimento disponible para los organismos en cultivo Mensualmente se hizo una determinación de la cantidad de materia orgánica

disponible para los ostiones en cultivo. Se tomaron 5 muestras de agua (a un metro

de profundidad) de un litro en diferentes zonas del área del cultivo. Las muestras se

transportaron al laboratorio donde se filtró el agua en filtros Whatman de fibra de

vidrio (GF/C, 47 mm) previamente lavados y quemados en horno a 160 °C en papel

aluminio. Antes de filtrar el agua se pesaron los filtros. Una vez filtrada el agua se

pesó el filtro con las partículas retenidas, luego se secaron en un horno a 40 °C y

después se pesaron de nuevo. Los filtros ya pesados se colocaron en una mufla a

550 °C por 20 min para quemar la materia orgánica. La concentración de materia

orgánica se obtuvo restando la materia inorgánica y el peso del filtro.

Resultados Parámetros fisicoquímicos La variación de la temperatura fue estacional, con un valor mínimo en invierno

de 18.5 °C (diciembre) y un máximo en verano de 30.9 °C. La salinidad más baja se

presentó en abril y agosto (26 y 27 ups, respectivamente) y la más alta en julio (39

ups) (Fig. 1).

0

5

10

15

20

25

30

35

F M A M J J A S O N D

Meses (2006)

Tem

pera

tura

(°C

)

0

5

10

15

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40

Sal

inid

ad (U

PS

)

TemperaturaSalinidad

Figura 1. Variación mensual de la temperatura y la salinidad en el estero La

Pitahaya, Bahía de Macapule.

Mortalidad La mortalidad acumulada hasta el mes de diciembre (11 meses) fue de 27.5 %

y muestra una correlación directa con la temperatura del agua (Fig. 2). Los

resultados indican que la mortalidad aumenta en los meses cálidos y en los meses

fríos es nula o mínima.

0

5

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F M A M J J A S O N D

Meses (2006)

Mor

talid

ad A

cum

ulad

a (%

)

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5

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Tem

pera

tura

(°C

)

MortalidadTemperatura

Figura 2. Mortalidad acumulada de C. gigas en relación a la temperatura.

Índice de condición fisiológica Los resultados (Fig. 3) muestran un estrés fisiológico de los organismos en los

meses donde ocurren los cambios de temperatura y en los meses cálidos. Los

organismos han perdido sus reservas de energía y pesan menos, observándose más

“flacos”. Cuando empieza a subir la temperatura en mayo, el índice cae casi 2.5

puntos (de 9.86 a 7.59), llegando a su mínimo en agosto y septiembre con un valor

de 2. En octubre, noviembre y diciembre aumenta un poco el índice, con

aproximadamente 3 puntos; sin embargo, los organismos siguen estando “flacos”.

0

2

4

6

8

10

12

F M A M J J A S O N D

Meses (2006)

ICF

de C

. gig

as

0

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10

15

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Tem

pera

tura

(°C

)

ICFTemperatura

Figura 3. Comparación del índice de condición fisiológica de C. gigas y la

temperatura del agua del estero La Pitahaya (Bahía de Macapule), durante los 11

meses reportados.

Concentración de proteína en la hemolinfa La concentración de la proteína (Fig. 4) de la hemolinfa muestra una relación

directa con la condición fisiológica de los organismos (Fig. 3) y, al igual que el ICF,

con la temperatura. Cuando la temperatura aumenta de 24.8 °C en mayo a 28.85 °C

en junio, la proteína de la hemolinfa cae bruscamente y se mantiene en niveles

mínimos hasta noviembre (falta el análisis de diciembre).

00.250.5

0.751

1.251.5

1.752

2.25

F M A M J J A S O NMeses (2006)

Pro

teín

a (m

g/m

L)

0

5

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20

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30

35

Tem

pera

tura

(°C

)

ProteínaTemperatura

Figura 4. Comparación de la concentración de la proteína de la hemolinfa de

C. gigas y la temperatura del agua del estero La Pitahaya (Bahía de Macapule),

durante los 10 meses reportados.

Sistema inmune

Doce de las 19 enzimas incluidas en el kit API ZYM están presentes en la

hemolinfa de C. gigas (Tabla 1). Las enzimas encontradas son: Fosfatasa alcalina,

esterasa (C 4), esterasa lipasa (C 8), leucina arilamidasa, valina arilamidasa,

fosfatasa ácida, naftol fosfohidrolasa, β-galactosidasa, β-glucoronidasa, β-

glucosidasa, N-acetil-β-glucosaminidasa y α-fucosidasa.

En los resultados obtenidos hasta el momento (faltan los datos de diciembre y

los muestreos de enero y febrero de 2007), se observan algunas tendencias claras

en 7 de las enzimas reportadas. La fosfatasa alcalina presentó una actividad mínima

de febrero a junio y cero actividad de julio a noviembre. La actividad de la esterasa

(C 4) sólo se detectó de junio a noviembre. La esterasa lipasa (C 8) sólo se detectó

en octubre y noviembre. Las enzimas leucina arilamidasa, fosfatasa ácida y β-

galactosidasa, muestran actividad en todos los meses reportados con una aumento

considerable en los meses (junio-noviembre) de mayor estrés fisiológico. La β-

glucosidasa presenta actividad de abril a noviembre, con un aumento en su actividad

de junio a noviembre.

La actividad de la enzima lisozima se detectó en los 10 meses reportados

(Tabla 1). Sin embargo, en los meses de junio a noviembre se observa un notable

aumento de su actividad de hasta 11 veces, en comparación con la encontrada en

los meses de febrero, marzo, abril y mayo.

Tabla 1. Determinación de la actividad de enzimas hidrolíticas lisosomales de la hemolinfa de C. gigas, utilizando el kit API ZYM y el ensayo de lisis en placa (diámetro del halo). Los valores de la lisozima (promedio, ± DE) se muestran como U/mg de proteína. Los valores de actividad de las enzimas del kit se muestran como unidades de sustrato hidrolizado/mg de proteína.

Enzimas F M A M J J A S O N D E

Fosfatasa alcalina 2.7 3.0 2.7 2.5 6.5 Esterasa (C 4) 0 0 0 0 13.0 75.1 64.9 78.6 56.9 29.7 Esterasa lipasa (C 8) 0 0 0 0 0 0 0 0 14.24 7.44 Lipasa (C 14) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Leucina arilamidasa 2.7 3.0 21.9 20.3 78.3 100.1 129.9 157.3 113.9 119.0 Valina arilamidasa 0 0 0 0 13.0 0 0 0 14.2 14.8 Cistina arilamidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tripsina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 α-quimiotripsina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Fosfatasa ácida 2.7 3.0 2.7 2.5 13.0 25.0 16.2 19.6 28.4 59.5 Naftol fosfohidrolasa 2.7 0 2.7 2.5 6.5 12.5 16.2 9.8 7.1 7.4 α-galactosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 β-galactosidasa 2.7 3.0 1.3 2.5 13.0 25.0 16.2 19.6 14.2 29.7 β-glucoronidasa 2.7 3.0 1.3 2.5 6.5 6.2 8.1 0 14.2 7.4 α-glucosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 β-glucosidasa 0 0 2.7 2.5 13.0 25.0 16.2 9.8 14.2 14.8 N-acetil-β-glucosaminidasa 2.7 3.0 1.3 2.5 6.5 0 0 0 14.2 14.8

α-mannosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 α-fucosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 14.2 14.8 *Lisozima 16.4±0 21.2±4.2 19.2±2.7 16.1±3.8 95.7±15.0 71.0±7.2 65.1±0 177.2±27.8 85.47±0 178.5±0

Alimento disponible para los organismos en cultivo La zona de cultivo muestra abundante presencia de materia orgánica. Los

resultados muestran un mayor valor del ICOS en los meses de marzo, abril y mayo y

un menor valor en los meses restantes. El valor mínimo del ICOS se observó en

febrero (19.24) y el valor máximo en mayo (49.44).

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20

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F M A M J J A S O N D

Meses (2006)

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S

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1

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Mar

ea

ICOSMarea

Discusión La temperatura mostró un patrón estacional; sin embargo, la salinidad no

mostró un patrón claro debido al aporte de agua dulce (salinidad baja, 26 y 27 ups)

de los sistemas de riego agrícola que descargan sus aguas en el estero de La

Pitahaya y a la evaporación (salinidad alta), probablemente debida a la lentitud del

recambio de agua del estero.

Los resultados muestran un estrés fisiológico de los organismos en los meses

donde ocurren los cambios de temperatura y en los meses cálidos. Los organismos

perdieron sus reservas de energía y se observaron “flacos”. En este sentido, se sabe

que C. gigas es una especie originaria del Pacífico Japonés, donde las aguas son

templadas. Por lo tanto, las aguas cálidas de verano en esta zona lo estresan y

pueden ocurrir mortalidades importantes. En este trabajo, la mortalidad (27 %)

ocurrió por estrés fisiológico provocado por el aumento de la temperatura; sin

embargo, no ocurrió una mortalidad masiva como se ha reportado en verano en

Sinaloa y Sonora (Valerie Barbosa, com. pers.) o en Francia, Norteamerica y Japón

(Glude 1974, Koganezawa 1974, Goulletquer et al. 1998, Cheney et al. 2000).

Usualmente, la temperatura es el factor exógeno más importante en la regulación del

metabolismo en organismos exotérmicos (Newell y Bayne 1980). Las funciones de la

tasa fisiológica están positivamente correlacionadas con la variación estacional de la

temperatura (Newell y Bayne, 1980, Huang y Newell 2002). En este sentido, la súper

imposición en el ciclo metabólico estacional asociado con la temperatura son

variaciones relacionadas a factores endógenos, tales como la nutrición y la condición

reproductiva (Huang y Newell 2002). En este trabajo no existe una correlación entre

la abundancia de alimento y el estrés de los organismos. Tampoco existe una

relación con la reproducción, puesto que los organismos experimentales eran

triploides, lo cual evita que se transfiera energía a la gónada.

En lo referente al sistema inmune, se observa una clara influencia de la

temperatura en el mismo. En este trabajo se observó una variación de la actividad de

las enzimas lisosomales (presentes en los lisosomas de hemocitos y plasma)

influenciada por la temperatura. Sin embargo, la salinidad, que es otro factor

ambiental que también afecta el sistema inmune, no mostró relación evidente. Se ha

demostrado que altas temperaturas y bajas salinidades disminuyen la actividad de

los hemocitos o los matan (Fisher 1988, Hegaret et al. 2003), por lo tanto, la

variación de las enzimas puede deberse a la muerte de hemocitos o al aumento del

número de los mismos (Ramírez-Castillo et al. 2005). Las enzimas lisosomales

hidrolíticas son elementos importantes del sistema de defensa de moluscos bivalvos

(Cheng 1992, Cajaraville et al. 1995, Luna-González et al. 2004) y están presentes

en todas las células eucariotas donde degradan material diverso, tales como

mitocondrias viejas y microorganismos intrusos (Langdon y Newell 1996, Elliot y Elliot

1997).

La cantidad de material particulado (seston) en el estero La Pitahaya presenta

una gran variabilidad a lo largo de los meses reportados. Sin embargo, no se observó

una relación directa con el estrés fisiológico de los organismos. La variación del

seston esta influenciada por el efecto de resuspensión del sedimento producto de la

marea y del viento (Jiménez-Illescas et al. 1997) y por el fitoplancton (Lechuga-

Deveze et al. 1986).

En este trabajo se demuestra la influencia de la temperatura en la condición

fisiológica y el sistema inmune del ostión del Pacífico C. gigas.

Recomendaciones

Las recomendaciones emanadas de este trabajo de investigación son las siguientes:

1) Sembrar en La Pitahaya en noviembre.

2) Cosechar en abril-mayo.

3) Si no se vendiera todo el producto, se recomienda dejar el cultivo con bajas

densidades y mantener limpias las canastas ostrícolas.

4) Realizar estudios futuros sobre las enzimas leucina arilamidasa y lisozima ya

que pueden servir como inmunomarcadores y marcadores de estrés térmico.

Cumplimiento de los Objetivos del Proyecto

Faltan los muestreos de enero de 2007; sin embargo, se hará un ciclo de 13

meses, por lo que se tomarán muestras también en febrero. Los resultados obtenidos

se anexarán a este informe en febrero de 2007.

Cumplimiento de las Metas Comprometidas

Metas de formación

No se formó el alumno de licenciatura comprometido debido a que el alumno

propuesto cambió de parecer.

Metas Científicas El artículo comprometido en revista internacional indexada se cumplirá en el

2007. Por lo tanto, este documento se deberá anexar en el futuro a este informe.

Agradecimientos

Mi más sincero agradecimiento a la Secretaría de Investigación y Postgrado

del IPN por el apoyo económico brindado para la realización de este trabajo.

También agradezco al señor Alejandro Nolasco por el apoyarme con sus

instalaciones de cultivo en La Pitahaya, Bahía de Macapule.

Bibliografía

Allam B. y C. Paillard. 1998. Defense factors in clam extrapallial fluids.

Dis. Aqua. Org. 33:123-128.

Anderson, R.S., K.T. Paynter y E. M. Burreson. 1992. Increased reactive oxygen

intermediate production by hemocytes withdrawn from Crassostrea virginica

infected with Perkinsus marinus. Biol. Bull. 183:467-481.

Aspan, A. y K. Söderhäll. 1991. Purification of prophenoloxidase from crayfish blood

cells, and its activation by an endogenous serine proteinase. Insect Biochem.

21:363-373.

Auffret, M. 1988. Bivalve hemocyte morphology. Am. Fisher. Soc. Spec. Publ.

18:169-177.

Bachère, E., D. Changot y H. Grizel. 1988. Separation of Crassostrea gigas

haemocytes by gradient centrifugation and counterflow centrifugal elutriation.

Dev. Comp. Immunol. 14:261-268.

Bachère, B., E. Mialhe, D. Nöel, V. Boulo, A. Morvan y J. Rodríguez. 1995.

Knoweledge and research prospects in marine mollusc and crustacean

imunology. Aquaculture 132:17-32.

Barbosa V., A. Luna-González, G. Aguirre-Guzmán, C. Riquelme y F. Ascencio-Valle.

2001. Enfermedades microbianas de pectínidos cultivados en

Iberoamérica. pp. 325-342 En: Maeda-Martínez, A. N (ed). Los moluscos

pectínidos de Iberoamérica: ciencia y acuacultura. Limusa. México.

Barbosa-Solomieu, V. 2004. Detección de agentes virales en ostión japonés

(Crassostrea gigas). Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste.

Tesis de doctorado. 246 pp.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

Biochem. 72:248-254.

Cajaraville, M.P. y S.G. Pal. 1995. Morphofunctional study of the haemocytes of the

bivalve mollusc Mytilus galloprovincialis with emphasis on the

endolysosomal compartment. Cell Struct. Funct. 20:355-367.

Cajaraville, M.P., S.G. Pal y Y. Robledo. 1995. Light and electron microscopical

localization of lysosomal acid hidrolases in bivalve haemocytes by enzyme

cytochemistry. Acta Histichem. Cytochem. 28:409-416.

Carballal, M.J., C. López, C. Azevedo y A. Villalba. 1997. Enzymes involved in

defense function of haemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis. J.

Invertebr. Pathol. 70:96-105.

Cheney, D.P., B.F. MacDonald y R.A. Elston. 2000. Summer mortality of Pacific

oysters, Crassostrea gigas (Thunberg): Initial findings on multiple

environmental stressors in Puget Sound, Washington, 1998. Journal of

ShellfishResearch 19: 353-359.

Cheng, T.C. 1975. Functional morphology and biochemistry of molluscan phagocytes.

Ann. New York Acad. Sci. 266:343-379.

Cheng, T.C. 1976. Beta – glucoronidase in the serum and hemolymph cells of

Mercenaria mercenaria and Crassostrea Virginica (Mollusca: Pelecypoda).

J. Invertebr. Pathol. 27:125-128.

Cheng, T.C. 1981. Bivalves. In “Invertebrates Blood Cells, Vol. 2” (N. A. Ratcliffe and

A. F. Rowley, Eds.). pp. 231 – 300. Academic Press, London.

Cheng , T.C. 1983. The role of lysosomes in molluscan inflammation. Am. Zool.

23:129-144.

Cheng, T.C. 1992. Selective induction of release of hydrolases from Crassostrea

virginica hemocytes by certain bacteria. J. Invert. Pathol. 59:197-200.

Cheng, T.C., G. E. Rodrick, D. A. Foley y S. A. Koehler. 1975. Released of lysozyme

from hemolymph cells of Mercenaria mercenaria during phagocytosis. J.

Invertebr. Pathol. 25:125-128.

Cropp, D.A.1987. Economic feasibility of scallop culture inTasmania. Dept. Sea

Fish.Tech .Rep. 15 (24pp).

Deslou-Paoli, J.M., M. Heral, J.P. Berthome, D. Razet y J. Garnier. 1982.

Reproduction naturelle de Crassostrea gigas Thunberg dans le bassin de

Marennes-Oleron en 1979 et 1981:aspects biochimiques et énergétiques.

Rev Trav InstPêches Marit 45:319–327.

Dikkeboom, R., C.J. Bayne, W.P.W. Van der Knaap y J.M.G.H. Tijnagel. 1988.

Possible role of reactive forms of oxygen in in vitro killing of Schistosoma

mansoni sporocysts by hemocytes of Lymnea stagnalis. Parasitol. Res.

75:148-154.

Elston, R. 1984. Prevention and management of infectious diseases in intensive

mollusk husbandry. J. World Maricul Soc. 15:284-300.

Fisher, W.S. 1988. Environmental influence on bivalve hemocyte function. Am. Fish.

Soc. Spec. Publ. 18:225-237.

Friebel, B. y L. Renwrantz. 1995. Application of density gradient centrifugation for

separation of eosinophilic and basophilic hemocytes from Mytilus edulis

and characterization of both cell groups. Comp. Biochem. Physiol.

112A:81-90.

Friedman, C.S. y R.P. Hedrick. 1991. Pacific oyster nocardiosis: isolation of the

bacterium and induction of laboratory infections. J. Invertebr. Pathol.

57:109– 120.

Fujimoto K., N. Okino, S. Kawabata, S. Iwanaga y E. Ohnishi. 1995. Nucleotide

sequence of the cDNA encoding the proenzyme of phenol oxidase A1 of

Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:7769-7773.

Glude, J.B. 1974. A summary report of Pacific Coast oyster mortality investigations

1965-1972. In: (Proceedings of the Third U.S.-Japan Meeting on

Aquaculture at Tokyo, eds) pp. 28. Tokyo.

Goulletquer, P., Soletchnik, P., Le Moine, O., Razet, D., Geairon, P., Faury, N. &

Taillade, S. (1998). Summer mortality of the Pacific cupped oyster

Crassostrea gigas in the Bay of Marennes-Oleron (France). ICES

Mariculture Committee CM, Copenhagen.

Harvell, C.D., K. Kim, J.M. Berkholder, R.R. Colwell, P.R. Epstein y D.J. Grimes.

1999. Emergin marine diseases-climate link and antropogenic factors.

Science 285:1505-1510.

Hegaret, H., G.H. Wikfors y P. Soudant. 2003. Flow cytometric analysis of

haemocytes from eastern oysters, Crassostrea virginica, subjected to a

sudden temperature elevation II. Haemocyte functions: aggregation,

viability, phagocytosis, and respiratory burst. Journal of Experimental

Marine Biology and Ecology 293: 249-265.

Henry, M., M. Auffret y E. Boucaud Camou. 1990. Aspects ultrastructuraux et

fonctionnels des hemocytes de quatre familles de bivalves (Ostreidae,

Veneridae, Mytilidae, Pectinidae). Haliotis 20: 195-196.

Huang, S.C. y R.I.E. Newell. 2002. Seasonal variations in the rates of aquatic and

aerial respiration and ammonium excretion of the ribbed mussel,

Geukensia demissa (Dillwyn). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 270: 241– 255.

Iwanaga, S. 1993. The limulus clotting reaction. Curr. Opin. Immunol. 5:74-82.

Jiménez-Illescas, A.R., M. Obeso-Nieblas y D.A. Salas-de León. 1997. Oceanografía

física de la bahía de La Paz, B.C.S. pp 31-41. En: Urbán-Ramírez, J. & M.

Ramírez-Rodríguez (Eds.). Bahía de la paz: investigación y conservación.

UABCS-CICIMAR-SCRIPPS.

Kawabata, T., Y. Yasuhara, M. Ochai, S. Matsuura y M. Ashida. 1995. Molecular

cloning of insect pro-phenoloxidase: a copper-containing protein

homologous to arthropod hemocyanin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

92:7774-7778.

Koganezawa, A. (1974). Present status of studies on the mass mortality of cultured

oysters in Japan and its prevention. In: (Proceedings of the Third U.S.-

Japan Meeting on Aquaculture at Tokyo, eds) pp. 29-34. Tokyo.

Langdon, C.J. y R.I.E. Newell. 1996. Digestión and nutrition in larvae and adults. In:

Kennedy V.S., Newell R.I.E., Eble A.F. (eds). The eastern oyster

Crassostrea virginica. Maryland Sea Grant College. 231-258 pp.

Elliot, W. y D.C. Elliot. 1997. Biochemistry and molecular biology. New York ; Oxford

University Press. 209-210 pp.

López, C., M.J. Carballal, C. Azevedo y A. Villalba. 1997a. Morphological

characterization of the hemocytes of the clam, Ruditapes decussates (Mollusca: Bivalvia). J. Invertebr. Pathol. 69: 51-57.

Lechuga-Deveze, C.H., J. García-Pámanes y J.J. Bustillos. 1986. Condiciones

ecológicas de una laguna costera de la costa oeste del Golfo de California.

Turbiedad y clorofila. Ciencias Marinas 12: 19-31.

López, C., M.J. Carballal, C. Azevedo y A. Villalba. 1997b. Enzyme characterisation

of the circulating haemocytes of the carpet shell clam, Ruditapes

decussatus (Mollusca: Bivalvia). Fish Shellf. Immunol. 7:595-608.

Luna-González, A., A.N. Maeda-Martínez, F. Ascencio-Valle y M. Robles-Mungaray.

2004. Ontogenetic variations of hydrolytic enzymes in the Pacific oyster

Crassostrea gigas. Fish Shell Immunol. 16 (3):287-294.

Luna-González, A. 2003. Susceptibilidad a Vibrio alginolyticus y mecanismos de

defensa de moluscos bivalvos. Tesis doctoral. CIBNOR, La Paz, B.C.S.

México. 108 pp.

Mann, R. y S.J. Glomb. 1978. The effect of temperature on growth and

gametogenesis in the manila clam Tapes japonica. Estuar. Coast. Mar. Sci.

6: 335– 339.

Mohandas, A., T.C. Cheng y J.B. Cheng. 1985. Mechanism of lysosomal enzyme

release from Mercenaria mercenaria granulocytes: a scanning electron

microscope study. J. Invertebr. Pathol. 16:189-197.

Moore C.A. & A.F. Eble. 1977. Cytochemical aspects of Mercenaria mercenaria

haemocytes. Biol. Bull. 152:105-119.

Moore, C.A. y S. R. Gelder. 1985. Demonstration of lysosomal enzymes in

hemocytes of Mercenaria mercenaria (Mollusca: bivalvia). Trans. Am.

Microsc. Soc. 104:242-249.

Muta T. y S. Iwanaga. 1996. The role of hemolymph coagulation in innate immunity.

Curr. Opin. Immunol. 8:41-47.

Nakayama, K., A.M. Nomoto, M. Nishijima y T. Maruyama. 1997. Morphological and

functional characterization of hemocytes in the giant clam Tridacna crocea.

J. Invertebr. Pathol. 69:105-111.

Newell, R.I.E. y B.L. Bayne. 1980. Seasonal changes in the physiology, reproductive

condition and carbohydrate content of the cockle Cardium (=Cerastoderma)

edule (Bivalvia: Cardiidae). Mar. Biol. 56; 11– 19.

Noël, D., V. Boulo, D. Chagot, E. Mialhe, F. Paolucci, C. Clavies, E. Hervaud y R.

Elston. 1991. Preparation and characterization of monoclonal-antibodies

against neoplastic hemocytes of Mytilus edulis (Bivalvia). Dis. Aquat.

Organ. 10:51-58.

Noël, D., R. Pipe, R. Elston, E. Bachére y E. Mialhe. 1994. Antigenic characterization

of hemocyte sub-populations in the mussel Mytilus edulis by means of

monoclonal antibodies. Mar. Biol. 119:549-556.

Novoa, B., A. Luque, D. Castro, J.J. Borrego y A. Figueras. 1998. Characterization

and infectivity of four bacterial strains isolated from Brown Ring Disease-

affected clams. J. Invertebr. Pathol. 71: 34–41.

Oubella, R., C. Paillard, P. Maes y M. Auffret. 1994. Changes in hemolymph

parameters in the manila clam Ruditapes philippinarum (Mollusca:

Bivalvia) following bacterial challenge. J. Invertebr. Pathol. 64:33-38.

Pipe, R.K. 1990a. Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the

marine mussel Mytilus edulis. Histochem. J. 22:595-603.

Pipe, R.K. 1990b. Differential binding of lectins to haemocytes of the mussel Mytilus

edulis. Cell Tissue Res. 261:261-268.

Pipe, R.K., J.A. Coles, M.E. Thomas, V.U. Fossato y A.L. Pulsford. 1995. Evidence

for environmentally derived immunomodulation in mussels from the Venice

Lagoon. Aquat. Toxicol. 32:59-73.

Pipe, R.K., S.R. Farley y J.A. Coles. 1997. The separation and characterisation of

haemocytes from the mussel Mytilus edulis. Cell Tissue Res. 289:537-545.

Paillard, C. y P. Maes. 1990. E´ tiologie de la maladie de l’anneau brun chez Tapes

philippinarum: pathogenicite´ d’un Vibrio sp. C. R. Acad. Sci., Paris, Se´rie

III 310: 15– 20.

Ramírez-Castillo, E.R. 2005. Caracterización de la respuesta inmune de la almeja

mano de león Nodipecten subnodosus. Centro Interdisciplinario de

Investigaciones Marinas. Tesis de mestria. 76 pp.

Rodrick, G.E. 1975. Selected enzyme activities in Mya arenaria hemolymph. Proc.

Oklahoma Acad. Sci. 53:28-32.

Rodrick, G.E. y S.A. Ulrich. 1984. Microscopical studies on the hemocytes of bivalves

and their phagocytic interaction with selected bacteria. Hengol Meeresun

37:167-176.

Sagarpa. 2001. Anuario estadístico de pesca. Secretaría de Agricultura, Ganadería,

Recursos Naturales, Pesca y Agricultura. pp. 253.

Simudu, U. y K. Tsukamoto. 1985. Habitat segregation and biochemical activities of

marine members of the family vibrionaceae. Appl. Environ. Microbiol.

50:781-790.

Sindermann, C.J. 1988. Vibriosis of larval oysters. pp. 271-273. En: Sindermann, C.J.

y D.V Lightner, (Eds) Disease Diagnosis and Control in North American

Aquaculture. Develop. Aqua. Fish. Sci. 17, Elsevier, Amsterdam.

Song, Y. y L. Huang. 2000. Aplications of immunoestimulant to prevent shrimp

diseases. pp. 173-187. En: Fingerman M. y R. Negabhusanam (Eds).

Resent advances in marine biotechnology. Science Publishers inc.

Playmouth, UK.

Tubiash, H.S. y S.V. Otto. 1986. Bacterial problems in oysters: a review. En: Vivares;

C. P., J. R. Bonami y E. Jasper (eds). Pathology in marine aquaculture.

European Aquaculture Society, Special Publ. No. 8. Breden. pp. 233-242.

Utting, S.E. 1986. Seasonal changes in sea water composition and some

observations on performance of Ostrea edulis L. and Crassostrea gigas

Thunberg spat at selected sites around the British coastline. Ministry of

agriculture, fisheries and food, directorate of fisheries research, internal

report No.15, Lowestoft.

Vargas-Albores, F. y M.A. Barracco. 2001. Mecanismos de defensa de los moluscos

bivalvos, con énfasis en pectÍnidos. 33, 127-146. En: Maeda-Martínez, A.

N., (ed). Los moluscos pectinidos de Iberoamerica: ciencia y acuacultura.

Editorial Limusa.

Xue, Q. y T. Renault. 2000. Enzymatic activities in European flat oyster, Ostrea

edulis, and pacific oyster, Crassostrea gigas, hemolymph. J. Invertebr.

Pathol. 76:155-163.