PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAISO

FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Laboratorio de Biocatalisis

Determinación de curvas de calibrado y cinética de crecimiento celular de la levadura Kluyveromyces Marxianus

Nombres: Yailán Godoy Jimenez

Francisco Ocares Briceño

Christian Pinilla Herrera

6 de Septiembre 2012

0

Resumen

En el presente informe se presentan diferentes experiencias experimentales que buscan diversos objetivos enfocados tanto como por ejemplo la realización de una curva de calibrado o como la obtención de la cinética de un microorganismo dado en la práctica.Como primera etapa se obtuvo las curvas de calibrado por medio de dos métodos cualitativos, uno de ellos fue el método de DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) que se aplico una solución patrón de lactosa stock de 2 (g/L), obteniendo como resultado nuestra de ecuación de regresión lineal Y (ABS)= 0,359x – 0,0585. El otro método empleado fue el de turbidimetría, que consiste en la medición de la turbidez a través de las absorbancias de las soluciones. El resultado de esta curva de calibrado para biomasa fue de Y (ABS)= 3,7299x – 0,0156Una vez que se realizaron las curvas de calibrado, se procedió a la realización del diseño medio cultivo, en la cual a través de diferentes cálculos, se obtuvieron las masas de los diferentes nutrientes y del sustrato limitante (lactosa) para el crecimiento microbiano, mostrado en el Anexo C.Por último, poniendo en práctica todo lo aprendido, procedió a estudiar la cinética de crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus, midiendo a lo largo del tiempo su respectivo consumo de lactosa (g/L) y aumento de biomasa (g/L), concentrando todos los datos en un gráfico de concentración (g/L) versus tiempo (h). Según lo realizado, se mostró que la velocidad de crecimiento resultante fue de µ = 0,3126 (1/h)

Al concluir estas prácticas, se logro obtener las curvas de calibrado, sin mayores problemas, mientas que en la preparación del diseño del medio de cultivo, al inocular se observo un crecimiento y además se pudo deducir que el microorganismo Kluyveromyces Marxianus logró presentar un crecimiento, pero no al 100% fiable, ya que no se pudo disponer de todo el tiempo necesario.

1

Índices

Índices………………………………………………………………………………………………2

Resultados y Discusión…………………………………………………………………………...3

1. Curvado de Calibrado para Cuantificación de Lactosa / Crecimiento de Biomasa por Turbidimetría….……………………………………………………….3

2. Preparación de medios de cultivo, esterilización e inoculación.…………………5

2.1. Preparación de un medio de cultivo……………………………………….5

2.2. Esterilización………………………………………………………………...5

2.3. Inoculación…………………………………………………………………..6

3. Cinética de crecimiento celular y Consumo de lactosa de la levadura Kluyveromyces Marxianus…………………………………………………………..6

Conclusiones………………………………………………………………………………………8

Bibliografía………………………………………………………………………………………….9

Anexos……………………………………………………………………………………………10

a) Anexo A……………………………………………………………………….....11

b) Anexo B…………………………………………………………………………..12

c) Anexo C…………………………………………………………………………..14

d) Anexo D………………………………………………………………………….17

2

Resultado y Discusión

1. Curvado de Calibrado para Cuantificación de Lactosa / Crecimiento de Biomasa por Turbidimetría

Figura 1. Curva de calibrado para la cuantificación de lactosa. La línea de tendencia corresponde a regresión lineal de los datos. Absorbancia medida a 540 nm.

En este gráfico podemos encontrar la construcción de la curva de calibrado para la medición de azúcares reductores (soluciones de lactosa) de concentración stock de 2 (g/L). Ésta experiencia se realizó por duplicado, ya que una vez tenido los resultados se calculó el promedio entre las absorbancias resultantes (Tabla A1) y su respectiva desviación estándar, para así poder conseguir un margen error aceptable y un R lineal muy cercano a 1. La absorbancia de la muestra problema medida por el espectrofotómetro fue de 0,114, lo cual es aceptable, producto que se encuentra dentro de los parámetros de nuestra curva de calibrado derivada de la cuantificaciones de lactosa. Por tanto, reemplazando en la ecuación de la recta proveniente de la Fig. 1 dio como resultado una concentración de 0,4805 (g/L) de lactosa. Como discusión de esta parte de la práctica, podemos abordar que la Ley de lambeert sólo es aplicable para bajas concentraciones, por lo que al elaborar una curva de calibración para garantizar la linealidad, se necesita que nuestras muestras fueran diluidas adecuadamente para poder leerlas dentro de la curva sin la necesidad de extrapolar.Podemos señalar que en la Fig. Se presentan las barras de error, que corresponde al alejamiento de la absorbancia de una desviación estándar establecida para nuestros

3

datos, en la cual entre mayor sea la desviación entre los datos, mayor será el error de este. De esta forma, se destacaron los datos de nuestra serie de absorbancia que se alejan de la media de forma significativa. Con lo dicho anteriormente, se puede analizar los diferentes puntos (absorbancias) que se nos presentan en la Fig. Concluyendo que sólo 2 puntos acentuados en el Anexo A fueron aquellos que se salen del protocolo de nuestra experiencia y que pudo haberse causado por diferentes factores como una mala manipulación o una defectuosa medición en el espectrofotómetro.Cabe destacar que la lactosa es un azúcar reductor y que posee aproximadamente la mitad como máximo de poder reductor por residuo glucosilo que la glucosa o galactosa libres por ejemplo, puesto que su residuo de glucosa puede formar la cadena abierta (Robert W. McGilvery, Reverte 1977)

Figura 1.2. Curva de calibrado para la medición de crecimiento exponencial de Biomasa. Centrifugación a 10.000 rpm por intervalos de 15 minutos, previo Secado a 105° y medición de la absorbancia a 650 nm.

En esta parte de la experiencia lo primero que se realizó fue la obtención de la concentración inicial por medio de secado de la muestra a 105º, para luego ser pesada. Como se ejecutaron dos secados a la misma muestra, se consiguieron dos concentraciones iniciales, las cuales al momento de diluir y alcanzar nuestra concentración final, se lograron obtener nuestros parámetros de Eje X. Se recabó dos valores distintos para cada medición, con lo cual se sacó el promedio para cada valor a distintas diluciones. Para la obtención de las absorbancias se nos presentó un rango entre 0.8-0.1, por lo que se debió realiza una dilución previa al procedimiento utilizando los factores correspondiente que se presentan en el Anexo B. Este mismo método también se realizó para las absorbancias que se adquirieron, logrando una curva de calibrado para la obtención de concentración de biomasa de un cultivo en fase de crecimiento exponencial. Gracias a esta regresión lineal podemos calcular la concentración de la muestra problema que se nos presentó.

4

La absorbancia de la muestra problema medida a través de un espectrofotómetro a 650 nm fue de 0,569. Por lo tanto reemplazando en la ecuación de la recta de la Fig. 1.2.nos da como resultado 0,6269 (g/L) de biomasa.Sobre las barras de error obtenidas en esta regresión que se nos exhibió, podemos enfocarnos sólo en una muestra, la cual fue destacada en el Anexo B, ya que los demás puntos el error que produjeron fue ínfimo comparado con la muestra mencionada anteriormente. Esto se pudo haber producido por una mala dilución que realizamos o un incorrecto manejo de las celdas antes de medir en el espectrofotómetro.La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en este caso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia de un bioproceso. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y del cálculo de los demás balances de cualquier proceso biológico.

2. Preparación de medios de cultivo, esterilización e inoculación

2.1 Preparación de un medio de cultivo

El medio de cultivo que se preparo toma en consideración un crecimiento de 2g/l de biomasa. Como fuente de energía y carbono se utilizó lactosa, siendo así el sustrato limitante del cultivo junto a esto otros componentes que se encuentran en el Anexo C (Tabla C 1.1) ayudarán al crecimiento teniendo en cuenta que se encontraran en un 50 % de excesoCabe señalar que se utilizara extracto de levadura que permitirá mejorar el crecimiento del medio, asi entregara los requerimientos nutricionales a la célula.Para la preparación del medio de cultivo se utilizó la formula de rendimiento celular.

Y xs

= ∆ X−∆S = Y x

s

=%de nutirnetes%de biomasa

× f

Los componentes del Anexo C (Tabla C 1.1) se utilizaran para preparar 100 ml de este medio (esto se realizo por duplicado) en un matraz de volumen total de 500 mL. Además se utilizó tampón citrato para mantener un pH de 6,5 aproximadamente.

2.2 Esterilización

Para esterilizar los materiales de laboratorio y los componentes del medio de cultivo se utilizó la autoclave a 121 ° c durante 20 minutos Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura, pero se sabe que hay microorganismos que sobreviven a ciertas temperaturas del autoclave como los prione.

5

2.3 Inoculación

Para llevar a cabo la inoculación se debe adicionar bajo mechero las sales al matraz de 500ml que contiene la lactosa, mezclar bien y luego inocular a partir de un cultivo liquido que se nos proporcionó, en este caso la Kluyveromyces Marxianus. En este caso se adiciona un 10% del inoculo a la mezcla.

En el Anexo C se puede estudiar a fondo todos los cálculos experimentales para diseñar un medio de cultivo

3. Cinética de crecimiento celular y Consumo de lactosa de la levadura Kluyveromyces Marxianus

Figura 3. Cinética de crecimiento celular de la levadura Kluyveromyces Marxianus. Agitación a 200 rpm y 30°C. Muestras de 3 mL tomadas aproximadamente cada 45 minutos.

Como se puede observa en la gráfica de concentración Lactosa / Tiempo / Biomasa siendo lactosa (g/L) y biomasa (g/L) correspondientes al eje Y y respectivamente el tiempo (h) en el eje X (Anexo D), se puede definir que la lactosa fue consumida por el microorganismo (m.o.), pero no en su totalidad debido a la falta de tiempo en que realizamos la experiencia, debiéndose así haber tomado una mayor cantidad de muestras en un periodo de tiempo más extenso, porque el m.o. logra un crecimiento exponencial aproximadamente a las 8 hrs de incubación, quedando demostrado en la Fig.3 que no se puede observar todas las fases del crecimiento celular. Al asimilar la lactosa el m.o. se

6

visualizó que la biomasa aumento favorablemente, viendo este resultado por medio de la absorbancias que se consiguieron a través de la turbidimetría. No obstante cabe destacar, que en la primera muestra que se realizó a los 0,75 (h) de espera, se consiguió un decrecimiento de biomasa, por lo que se pudo haber originado por diversos factores, ya sea la mala manipulación de los instrumentos, como también el tiempo en se realiza la incubación, que debe realizarse lo más rápido posible para no interferir en el crecimiento celular. También se puede destacar que la medición en el tiempo 0 (h) pudo haber sido errónea, por el motivo que pudo haberse encontrado la celda del espectrofotómetro de manera defectuosa o mal manipulada, la cual arrojó una absorbancia mayor a lo que debía ser originalmente. Por ende, sí en las muestras siguientes se siguió una tendencia creciente, con respecto a la regresión que se debiese cumplir. Se puede decir también que la muestra obtenida a las 2,25 (h) nuevamente no se registró una predisposición a crecer, por lo que pudo haber sido afectada por factores mínimos, como una mala dilución pero que no perturba considerablemente el crecimiento.Gracias a los datos obtenidos según el anexo, no podemos dar con certeza que el µ obtenido sea el correcto, ya que según el tiempo empleado, el periodo de incubación que se debe regir es de 8 (h) aproximadamente, por lo que en nuestra experiencia no podemos apreciar el verdadero crecimiento exponencial porque nuestro tiempo ejecutado fue de sólo 3,75 (h), o sea llegando ni siquiera a la mitad de la incubación original. Por ende el microorganismo presento fases de latencia, que es cuando se adaptan al medio de cultivo y de crecimiento celular, la cual el ritmo de reproducción de células ocurre a ritmo constante, pero siendo éste último no en su totalidad.Con la gráfica resultante de los datos que se presentan en el anexo, el µ resultante de la ecuación de la Fig. 3.1. Resultó ser de 0,3126 (1/h). Se debe recalcar también que le punto 0,0 no fue considerado para la obtención del µ, ya que se aleja demasiado de los parámetros y de la linealidad de la regresión.

Figura 3.1. Velocidad de Crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus

7

Conclusiones

Como primera conclusión podemos decir se realizaron todos los experimentos según lo especulado en la guía entregada, obteniendo así resultados conformes y adecuados a los establecido para la determinación de los distintos parámetros para cada objetivo.En general se cumplieron todos los objetivos, tanto como para la realización de las curvas de calibrado, diseño de medio cultivo y cinética de crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus. Sobre las curvas de calibrado se logro establecer una regresión lineal aceptable, producto de la linealidad de los puntos y su respectivo R. Se pudo ratificar que la experiencia realizada en el laboratorio fue correcta, ya que al hacerla por duplicado y analizando su ecuación de la recta, se confirma que con sus intercepto muy cercanos a 0 y sus pendientes muy similares.Por otro lado, en la preparación del diseño de medio de cultivo celular estéril, nos pudo percatar que resulto correctamente a lo esperado, viendo así un notorio cambio de color y una apreciación en la suspensión de microorganismos analizando cualitativamente por turbidez.Cuando sembramos el microorganismo, Kluyveromyces Marxianus, en un medio de cultivo apropiado, el mismo comienza a dividirse activamente, empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo. Este proceso continúa hasta que un nutriente del medio se agota, pero en este caso de la experiencia no ocurre esto, ya que los nutrientes que le aplicamos al medio de cultivo, junto con su sustrato limitante, que es lactosa, no se acabaron en su totalidad quedando demostrado que el crecimiento no se detuvo.

8

Bilbliografía

Robert W. McGilvery. 1977. Azucares Reductores. Robert W. McGilvery. Biochemical Concept. 5ºta Edición. Editorial reverté, s.a.

Charles W. Bamforth. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. Charles W. Bamforth. 1º Edición. Editorial Wiley-Blackwell Publishing.

Pauline M. Doran.1998. Principios de Ingeniería de Los Bioprocesos.3ra Edición. Editorial Acribia.

ARAUJO, Karelen et al. 2007. Efecto de la concentración de lactosa sobre la cinética de crecimiento de Kluyveromyces marxianus var. marxianus y la producción de b-D-galactosidasa (E.C. 3.2.1.23). Rev. Téc. Ing. Univ. Zulia vol.30, n.1, pp. 64-73

9

ANEXOS

10

Anexo A

Curva de calibrado de lactosa por el método DNS

Concentración del estándar inicial de lactosa: 2(g/L)

Tabla A.1 Datos para la determinación de la curva de calibrado de lactosa por el método DNS

Tubo

Volumen de solución

estándar de lactosa (ml)

Volumen de agua

adicionada (ml)

Concentración de lactosa

(g/L)Absorbanci

a 1Absorbanci

a 21 1 3 0,5 0,16 0,1422 1,6 2,4 0,8 0,19 0,2093 2,2 1,8 1,1 0,347 0,3344 2,8 1,2 1,4 0,46 0,3615 3,4 0,6 1,7 0,588 0,5596 4 0 2 0,74 0,593

Absorbancia de muestra problema de lactosa: 0,114Muestra no fue diluida

Absorbancia medida 540nm

Tabla A.2 promedio y desviación estándar de datos

Tubo PromedioDesviación

estándar1 0,151 0,012727922 0,1995 0,013435033 0,3405 0,009192394 0,4105 0,070003575 0,5735 0,02050616 0,6665 0,1039447

Promedio y desviación estándar entre las distintas absorbancias obtenidas para cada tubo

11

Anexo B

Curva de calibrado de biomasa

Tabla B1.1.- Datos de absorbancia para la determinación de la curva de calibrado de biomasa

Tubo Volumen de

muestra (ml)

Volumen de agua

(ml)Absorbancia

1Absorbancia

2Concentración

1Concentración

21 1 3 0,651 0,765 0,146 0,2452 0,9 3,1 0,645 0,615 0,132 0,2213 0,8 3,2 0,545 0,580 0,117 0,1964 0,7 3,3 0,520 0,552 0,102 0,1725 0,6 3,4 0,419 0,401 0,088 0,1476 0,5 3,5 0,354 0,358 0,073 0,1237 0,3 3,7 0,188 0,187 0,044 0,0748 0,2 3,8 0,130 0,137 0,029 0,049

Absorbancia de muestra problema de lactosa: 0,569Muestra fue diluida 4 veces (FD= 4)Absorbancia medida a 650 nm

Tabla B2.1.- Promedio y desviación estándar de datos

Tubopromedio

concentraciones

promedio absorbancia

sDesviación estándar

1 0,196 0,708 0,0812 0,176 0,630 0,0213 0,157 0,563 0,0254 0,137 0,536 0,0235 0,117 0,410 0,0136 0,098 0,356 0,0037 0,059 0,188 0,0018 0,039 0,134 0,005

Promedio entre las distintas concentraciones y absorbancias obtenidas para cada tubo; desviación estándar calculada para las distintas absorbancias obtenidas

12

Tabla B3.1. Datos de peso seco para determinación de curva de calibrado de biomasa

Anexo C

CINÉTICA DE CULTIVO CELULAR

Tabla C1.1 Preparación de un medio de cultivo

13

Número de

Capacho

Peso Capacho seco (g)

Volumen muestra

(ml)

Peso Capacho +

muestra seca (g)

Peso Muestra

(g)

Concentración (g/L)

1 0,3888 20 0,4005 0,0117 0,58515 0,2786 20 0,2982 0,0196 0,98

X (g/L) 2,0

NutrienteFuente

deNº

ÁtomosPA PM

% en

nutriente

% en célula

Yx/s So (g/L)

Masa a agregar para 200

ml

C12H22O11 C 12 12 342,3 42.1 48 0,44 4,55 0,91(NH4)2SO4 N 2 14 132,1 21.2 7,5 2,83 0,71 0,14KH2PO4 P 1 39,1 136,1 28.7 2,5 11,48 0,17 0,034

MgSO4*7H2O Mg 1 24,3 246,4 9.86 0,3 32,87 0,061 0,012

Tabla C1.2 Masa con exceso 50%

Nutriente

Masa con 50% de exceso

C12H22O11 0,91(NH4)2SO4 0,213

KH2PO4 0,051

MgSO4*7H2O

0,018

Para preparar este medio de cultivo se realizo de la siguiente manera. con la levadura

1. Para el cálculo de % de nutrientes se utiliza la siguiente ecuación :

%Nutriente=Nº deatomos× P APM

×100%

14

El numero de átomos referente a la fuente de algún elemento del nutriente que se le aplicara al medio

2. Para el cálculo de Y x/s se aplica la ecuación de rendimiento dada por

Y xs

=%de nutirnetes%de biomasa

× f

Este factor esta dado si el microorganismo tiene facultades tanto como aerobias o anaerobias:

Factor anaerobio: 0.1

Factor aerobio: 0,5 – 0,6

Factor de otros componentes: 1

3. Cuando se quiere calcular la concentración de sustrato , aplicamos la ecuación de rendimiento dada de la siguiente manera

Y xs

= ∆ X−∆S Teniendo así que

S0−S=X−X0Y xs

En esta experiencia nuestra concentración de biomasa inicial (Xi) es 0 g/l y nuestra concentración de biomasa final serán los 2 g/l.

La concentración inicial de sustrato es la que queremos saber , sabiendo que la final a la correspondiente es 0 ya que el medio aun no empieza su actividad

4. Gracias a los cálculos de concentraciones de sustrato de cada fuente de los correspondientes nutrientes se pudo sacar la masa agregar para nuestros 200 ml (0,2L )del matraz , así con este volumen se pudo analizar que Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L

5. Por ultimo en el experimento todos nuestros nutrientes estarán a un exceso de 50 % descartando el sustrato limitante que será la lactosa

Ejemplo para el cálculo de la masa que se agregara

Para el sustrato limitante como c12h22o11 y fuente de C utilizaremos el factor para un microorganismo aerobio, 0,5.

15

Por tanto esto será de la siguiente manera siguiendo los pasos anteriores.

%Nutriente=Nº deatomos× PAPM

×100%

% nutrientes: 12*12 /342,3 *100% = 42,1 %

Y xs

=%de nutirnetes%de biomasa

× f

Yx/s = (42,1 / 48)*0,5 = 0,44

S0−S=X−X0Y xs

So = 2g/l / 0,44 = 4,55 g/L

Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L Masa agregar (g) = 4,55 g/l * 0,2 L = 0,91 g ( no se saca el exceso porque es el sustrato limitante)

Para el Fosfato Monopotásico (KH2PO4) con un factor de 1 porque es otro componente

%Nutrie nte=Nº de atomos×PAPM

×100%

% nutrientes: 1*39,1 /136,1 *100% = 28,71 %

Y xs

=%de nutirnetes%de biomasa

× f

Yx/s = (28,7/2,5 )*1 = 11,48

S0−S=X−X0Y xs

So = 2g/l / 11,48 = 0,17 g/L

Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L Masa agregar (g) = 0,17g/l * 0,2 L = 0,034g

Con el 50 % de exceso nos quedaría en 0,051 g que tenemos que agregar a la muestra de este nutriente

16

Anexo D

Cinética de crecimiento celular

Tabla D1.1.- Determinar concentración de biomasa

Tiempo T (hrs) Absorbancia 1 Absorbancia 20 0 0,096 0,095

45 0,75 0,047 0,0571:30 1,5 0,11 0,0832:15 2,25 0,089 0,0953:00 3 0,132 0,1523:45 3,75 0,177 0,16

Muestra fue diluida 3 veces (FD 3)Absorbancia a 650 nm

Según Ecc. Figura.

Tabla D1.2

Concentración 1 Concentración 2

Promedio concentracione

sDesviación estándar

0,090 0,089 0,089 0,0010,050 0,058 0,054 0,0060,101 0,079 0,090 0,0150,084 0,089 0,087 0,0030,119 0,135 0,127 0,0110,155 0,141 0,148 0,010

17

Tabla D2.-Determinar consumo de lactosa

Tiempo (h) T(hrs) Absorbancia 1

Absorbancia 2 FD

0:00 0 0,13 0,172 100:45 0,75 0,166 0,231 51:30 1,5 0,352 0,37 3,32:15 2,25 0,55 0,617 23:00 3 0,66 0,651 1,53:45 3,75 0,94 0,95 1

Procedimiento del método de DNS (figura y anexo A)

Según ecuación

Concentración 1

Concentración 2

Promedio concentraci

ones

Desviación

estándar

5,408 6,456 5,932 0,7413,153 3,964 3,559 0,5743,613 3,761 3,687 0,1053,178 3,512 3,345 0,2362,795 2,762 2,778 0,0242,562 2,587 2,575 0,018

Tabla D3.- Determinación de µ

Ln(X/X0) T0,000 0,000-0,493 0,7500,013 1,500-0,028 2,2500,354 3,0000,509 3,750

18