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INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6. “Desarrollo de normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en alimentos”.

1

Informe técnico de la

Demanda Específica 6.

“Desarrollo de normatividad y

métodos para detección y

medición de organismos

microbiológicos en alimentos”

Del proyecto sectorial

SAGARPA-CONACYT 2011-

09-172352


2

ÍNDICE

Alcance 6

Justificación del proyecto 8

Discusion y guía del manual integrado de la normatividad y métodos de detección y

medición de organismos microbiológicos en alimentos como vegetales y frutas

frescas, productos del mar y cárnicos de animales terrestres

17

Conclusiones de los resultados de las encuestas realizadas a laboratorios de México

que analizan microorganismos patógenos en alimentos

58

Programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos

en beneficio del sector productivo de cárnicos, productos de frutas y a base de

vegetales

62

Recomendaciones para establecer un programa de verificación interno en México 71

Propuestas de mejora a la normatividad para la detección 79

de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus 79

de Salmonella spp 81

de Listeria monocytogenes 83

de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas 84

de Staphylococcus aureus

84

PROPUESTA DE NORMAS 85

Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Método para la cuenta e identificación

de Escherichia coli diarreogénica.

125

Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Método para la detección de Vibrio

cholerae enterotoxigénico

181

CONCLUSIONES 200

BIBLIOGRAFÍA 202


3

PREFACIO

El presente informe de normatividad y métodos para la detección y medición de microorganismos

patógenos en alimentos fue integrado y compilado por el Centro Nacional de Metrología con el

apoyo del Proyecto Sectorial SAGARPA-CONACyT 2011-09-172352, Demanda Específica 6.

“Desarrollo de normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos

en alimentos”, el cual fue realizado en colaboración con el Centro de Investigación en Alimentación

y Desarrollo, A.C. y tuvo aportaciones honoríficas de distinguidos investigadores y usuarios de

México.

Centro Nacional de Metrología

Responsable Técnico: Dr. Yoshito Mitani Nakanishi

Responsable Administrativo: C.P. Guillermo Salomón Villalobos Castrejón

Director General del CENAM. Dr. Héctor Nava Jaimes

CENAM

km 4.5 Carretera a los Cués,

Municipio El Marqués, Querétaro.

C.P. 76246 México Tel. (442) 2110500 al 04

Correo electrónico: [email protected]

Compilado y escrito por:

Dra. Melina Pérez Urquiza. Coordinador Científico. Líder de la Demanda Específica 6

Dr. Aldo Amaro Reyes, profesor investigador de la UAQ, contratado por CENAM con fondos del

proyecto.

Dra. Nohelia Castro del Campo. CIAD Culiacán

M.en C. Leobardo Montoya Rodríguez. CIAD Mazatlán

Esta publicación ha sido revisada por:

Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro

Q.A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico

®2013 por el Centro Nacional de Metrología

Secretaría de Economía

Primera Edición consta de 500 ejemplares

Reservado todos los derechos

ISBN: 978-607-96162-5-0

Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada en un sistema o

transmitida, en ninguna forma o en ningún medio, electrónico, mecánico, fotocopia, grabado, sin el

permiso de los copropietarios. Para simplificar la información, se han utilizado los nombres de los

productos comerciales. Este manual no pretende recomendar productos nombrados o ilustrados,

como tampoco existe una crítica implícita de productos similares que no se mencionan o ilustran.

mailto:[email protected]


4

Agradecimientos por su contribución en la elaboración del presente informe técnico

UAQ

Dra. Blanca García Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autónoma de Querétaro

CIAD Culiacán

Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz

Dra. Josefina León Félix

Dr. Osvaldo López Cueva

Dra. Hilda Karina Ramírez Medina

QFB Célida Isabel Martínez Rodríguez

QFB Jesús Hector Carrillo Yáñez

Dra. Nohelia Castro del Campo

CIAD Mazatlán

Dr. Miguel Betancourt Lozano

M.C. Leobardo Montoya Rodriguez

M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez

Dr. Bruno Gómez-Gil Rodríguez Salas

Dra. Sonia Araceli Soto Rodríguez

Dr. Omar Calvario Martínez

Dra. Lorena Olivia Noriega Orozco

Dra. Maribel Jiménez Edeza

M. en C. Maria Eugenia Ménez Robles


5

CENAM

Dr. Yoshito Mitani Director General de Metrología de Materiales

Q.en A. Judith Sainz Uribe Coordinador Científico

Dra. Mariana Arce Osuna Director de Análisis Orgánico

M.C. Judith Rivera Mellado contratada por CENAM con fondos del proyecto

IIA Blanca Erika Alvarez Nieves contratada por CENAM con fondos del proyecto

Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura:

p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez. Instituto Tecnológico de Celaya

p.IBQ Alma Liliana Villarreal Cásares. Instituto Tecnológico de Durango


6

ALCANCE

En este volumen se presentan:

Las conclusiones y sugerencias resultado del Proyecto

1. En el estado actual, las metodologías microbiológicas nacionales para el análisis

microbiológico de productos cárnicos, frutas, verduras y marinos, en comparación con las

internacionales, (metodologías propuestas y validadas por organismos de reconocimiento

internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de técnicas de biología

molecular, pruebas automáticas y ensayos rápidos mediante kits comerciales, pero si son

concordantes ó parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologías

tradicionales de identificación bioquímica y medios selectivos.

2. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para análisis de

microorganismos patógenos de los alimentos y se proporciona el fundamento científico y la

factibilidad técnica en relación a la actualización de la normatividad nacional y su

aplicación referente a estudios microbiológicos en productos cárnicos, frutas, verduras y

marinos.

3. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad

de los alimentos, y se sugiere su adopción en México.

4. Una vez considerado que la presentación de las normas internacionales se realiza por

patógeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de

Norteamérica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado

por Estados Unidos de Norteamérica, se sugiere elaborar un manual con los métodos de

determinación de los patógenos en las diferentes matrices, al cual se podría hacer referencia

en las normas, lo que facilitaría y mantendría actualizados los métodos de medición sin la

necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualización de una

norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podría contener los

métodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados

Unidos de Norte América, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el

usuario pueda elegir el adecuado para su propósito, sin restringirlo a un kit, equipo ó

método especifico, sin embargo sería un requisito el utilizar patrones de medición ó

Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad,

incertidumbre y calidad del resultado de la medición realizada. b) En el caso de seguir el

modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patógeno para las

diferentes matrices alimentarias de interés, en lugar de tener una norma por producto para

los diferentes patógenos.

5. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluación,

validación y aplicación de nuevos métodos para la detección de Vibrio cholerae, Vibrio

paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las

diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados

Unidos de Norteamérica.

6. Se realizó un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicación actual y un

estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de

investigación, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector

productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluación de la inocuidad de los

alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas


7

nacionales sobre la detección y/o cuantificación de microorganismos patógenos en

alimentos en sus diferentes matrices.

7. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente sección del

BAM y con los métodos de análisis reconocidos a nivel internacional para la determinación

de los patógenos de interés requeridos para los productos exportables hacia los Estados

Unidos de Norteamérica y/o los distintos socios comerciales de México.

8. Se sugiere la implementación de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la

experiencia de proveedores de ensayos de análisis de microorganismos patógenos de los

alimentos internacionales.

9. Se propone trabajar en las comparaciones del recién formado grupo de trabajo de

microbiología del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales

tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la

determinación de los patógenos motivo de este estudio en alimentos.

Metodología empleada:

1. Revisión de normas nacionales e internacionales sobre las metodologías microbiológicas

que involucran la detección de microorganismos patógenos como Salmonella spp,

Escherichia coli, Listeria Monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli

O157:H7 y productoras de shiga toxinas.

NOMs SSA: 109, 110, 112, 113, 114, 115, 143 y 242 , que para el caso de productos

del mar se complementan con más de 20 NOM ó NMX (NOM-001-STPS-1993, NOM-

002-SCFI-1993, NOM-051-SCFI-1994, NOM-030-SCFI-2006, NOM-027, 040, 092,

116, 117, 120, 128, 129, 130 y NMX-F-083, 088, 144, 254, 304, 314, 315).

Normas internacionales: ISO (se revisaron 34 normas aplicables del compendio de

normas UNE sobre microbiología de los alimentos), AOAC, BAM, BS, CFIA (Agencia

Canadiense de Inspección de Alimentos por sus siglas en inglés), y del CODEX.

2. Encuestas a 35 laboratorios de México que realizan análisis de microorganismos patógenos

en alimentos

3. Revisión de programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los

alimentos en beneficio del sector productivo de cárnicos, productos de frutas y a base de

vegetales

4. Visita a los laboratorios de USDA, NIST, LGC y NIBSC

5. Resultados:

a. Propuestas de mejora a la normatividad existente (NOM) referente a los 5

patógenos motivo de estudio y

b. propuesta de dos normas de la traducción al castellano de las establecidas en el

Manual Analítico de Bacteriología

i. Método para la cuenta e identificación de Escherichia coli diarreogénica

ii. Método para la detección de Vibrio cholerae enterotoxigénico

c. Algunas Propuestas adicionales. Ver propuestas en las páginas 76-197

Los entregables son:

Un Informe técnico que describe las actividades y los hallazgos del proyecto “Desarrollo de

normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en

alimentos”, así como sugerencias y propuestas de mejora regulatoria

Un Manual de Normas


8

Compendio de las normas y métodos estandarizados en México y las traducciones al

castellano de las aplicables de nuestros principales socios comerciales como son las

presentadas en el Manual Analítico de Bacteriología (BAM por sus siglas en Ingles) de

Estados Unidos de Norte América, las guías ISO de la Comunidad Europea y las normas

británicas del Reino Unido, para los 5 patógenos motivo de estudio en este proyecto:

Salmonella spp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus

aureus y E. coli O157:H7 y productoras de shiga toxinas.

JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema cada vez más importante a

nivel internacional debido al intercambio comercial y al movimiento de personas entre los

diferentes países. Se estima que tres millones de personas en los países desarrollados y en desarrollo

mueren cada año a consecuencia de ellas y que muchos millones más se enferman (FAO, 2012). La

mayoría de estas enfermedades son ocasionadas por los géneros bacterianos, considerados

patógenos como Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli O157,

Listeria monocytogenes, entre otros.

Con la finalidad de garantizar la inocuidad de los alimentos y proteger a los consumidores los

países han implementado sistemas nacionales de control de los alimentos con una base oficial y de

carácter obligatorio. Dichos sistemas aseguran también que los alimentos importados cumplen con

los requisitos nacionales. En Estados Unidos de América, por ejemplo, la Food and Drug

Administration (FDA) firmó recientemente, en enero del 2012, la ley denominada Food Safety

Modernization Act. Esta ley provee a la FDA de herramientas para tratar a los alimentos importados

con los mismos estándares de calidad que los impuestos para los alimentos locales.

El entorno mundial del comercio de productos alimenticios impulsado por las exigencias de los

consumidores y el aseguramiento de la inocuidad para la prevención de las enfermedades, impone

numerosas obligaciones a los países, en cuanto al fortalecimiento de sus sistemas de control de los

alimentos que incluyen: la legislación alimentaria, la inspección de los alimentos, los análisis

(laboratorios oficiales), la gestión del control de los alimentos y la información, educación y

comunicación.

El panorama actual en materia de inocuidad alimentaria presenta varias razones que justifican la

necesidad de unificar la normatividad mexicana actual en materia de detección de microorganismos

patógenos con las normas internacionales vigentes. Algunas de ellas son las siguientes:

Los sistemas de control alimentario de los países desarrollados presentan barreras técnicas que

dificultan el comercio internacional de productos agropecuarios mexicanos y productos derivados

de la pesca.

Aunado a ello, la mayoría de las Normas Oficiales Mexicanas que establecen la metodología para la

determinación de microorganismos patógenos en alimentos no han sido actualizadas desde que

fueron publicadas en los años noventa (Ver Tabla 1). A excepción de la norma NOM-242-SSA1-

2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados.

Especificaciones sanitarias y métodos de prueba, que fue publicada en el año 2010. Sin embargo,

debe considerarse, que aunque su revisión se realizó en 2010, esta norma hace referencia a los

métodos y procedimientos microbiológicos propuestos en otras normas que no han sido actualizadas


9

y por lo tanto las normas actualmente utilizadas no contemplan las ventajas del uso de la tecnología

moderna, lo cual representa una serie desventaja que afecta no solo a los productores, sino también

a los consumidores, es decir a todos los usuarios

Tabla 1. Fecha de publicación de algunas Normas Oficiales Mexicanas para el análisis de

microorganismos patógenos en los alimentos y el tiempo en años que las mismas llevan sin

actualizarse.

Normas Oficiales Mexicanas Fecha de

publicación

Tiempo en años

sin actualización

hasta el 2012

NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación

de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.

10 de mayo de

1995

17

NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la

cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

10 de mayo de

1995

17

NOM-143-SSA1-1995, Bienes y servicios. Método de

prueba microbiológico para alimentos. Determinación de

Listeria monocytogenes.

31 de octubre

de 1997

15

NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y

dilución de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico.

10 de mayo de

1995

17

NOM-109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos

para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos

para su análisis microbiológico.

26 de mayo de

1994.

18


determinación de Salmonella en alimentos.

10 de mayo de

1995

17


determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

10 de mayo de

1995

17

NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de

la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados.

Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.

3 de

noviembre de

2010

2

Esta situación persiste en nuestro país, a pesar de que la Ley Federal sobre Metrología y

Normalización (LFMN) establece en su Artículo 51 que: Las normas oficiales mexicanas deberán

ser revisadas cada 5 años a partir de la fecha de su entrada en vigor.

Otra razón que justifica la actualización de las normas es que la mayoría de ellas no presenta

concordancia con las normas internacionales, situación que explica por qué muchos productos

mexicanos no pueden ser comercializados a nivel internacional ya que no cumplen con los

estándares requeridos por ellos. En la actualidad la única norma que tiene concordancia con normas

internacionales es la NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos,

refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.

La LFMN en el Artículo 51-A establece que:

Para la elaboración de las normas mexicanas se realizará lo siguiente:


10

… II. Tomar como base las normas internacionales, salvo que las mismas sean ineficaces o

inadecuadas para alcanzar los objetivos deseados y ello esté debidamente justificado…

A diferencia de las normas mexicanas, las normas internacionales han sido actualizadas más

recientemente. Por ejemplo, los procedimientos de análisis compilados en el Bacteriologycal

Analytical Manual (BAM) publicado por la Food and Drug Administration han sido revisados

desde el 2001 y la revisión más reciente es del 2011.

Tabla 2. Comparación de la fecha de revisión de las Normas para detección de microorganismos

patógenos en alimentos Nacionales e Internacionales.

Aplicación de

la Norma

Norma Oficial

Mexicana

(NOM)

Comité Europeo

de

Normalización-

Asociación

Española de

Normalización y

Certificación

(UNE/ISO)

Bacteriological

Analytical Manual

(BAM)

British Standard

Institution (BS)

Salmonella 114-SSA1-

1994

Revisión 1995

6579:2002

Revisión 2003

Capítulo 5.

Salmonella.

Revisión 2011

Listeria

monocytogenes

143-SSA1-

1995

Revisión 1997

11290-1:1997

Revisión 1997

11290-2:2000

Revisión 2000

Capítulo 10.

Detección y recuento

de Listeria

monocytogenes en los

alimentos.

Revisión 2011

Protocolo:

Confirmación

simultánea de especies

aisladas de Listeria y

L. monocytogenes por

PCR en tiempo real.

Revisión 2011

Staphylococcus

aureus

115-SSA1-

1994

Revisión 1995

6888-1: 1999

Revisión 2000

6888-2:1999

Revisión 2000

6888-3:2003

Revisión 2003

Capítulo 12

Staphylococcus

aureus

Revisión 2001

5763:Part 7:1983

Revisión 1983

E coli O157 16654:2002

Revisión 2002

Escherichia coli

diarreogénica

Capitulo 4ª

Escherichia coli

diarreogénica.

Revisión 2011

Bacterias

coliformes y E.

coli

112-SSA1-

1994

113-SSA1-

1994

16654:2002

Revisión 2002

Capítulo 4. Recuento

de Escherichia coli y

bacterias coliformes.

Revisión 2002

5763:Part13:1989

Revisión 1989

5763:Part 10:1993

Revisión 1993


11

Revisión 1995

Vibrio NOM-242-

SSA1-2009

Revisión 2010

Capítulo 9. Vibrio.

Revisión 2004

5763:Part14:1991

Revisión 1991

Procedimientos

para la toma,

manejo y

transporte de

muestras

109-SSA1-

1994

Revisión 1994

Capítulo 1: Muestreo

de alimentos y

preparación de la

muestra

homogeneizada.

Revisión 2003

5763:Part 0:1986

Revisión 1986

Preparación y

dilución de

muestras

110-SSA1-

1994

Revisión 1995

6887-1

Revisión 2000

Capítulo 1: Muestreo

de alimentos y

preparación de la

muestra

homogeneizada.

Revisión 2003

5763:Part 0:1986

Revisión 1996

Las normas Mexicanas aplicables a la detección de microorganismos patógenos en alimentos para

consumo humano proponen métodos convencionales basados en crecimiento en medios de cultivo,

aislamiento, identificación bioquímica y en ocasiones serología. Sin embargo, la detección rápida

de patógenos en alimentos es crítica ya que con ella se asegura a los consumidores. En algunas

normativas internacionales se ha establecido el uso de métodos rápidos, término subjetivo usado

para describir la variedad de pruebas que ofrecen una detección e identificación más rápidas, más

convenientes, sensibles y más específicas, como “kits” bioquímicos, pruebas de anticuerpos,

pruebas basadas en ADN y ensayos que son modificaciones de pruebas convencionales para

acelerar los análisis.

La mayoría de los “kits” bioquímicos miniaturizados requieren de (18 a 24) horas de incubación,

con excepción de algunos en los que los resultados pueden leerse en 4 horas. Han sido diseñados

para identificar bacterias entéricas, pero existen también los que permiten identificar a

Campylobacter, Listeria, anaerobios, bacterias Gram-negativas no fermentativas y bacterias Gram-

positivas (BAM, 2001).

La alta especificidad de la unión anticuerpo-antígeno y la versatilidad de esta reacción, ha facilitado

el diseño de una gran variedad de ensayos y formatos de anticuerpos. Son 5 los formatos de ensayos

de anticuerpos más utilizados. El más simple es la aglutinación látex (LA), en la que se usan

anticuerpos cubiertos de látex coloreado o partículas doradas para una identificación serológica o un

aislado de cultivos puros de bacterias de los alimentos. En la inmunodifusión, una muestra

enriquecida es colocada en una matriz de gel con anticuerpos; si el antígeno específico está

presente, se forma una línea de precipitación. El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

(ELISA) es el formato de ensayo de anticuerpos más utilizado para la detección de patógenos en

alimentos. En este ensayo, un anticuerpo está ligado a una matriz sólida y es usado para capturar al

antígeno presente en un cultivo de enriquecimiento y un segundo anticuerpo conjugado a una

enzima es usado para su detección. Las paredes de los pozos de las placas “microtiter” son los

soportes sólidos más utilizados. (BAM,2001). En la separación inmunomagnética (IMS) se usan

anticuerpos acoplados a partículas magnéticas para capturar patógenos del medio de

preenriquecimiento. Esta tecnología puede sustituir los enriquecimientos selectivos, pero en lugar

de usar antibióticos o reactivos fuertes que puedan causar estrés, se usa un anticuerpo para capturar

un antígeno.


12

La inmunoprecipitación o inmunocromatografía es otro formato de anticuerpo. Es un procedimiento

“sándwich”, como el ELISA, pero en lugar de un conjugado enzimático, la detección del anticuerpo

es acoplada a una cuenta de látex coloreada a oro coloidal.

Los métodos basados en ADN y anticuerpos comenzaron a surgir en los años ochenta cuando la

investigación básica fue aplicada en áreas como la biotecnología. Existen varios formatos de

ensayos basados en ADN, pero únicamente las sondas, el PCR y los bacteriófagos han sido

desarrollados comercialmente para detectar patógenos en alimentos (BAM,2001).

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método en el que fragmentos cortos de ADN

(sondas) o primers son hibridizados en una secuencia específica, la cual es amplificada

enzimáticamente por una enzima conocida como Taq polimerasa usando un termociclador.

Teóricamente el PCR puede amplificar una copia simple de ADN en un millón de copias en menos

de 2 horas. Sin embargo, la presencia de inhibidores en los alimentos y en los medios de cultivos

pueden disminuir la eficiencia de la amplificación, por lo que la extrema sensibilidad del PCR se ve

reducida cuando se usa en pruebas de alimentos (BAM, 2001).

Los métodos de detección e identificación de patógenos microbianos, basados en el ADN y en la

técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) -método molecular, ofrecen ventajas tanto

para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiológica de los alimentos

continúa suscitando gran preocupación entre todos los componentes de la cadena alimentaria, del

campo a la mesa (EUFIC, 2000).

Los métodos moleculares necesitan de más presupuesto, ya que parte del proceso es automatizado,

sin embargo tienen mayor sensibilidad para detectar e identificar microorganismos a través de

pruebas simples y específicas y se realiza en pocas horas. En México se ha limitado el uso de

métodos moleculares a la investigación privada, porque aún no se han validado como métodos

oficiales (Carrillo-Inungaray et al., 2011).

Por otro lado, el uso de los métodos moleculares ha recibido un gran impulso a través de la creación

de “PulseNet”, red de subtipificación molecular creada por el CDC (Center for Disease Control), la

asociación de los departamentos de salud estatal y la Asociación de Laboratorios de Salud Pública

(APHL) de Estados Unidos, que se basa en la identificación de ADN de bacterias causantes de

enfermedades relacionadas con alimentos. El proyecto está siendo implementado primero para

Escherichia coli 0157-H7 y luego será extendido para incluir Salmonella typhimurium y otros

patógenos relacionados con los alimentos tales como Shigella, Listeria o Campylobacter. Todos los

participantes utilizarán equipos y protocolos estandarizados y se compilará una base de datos

centralizada de patrones de ADN (“huellas genéticas del ADN”) en un servidor computacional en el

CDC. A través de la participación del Departamento de Agricultura y la Food and Drug

Administration de los Estados Unidos, la base de datos incluirá huellas genéticas derivadas de

alimentos contaminados y de aislados clínicos (Pulsenet, Consultado el 15 de mayo de 2012.

http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).

Esta metodología convenientemente estandarizada y con adecuados controles de calidad, tiene la

gran ventaja de poder ser realizada en diferentes laboratorios al mismo tiempo, las fotografías de los

fragmentos de ADN obtenidos pueden ser analizados en el o los laboratorios que lo generan y

enviados electrónicamente a una base de datos habilitada para comparar los perfiles de las cepas

aisladas en diferentes países y regiones en tiempo real. Esta secuencia de eventos organizados en

una red regional-internacional, con participación de los sectores de salud humano, animal y de

alimentos, posibilita la detección temprana del brote, en particular en brotes dispersos y la respuesta

rápida y oportuna a las infecciones por patógenos bacterianos transmitidos por alimentos (Pulsenet,

Consultado el 15 de mayo de 2012.

http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet


13

http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet).

Siguiendo la tendencia de implementar metodología molecular al análisis de microorganismos

patógenos de los alimentos, se han incorporado análisis moleculares en algunos capítulos del

manual analítico bacteriológico (Bacteriological Analytical Manual, BAM, 1998) como podemos

apreciar en los siguientes ejemplos:

Capítulo de Vibrio (BAM, 1998).

… una serie de cambios sustanciales se han hecho en esta versión del capítulo referente a Vibrio en

donde se incluye un mayor énfasis hacia los métodos moleculares, tales como hibridación de ADN

de colonia y PCR para la identificación y caracterización de Vibrio

spp patógenos. Con la adición de estas opciones, se ha puesto menos énfasis en algunos de los

métodos más antiguos y en algunos casos, en secciones que requieren reactivos peligrosos o

difíciles de obtener (es decir O/129 reactivo) han sido eliminadas…

…estas nuevas tecnologías tienen la ventaja de una mayor detección e identificación rápida y se

incluyen en aquellos laboratorios con el equipo adecuado. La identificación basada en la PCR

ofrece un análisis en un día, mientras que los procedimientos con sondas de genes, incluyendo los

que se presentan en este capítulo, son análisis que tardan de uno a dos días. El procedimiento

tradicional cualitativo y la técnica del número más probable (NMP) requieren de cuatro a siete días

para completarse…

Adicionalmente en la página oficial de la FDA se encuentra descrito, además de la metodología

preferida estándar, las metodologías rápidas alternativas permitidas para la detección y aislamiento

de Listeria monocytogenes.

Capitulo Listeria y pruebas alternativas.

Los “kits” de detección rápida con sus respectivos medios de enriquecimiento pueden ser utilizados

para detectar la presencia de contaminantes de Listeria. Las cepas aisladas presuntivamente de

Listeria en agares selectivos pueden ser confirmadas por pruebas de identificación convencionales o

por una serie de pruebas de este tipo en forma de kit. Además, los aislamientos pueden ser

confirmados rápidamente como L. monocytogenes (o no) mediante el uso de “kits” de prueba

específicos. Por otro lado, la tipificación de aislamientos de L. monocytogenes para los aislamientos

de la FDA tienen que ser tipificados serológicamente, por electroforesis en gel de campo pulsado

(PFGE) y por ribotipificación (BAM, 1998).

Asimismo, revisando las características relevantes en la aplicación de análisis molecular de

patógenos en los alimentos, podemos generar un análisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y

amenazas (FODA) en donde se aprecian las características relevantes en la aplicación de esta

tecnología (Tabla 3).

Tabla 3. Análisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas del análisis molecular de

patógenos en los alimentos.

Fortalezas Debilidades

Especificidad (pueden detectar solo la molécula

o microorganismo de interés).

No distinguen entre organismos vivos y

muertos.

Sensibilidad (son capaces de detectar la

presencia de un solo microorganismo).

Se tiene que contar con conocimientos de

secuencias de nucleótidos específicas del

patógeno a diagnosticar.

Rapidez (se puede identificar un La mayoría de ensayos son cualitativos o semi

http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet


14

microorganismo en menos de 24 horas). cuantitativos.

Permiten estudiar las poblaciones microbianas

sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los

sesgos que pueden surgir con el cultivo de

microorganismos.

La mayoría de ensayos sólo detectan una

especie o muy pocas especies a un tiempo.

Ha permitido identificar nuevos

microorganismos, los cuales no había sido

posible su cultivo e identificación por técnicas

tradicionales.

Se desarrollan procedimientos con múltiples

etapas, lo que incrementa la posibilidad de

errores.

Permiten la detección de microorganismos

altamente patógenos, los cuales pueden ser

identificados muertos evitando así los riesgos de

infección del analista.

No permite el aislamiento del microorganismo

para la posterior detección de resistencia.

Útiles en situaciones clínicas donde los métodos

convencionales son muy insensibles (v.g.

durante la etapa asintomática de las infecciones

del VIH), muy lenta (cultivo micobacterial) o

muy complicados para ser usados a gran escala

(v.g. aislamiento viral).

La mayoría de los ensayos detectan sólo las

especies a que apuntan y presentan errores en

detectar especies no esperadas.

Monitoreo del surgimiento de mutaciones en el

genoma, por ejemplo, la selección de variantes

resistentes durante la terapia

antiviral/antibiótica.

Sesgos en PCR de amplio espectro debidos a

procedimientos de homogenización,

amplificación preferencial de ADN y extracción

diferencial de ADN.

Puede detectar microorganismos muertos.

En el caso de Staphylococcus aureus la bacteria

muere a temperaturas que no degradan la toxina

así la detección de la bacteria muerta es un

indicativo de la presencia de toxinas en la

muestra.

Oportunidades Amenazas

El alto costo de las técnicas moleculares tenderá

a bajar a medida que se incremente el uso de

estas técnicas.

La falta de estandarización de las técnicas

El problema de falsos positivos y falsos

negativos se puede solucionar si se incluye en

cada análisis un testigo positivo y un testigo

negativo.

La probabilidad de resultados falsos positivos

por contaminación con productos de

amplificados anteriores “Amplicones”, hace

necesario una cuidadosa evaluación de sus

resultados.

Pueden ser automatizadas (permiten tener un

diagnóstico en un menor tiempo y reducir los

costos).

La probabilidad de falsos negativos por la

presencia de inhibidores o inconvenientes en los

diferentes pasos de las técnicas.

No requiere de condiciones anaeróbicas

cuidadosamente controladas en la toma de la

muestra, transportación y manipulación.

Se requiere de personal altamente capacitado

para el desarrollo de las pruebas de

identificación.

Puede ser utilizada durante el tratamiento de un

antimicrobiano.

Se requiere equipo más específico para el

diagnóstico, lo cual eleva la inversión inicial.

Las muestras pueden ser congeladas para un

análisis posterior.

El ADN puede ser transportado entre

laboratorios fácilmente


15

Cocolina et al., 2011, Mandal et al., 2011, Velusamy et al., 2010, Rodríguez-Herrera et al., 2009,

Rojas y Herrera 2006.

Podemos apreciar que las fortalezas y oportunidades lograrían enmascarar a las debilidades y

amenazas en la aplicación del análisis molecular de patógenos en los alimentos.

Casi todos los métodos rápidos se diseñan para detectar un solo microorganismo blanco, lo cual lo

hace ideal para utilizarlo en programas de control de calidad y analizar rápidamente un gran número

de muestras de alimentos para la presencia de un patógeno en particular o una toxina. Un resultado

positivo por un método rápido sin embargo, es solo considerado como presuntivo y se debe

confirmar por los métodos estándar. Aunque la confirmación podría tardar varios días, esto podría

no ser una limitación de imposición, ya que la mayoría de los análisis de alimentos resultan

negativos (BAM, 2001).

Una de las ventajas que presentan estos métodos es que son más rápidos que los tradicionales, la

mayoría de ellos se puede hacer desde unos cuantos minutos hasta pocas horas. Sin embargo,

cuando son usados en el análisis de alimentos aún carecen de suficiente sensibilidad y especificidad

para una prueba directa. Por esta razón, las muestras de alimento requieren de un enriquecimiento

previo antes de ser analizados. Aunque el enriquecimiento es una limitante en términos del tiempo

del ensayo, provee beneficios como la dilución de los efectos de los inhibidores, la diferenciación

entre células viables y no viables y permite la reparación del estrés celular o daño celular causados

por los procesos a los que se someten los alimentos (BAM, 2001).

La evaluación de métodos rápidos ha mostrado que algunos tienen un mejor desempeño en ciertos

tipos de alimentos que otros métodos. Esto se puede atribuir principalmente a interferencias de los

componentes de la misma muestra, algunos de los cuales pueden ser especialmente complicados

para las tecnologías de los métodos rápidos. Por ejemplo, un ingrediente presente en el alimento

puede inhibir la hibridización del ADN o la acción de la Taq polimerasa, pero este mismo

ingrediente no tiene efecto en las interacciones antígeno anticuerpo o viceversa. Debido a que la

eficiencia de los métodos podría ser dependiente del alimento, se recomienda realizar estudios

comparativos para asegurar que un ensayo particular será efectivo en el análisis de ese tipo de

alimento.

La especificidad de los ensayos de ADN es dirigida por sondas cortas; así, un resultado positivo

basado en una sonda o cebador específico para el gen de una toxina solo indica está presente la

bacteria que contiene la secuencia de ese gen y que tiene el potencial de ser toxigénico. No

obstante, esto no indica que el gen está siendo expresado y que está presente la toxina.


16

Símbolos, acrónimos y abreviaturas

± más menos

/ signo de división

⁰C Celsius

% por ciento

1/d inversa de la dilución

ATCC American Type Culture Collection

ß beta

cbp cuanto basta para

CIP Culture International Production

cm centímetro

cm2 centímetro cuadrado

g gramo

h hora

kg kilogramo

l, L litro

lb libras

μm micrómetro

M molar

ml, mL mililitro

mm milímetro

min minuto

N normal

NCTC National Culture Type Collection

NMP número más probable

p peso

p. ejem. por ejemplo

pH potencial de hidrógeno

PM peso molecular

RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa

s segundo

UFC unidades formadoras de colonias

spp especies plurales

v volumen

x signo de multiplicación

NIBSC National Institute for Biological

Standards and Control

LGC Laboratory of the Government

Chemistry, Reino Unido

BS British Standards

CFIA (Agencia Canadiense de Inspección de

Alimentos por sus siglas en inglés)

ISO International Standards Organization


17

DISCUSIÓN Y GUIA DEL USUARIO DEL MANUAL INTEGRADO

DE LA NORMATIVIDAD Y MÉTODOS DE DETECCIÓN Y

MEDICIÓN DE ORGANISMOS MICROBIOLÓGICOS EN

ALIMENTOS COMO VEGETALES Y FRUTAS FRESCAS,

PRODUCTOS DEL MAR Y CÁRNICOS DE ANIMALES

TERRESTRES

NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS

MÉTODOS PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

Para la realización del manual se consultaron las siguientes normas oficiales y regulaciones

nacionales e internacionales relacionadas con los métodos para el análisis microbiológico de

alimentos en productos para consumo humano incluidos productos frescos de vegetales, frutas,

carne de animales terrestres y productos del mar (Ver Tablas 4 y 5).

Tabla 4. Normatividad nacional e internacional que rige los procedimientos para la toma, manejo y

preparación de las muestras de alimentos revisada para la realización del manual.

Objeto y campo de

aplicación Normas aplicables

Procedimientos para la toma,

manejo y transporte de

muestras

NOM 109-SSA1-1994

BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la

muestra homogeneizada

BS 5763: Part 0: 1986

Preparación y dilución de

muestras

NOM 110-SSA1-1994

UNE/ISO 6887-1

BAM Capítulo 1: Muestreo de alimentos y preparación de la

muestra homogeneizada

BS 5763: Part 0: 1986 NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de

Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Institución de Normas

Británicas.

Tabla 5. Normatividad nacional e internacional revisada para la realización del manual para

determinar microorganismos patógenos en alimentos de consumo humano y animal.

Objeto y campo de

aplicación Normas aplicables

Bacterias coliformes y

Escherichia coli

NOM 112-SSA1-1994

NOM 113-SSA1-1994

NOM-242-SSA1-2009

UNE/ISO 16654:2002


18

BAM Capítulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias

coliformes

BS 5763: Part13: 1989

BS 5763: Part 10: 1993

Escherichia coli O157 BAM Capitulo 4A. Escherichia coli diarreogénica

Listeria spp. y L.

monocytogenes

NOM 143-SSA1-1995

NOM-242-SSA1-2009

UNE/ISO 11290-1:1997

UNE/ISO 11290-2:2000

BAM Capítulo 10. Detección y recuento de Listeria

monocytogenes en los alimentos; Protocolo: Confirmación

simultánea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por

PCR en tiempo real.

Staphylococcus aureus

NOM 115-SSA1-1994

NOM-242-SSA1-2009

UNE/ISO 6888-1: 1999

UNE/ISO 6888-2:1999

UNE/ISO 6888-3:2003

BAM Capítulo 12. Staphylococcus aureus

BS 5763: Part 7: 1983

Salmonella spp.

NOM 114-SSA1-1994

NOM-242-SSA1-2009

UNE/ISO 6579:2002

BAM Capítulo 5. Salmonella

Vibrio

NOM-242-SSA1-2009

BAM Capítulo 9. Vibrio

BS 5763:Part14:1991 NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comité Europeo de Normalización-Asociación Española de

Normalización y Certificación, BAM: Manual Analítico Bacteriológico, BS: Institución de Normas

Británicas.

Normas oficiales y regulaciones nacionales e internacionales relacionadas con los métodos

para el análisis microbiológico de alimentos en productos frescos de vegetales, frutas, carne de

animales terrestres y productos del mar.

Ante la necesidad imperante de países en vías de desarrollo de actualizar su tecnología, equipos,

infraestructura y métodos de detección rápida y efectiva de microorganismos; utilizados para la

exportación de productos alimenticios a mercados que exigen el ingreso de alimentos inocuos para

su población y estableciendo en sus fronteras para lograrlo, de estrictos y rigurosos sistemas de

monitoreo de embarques alimenticios vía terrestre o marítima..

Ante esta problemática, en la que el exportador requiere cumplir con los criterios de aceptación del

país que importará su producto, exige a sus gobiernos planes, programas y estrategias que le


19

permitan estar a la vanguardia en métodos para el análisis microbiológico del alimento a exportar y

le asegure el ingreso de su producto en esos mercados.

México no es la excepción, que teniendo tratados bilaterales y de libre comercio, sus productos

deben cumplir con los criterios de aceptación del mercado importador, por lo que se ve en la

necesidad de apoyar a sus productores con metodologías actualizadas, rápidas y precisas; y así dar

el cumplimiento a estos criterios dando paso a normas oficiales y regulaciones nacionales e

internacionales en el aspecto de determinación de microorganismos microbiológicos.

En términos de producción de alimentos y capacidad de adquirirlos, los países se dividen en tres

grupos: 1) Los que tienen la capacidad agrícola para ser autosuficientes en la producción de

alimentos; 2) Los que no son autosuficientes en la producción de alimentos pero tienen otros

recursos que les permiten importar suministros alimentarios adecuados; y 3) Los que no son

autosuficientes en la producción de alimentos y no poseen los recursos financieros necesarios para

cubrir el déficit con importaciones. Siendo México incluyente dentro del primer grupo tiene

establecidas las siguientes normas con las cuales regula dentro del territorio mexicano los productos

alimenticios que son generados tanto para exportación o el consumo de los mismos dentro del país.

• Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación y dilución

de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

• Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la

Determinación de Salmonella en Alimentos.

• Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la

determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

• Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Método de prueba

microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes.

Algunas tendencias en las que se conjuga no solo la búsqueda de alimentos saludables sino la

posibilidad de alimentarse adecuadamente en el difícil mundo de hoy, muestran que el público

general busca alimentos menos procesados con aspecto y calidad similares a los recién preparados.

Entre estos se incluyen : alimentos frescos o mínimamente procesados, platos preparados o

precocinados (refrigerados, congelados), productos semipreparados o precocidos que sólo requieren

calentamiento para su consumo y la “comida rápida” en la que se valora que sea rápida de

consumir, fácil de llevar y que además sean productos saludables. Ante esta situación el control

biológico de estos alimentos requiere de metodologías microbiológicas que le permitan identificar y

cuantificar en forma eficiente y rápida, por la vida de anaquel tan corta que presentan estos

alimentos. Los microorganismos son responsables de algunas de las más serias intoxicaciones

alimentarias y causan también la descomposición de una gran variedad de alimentos.

Ante esta temática, es importante la actualización e incorporación a la normatividad mexicana de

nuevas guías determinativas más adecuadas y con el alcance necesario que el productor mexicano

requiera para la colocación de sus productos alimenticios en mercados tanto nacionales como

internacionales, como lo son las normas ISO y algunos métodos rápidos del BAM (Bacteriological

Analytical Manual), USDA Laboratory Guide Notebook, por mencionar algunos.

Desarrollo de métodos

Desde la década del 70, el desarrollo y la implementación de los métodos rápidos para la

identificación de microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras áreas de la

investigación científica, en particular con la generalización del uso de galerías de pruebas

bioquímicas miniaturizadas.


20

A partir de la década del 80, el avance en la producción de anticuerpos monoclonales hizo posible el

desarrollo de pruebas inmunológicas de identificación, como el ELISA o la inmunocromatografía.

En 1990, con el advenimiento de las técnicas de biología molecular comenzaron a utilizarse

técnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificación de microorganismos y sus

factores de virulencia.

A partir del año 2000, comenzó el desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y

microarreglos.

El crecimiento exponencial de los métodos rápidos aplicados a la microbiología de los alimentos

puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos comerciales que se ofrecen en la actualidad con

el objetivo de tener resultados rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como

consecuencia de la automatización, el estudio de genotipos bacterianos pasó de ser un proceso

tedioso y lento a un método práctico que se puede aplicar en los ensayos microbiológicos

cotidianos.

Los factores que justifican la utilización de métodos rápidos e impulsan su desarrollo son

numerosos, entre ellos se pueden mencionar las presiones regulatorias, las modernas prácticas de

producción y la complejidad analítica.

Para hacer frente a las presiones regulatorias, la industria alimentaria debe utilizar métodos oficiales

de referencia, como los recomendados por la ISO (International Standards Organization) y AOAC

(International Association of Official Analytical Chemists), entre otras. Actualmente, algunos

métodos rápidos son recomendados como técnicas de tamizaje por agencias regulatorias

internacionales. En consecuencia, la oferta de métodos rápidos es cuantiosa. Sin embargo, se debe

considerar que antes de la adopción de nuevos métodos por parte de la industria, estos deben tener

constancia del proceso de estandarización y validación ante entidades internacionales, o bien en

instancias inter e intralaboratorio.

Algunos métodos para la detección de patógenos evolucionaron desde los análisis estándar

realizados en el laboratorio, hacia análisis efectuados en tiempo real en la línea de producción. Esta

tendencia hacia las pruebas en tiempo real, que surgió debido a la necesidad de ofrecer información

de utilidad durante la operación de producción de alimentos, se trata de un esfuerzo para superar en

parte las deficiencias de los métodos convencionales cuyos resultados no se pueden utilizar para

controlar el proceso in situ.

En el presente, la industria de alimentos basa la seguridad y calidad de sus productos en pruebas o

medidas fuera de la línea de producción. Sin embargo, las nuevas tendencias hacen cada vez más

necesaria la implementación de un sistema de medición continua y en tiempo real, que haga posible

la intervención in-line u on-line.

Las medidas de intervención in-line son aquellas que se efectúan directamente en la línea del

proceso y las medidas de intervención on-line son aquellas que pueden efectuarse en un asa by-pass

de la línea principal del proceso y que luego de la medida se retorna a la línea principal.

Desde una perspectiva futurista, el Dr. Daniel Fung, profesor de la Universidad de Kansas y uno de

los mayores expertos sobre métodos rápidos aplicados a la microbiología de alimentos, propuso el

siguiente escenario para los próximos años:

1) no se podrá reemplazar el recuento de microorganismos viables,


21

2) la supervisión de la higiene con métodos rápidos se efectuará en tiempo real,

3) las técnicas genotípicas serán habituales en los laboratorios de alimentos,

4) las pruebas inmunológicas serán automatizadas,

5) los resultados más rápidos se obtendrán con inmunocromatografía,

6) en los programas de análisis de peligros y de puntos críticos de control o HACCP (siglas en

inglés) se utilizarán biosensores,

7) los patógenos se detectarán inmediatamente de forma computarizada,

8) se realizará la separación y la concentración eficaz de las bacterias buscadas,

9) se utilizará un sistema de alerta microbiológico en los envases de alimentos,

10) los consumidores tendrán dispositivos de alerta rápido para detectar patógenos en sus hogares.

Como se puede deducir, el desarrollo de métodos rápidos está dirigido hacia las empresas

productoras de alimentos en primera instancia y luego a los consumidores. Sin embargo, se debe

considerar que para los organismos municipales, provinciales o nacionales responsables del control

de los alimentos no es habitual el uso de métodos rápidos, sobre todo de métodos moleculares. Esto

se debe a que actualmente la tendencia internacional de los organismos de control está orientada al

aseguramiento de los programas de HACCP utilizados por las empresas productoras de alimentos y

no al análisis microbiológico del producto final. Aunque en países como el nuestro, donde la

aplicación de este tipo de programas de control aún no es de cumplimiento obligatorio, no es

posible asegurar que la oferta de alimentos en la boca de expendio provenga de empresas que

utilizan programas HACCP.

Es entonces cuando la utilización de los métodos rápidos puede agilizar y mejorar los resultados

generados por los organismos de control. Sin embargo, también se debe considerar que para la

utilización de los métodos rápidos, además de inversiones y operadores capacitados, se requieren

políticas estatales de control tendientes a asegurar la calidad de los alimentos que consumimos.

Características principales de los microorganismos patógenos más relevantes considerados en

la normatividad de productos de la pesca y la acuicultura, por su implicación en salud pública

y por ser causa de detenciones y notificaciones de producto en el ámbito internacional.

(Representa el fundamento científico para considerar la conveniencia o no de la regulación de un

patógeno en un alimento).

El estudio de las ETAs de origen acuático en el ámbito mundial, se ha incrementado notablemente

en las últimas tres décadas, debido a diversos factores:

a) Culturales, que ha implicado mayor apertura a productos del mar que anteriormente no se

consumían o estaban restringido a ciertas tradiciones o hábitos culinarios;

b) Sociales, incremento de las poblaciones humanas y con ello de la demanda de proteínas de

calidad. Al mismo tiempo, las ETAs son motivo de ausencia al trabajo, gastos médicos y pérdidas

económicas;


22

c) Comerciales, la globalización del comercio de alimentos permite ahora el acceso a

productos de diferentes países sin un adecuado control que garantice su condición de inocuidad,

causa detenciones y notificaciones de producto, cancelación de ventas y en ocasiones hay

desperdicio del producto.

d) Deficiencias en prácticas de higiene. Falta de capacitación y conocimiento en el manejo

adecuado de estos productos en toda la cadena de producción, procesamiento, comercialización y

consumo;

e) Intensificación de la producción acuícola y pesquera. Debido a la presión que ejerce la

demanda de pescados y mariscos sobre estos sistemas de producción, el esfuerzo pesquero y las

densidades de organismos que se manejan son cada vez mayores y con ello, los riesgos de

contaminación y diseminación de patógenos también se han incrementado;

f) Otras actividades antropogénicas han ocasionado cambios relacionados con la calidad de

agua en cuerpos naturales y con ello los niveles de contaminación microbiológica;

g) Aparición de nuevas cepas o variantes patógenas;

Los patógenos más relevantes que se han relacionados con las ETAs, de origen acuáticos, son:

Salmonella spp., E. coli, V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus, las enfermedades son

causadas por los microorganismos y/o sus toxinas y la mayoría se manifiestan como cuadros

gastrointestinales, que varían en gravedad y duración.

El Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) ha estimado 76 millones de casos, con

5 000 muertos y 325 000 hospitalizaciones relacionadas con las ETAs cada año en EE. UU. y un

gran porcentaje han estado relacionadas con pescados y mariscos. Se considera que las

enfermedades causadas por Campylobacter, Salmonella, E. coli O157, y Listeria monocytogenes

tienen costos de casi US$ 7 billones cada año.

En países en desarrollo, se calcula en 2 millones de niños las mortalidades por enfermedades

diarreicas causadas por alimentos y agua contaminada cada año, siendo la causa más común los

patógenos virales y bacterianos.

En México el consumo de productos pesqueros es de aproximadamente 1.3 millones de toneladas

anuales, de las cuales el 5.66 % son de consumo de camarón. La contaminación de este producto

por diversos microorganismos patógenos, lo convierten en fuente importante de ETAs; de esta

manera en el año de 1999, se notificaron 163 brotes de ETAs determinándose 2 427 personas

enfermas y 9 defunciones; en el 2005, se informó de 191 brotes con 4 771 enfermos y 17 decesos,

este informe indicó que el número de brotes asociados con el consumo de pescados fue del 6.3 %, lo

que significó el 4º lugar entre los alimentos más involucrados con brotes de ETAs. En relación con

los agentes etiológicos, sólo en el 56 % de los brotes se identificó su naturaleza, de los cuales 12.9

% fueron de origen bacteriano (Pérez et al., 2005).

Revisión y análisis de la normatividad nacional e internacional más importante en el campo

de la microbiología, para garantizar la inocuidad en alimentos de origen acuático.

Nacional.


23

El Gobierno Mexicano tiene como prioridad el establecimiento de políticas que promuevan la

inocuidad de los alimentos, mediante la implementación de sistemas de reducción de riesgos en

unidades de producción, extracción y procesamiento primario de alimentos de origen acuícola y

pesquero, tanto para disminuir la incidencia de enfermedades ocasionadas a la población por la

contaminación de los mismos, como para asegurar e incrementar su comercialización interna y de

exportación.

El marco legal y normativo para garantizar la inocuidad de los alimentos de origen acuático en

México, es responsabilidad de SAGARPA a través del SENASICA (Servicio Nacional de Sanidad,

Inocuidad y Calidad Agroalimentaria) y es un tema principal en la agenda dentro de las actividades

primarias. Este organo tiene competencia sobre la inocuidad de los alimentos a partir del 2001 y

esta respaldado en la Ley General de Pesca y Acuicultura Sustentables actualizada en el 2009.

El Reglamento interior establece atribuciones específicas al SENASICA en el artículo 49, las cuales

son:

Establecer políticas, lineamientos, criterios, sistemas, estrategias, programas, proyectos,

procedimientos y servicios que coadyuven a mejorar la inocuidad de los alimentos de origen

animal, vegetal, acuícola y pesquero.

Proponer disposiciones generales a través de reglamentos y normas oficiales mexicanas

para garantizar la inocuidad de los alimentos y sus procesos de producción, procesamiento,

almacén, empaque, transporte y distribución.

Reconocer, autorizar y en su caso, certificar los sistemas de producción, procesamiento,

verificación e inspección de alimentos con el fin de garantizar su calidad sanitaria para consumo

nacional o exportación.

La Secretaría de Salud en México, es la encargada de regular los aspectos relacionados a la salud de

las personas. La Ley General de Salud reglamenta el derecho a la protección de la salud que tiene

toda persona en los términos del artículo 4° de la Constitución Política de los Estados Unidos

Mexicanos, el cual establece que “Toda persona tiene derecho a la alimentación nutritiva, suficiente

y de calidad. El estado lo garantizará” (decreto publicado en el DOF del 13 de octubre de 2011). Es

de aplicación en toda la República y sus disposiciones son de orden público e interés social.

Finalmente, cuenta con reglamentos específicos sobre los productos acuáticos, como el Reglamento

de Control Sanitario de Productos y Servicios (DOF miércoles 26 de enero 2011).

El siguiente es un listado de la reglamentación en materia de inocuidad y presenta las normas y

otros documentos que son aplicados en México como guías y directrices en relación a las

especificaciones sanitarias y de higiene, así como a métodos y técnicas para la detección de los

microorganismos patógenos más importantes y reconocidos como responsables de enfermedades

transmitidos por alimentos (ETAS) de origen acuáticos (pesca y acuicultura). Aplica a los procesos

productivos, transporte, almacenamiento, procesamiento y venta de crustáceos, moluscos y peces en

diferentes presentaciones. La normativa plantea también la aplicación de un sistema de análisis de

riesgos y control de puntos críticos (HACCP) en plantas procesadoras y de buenas prácticas como

medidas preventivas.

1. Secretaría de Salud. “Método de prueba para la estimación de la densidad microbiana por la

técnica del número más probable (NMP), detección de coliformes totales, coliformes

fecales y Escherichia coli.” CCAYAC-M-004. Revisión No. 8. Fecha de emisión: 25 Nov.

2011. México. 34p.


24

2. NOM-027-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados frescos-

refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.

3. NOM-028-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados en conserva.

Especificaciones sanitarias.

4. NOM-029-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustáceos frescos-

refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.

5. NOM-030-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustáceos en conserva.

Especificaciones sanitarias.

6. NOM-031-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos

frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.

7. NOM-032-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos en

conserva. Especificaciones sanitarias.

8. PROY-NOM-109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y

transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

9. NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos


10. NOM-112-SSA1-1994, bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica

del número más probable.

11. NOM-113-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos

coliformes totales en placa.

12. NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la determinación de Salmonella en

alimentos.

13. NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la determinación de

Staphylococcus aureus en alimentos.

14. NOM-128-SSA1-1994, bienes y servicios. Que establece la aplicación de un sistema de

análisis de riesgos y control de puntos críticos en la planta industrial procesadora de

productos de la pesca.

15. NOM-129-SSA1-1995. Bienes y servicios. Productos de la pesca: secos salados, ahumados,

moluscos cefalópodos y gasterópodos frescos-refrigerados y congelados. Disposiciones y

especificaciones sanitarias.

16. NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para

alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes.

17. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba

18. NOM-251-SSA1-2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o

suplementos alimenticios.

19. NMX-F-539-SCFI-2009 Productos de la pesca - filetes de anchoa en aceite enlatados –

especificaciones.

20. NOM–242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesado. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba”.

La mayoría de las normas no indican concordancia con normas internacionales, otras solo señalan

equivalencia parcial, sin embargo los métodos y técnicas a los que hacen mención, están basados en

procedimientos estandarizados y recomendados en el ámbito internacional. En la Tabla 6 se

presenta de manera resumida, información relevante y particular de cada norma y la manera como

se complementa con otras.

En particular, la NOM-242-SSA1-2009 es de reciente publicación en el Diario Oficial de la

Federación (Febrero 2011) y está basada en información científica, reglamentos e instrumentos

nacionales e internacionales de EE. UU., Canadá, Australia, Unión Europea (UE) y organismos


25

como FAO, OMS, OIE y OMC. Integra información relacionada con técnicas y métodos para la

detección de los principales patógenos relacionados con ETAs de origen acuático (Salmonella spp.

Staphylococcusaureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus y Vibrio vulnificus), así como para Clostridium spp. y coliformes.

Pese a lo anterior, dicha norma no toma en cuenta los adelantos científicos y nuevas tecnologías

desarrolladas en las últimas dos décadas en materia de análisis microbiológico y diagnóstico, ni de

adecuaciones a los métodos analíticos convencionales que pudieran ofrecer mayores beneficios a

los usuarios en términos de automatización, especificidad, sensibilidad, capacidad y tiempo de

respuesta, disminución de costos, discriminación de cepas toxigénicas y principalmente del nivel

de seguridad en la inocuidad de los alimentos.

Tabla 6.- NORMAS MEXICANAS DESTINADAS A ASEGURAR LA INOCUIDAD DE

PRODUCTOS DERIVADOS DE LA PESCA Y ACUICULTURA.

NOMBRE DE LA

NORMA

CAMPO DE

APLICACIÓN

FUNDAMENTO


26

Secretaría de Salud.

“Método de prueba para

la estimación de la

densidad microbiana por

la técnica del número más

probable (NMP),

detección de coliformes

totales, coliformes

fecales y Escherichia

coli.” CCAYAC-M-004.

Revisión No. 8. Fecha de

emisión: 25 Nov. 2011.

México. 34p.

Concordancia: El

documento no menciona

concordancia con normas

internacionales. Sin

embargo la metodología

que presenta se basa en

procedimientos

estandarizados y

recomendados en el

ámbito internacional.

Este método es aplicable

para la detección de

coliformes totales,

coliformes fecales y E. coli,

especialmente en productos

que se encuentran en bajas

concentraciones de

microorganismos (<10

UFC/g o ml). Por ejemplo:

alimentos cuyas

características particulares

puedan interferir en la

exactitud de la cuenta de

unidades formadoras de

colonias (UFC).

La detección de bacterias coliformes se

usa como indicador de la calidad

sanitaria de agua o como indicador de

condiciones sanitarias en el

procesamiento de alimentos. Las

coliformes fecales continúan siendo el

indicador de elección para moluscos

bivalvos y sus aguas de cultivo y E.

coli como indicador de contaminación

fecal reciente o condiciones higiénicas

inadecuadas. El método se basa en la

fermentación de la lactosa y el NMP es

una prueba presuntiva y confirmativa.

La serie de 3 tubos generalmente se

utiliza para la mayoría de los

alimentos, la serie de 5 tubos se emplea

para moluscos y para diversos tipos de

aguas, las series de 3, 5, y 10 tubos

dependiendo de la contaminación

esperada y del grado de exactitud

deseado. Se basa en la dilución de la

muestra en tubos múltiples, de tal

forma que todos los tubos de la menor

dilución sean positivos y todos los

tubos de la mayor dilución sean

negativos. El resultado positivo se

demuestra por la presencia de gas y/o

crecimiento microbiano propiedad de

los microorganismos coliformes para

producir gas a partir de la fermentación

de lactosa dentro de las 48 horas

incubación a 35 ± 0.5 °C (coliformes) y

a 45.5 ± 0.2 °C (coliformes fecales y E.

coli).

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-027-

SSA1-1993, bienes y

servicios. Productos de la

pesca. Pescados frescos-

refrigerados y

congelados.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia: Esta

Norma no menciona


internacionales. Se

Establece las

especificaciones sanitarias de

los pescados frescos-

refrigerados y congelados.

Es de observancia obligatoria

en el territorio nacional para

las personas físicas o

morales que se dedican a su

proceso o importación.

Presenta el método de prueba

para la determinación

microbiológica de Vibrio

cholerae (NOM-031-SSA1-

Las enfermedades transmitidas por

alimentos, en su mayoría son de tipo

infeccioso, su incidencia sigue

constituyendo un grave problema de

salud pública y es una de las causas

principales de morbilidad que ocupan

el segundo lugar entre las

enfermedades transmisibles de

notificación obligatoria. Entre los

alimentos involucrados resaltan el

pescado fresco-refrigerado y

congelado, debido a que por su origen,

es probable la contaminación

microbiológica y química, entre otras y

que aunado a la forma de consumo,


27

complementa con:

NOM-031-SSA1-1993;

NOM-051-SFCI-1994;

NOM-092-SSA1-1994;

NOM-112-SSA1-1994;

NOM-113-SSA1-1994;

NOM-114-SSA1-1994;

NOM 115-SSA1-1994;

NOM-120-SSA1-1994;

NOM-128-SSA1-1994.

1994).

Establece el límite máximo

permisible para: Mesofílicos

aerobios, Coliformes

fecales, Staphylococcus

aureus, Vibrio cholerae O1

toxigénico y Salmonella

spp.

pueden generar enfermedades para el

consumidor.

Una norma oficial Mexicana que regule

a estos productos desde el punto de

vista sanitario, permitirá promover el

consumo de los mismos y a la vez

proteger la salud del consumidor.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-028-

SSA1-1993, bienes y


pesca. Pescados en

conserva.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia: Esta

norma no menciona


internacionales.

Se complementa con:

NOM-120-SSA1-1994 y

NOM-128-SSA1-1994.

Establece las


los pescados en conserva. Es

de observancia obligatoria en

el territorio nacional para las

personas físicas o morales

que se dedican a su proceso

o importación. Establece

como requisito, la ausencia

de:

Mesofílicos aerobios,

Mesofílicos anaerobios,

Termofílicos aerobios y

Termofílicos anaerobios.










alimentos involucrados resaltan los

pescados en conserva, debido a que

estos productos en su origen están

sometidos a una contaminación

microbiológica y química entre otras

y que aunado a la forma de consumo

generan enfermedades para el

consumidor.






Los productos con un pH superior a 4.6

deben recibir un tratamiento capaz de

destruir todas las esporas de

Clostridium botulinum, a menos que la

proliferación de las esporas

supervivientes quede impedida en

forma permanente por otras


28

características distintas del pH.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-029-

SSA1-1993, bienes y


pesca. Crustáceos

frescos-refrigerados y

congelados.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia:

Esta Norma no menciona


internacionales.

Se complementa con:

NOM-027-SSA1-1993;

NOM-031-SSA1-1993;

NOM-092-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994

NOM-112-SSA1-1994

NOM-113-SSA1-1994

NOM-114-SSA1-1994

NOM-115-SSA1-1994

NOM-120-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994

Establece las


los crustáceos frescos-

refrigerados y congelados.






Presenta el método de prueba

para la determinación

microbiológica de Vibrio

cholerae (NOM-031-SSA1-

1994).


permisible para:


Coliformes fecales,

Staphylococcus aureus,

Vibrio cholerae O1

toxigénico y Salmonella

spp.











crustáceos frescos-refrigerados y

congelados, debido a que estos

productos en su origen están sometidos

a una contaminación microbiológica y

química entre otras, que aunado a la

forma de consumo generan

enfermedades para el consumidor.






NORMA Oficial

Mexicana NOM-030-

SSA1-1993, bienes y

servicios. Productos de

la pesca. Crustáceos en

conserva.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia:

Establece las


los crustáceos en conserva.






Establece como requisito, la

ausencia de:












crustáceos en conserva, debido a que

estos productos en su origen están

sometidos a una contaminación


29

Esta norma no tiene


internacionales.

Se complementa con:

NOM-120-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994




microbiológica y química entre otras,

que aunado a la forma de consumo

generan enfermedades para el

consumidor.






NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-031-

SSA1-1993, bienes y


pesca. Moluscos

bivalvos frescos-

refrigerados y

congelados.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia:

Esta norma no tiene


internacionales.

Se complementa con:

NOM-092-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994

NOM-112-SSA1-1994

NOM-114-SSA1-1994

NOM-120-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994

Establece las


los moluscos bivalvos

frescos-refrigerados y

congelados.







permisible para

microrganismos


Bacterias coliformes fecales,

Salmonella spp. y Vibrio

cholerae 01 toxigénico, en

carne y liquido intervalvar.

De igual manera en áreas de

producción clasificadas

como: Área aprobada, área

aprobada condicionalmente,

área restringida y área

prohibida.

Describe la técnica y

procedimientos para la

investigación de Vibrio

cholerae en moluscos

bivalvos y el procedimiento

para la diferenciación de V.

cholerae O1, V.cholerae No

01 y otras especies de

Vibrios.











moluscos frescos-refrigerados y

congelados, debido a que estos






Debido a lo anterior y a la fisiología de

los moluscos, se hace necesaria la

regulación y clasificación de las áreas

de producción.






NORMA Oficial

Mexicana NOM-032-

Establece las





30

SSA1-1993, bienes y


pesca. Moluscos

bivalvos en conserva.

Especificaciones

sanitarias.

Concordancia:

Esta norma no tiene


internacionales.

Se complementa con:

NOM-120-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994

los moluscos bivalvos en

conserva.






Establece como requisito, la

ausencia de:













moluscos bivalvos en conserva, debido a que estos productos en su

origen están sometidos a una

contaminación microbiológica y




Debido a lo anterior y a la fisiología de

los moluscos, se hace necesaria la

regulación y clasificación de las áreas

de producción.






PROYECTO de Norma

Oficial Mexicana NOM-

109-SSA1-1994, bienes y

servicios.

Procedimientos para la

toma, manejo y

transporte de muestras

de alimentos para su

análisis microbiológico.

Concordancia:

Esta norma no tiene


internacionales.

Se complementa con:

NOM-008-SCFI-1993

Norma Oficial Mexicana.

Sistema General de

Unidades de Medida.

Secretaría de Comercio y

Establece los procedimientos

para la toma, transporte y

manejo de muestras de

alimentos para su análisis

microbiológico. Es de

observancia obligatoria en el

territorio nacional para las

personas físicas o morales

que requieren efectuar este

procedimiento para el

análisis microbiológico de

alimentos nacionales y de

importación.

No hace distinción para

algún alimento en

particular, pero es de vital

importancia en alimentos

perecederos.

Destaca la importancia del muestreo, la

adecuada selección y toma de muestra,

los medios de conservación, su

transporte al laboratorio, ya que son

factores determinantes para la

obtención de resultados significativos y

confiables.


31

Fomento Industrial.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-110-

SSA1-1994, bienes y

servicios. Preparación y

dilución de muestras de

alimentos para su

análisis microbiológico.

Concordancia:

Esta norma es

técnicamente equivalente

a la norma ISO 6887-

1983 (E) microbiology

general guidance for the

preparation of dilutions

for microbiological

examination.

international organization

for standardization.

Se complementa con:

NOM-109-SSA1-1994.

Establece el procedimiento

para la preparación de

diluciones para el análisis

microbiológico de productos

alimenticios.




morales que se dedican a

efectuar este método en

alimentos nacionales o de

importación, para fines

oficiales.

Se basa en la preparación de diluciones

primarias, para obtener una

distribución lo más uniforme posible de

los microorganismos presentes en la

porción de muestra.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-112-

SSA1-1994, bienes y

servicios. Determinación

de bacterias coliformes.

Técnica del número más

probable.

Concordancia:

El documento no

menciona concordancia

con normas




procedimientos

estandarizados y

recomendados en el


Se complementa con:

NOM-109-SSA1-1994

Establece el método

microbiológico para estimar

el número de coliformes

presentes en productos

alimenticios, por medio del

cálculo del número más

probable (NMP).

Puede aplicarse a agua

potable, agua purificada,

hielo y alimentos procesados

térmicamente, así como a

muestras destinadas a

evaluar la eficiencia de

prácticas sanitarias en la

industria alimentaria.




morales que requieran


productos nacionales o de


El método se basa en que las bacterias

coliformes, fermentan la lactosa

incubadas a 35 ± 1°C durante (24 a 48)

horas, resultando una producción de

ácidos y gas el cual se manifiesta en las

campanas de fermentación.

Este procedimiento debe seleccionarse

cuando la densidad esperada es como

mínimo de una bacteria en 10 ml de

producto líquido o una bacteria por

gramo de alimento sólido.

Si la densidad microbiana se espera sea

mayor a 100 por mililitro o gramo de

muestra, ampliar el intervalo de

diluciones o utilizar el método en

placa.


32

NOM-110-SSA1-1994 oficiales.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-113-

SSA1-1994, bienes y

servicios. Método para

la cuenta de

microorganismos

coliformes totales en

placa.

Concordancia:.

El documento no


con normas




procedimientos

estandarizados y

recomendados en el


Se complementa con:

NOM-109-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994

NOM-092-SSA1-1994

NOM-112-SSA1-1994


microbiológico para

determinar el número de

microorganismos coliformes

totales presentes en

productos alimenticios por

medio de la técnica de cuenta

en placa.






productos nacionales o de


oficiales.

El método permite determinar el

número de microorganismos

coliformes presentes en una muestra,

utilizando un medio selectivo (agar

rojo violeta bilis) en el que se

desarrollan bacterias a 35 °C en

aproximadamente 24 h, dando como

resultado la producción de gas y ácidos

orgánicos, los cuales viran el indicador

de pH y precipitan las sales biliares.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-114-

SSA1-1994, bienes y


la determinación de

Salmonella en

alimentos.

Concordancia:

El documento no


con normas




Establece un método general

para la determinación de

Salmonella en alimentos.



las personas físicas y



productos nacionales y de

importación para fines

oficiales.

El método describe de manera general

5 pasos básicos para la detección de

Salmonella.:

a) Preenriquecimiento, permite la

restauración de las células de

Salmonella dañadas a una condición

fisiológica estable.

b) Enriquecimiento para incrementar

las poblaciones de Salmonella e inhibir

otros organismos presentes en la

muestra.

c) Crecimiento en medios sólidos

selectivos, con el fin restringir el


33

procedimientos

estandarizados y

recomendados en el


Se complementa con:

NOM-109-SSA1-1994

crecimiento de otros géneros diferentes

a Salmonella y permitir el

reconocimiento visual de colonias

sospechosas.

d) Identificación bioquímica, para la

determinación genérica de Salmonella.

e) Serotipificación, para la

identificación específica de la cepa en

cultivo.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-115-

SSA1-1994, bienes y


la determinación de

Staphylococcus aureus

en alimentos.

Concordancia:

El documento no


con normas




procedimientos

estandarizados y

recomendados en el


Se complementa con:

NOM-109-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994



determinar la cuenta de S.

aureus presente en alimentos

de cualquier tipo (nacionales

o de importación), que

puedan estar potencialmente

contaminados con este

patógeno. Es de observancia

obligatoria en el territorio

nacional para las personas

físicas o morales que

requieran demostrar, para

fines oficiales, la ausencia de

microorganismos en sus

productos.

El método permite hacer una

estimación del contenido de S. aureus

en alimentos. Se efectúa directamente

en placas de medio de cultivo selectivo

y diferencial y confirmación mediante

las pruebas de coagulasa y

termonucleasa.

El método es adecuado para el análisis

de alimentos en los cuales se esperen

más de 100 células de S. aureus por g.

NORMA OFICIAL

MEXICANA NOM-128-

SSA1-1994, bienes y

servicios. Que establece

la aplicación de un

sistema de análisis de

riesgos y control de

puntos críticos en la

planta industrial

procesadora de


Establece la aplicación de un

sistema de análisis de

riesgos y control de puntos

críticos en la planta

industrial procesadora de


Se aplica a las personas

físicas o morales que se

dedican a su proceso y

comercialización.

No se aplica a las personas

Disposiciones sanitarias para moluscos

bivalvos crudos.

Aquella planta industrial o importador

que se dediquen al manejo de los

moluscos bivalvos deben incluir en su

Programa de Análisis de Riesgos y

Control de Puntos Críticos (HACCP)

la manera por medio de la cual estén

controlando el origen de los mismos.

En la planta industrial sólo deben

procesarse moluscos bivalvos que


34

Concordancia:

-Fish Inspection Act,

R.S.C., 1070, c.F.-12,

Canadian Fish

Inspections Regulations.

-Fish Inspection

Regulations, p.C. 1978,

c.802, as amended,

Canada.

- Food And Drugs Act

and Regulations,

Department Of National

Health and Welfare,

Canada.

-Diario Oficial de la

Comunidad Europea, L

268, 34o. año, 24 de

septiembre de 1991.


Comunidad Europea, L

268, 34o. año, 24 de

septiembre de 1991.


Comunidad Europea,

VI/3202/93-EN-Rev.7

(PVET/EN/2016).

físicas o morales que sólo

cosechan y transportan

alimentos de origen marino,

es decir que no están

involucradas en el proceso

del producto ni a las

operaciones que se efectúan

en los establecimientos de

venta al detalle.

cumplan con la Norma Oficial

Mexicana correspondiente.

Los procesadores o importadores deben

guardar y mantener actualizados los

registros de cada lote recibido y

procesado.

NOM-129-SSA1-1995.

Bienes y servicios.

Productos de la pesca:

secos salados,

ahumados, moluscos

cefalópodos y

gasterópodos frescos-

refrigerados y

congelados.

Disposiciones y

especificaciones

sanitarias.

Concordancia:

Esta Norma es

parcialmente equivalente

a la siguiente norma y

Esta Norma Oficial

Mexicana establece

especificaciones sanitarias

para productos de la pesca en

diferentes presentaciones.

Para productos frescos,

refrigerados y congelados

considera a: Mesofílicos

aerobios, Coliformes

fecales, Salmonella spp. y

Vibrio cholerae O1

toxigénico.

Para productos secos –

salados: Staphylococcus

aureus y Salmonella spp.

Para ahumados:











productos de la pesca: secos salados,

ahumados, moluscos cefalópodos y

gasterópodos frescos-refrigerados y

congelados. Debido a que estos






35

códigos.

-FAO/OMS. Norma

Codex para Pescado seco

- salado (Klippfish) de la

familia de los Gadidae.

Codex Stan 167-1989.

-FAO/OMS. Código

Internacional

recomendado de prácticas

para el Pescado seco-

salado. CAC/RCP 26-

1979.

-FAO/OMS. Código

Internacional


para el Pescado ahumado.

CAC/RCP 25-1979.

-FAO/OMS. Código

Internacional


para Cefalópodos.

CAC/RCP 37-1989.

Se complementa con:

NOM-028-SSA1-1993

NOM-030-SSA1-1993

NOM-031-SSA1-1993

NOM-051-SCFI-1993

NOM-092-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994

NOM-112-SSA1-1994

NOM-113-SSA1-1994

NOM-114-SSA1-1994

NOM-115-SSA1-1994

NOM-120-SSA1-1994


Salmonella spp.,

Coliformes fecales,

Staphylococcus aureus,

Listeria monocytogenes,

Clostridium botulinum y

Vibrio cholerae O1

toxigénico.

Esta Norma Oficial

Mexicana es de observancia

obligatoria en el territorio

nacional para las personas

físicas o morales que se

dedican a su proceso o

importación.


Una Norma Oficial Mexicana que

regule a estos productos desde el punto

de vista sanitario, permitirá promover

el consumo de los mismos y a la vez



36

NOM-122-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994

NOM-143-SSA1-1994

NOM-143-SSA1-1995,

bienes y servicios.

Método de prueba


alimentos.

Determinación de

Listeria monocytogenes.

Concordancia:

El documento no


con Normas

Internacionales. Sin



procedimientos

estandarizados y

recomendados en el


Se complementa con:

NOM-110-SSA1-1994



determinar la presencia de

Listeria en alimentos.


en el Territorio Nacional

para las personas físicas o



productos nacionales y de


oficiales.

El método se basa en el aislamiento y

la diferenciación de especies de

Listeria spp., principalmente por la

fermentación de carbohidratos y la

actividad hemolítica de los miembros

de este género.

NORMA Oficial

Mexicana NOM-242-

SSA1-2009, Productos y

servicios. Productos de

la pesca frescos,

refrigerados, congelados

y procesados. Especificaciones

sanitarias y métodos de

prueba.

Concordancia:

Esta norma es

parcialmente equivalente

con las siguientes normas

internacionales:

-Codex Alimentarius.

ALINORM 01/18.

Establece los requisitos

sanitarios para: las áreas

de captura de moluscos

bivalvos; los

establecimientos que

procesan productos de la

pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesados,

incluyendo las

embarcaciones de pesca y

recolección, así como las

especificaciones sanitarias

que deben cumplir dichos

productos.


en el Territorio Nacional


morales que se dediquen a la

captura, extracción,

Incluye las diferentes técnicas y

metodologías convencionales y

aceptadas para la detección y

cuantificación de diferentes patógenos

(Salmonella spp, Coliformes fecales

y/o E. coli, Listeria monocytogenes,

Clostridium botulinum, Vibrio cholerae

O:1 y no O:1, Vibrio parahemolitycus

y Staphylococcus aureus) y otros

contaminantes, en alimentos derivados

de la pesca y acuicultura, en sus

diferentes presentaciones.


37

Apéndice V.


ALINORM 01/18.

Apéndice III..


ALINORM 01/18.

Apéndice VI.


ALINORM 95/18.

Apéndice VII.


ALINORM 95/18.

Apéndice IX.


ALINORM 95/18.

Apéndice X.


ALINORM 95/18.

Apéndice XI.


ALINORM 95/18.

Apéndice XII.


ALINORM 95/18.

Apéndice XIII.


ALINORM 95/18.

Apéndice XIV.


ALINORM 95/18.

Apéndice XV.

Se complementa con:

NOM-051-SCFI/SSA1-

2010

NOM-084-SCFI-1994

NOM-051-SSA1-2009

NOM-127-SSA1-1994

procesamiento,

conservación,

almacenamiento,

distribución, transporte,

venta o importación de



38

NOM-128-SSA1-1994

NOM-130-SSA1-1995

NOM-201-SSA1-2002

NOM-251-SSA1-2009,

Prácticas de higiene

para el proceso de

alimentos, bebidas o

suplementos

alimenticios.

Concordancia:

-Código Internacional

Recomendado de

Prácticas. Principios

Generales de Higiene de

los Alimentos.

CAC/RCP-1 (1969), Rev.

4 (2003).

Se complementa con:

NOM-127-SSA1-1994

Establece los requisitos

mínimos de buenas prácticas

de higiene que deben

observarse en el proceso de

alimentos, bebidas o

suplementos alimenticios y

sus materias primas a fin de

evitar su contaminación a lo

largo de su proceso.



morales que se dedican al

proceso de alimentos,

bebidas o suplementos

alimenticios, destinados a los

consumidores en territorio

nacional.

Hace énfasis en la

conveniencia de la aplicación

de un sistema de análisis de

peligros y de puntos críticos

de control (HACCP) y

directrices para su

aplicación.

Las buenas prácticas de higiene

representan un requisito

indispensable que deben ser

implementado, desde los sitios de

producción hasta la distribución y

venta de los productos, pasando por

la cosecha, procesamiento. Cada una

de las partes y el personal que esta en

contacto con los productos debe

cumplir con dichas prácticas.

Los establecimientos deben contar con

instalaciones que eviten la

contaminación de las materias primas,

alimentos, bebidas o suplementos

alimenticios.

NMX-F-539-SCFI-2009

Productos de la pesca -

filetes de anchoa en

aceite enlatados –

especificaciones.

Concordancia:

Esta norma mexicana no

es equivalente a ninguna

norma internacional por

no existir referencia

alguna al momento de su

elaboración

Se complementa con:

NOM-001-STPS-1993

La presente norma mexicana

se aplica únicamente a los

filetes de anchoa en aceite

enlatados que se

comercializan en territorio

nacional.

La determinación de

microorganismos se efectúa

de acuerdo con las normas

mexicanas NMX-F-088-

1964, NMX-F-358-S-1981,

NMX-F-359-S1980 y NMX-

F-361-S-1981.

Esta Norma Oficial Mexicana se

fundamenta en la verificación de las

especificaciones físicas que se

establecen en esta norma, que se

deben aplicar las normas mexicanas

que se indican en el capítulo de

referencias y el método de prueba que

se indica a continuación, así como los

métodos establecidos por la Secretaría

de Salud.


39

NOM-002-SCFI-1993

NOM-027-SSA1-1993

NOM-030-SCFI-2006

NOM-040-SSA1-1993

NOM-051-SCFI-1994

NOM-092-SSA1-1994

NOM-109-SSA1-1994

NOM-110-SSA1-1994

NOM-111-SSA1-1994

NOM-112-SSA1-1994

NOM-113-SSA1-1994

NOM-114-SSA1-1994

NOM-115-SSA1-1994.

NOM-116-SSA1-1994

NOM-117-SSA1-1994

NOM-120-SSA1-1994

NOM-128-SSA1-1994

NOM-129-SSA1-1995

NOM-130-SSA1-1995

NMX-F-083-1986

NMX-F-088-1964

NMX-F-144-1978

NMX-F-254-1977

NMX-F-304-1977

NMX-F-314-1977

NMX-F-315-1978

NMX-F-317-S-1978


40

NMX-F-358-S-1981

NMX-F-359-S-1980

NMX-F-360-1981

NMX-F-361-S-1981.

NMX-FF-539-SCFI-2009

NMX-Z-012/1-1987

NMX-Z-012/2-1987

NMX-Z-012/3-1987

Esta norma

Europea. Normas AENOR–UNE-ISO.

El objetivo de la política de seguridad alimentaria de la UE es proteger la salud y los intereses de

los consumidores y garantizar el buen funcionamiento del mercado interior entre los 27 países que

la conforman. Para lograr este objetivo, la UE establece y vela por el cumplimiento de normas de

control en materia de higiene de los productos alimenticios, de salud y bienestar de los animales, de

fitosanidad y de prevención de los riesgos de contaminación por sustancias externas además de

establecer normas para el adecuado etiquetado de los productos.

Esta política fue reformada a principios del año 2000, de acuerdo con el enfoque “de la granja a la

mesa”. La Comisión de la Comunidad Europea (CCE), ha hecho de la inocuidad alimentaria una de

sus prioridades principales, por lo que elaboró el Libro Blanco sobre seguridad alimentaria en el que

se estableció una política alimentaria nueva y dinámica, la SE modernizó la legislación fijando un

conjunto coherente y transparente de normas, se reforzaron los controles desde la explotación hasta

la mesa del consumidor y se aumentó la eficiencia del sistema de asesoramiento científico para

garantizar un elevado nivel de salud y protección de los consumidores (CCE, 2000).

Las prioridades estratégicas para la CCE son:

Crear una autoridad Europea de inocuidad alimentaria.

Implantar sólidamente el enfoque “de la granja a la mesa” en la normativa alimentaria.

Establecer el principio según el cual, las empresas productoras de alimentos para consumo

humano, son las primeras responsables de la inocuidad alimentaria y los gobiernos de los

estados miembros deben realizar la supervisión y control.

La CCE evalúa la eficiencia de las capacidades y aptitudes de los estados miembros para

realizar ese control por medio de auditorias e inspecciones.

Para el 2002, el consejo y el parlamento europeo crearon, la European Food Safety Authority

(EFSA) como un organismo independiente con tareas esenciales, que abarcan la formulación de

dictámenes científicos, la gestión de los sistemas de alerta rápida, la comunicación y el diálogo con

los consumidores sobre las cuestiones sanitarias y de seguridad alimentaria, así como la creación de


41

redes con las agencias nacionales y los organismos científicos; convirtiéndose, la EFSA, en la

piedra angular de las evaluaciones de riesgo de la UE concerniente a la seguridad alimentaria (para

humanos y piensos animales), colaborando estrechamente con los estados miembros, organismos

europeos y organizaciones internacionales y de terceros países para compartir información, datos y

mejores prácticas, identificar los riesgos emergentes y desarrollar comunicaciones coherentes de los

riesgos de la cadena alimentaria.

Los riesgos microbiológicos de los productos alimenticios de origen acuático, constituyen una

prioridad debido a que es de las principales fuentes de ETAs. De acuerdo al reglamento (CE) nº

2073/2005 y a otros, los alimentos no deben contener microorganismos ni sus toxinas o metabolitos

en cantidades que supongan un riesgo para la salud humana al mismo tiempo prioriza un enfoque

estructurado de prevención, con el buen diseño de procesos y materias primas y la aplicación de

buenas prácticas de higiene, así como los principios HACCP.

En relación al uso de métodos analíticos alternativos, se autoriza su aplicación siempre que existan

procedimientos de validación con respecto al método de referencia, conforme a la norma EN/ISO

16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados y su uso deberá ser autorizado por

la autoridad competente como la Asociación Española de Normalización y Certificación (AENOR).

Dicha asociación es una entidad privada, independiente, sin fines de lucro, reconocida en los

ámbitos nacional, comunitario e internacional, contribuye, mediante el desarrollo de las actividades

de normalización y certificación, a mejorar la calidad en las empresas, sus productos y servicios, así

como a proteger el medio ambiente y, con ello, el bienestar de la sociedad. Se constituyó en 1986,

coincidiendo con la incorporación de España a la UE. Un año más tarde, AENOR asumió la

representación de España ante el Comité Europeo de Normalización (CEN) y ante la ISO.

Actualmente, son más de 200 los comités técnicos de normalización en los que participan cerca de

6.000 expertos, de tal manera que dichas normas sirven de referencia para las normas europeas e

internacionales.

Las Normas UNE-EN-ISO son las que rigen específicamente lo relativo a la microbiología de los

alimentos en la Unión Europea. Su contenido proporciona información para el desarrollo e

implementación de métodos normalizados en los laboratorios, garantizando los resultados, la

calidad y la seguridad de los alimentos sometidos a control. Contienen, entre otras especificaciones:

Preparación de medios de cultivo en laboratorios

Preparación de muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen

microbiológico

Protocolos de validación de métodos alternativos

Aplicación de la PCR para determinación de patógenos.

Detección de los siguientes patógenos: Salmonella typhi, S. paratyphi, Salmonella spp., Escherichia

coli O157, Shigella spp., Yersinia enterocolítica y Listeria monocytogenes, otros patógenos

contemplados son: Staphylococcus aureus coagulasa positivos, Bacillus cereus y Clostridium

perfingens. No se especifican límites máximos permitidos en los alimentos (pescados, crustáceos o

moluscos) ni la matriz que se utiliza. Sin embargo en los reglamentos de la CE, relativo a los

criterios microbiológicos aplicables a los productos de origen acuático, si se establecen

requerimientos en términos cuantitativos, dependiendo de las diferentes presentaciones

(REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de noviembre de 2005).

Todas estas normas tienen concordancia con normas ISO, que están aprobadas por el CEN y están

sujetas a revisiones periódicas para asegurar su actualización y concordancia con los progresos de la


42

industria y de la sociedad. En la Tabla 7, se presentan las Normas UNE-CEN-ISO mas recientes

relacionadas con la microbiología de alimentos de origen acuático.

Tabla 7. Normas UNE-CEN ISO más recientes que se relacionan con la microbiología de los

alimentos para consumo humano y animal.

1 UNE-CEN ISO/TS 11133-

1:2009

Microbiología de los alimentos

para consumo humano y

animal.

Guía para la preparación y producción de medios de

cultivo. Parte 1: Directrices generales para el

aseguramiento de la calidad para la preparación de

medios de cultivo en el laboratorio. (ISO/TS 11133-

1:2009).

2 UNE-EN ISO 11290-1:1997


para consumo humano y para

animales.

Método horizontal para la detección y el recuento de

Listeria monocytogenes. Parte 1: Método de detección.

(ISO 11290-1:1996).

3 E-EN ISO 11290-

1:1997/A1:2005

(ISO 11290-1:1996/AM1:2004



animales).

Método horizontal para la detección y el recuento de

Listeria monocytogenes. Parte 1: Método de detección.

Modificación 1: Modificación del medio de

aislamiento y de la prueba de la hemólisis e inclusión

de los datos de precisión

4 UNE-EN ISO 11290-2:2000



animales

Método horizontal para la detección y recuento de

Listeria monocytogenes. Parte 2: Método de recuento.

(ISO 11290-2:1998).

5 UNE-EN ISO 16140:2003



animal

Protocolo de validación de métodos alternativos (ISO

16140:2003).

6 UNE-EN ISO 16654:2002



animal.

Método horizontal para la detección de Escherichia

coli O157. (ISO 16654:2001)

7 UNE-EN ISO 20838:2007



animal

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la

detección de patógenos en los alimentos. Requisitos

para la amplificación y la detección para los métodos

cualitativos. (ISO 20838:2006).

8 UNE-EN ISO 6579:2003 Método horizontal para la detección de Salmonela spp.


43



alimentación animal.

(ISO 6579:2002)

9 UNE-EN ISO 6887-3:2004



animal.

Preparación de las muestras de ensayo, suspensión

inicial y diluciones decimales para examen

microbiológico. Parte 3: Reglas específicas para la

preparación de pescados y productos de la pesca. (ISO

6887-3:2003)

10 UNE-EN ISO 6888-1/A1:2004



animal.

Método horizontal para el recuento de estafilococos

coagulasa-positivos (Staphylococcus aureus y otras

especies). Parte 1: Técnica que utiliza el medio agar de

Baird-Parker. Modificación 1: Incorporación de los

datos de precisión.(ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003).

Estados Unidos (EE. UU.)

Al igual que en otros países la responsabilidad del aseguramiento de la inocuidad de los productos

para consumo humano, está a cargo de instancias gubernamentales y se basa en reportes,

investigaciones y programas. Los principales actores en el área de prevención de las ETAs, son:

a) The Food and Drug Administration (FDA)

Es una de las agencias responsables de la protección de la salud pública, procurando que solamente

productos inocuos lleguen al mercado, sus actividades incluyen:

o Ayudar y orientar a productores y consumidores de alimentos para que conozcan cuáles son

los riesgos a la salud que pueden derivarse de los mismos.

o Promover la aplicación de buenas prácticas de manejo sanitario de los alimentos por parte

de los consumidores y productores.

o Promover la detección, seguimiento y prevención de enfermedades relacionadas con el

consumo de alimentos.

Opera un programa de seguridad de manera obligatoria para el sector acuícola y pesquero bajo las

disposiciones de la Ley de Servicios a la Salud Pública y Reglamentos Relacionados (FD&C Act.),

fundamentado en la investigación, inspección, desarrollo, difusión, cumplimiento y ejecución de

normas. El “Manual de Análisis Bacteriológicos” (BAM), elaborado por la FDA, es un compilado

de procedimientos de laboratorio que sirve de guía para el análisis microbiológico de alimentos y

cosméticos, es una recopilación de información científica actualizada y de la política relacionada a

los riesgos potenciales en la producción y consumo de productos de la pesca y los controles eficaces

para prevenir su ocurrencia. El BAM representa la piedra angular del programa.

Dichas guías y documentos son actualizados y reconocidos a nivel mundial. Explican los

lineamientos a seguir en lo relacionado con los planes HACCP y orienta a los usuarios para la

identificación de los principales peligros microbiológicos como: Salmonella spp., Staphylococcus

aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V.

vulnificus, así como Clostridium perfringes, Bacillus cereus, Campillobacter jejuni y coliformes en

productos alimentarios de origen acuático como: peces (en general), crustáceos (camarón, cangrejo,


44

langosta) y moluscos (ostión, almeja, mejillón, caracol), en diferentes presentaciones (frescos,

congelados, pre cocidos, cocinados, enteros y enlatados) ver Tabla 8.

Recientemente se formó la “Red de Evaluación y Respuesta Coordinada a Brotes (CORE, por sus

siglas en inglés), integrada por equipos multidisciplinarios con personal de tiempo completo para

preparar, coordinar y mejorar el tiempo de respuesta a brotes ocasionados por alimentos. Al tener

un sistema centralizado aplica las experiencias en la elaboración de políticas eficaces y prácticas

preventivas de seguridad alimentaria para evitar incidentes en el futuro.

Otra publicación de referencia, es el BAD BUG BOOK, publicado por el Centro para la Seguridad

Alimentaria y la Nutrición Aplicada de la FDA, Departamento de Salud y Servicios Humanos.

b) Center of Disease Control and Prevention (CDC)

Estos centros van a la cabeza de los esfuerzos federales para recopilar información sobre las ETAs,

su objetivo es investigar dichas enfermedades, los brotes y supervisar la efectividad de los esfuerzos

de prevención y control realizados para disminuir esos sucesos, también desempeñan un papel

fundamental en el desarrollo de la capacidad epidemiológica de laboratorio y de salud ambiental en

el departamento de salud estatal y local a fin de respaldar la vigilancia de las ETAs y la respuesta

ante los brotes. Investigan los brotes de enfermedades que surgen en relación con alimentos y se

encargan de realizar estudios sobre problemas de salud o producidos por determinados ambientes.

Igualmente, gestionan programas de ámbito nacional para la prevención y control de dichas

enfermedades.

Cuando un brote es identificado, los CDC colaboran con la FDA, la USDA, o la Agencia de

Protección Ambiental (EPA), para rastrear el alimento desde sus orígenes, evaluar las medidas de

inocuidad alimentaria de los restaurantes y las procesadoras, haciendo una investigación desde la

granja de producción, hasta retirar el producto del mercado.

Tabla 8. Métodos y Referencias en ISO y en BAM para la detección de los principales patógenos

reconocidos en alimentos acuáticos

Internacional EUA (BAM)

Método Referencia Método Referencia

Escherichia coli

Convencional

b EN-ISO

16654: 2002 Convencional

c

Feng et al., 2002

Convencional

c ISO 7251:

2005 Inmunológico

h

Feng et al., 2002

Conv-Molec

i Feng et al., 2011

Listeria

monocytogenes

Convencional

a ISO (EN-ISO)

11290-1: 2005 Convencional

c Hitchins y Jinneman,

2002

Conv-Molec

j Hitchins y Jinneman,

2011


45

Kits AOAC

k Hitchins y Jinneman,

2011

Salmonella spp Convencional

d ISO (EN-ISO)


Andrews et al., 2011

Staphylococcus

aureus

Convencional

e EN ISO 6888-


e,l Bennett y Lancette,

2001

Convencional

e EN ISO 6888-


g,l Bennett y Lancette,

2001

Convencional

f,

g

EN ISO 6888-

3: 2003

Vibrio cholerae

Convencional

a ISO 21872-1:

2007 Convencional

a,

m

Kaysner y DePaola,

2004

Molecular

o Kaysner y DePaola,

2004

Vibrio

parahaemolyticu

s

Convencional

a ISO 21872-1:

2007 Convencional

c,

n

Kaysner y DePaola,

2004

Molecular


2004

Vibrio vulnificus

Convencional

a ISO 21872-2:

2007 Convencional

c,

n

Kaysner y DePaola,

2004

Molecular


2004

a El procedimiento general en el met. de Cultivo son; dos enriquecimientos, aislamiento y

confirmación

La expresión de resultados es presencia o ausencia en x gr ó ml de muestra.

b El procedimiento general en el met. de cultivo son; enriquecimiento, separación,

concentración, aislamiento y confirmación

La expresión de resultados es presencia o ausencia en X gr ó ml de muestra.

c El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, separación,

concentración, aislamiento y confirmación.

La expresión de resultados es número más probable en X gr ó ml de muestra.

d El procedimiento general en el met. de cultivo son; Pre-enriquecimiento, enriquecimiento,

cultivo y confirmación.


e El procedimiento general en el met. de cultivo son; Inoculación, incubación y confirmación.

La expresión de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos por gr ó ml de

muestra.


46

f El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, subcultivo y

confirmación.


g El procedimiento general en el met. de cultivo son; Cultivo, incubación, subcultivo y

confirmación.

La expresión de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos más probable por gr

ó ml de muestra.

h Ensayo LST-MUG es exclusivo para moluscos bivalvos fríos o congelados.

i Detección de E. coli O157:H7 Se realiza un previo enriquecimiento y se lleva a PCR en

Tiempo Real, donde además están configurados para las plataformas SmartCycler II o

LightCycler® 2.0. Es específico para los Genes stx1 y stx2. Y las muestras que den positivas

en PCR se confirman por cultivo.

j Son recomendaciones de confirmación por métodos moleculares (PCR en tiempo real y

campos pulsados -PGDE-) para la detección se utiliza comúnmente el Gen hly y 16s rARN

k Enzyme Linked Immunofluorescent Assay (ELFA) VIDAS LIS Assay; Colorimetric

monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method; TECRA Listeria Visual

Immunoassay [TLVIA]

l La expresión de resultados para

e es S. aureus/g de muestra y para

g es S. aureus (NMP/g)

m El reporte final debe incluir identificación bioquímica y serológica del aislado y resultados de

enterotoxicidad

n Membrana filtrante hidrofóbica cuadriculada (HGMF), similar al convencional por el tiempo

de incubación

o Se enriquece y para confirmación con PCR se utiliza para V. cholerae el Gen ctxAB, para V.

vulnificus es el gen vvhA y para V. parahaemolyticus (PCR Multiplex) los genes tlh, trh y

tdh

Canadá

La Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos (CFIA por sus siglas en inglés), desarrolla y

verifica el cumplimiento de las normas de procesos que contribuyen a la obtención de productos

apropiados y con una calidad aceptable, garantiza la seguridad e identidad de pescados y mariscos

que son procesados en establecimientos federales o importados en Canadá. Sus actividades

incluyen:

o Registro federal de productos de la pesca que procesan los establecimientos,

o Inspección del pescado importado y productos de la pesca,

o Desarrollo y mantenimiento de disposiciones con países con sistemas aprobados de

inspección,

o Inspección y ejecución de regulaciones, incluyendo la aplicación de normas de etiquetado,

o Pruebas para detección de residuos.

Parte del alcance de las inspecciones incluye actividades de: limpieza, fileteado, glaseado, embalaje,

enlatado, congelación y presentaciones como: ahumado, salado, cocinado, en escabeche, seco o


47

cualquier otra. Se encarga de examinar patógenos de alto riesgo en los alimentos como: E. coli, L.

monocytogenes, S. aureus, Salmonella y Shigella. El Compendium of Analytical Methods (Vol. 2 y

3), proporciona la descripción de las técnicas recomendadas para la detección de los patógenos

(Tabla 9).

Dentro de los programas que maneja la CFIA se encuentran: el de importación/exportación de peces

y mariscos, inspección de los planes de acción de seguridad alimentaria (químicos y

microbiológicos) y planes HACCP, entre otros.

a) El CFSP (Canadian Fish and Seafood Program) basa las inspecciones a peces y mariscos

procesados, en el documento Fish Inspection Regulations considera los siguientes productos y

presentaciones:

o Productos enlatados (almejas, mejillón, ostión, coctel y pasta de langostino, salmón, atún y

sardina),

o Frescos y congelados (empanizados, carne de langosta, ostiones, salmón, coctel de

camarón, vieira (escallopos), eperlanos y pescado blanco),

o Además en escabeche, condimentados, marinados, salados, secos y ahumados.

o Para que la importación se lleve a cabo, es necesario que los lotes de interés, sean sujetos a

una inspección rigurosa y a muestreos aleatorios para los siguientes análisis:

o Físicos (calidad del empacado, etiqueta, etc.),

o Químicos (mercurio, metales pesados, plaguicidas, etc.),

o Fisicoquímicos (sensoriales, pH, índice de calidad, etc.),

o Microbiológicos (E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus, Vibrio spp., etc.).

b) El Canadian Shellfish Sanitation Program (CSSP) es un programa federal dirigido y

administrado conjuntamente por la CFIA, el departamento del medio ambiente (EC) y el de Pesca y

el Océano (DFO). El objetivo principal es proteger a los canadienses de los riesgos a la salud

asociados con el consumo de moluscos bivalvos contaminados (p.ej. mejillones, ostiones y

almejas), a partir de él, el gobierno canadiense implementó controles para verificar que solo los

mariscos que cumplan con los estándares de calidad e inocuidad alimentaria lleguen al mercado

nacional e internacional. Incluye tanto a la industria como al consumidor.

c) El Programa de Inspección de Peces (FIP), se encarga de la calidad e inocuidad alimentaria,

basada en resultados analíticos. Dentro de él se creó una política para que terceros laboratorios

pudieran hacer las pruebas de los productos derivados de la pesca (Policy on the Use of Third Party

Laboratories for Testing Fish and Fish Products), a través del reglamento de inspección de peces

(FIR), el cual establece las condiciones de aceptación de los resultados de dichos laboratorios y

aplica solo dentro del programa de gestión de calidad para importadores (QMPI). Sin embargo, hay

otras situaciones donde pruebas analíticas, por terceros laboratorios, son mayormente requeridas,

por lo que es necesaria una política clara sobre las condiciones de trabajo de laboratorios

acreditados o no, para diferentes actividades dentro de la FIP.

d) Programa de monitoreo microbiológico, es una de las actividades que realiza la CFIA, la

cual consiste en un muestreo aleatorio y análisis de muestras para una amplia variedad de productos

nacionales e importados. Los análisis se realizan cada año para evaluar la contaminación

microbiológica en el suministro de alimentos, haciéndose pruebas para patógenos de alto riesgo,

incluyendo E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella.

e) El Plan de acción de seguridad alimentaria (FSAP) es apoyado por la CFIA para construir el

sistema de seguridad alimentaria actual. Esta iniciativa permite responder rápida y eficazmente a


48

problemas de seguridad alimentaria e identificación de los riesgos potenciales de manera temprana.

Con este plan se examinan los alimentos que se consideran con gran potencial de riesgo a la salud

debido a la variedad de patógenos. Las muestras son analizadas bajo los estándares de seguridad

alimentaria que han sido establecidos por Health Canada y varias organizaciones internacionales,

tales como la comisión del Codex Alimentarius. Cuando la CFIA encuentra un alimento o un

ingrediente que viola esos estándares, toma alguna de las siguientes acciones correctivas:

o Realizar mas inspecciones,

o Más muestreos,

o Emitir anuncios públicos y

o Retirar los productos del mercado que poseen un riesgo a la salud.

f) Los planes de muestreo para análisis microbiológicos y químicos fueron adoptados de la

International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Sin embargo, la

Health Canada preparó un manual que provee de métodos de referencia listos para aplicarse y es

utilizado por la Health Products and Food Branch (HPFB) en los siguientes casos:

o Para determinar si la industria alimentaria cumple con la regulación y guías en relación a

materiales extraños y microbiológicos en alimentos,

o Para evaluar la calidad de los alimentos en general con respecto a su contenido

microbiológico o material extraño,

o Para fungir como apoyo en la investigación de las ETAs.

g) Health Canada. Para esta institución, es esencial tener una base científica para prevenir y

responder apropiadamente cuestiones de inocuidad y salud, donde las investigaciones y las mismas

actividades científicas juegan un papel importante en muchos procesos de toma de decisiones. Este

conocimiento contribuye al desarrollo de políticas y programas, regulaciones, servicios,

información y evaluación de riesgo, mismos que incluyen el estudio de:

o Productos químicos potencialmente peligrosos en alimentos y sus efectos sobre la salud

humana,

o Aspectos nutricionales y metabólicos de los alimentos, incluyendo las relaciones de

determinados aspectos de la dieta a las condiciones de la enfermedad,

o Consumo de alimentos y los patrones de ingesta de nutrientes de los canadienses,

o Organismos infecciosos y toxigénicos, (p.ej., E coli, Salmonella, Listeria monocytogenes) y

medidas de control para la seguridad alimentaria.

1.5 Japón. Ley Básica de Seguridad Alimentaria.

En 2002, el Director Food and Environmental Hygiene (DFEH) estableció directrices en relación a

los límites de seguridad de nueve agentes patógenos, principales, transmitidos por los alimentos.

El 01 de julio de 2003, entró en vigor la Ley Básica de Seguridad Alimentaria (FSBL) con el

propósito de promover integralmente las políticas para garantizar la seguridad alimentaria mediante

el establecimiento de principios básicos, entre los que se encuentra, el “Reconocer que la protección

a la salud de los ciudadanos japoneses es prioritaria” y que la guía básica incluye:

o Promoción de evaluar el riesgo (evaluando el efecto de los alimentos en la salud),

o Gestionar el riesgo (formulando políticas que se basen en la evaluación del riesgo) y

o Comunicar el riesgo (donde se comparte información y opiniones entre las partes

interesadas).


49

Debido a las grandes cantidades de productos importados por Japón provenientes de China, se

crearon reglamentos para conocer y monitorear los productos comestibles que son importados al

país, incluyendo lácteos, cárnicos, en diferentes presentaciones, y en particular la “Guide to Import

Marine Products into Hong Kong”. Se elaboraron directrices microbiológicas para alimentos listos

para comer (RTE), las cuales establecen los límites de seguridad de 9 de los principales patógenos

transmitidos por los alimentos: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157, V. cholerae,

V. parahaemolyticus, S. aureus, Campylobacter spp., Clostridium perfringens y B. cereus. También

proporciona una clasificación de calidad microbiológica de esos alimentos que refleja el estado

higiénico de los mismos. Los comerciantes de los alimentos involucrados deben obtener asistencia

del personal DFEH, para tomar muestra del alimento en cuestión para su análisis, u otro examen

bacteriológico o de otra índole. Los productos acuáticos concernientes pueden ser: peces,

crustáceos, moluscos, anfibios o cualquier otra forma de vida acuática como mamíferos o reptiles.

La venta de alimentos de origen acuático como ostras, pescados y mariscos en general, crudos y/o

vivos está restringida a personas y establecimientos que cuenten con el permiso específico emitido

por DFEH.

La comisión de seguridad alimentaria (Food Safety Commission of Japan (FSCJ), fue establecida

para la realización de evaluaciones de riesgo de manera neutral e imparcial, sobre la base de

conocimiento científico y conjuntamente con la creación de la ley (FSBL), atienden las situaciones

que englobaban la seguridad alimentaria de Japón ya que las importaciones de productos

comestibles que hace este país se han incrementado drásticamente en las últimas décadas.

Tabla 9. Listados de técnicas para detección y aislamiento de microorganismos patógenos causantes

de ETAs (CAM, Canadá).


50

Método

Numero de

indentificacion del

metodo y apendices

Titulo

MFHPB-07The isolation of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. from foods and

environmental samples using Palcam broth

MFHPB-30Isolation of Listeria monocytogene s and other Listeria spp. from foods and

environmental samples

MFLP-11Enumeration of Listeria spp. in environmental samples using 3MJ PetrifilmJ

Environmental Listeria Plates

MFLP-74 Enumeration of Listeria monocytogenes in Food

MFHPB-29Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIDAS

Listeria™ Method

MFLP-33Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples by

the VIDAS LMO 2™ Method

MFLP- 34Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIP

Method

MFLP-71Detection of Listeria spp. in foods and environmental samples using the Oxoid

Listeria Rapid Test (The Clearview Kit)

MFLP-77Detection of Listeria spp. in food products and environmental samples by the

VIDAS® Listeria species Xpress (LSX) method

MFLP-13The Genequence Listeria spp. assay for the detection of Listeria spp. in foods

and environmental surfaces

MFLP-14The Genequence Listeria monocytogenes assay for the detection of Listeria

monocytogenes in foods

MFLP-15The detection of Listeria species from environmental surfaces using the Dupont

Qualicon BAX® System method and direct plating

MFLP-28The Qualicon BAX® SYSTEM Method for the detection of Listeria monocytogenes

in a variety of food

MFLP-31Identification of Listeria monocytogenes using the Adiafood Rapid Pathogen

Detection System, a Real-Time PCR Technique

MFLP-39Detection of Listeria spp. from environmental surfaces using iQ-CheckTM

Listeria spp. Real-Time PCR Test Kit

MFLP-78Identification of presumptive positive Listeria monocytogenes from foods and

environmental samples by the Polymerase Chain Reaction

MFLP-88 Identification of Listeria monocytogenes by Accuprobe™

Genéticos

Aislamiento e Identificación

Enumeración

Inmunológicos


51

Método

Numero de

indentificacion del

metodo y apendices

Titulo

MFHPB-21 Enumeration of Staphylococcus aureus in foods

MFHPB-28Determination of Staphylococcus aureus Thermostable

Nuclease in foods.

MFLP-21

Enumeration of Staphylococcus aureus in foods and

environmental samples using 3MJ PetrifilmJ Staph Express

Count (STX) Plates (Supplement to MFLP-21)

MFLP-65

Detection of Staphylococcal enterotoxins in food products

using the VIDAS Staph Enterotoxin II (SET2), an ELFA

(Enzyme-Linked Fluorescent Assay)

MFLP-67

Determination of enterotoxin production by

Staphylococcus aureus in foods and broth media (The

Reverse Passive Latex Agglutination (RPLA) Method)

MFLP-68

Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus

aureus in foods (The Enzyme-linked Immunosorbent

Assay (ELISA) using the TECRA Kit)

MFLP-69

Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus

aureus in foods (Ridascreen SET A, B, C, D, E Enzyme

Immunoassay)

Enumeración e

Identificación

Enterotoxin

Immunological

Método

Numero de

indentificacion del

metodo y apendices

Titulo

MFLP-72 The Isolation and Identification of Vibrio cholerae 01 and non-01 from Foods

MFLP-73 The Isolation and Enumeration of Vibrio vulnificus from Fish and Seafoods

MFLP-23Specific detection of Vibrio parahaemolyticus strains using a multiplex polymerase chain

reaction (pcr) based on the r72h taxonomic marker and the hemolysin genes tdh and trh

MFLP-37 Detection of Halophilic Vibrio Species in Seafood

Aislamiento e

Identificación

Genéticos


52

Método

Numero de

indentificacion del

metodo y apendices

Titulo

MFHPB-20 Methods for the Isolation and Identification of Salmonella from Foods in foods and environmental samples

MFHPB-20A Amendment to MFHPB-20 for the analysis of seed used to manufacture sprouts

MFLP- 75Procedure for the Isolation of Salmonella species by the Modified Semi-Solid

Rappaport Vassiliadis (MSRV) Method feeds, raw foods, feces, litter, fluff, dust and other environmental samples

MFHPB-24 Detection of Salmonella spp. in Foods by the VIDAS SLMJ Methodfoods and in agricultural products

MFLP-18The 48h DupontTM Lateral Flow SystemTM Method for the detection of

Salmonella species in raw and processed meats in raw (ground chicken, turkey, beef and pork, as well as chicken carcass wash) and processed meats (turkey deli meat only)

MFLP- 35Detection of Salmonella by the Tecra Salmonella Visual ImmunoassayJ (VIA)

Method foods, food ingredients and environmental samples

MFLP-70 Detection of Salmonella in foods by the Modified 1-2 Test animal feed, chicken, pork, seafood and artificially-contaminated foods and other foods, food ingredients, and environmental samples

MFLP- 84 Identification of Salmonella spp. by DynabeadsJ anti-Salmonella foods, animal feed andenvironmental samples

MFLP- 96 The Reveal Test Kit for detecting Salmonella feeds, raw foods and other samples

MFLP-97 The Alert Test Kit for detecting Salmonella artificially contaminated foods and naturally contaminated poultry rinse, raw ground turkey and rendered poultry meal and other foods and food ingredients

MFLP-20The Genequence® Salmonella Microwell Assay for the detection of Salmonella

in a variety of foods in a wide variety of food products, including meat, poultry, fish and seafood, fruits and vegetables, eggs, nuts, flours, confectionery products, dairy products, spices, pet foods, and miscellaneous processed foods.

MFLP-29The Qualicon Bax® System Method for the detection of Salmonella in a variety

of food and environmental samples has been validated for use in a wide variety of food, including meat, poultry, fish and seafood, fruits and vegetables, dairy, miscellaneous food products and environmental samples.

MFLP-32Identification of Salmonella species using the Adiafood rapid pathogen

detection system, a real-time PCR technique foods and other samples

MFLP-36Detection of Salmonella in foods and environmental surfaces - Assurance GDS

for Salmonella Gene Detection System in a variety of foods and environmental surfaces including raw beef, raw pork, ground poultry, poultry rinse, raw shrimp, nonfat dry milk, liquid milk, egg, stainless steel, rubber and concrete to determine compliance with the requirements of Section 4 and 7 of the Food and Drugs Act.

Genéticos

Aislamiento e Identificación

Inmunológicos


53

Método

Numero de

indentificacion del

metodo y apendices

Titulo

MFLP- 80 Isolation of E. coli O157:H7 or NM in foodsThe method has been shown to

produce satisfactory results

MFLP- 90 Identification of E. coli O157 by DynaBeadsTM anti-E. coli O157 in food

MFLP-19The DupontJ Lateral Flow SystemJ Method for detecting E. coli O157 in raw

ground and raw boneless beef (Supplement to MFLP-19)in raw ground beef and raw

boneless beef

MFLP-81Detection of Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in Food Products and Food

Ingredients by the Assurance EHEC Enzyme Immunoassay (EIA) Method

food products and food

ingredients

MFLP-82 Detection of E. coli O157 by the Merck Singlepath7 E. coli O157 Kit raw ground beef and

pasteurised whole milk

MFLP-87Detection of Enterohemorrhagic E. col i (EHEC) in food products and food

ingredients by the VIP for EHEC Methodfood products, food ingredients

and environmental samples

MFLP-91Detection of E. coli O157 by the TecraTM E. coli O157 Visual Immunoassay

(VIA) Method and TecraTM E. coli O157 Immunocapturefood products, food ingredients

and environmental samples

MFLP-92MFLP-92 Detection of Escherichia coli O157 in foods by Polymixinbased

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

a variety of foods, including

ground beef, processed meats,

fruits and vegetables

MFLP-94The Eight Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 In raw

beef and environmental samples.raw beef cubes, raw ground

beef, and environmental swabs

MFLP-95The 20 Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 from foods

and environmental samples.

with artificially contaminated

foods and naturally

MFLP-98Detection of E. coli O157:H7 in food products by the VIDAS® UP E. coli O157

(including H7) method

use in raw processed meats,

raw unprocessed meats and

leafy greens.

MFLP-12

Identification of Escherichia coli O157:H7 and Verotoxin producing Escherichia

coli O157:NM by the ADIAFOOD Rapid Pathogen Detection System, a Real-

Time Polymerase Chain Reaction System raw ground beef

MFLP-16Detection of Escherichia coli O157:H7 in Foods - Assurance GDSJ for E. coli

O157:H7 Gene Detection System

in raw ground beef, beef trim,

orange juice, apple juice, fresh

vegetables and sprout process

MFLP-24Identification of Escherichia coli O157 by the Warnex Real Time Polymerase

Chain Reaction System foods and food ingredients

MFLP-30The Dupont Qualicon Bax7 System Method for the detection of E. coli O157:H7

in raw beef and fruit juice (Supplement to MFLP-30) raw ground beef and fruit juice

Supplement 2 to MFLP-30 The use of the Bax E. coli O157:H7 MP assay

MFLP-76The DuPont Qualicon BAX® System real-time method for the detection of E.

coli O157:H7 in raw beef trim and raw ground beef raw ground beef and beef trim

MFLP-86Identification of presumptive positive Verocytoxigenic Escherichia coli by the

Polymerase Chain Reaction from foods and other samples

MFLP-83 Detection of Verotoxins VT 1 and VT 2 by the Merck Duopath7 Verotoxin Kitfoods to determine compliance

with the requirements of

MFLP-93Identification of Escherichia coli Verotoxins by the Meridian Premier EHEC

KitTM

in food or food ingredients to

determine compliance with the

requirements of Sections 4 and

Pruebas para

Verotoxinas

Genéticos

Aislamiento e

Identificación

Inmunológicos


54

Chile. Agencia Chilena para la Inocuidad Alimentaria (ACHIPIA)

Dicha Agencia implementó un moderno, eficiente y transparente sistema nacional de inocuidad de

los alimentos. Cuenta con un sistema integrado de laboratorios que realizan análisis de alimentos

relacionados con la inocuidad, los cuales utilizan métodos acreditados conforme a la norma

ISO/IEC17025 según recomendación del Comisión del Codex Alimentarius.

En general, la metodología está basada en métodos de referencia internacional o validados a nivel

nacional: AOAC, FDA-BAM, AFNOR, USDA-FSIS, ICMSF, ISO, normas chilenas, FAO/OMS –

Codex Alimentarius, manual de métodos de análisis físico-químicos de alimentos, agua y suelos del

ISP, entre otros.

El servicio nacional de pesca (SERNAPESCA), que depende del Ministerio de Economía,

estableció dentro de la política de la inocuidad de los alimentos el reglamento sanitario de los

alimentos, DTO. N° 977/96, del cual se desprenden algunos apartados específicos para el análisis

microbiológico de productos de origen acuático. Toma como base la clasificación, los parámetros

de control y los planes de muestreo de la ICMSF (International Commission on Microbiological

Specification For Foods), en la cual se definen 18 grupos de alimentos según su origen y/o

tecnología aplicada en su elaboración. El grupo N#11 “Pescados y Productos de la Pesca” muestra

las especificaciones microbiológicas para dichos productos (Tabla 10). En el artículo 173 del

reglamento, se presenta una lista de las bacterias potencialmente presentes en dichos productos, con

la cual, la autoridad sanitaria puede considerar el alimento como contaminado, conforme a la

evaluación de los riesgos que de su análisis se deriven.

Tabla 9. Grupos bacterianos considerados para determinar la inocuidad en pescados y productos de

la pesca, según presentación, de acuerdo a la política de la inocuidad de los alimentos en Chile.

Moluscos bivalvos

frescos:

Pescados y mariscos

crudos congelados

Pescados y mariscos

precocidos o cocidos

congelados;

Pescados y mariscos

ahumados

Recuento Aerobios

Mesófilos, Coliformes

fecales en 100 g. y

Salmonella en 25 g.

Recuento Aerobios

Mesófilos, E. coli, S.

aureus

Recuento Aerobios


aureus, Salmonella en

25 g.

Recuento Aerobios


aureus.

Artículo 174.- En los alimentos listos para el consumo (LPC) también se hace análisis de Listeria

monocytogenes

Fuente: Reglamento sanitario de alimentos. Chile. Artículo 173, DTO. N° 977/96.

En esta perspectiva, Chile ha ido actualizando el reglamento sanitario de los alimentos,

fortaleciendo los programas de higiene y control, perfeccionando los procesos de inspección y

certificación de las exportaciones, ampliando los mecanismos de participación de los distintos

actores, desarrollando los mecanismos de aseguramiento de la calidad y los sistemas de

trazabilidad, fortaleciendo las capacidades analíticas de los laboratorios, e incorporando

crecientemente el enfoque integrado de las cadenas de producción sustentado en el análisis de

riesgo. Muchos de estos mejoramientos, que han significado avances, han contado con la valiosa

cooperación internacional, especialmente de Japón, Unión Europea, Estados Unidos y Canadá.


55

AOAC Official Method.

La Asociación de comunidades analíticas, "AOAC INTERNATIONAL” tiene como fin el ser un

proveedor proactivo, mundial y facilitador en el desarrollo, empleo y la armonización de métodos

validados, analíticos y programas de garantía de calidad de laboratorio y servicios. Las directrices

del comité de métodos para la validación de métodos microbiológicos para los alimentos y análisis

ambientales (Methods Committee Guidelines for Validation of Microbiological Methods for Food

and Environmental Surfaces) es una guía que incluye términos y definiciones asociadas con los

programas oficiales de métodos de análisis estandarizados y métodos estandarizados de pruebas de

rendimiento y los requisitos para la validación de metodologías de identificación confirmatoria,

cuantitativa y cualitativa mas actualizadas. La edición más reciente es de febrero del 2012. El

propósito de este documento es proporcionar directrices técnicas comprensibles para llevar a cabo

estudios de validación microbiológica de los alimentos y de los métodos de análisis ambientales.

Los métodos validados que contiene para los productos de la pesca y acuicultura engloban:

productos frescos y congelados, secos, salados, cocidos, en conserva y semiconservas en vinagre,

anchoas en aceite y productos ahumados. Los patógenos que son considerados en este tipo de

alimentos son: Salmonella, Listeria, Coliformes, E. coli, Legionella, Bacillus y Staphylococus

aureus.

Comisión del Codex Alimentarius.

El CODEX fue creado en 1963 para desarrollar estándares, guías y códigos de buenas prácticas,

destinadas a proteger la salud de los consumidores y garantizar prácticas justas y leales en el

comercio de alimentos bajo la supervisión del Programa de Estándares de Alimentos, de la

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la

Organización Mundial de la Salud (OMS). Asimismo promueve la coordinación de todos los

trabajos sobre normas alimentarias ejercidas por organizaciones internacionales gubernamentales y

no gubernamentales.

Para esta comisión, es tarea de cada país desarrollar el marco normativo adecuado siguiendo las

guías establecidas por el CODEX e informar y realizar programas de educación para lograr la

inocuidad alimentaria en la producción de alimentos para el consumo humano. En 1983, un comité

de expertos en inocuidad alimentaria fue convocado por la OMS y FAO (organizaciones

internacionales que tienen asignaciones específicas en la materia), para discutir temas relacionados

con la inocuidad alimentaria. La conclusión del comité, fue que las ETAs, posiblemente sea el

problema de salud más importante a nivel mundial y una de las principales causas que contribuyen a

reducir la productividad económica (OMS, 1999).

Existen varias comisiones dentro del Codex que están preparando los códigos de prácticas para los

diversos aspectos relacionados con la inocuidad de diferentes productos:

o Comité del Codex en peces y productos de la pesca.

o Comité del Codex en higiene de alimentos.

o Comisión intergubernamental de investigación Ad-Hoc en alimentación animal.

o Comité del Codex en aditivos y contaminantes en alimentos.

o Comité del Codex en residuos de medicamentos veterinarios en alimentos.

o Comisión intergubernamental de investigación Ad-Hoc en alimentos derivados de la

biotecnología.

o Comité del Codex en sistemas de inspección y certificación de alimentos importados y

exportados.


56

El Comité del CODEX sobre pescados y productos pesqueros establece normas mundiales para

pescado, crustáceos y moluscos bivalvos frescos y congelados o elaborados de cualquier otra forma,

la mayor parte de las evaluaciones son sensoriales (organolépticas). En el código de prácticas para

el pescado y los productos pesqueros se le incorporaron las buenas prácticas de fabricación (BPF) y

el HACCP. En el código, se hace mención de Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio,

parahaemolyticus y Vibrio, vulnificus como posibles peligros biológicos que pueden encontrarse

contaminando los productos acuáticos, antes de su cosecha; e incluye a Listeria monocytogenes,

Clostridium botulinum y Staphylococcus aureus como aquellos que pueden ser introducidos durante

el procesamiento de los productos. En otros casos se puede presentar contaminación de origen fecal,

cuando las instalaciones se encuentran cerca de la la influencia de poblados o actividades

productivas que puedan contaminar con residuos de medicamentos veterinarios en exceso y de otras

sustancias químicas.

Señala también los posibles peligros para el pescado vivo almacenado y transportado a bajas

temperaturas, como son: contaminación microbiológica, biotoxinas, contaminación química (p. ej.,

aceite, agentes de limpieza y desinfección (Codex, 2012).

En relación a los moluscos, como son organismos filtrantes, los contaminantes se concentran en

niveles mayores que las aguas marinas que los circundan, por consiguiente, la contaminación por

bacterias y virus en la zona de cría es de importancia crítica para la especificación del producto final

y determina los requisitos del proceso de elaboración ulterior. La contaminación por aguas de

escurrimiento agrícola o aguas negras pueden transmitir patógenos bacterianos y/o virales

(Norwalk, virus de la hepatitis). A efectos de controlar los peligros, es muy importante la

identificación y vigilancia de las zonas de cría para la inocuidad de los moluscos bivalvos.

Organización Mundial del Comercio (OMC).

Es el único organismo internacional que se ocupa de las normas que rigen el comercio entre los

países. Su principal propósito es asegurar que las corrientes comerciales circulen con la máxima

facilidad, previsibilidad y libertad posible.

La OMC ha implementado dos acuerdos relacionados con plantas y animales de la acuacultura: el

Acuerdo de Aplicación de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (SPS, por sus siglas en inglés) y el

Acuerdo sobre Barreras Comerciales para el Comercio (TBT, por sus siglas en inglés). El primero

proporciona las reglas básicas para inocuidad alimentaria, conjuntamente con estándares de salud

para animales y plantas, mientras que el segundo cubre todos los requerimientos técnicos,

estándares y consideraciones regionales que no estén cubiertas por el SPS. El resultado es la

certidumbre. Los consumidores y los productores saben que pueden contar con un suministro

seguro y con una mayor variedad en lo que se refiere a los productos acabados, los componentes,

las materias primas y los servicios que utilizan, mientras que los productores y los exportadores

tienen la certeza de que los mercados exteriores permanecerán abiertos a sus actividades. Otra

consecuencia es que el entorno económico mundial se vuelve más próspero, tranquilo y fiable.

(WTO, 2012).

Organización Mundial de la Salud (OMS)

Este organismo internacional entró en vigor el 7 de abril de 1948, siendo la autoridad directiva y

coordinadora de la acción sanitaria en el sistema de las Naciones Unidas. Es responsable de

desempeñar una función de liderazgo en los asuntos sanitarios mundiales, configurar la agenda de


57

las investigaciones en salud, establecer normas, articular opciones de política basadas en la

evidencia, prestar apoyo técnico a los países y vigilar las tendencias sanitarias mundiales. Un

instrumento decisivo en la lucha contra la propagación mundial de las enfermedades infecciosas es

el Reglamento Sanitario Internacional (RSI), negociado por los estados miembros de la OMS,

establece las normas que deben aplicar los países para identificar los brotes epidémicos y detener su

propagación. Es un instrumento jurídico de carácter vinculante para 194 países, entre ellos todos los

estados miembros de la OMS. Su objetivo es ayudar a la comunidad internacional a prevenir y

afrontar riesgos agudos de salud pública susceptibles de atravesar fronteras y amenazar a

poblaciones de todo el mundo. El RSI, que entró en vigor el 15 de junio de 2007, obliga a los países

a comunicar a la OMS los brotes de ciertas enfermedades y determinados eventos de salud pública

(WHO, 2006).

a) Estrategia global para la inocuidad (WHO Global Strategy for Food Safety). En mayo del

2010 la OMS aprobó esta nueva resolución sobre seguridad alimentaria. Se trata de un esfuerzo

global para la vigilancia de lasETAs. Las organizaciones internacionales reconocen que un sistema

global de inocuidad alimentaria compete a todos; desde autoridades gubernamentales hasta

consumidores y que la “elaboración de sistemas eficaces de inocuidad de los alimentos” se basa en

gran medida en la coordinación, colaboración y comunicación entre todas las actividades. Para lo

anterior el análisis de riesgos es una herramienta muy útil que debe ser realizado en colaboración

con agencias internacionales utilizando las herramientas científicas existentes para riesgos

microbiológicos. Los problemas más preocupantes relacionados con la inocuidad de los alimentos

son:

o la propagación de los riesgos microbiológicos

o los contaminantes químicos de los alimentos, la evaluación de nuevas tecnologías

alimentarias, como los alimentos genéticamente modificados y

o la creación de sistemas sólidos que velen por la inocuidad de los alimentos y garanticen la

seguridad de la cadena alimentaria mundial. (WHO, 2002).

La OMS trata de generar estrtegias para prevenir brotes de enfermedades y minimizar los riesgos

para la salud en toda la cadena, desde el productor hasta el consumidor y ha elaborado documentos

de divulgación que sirven como herramienta o guía educativa, así como material de consulta, para

la comunidad educativa para que aprendan como mantener los alimentos seguros y evitar la

contaminación de los mismos. Cabe señalar que esta organización trabaja junto con la OMC y FAO

en estos aspectos.

b) International Food Safety Authorities Network (INFOSAN). Es una iniciativa entre la OMS

y FAO. Las autoridades en materia de inocuidad de los alimentos incluyen autoridades nacionales

involucradas en la legislación alimentaria, la evaluación del riesgo, el control y la gestión de

alimentos; la inspección de alimentos; los laboratorios de control y vigilancia, y los materiales de

información, educación y comunicación sobre inocuidad de los alimentos, en todo el proceso que va

desde la producción hasta el consumo (“de la granja a la mesa”). Por lo tanto, es posible que los

centros de enlace de INFOSAN estén en diferentes ministerios, como los de salud, comercio y

agricultura. Dado que la información que se intercambia puede ser delicada, la comunicación dentro

la red es confidencial y los puntos de contacto de INFOSAN Emergencias son oficialmente

designados por los países. INFOSAN emergencias funciona las 24 horas del día, los siete días de la

semana y la red está estrechamente vinculada con otros sistemas de vigilancia y respuesta de la

OMS (FAO-WHO, 2010).


58

Conclusiones de los resultados de la encuestas a los laboratorios que realizar la determinación

de microorganismos patógenos en alimentos

La participación de los Estados de la República Mexicana a la encuesta fue del 56 %.

El 58 % de los laboratorios o instituciones encuestados pertenecen al sector privado y el 42 %

pertenece al sector público.

El equipo común para realizar el análisis de MPA entre las empresas o instituciones es algún tipo de

microscopio (contraste de fases, campo oscuro, entre otros). El segundo equipo que se utiliza en el

análisis de MPA son relacionados con técnicas moleculares (termocicladores para realizar PCR

punto final y PCR en tiempo real) siendo similar el uso de técnicas de ensayos por inmunoabsorción

ligado a enzimas (ELISA).

El 61 % de las 35 empresas o instituciones encuestadas cuentan con instalaciones para la

capacitación del personal encargado del análisis de MPA y el 31 % no cuenta con instalaciones

destinadas a la capacitación. El 86 % de los entrevistados afirma que cuenta con un programa de

capacitación anual para su personal.

Los análisis más frecuentes de MPA se centran en primer lugar los dedicados a Salmonella spp., en

segundo lugar Coliformes totales y en tercer lugar Coliformes fecales. La mayoría de los análisis

que se solicitan son para matrices complejas o que no se definían como cárnicos, frutas, verduras o

marinos.

Los análisis de Coliformes totales y fecales para frutas y verduras son más frecuentes que los

análisis para estos microorganismos en cárnicos y marinos.

Para cárnicos y marinos son más frecuentes los análisis para Salmonella spp que en frutas y

verduras.

Los análisis para Vibrio cholerae son más frecuentes en marinos que en cárnicos, frutas y verduras.

Las especies de Campilobacter jejuni, Shigella, Yersinia enterocolitica, Yersinia spp. y Bacillus no

son microorganismos sujetos a análisis de MPA por parte de los encuestados.

Las matrices de alimentos no definidas como cárnicos, frutas, verduras y/o marinos, indican que se

utilizan en una misma proporción los procedimientos tanto manuales como automáticos,

independientemente del microorganismo a analizar.

Las técnicas de análisis de MPA más utilizadas son las de medios selectivos.

Para Coliformes totales y fecales el uso de la técnica del número más probable sigue siendo la

técnica de análisis de mayor uso, sin importar la matriz a analizar.

Para el análisis de E. coli O157:H7 y STEC se prefiere el uso de técnicas moleculares basadas en

PCR punto final, PCR tiempo real y también en técnicas de separación inmunomagnética. No hay

variación en la matriz a analizar.

Para el análisis de Salmonella spp. se utilizan métodos tales como PCR punto final, PCR tiempo

real, pruebas inmunológicas, pruebas bioquímicas, medios selectivos, sistemas miniaturizados para

identificar MPA, separación inmunomagnética. Este comportamiento descrito se aplica a todas las

matrices de alimentos descritas en la encuesta.


59

Para el análisis de Listeria monocytogenes se utilizan métodos tales como PCR punto final, PCR

tiempo real, pruebas inmunológicas, pruebas bioquímicas, medios selectivos, ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas, sistemas miniaturizados para identificar MPA, separación

inmunomagnética. Este comportamiento descrito se aplica a todas las matrices de alimentos

descritas en la encuesta.

Para el análisis de especies de Vibrio se aprecia que además del uso de medios selectivos también se

prefiere su análisis por medio de sistemas miniaturizados de identificación. Este comportamiento

descrito se aplica a todas las matrices de alimentos descritas en la encuesta.

De los laboratorios o instituciones encuestados, 91 % tienen un sistema de calidad implantado. El

80 % de las respuestas brindadas por los laboratorios encuestados indican que adoptaron un sistema

de calidad basado en la norma ISO/IEC 17025:2004 en sus diferentes versiones hasta la versión

2006; el 18 % restante de los laboratorios encuestados adoptó las normas ISO 9000 y sus

actualizaciones hasta la ISO 9001:2008. La norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 es la más

adoptada para acreditar un sistema de calidad, en segundo lugar se encuentra una versión anterior de

esta norma (ISO/IEC 17025:2005).

Para analizar Coliformes totales se usan las normas CCAYAC M-04, NOM-112-SSA1-1994 y

NOM-113-SSA1-1994.

Para analizar Coliformes fecales se usan en mayor medida la norma CCAYAC M-04.

Para el análisis de E. coli O157:H7 destacan el uso de las normas AOAC, CCAYAC M-04 y BAM.

Para el análisis de E. coli STEC se repiten en uso las normas descritas por CCAYAC M-04, AOAC,

NOM de la SSA y BAX.

Las normas con las que se realizan los análisis para determinar especies de Vibrio cholerae,

parahaemolyticus y vulnificus se realiza siguiendo las NOM-242-SSA1-2009 y NOM-031-SSA1-

1993, en menor frecuencia se siguen las normas descritas en el BAM.

Los análisis para Salmonella spp, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus se realizan

siguiendo las normas NOM-114-SSA1-SSA1-1994, NOM-143-SSA1-1995 y NOM-115-SSA1-

1994, respectivamente.

Para analizar Campylobacter jejuni se utiliza la norma OIE y las NOM de la SSA.

El 69 % de los 35 laboratorios o instituciones encuestados ha participado en pruebas

interlaboratorio para análisis de MPA.

Las pruebas interlaboratorio más mencionadas por los laboratorios encuestados son LGC Standars

(internacional) Salmonella en cocoa (2012), Staphylococcus aureus (LGC Standard-Reino Unido),

Coliformes fecales, Coliformes totales, E. coli, Salmonella, FEPAS, M0795, 2010 (Salmonella

especies), S. aureus, Listeria spp. y Listeria monocytogenes.

Las pruebas interlaboratorio que fueron mencionadas una sola vez por los laboratorios encuestados

son: ALAC CONFORME; CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en jamón (2010);

CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en embutido de cerdo (2009); FEPAS E. coli en carne

(2009); Mesofilos aerobios (LGC Standard-Reino Unido); Coliformes (LGC Standard-Reino

Unido); E. coli (LGC Standard-Reino Unido); Hongos y levaduras (LGC Standard-Reino Unido);

Vibrio cholerae (LGC Standard-Reino Unido); API; WS-183 Coliformes totales (NMP) Agua


60

potable ERA, FAPAS; QMS, raund 186, 2011 (Vibrio especies y V. parahaemolyticus); QMAS,

round 186, 2011 (Salmonella especies);, QMAS, round 186, 2011 (Listeria monocytogenes);

QUALITY IBN MICROBIOLOGY SCHEME; FEPAS Coliformes totales, indicadores mesofilicos

aerobios, Coliformes totales, E. coli; LGC STANDARDS ROUND 166 MARZO 2010; LGC

STANDARDS ROUND 186 NOVIEMBRE 2011; LGC Standards Proficiency Testing;

Determinación de BMA; LGC Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia L. monocytogenes; LGC

Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia Salmonella; LGC Standards-- en proceso

Presencia/Ausencia L. monocytogenes; 078QR SourceWatRTM para CT, CF y E. coli; SUERO

SHIGATOXIN STEC; CARNE STEC; Campylobacter en leche; UC Davis/reptiles and anphibians.

Las pruebas interlaboratorio en las que los laboratorios encuestados han participado en orden de

ascendente de número de mención son: Salmonella con 28 %, E. coli con 17 %, Coliformes

totales con 15 % y Listeria con 10 %.

El 97 % de los 35 laboratorios encuestados expresaron que debe actualizarse la normatividad

mexicana existente respecto a la normatividad internacional.

Las normas en orden de prioridad en que los 35 laboratorios encuestados sugieren que se actualicen

las normas son: NOM-114-SSA1-1994, NOM-115-SSA1-1994, NOM-113-SSA1-1994, NOM-143-

SSA1-1995, NOM-092-SSA1-1994, NOM-110-SSA1-1994, NOM-111-SSA1-1994, NOM-112-

SSA1-1994, NOM-031-SSA1-1993, NOM-242-SSA1-2009.

El 84 % de los 35 laboratorios encuestados contestoóafirmativamente en la disposición para invertir

para actualizar sus técnicas de medición de MPA.


61

Lista de empresas o instituciones entrevistadas

1 Laboratorio de Microbiología y métodos moleculares de USAM de CIATEJ

2 Laboratorio Central Regional de Monterrey

3 Analítica del Noroeste SA de CV

4 Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos

5 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Chiapas

6 Alimentos y Biotecnología UNAM

7 Laboratorios Becar, S.A. de C.V.

8 Laboratorio Microbiológico ANDA

9 Biofleming Laboratorios

10 Laboratorios de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.

11 Analysis & Research Lab., S.A. de C.V.

12 Laboratorio de Microbiología en Inocuidad del CESAVESIN

13 Laboratorio de Análisis Químico, Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en

Electroquímica, S.C.

14 Laboratorio Químico Industrial y Agrícola S.A. de C.V.

15 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Aguascalientes

16 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Durango

17 Laboratorios Valdés S.A. de C.V.

18 Laboratorio Microanalítico de Control S.A. de C.V.

19 Ecolaboratorios, S.A. de C.V.

20 Laboratorio Regional de Salud Pública Servicios de Salud Chihuahua

21 Bufete Químico S.A. de C.V.

22 Intertek Testing Services

23 Kimpen, S.A. de C.V.

24 Laura Tobilla Lalo. Consultoría en Inocuidad y Microbiología de Alimentos

25 Nestle Quality Assurance Center (NQAC) Toluca

26 Laboratorio Estatal de Salud Pública de Michoacán

27 Cierto y Seguro S.A. de C.V.

28 Laboratorio Central Regional de Mérida, Yucatán

29 Primus Laboratorios de México, S. de R.L. de C.V.

30 Laboratorio Fermi, S.A. de C.V.

31 Zábok Laboratorio SA de CV

32 Laclicsa Laboratorios

33 Difaza, Laboratorio de Control Industrial S.A. de C.V.

34 Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos

35 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C.


62

PROGRAMAS INTERNACIONALES

IMPLEMENTADOS EN MATERIA

DE INOCUIDAD DE LOS

ALIMENTOS EN BENEFICIO DEL

SECTOR PRODUCTIVO DE

CÁRNICOS, PRODUCTOS DE

FRUTAS Y A BASE DE VEGETALES

I.1. PROGRAMAS INTERNACIONALES IMPLEMENTADOS EN MATERIA DE

INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

I.1.1. Política de Inocuidad, CHILE 2009-2015. Unidad de Diseño FUCOA, Ministerio de

Agricultura.

Su objetivo es velar por la inocuidad de los alimentos

producidos, elaborados y comercializados en el país con el fin

de resguardar la protección de la salud de las personas y de los

derechos de los consumidores, además de favorecer el

desarrollo competitivo y exportador de la industria de los

alimentos. Esto, a través de un moderno, integrado, eficiente y

transparente sistema de inocuidad de los alimentos.

Como objetivos específicos se planea:

1. Perfeccionar el marco regulatorio

a. Contar con un marco regulatorio armonizado o

equivalente con las normas internacionales del

Codex Alimentarius.

i. Mantener actualizadas las normativas

de inocuidad con respecto al Codex

Alimentarius en los casos que corresponda.

ii. Revisar una legislación nacional a fin de analizar si se están detectando los

fraudes alimentarios.

b. Fortalecer la presencia de Chile en instancias internacionales.

i. Dar mayor relevancia al trabajo del Comité Nacional del Codex

Alimentarius.

ii. Robustecer la participación Chilena en el Codex Alimentarius.

2. Fortalecer las capacidades científicas y tecnológicas

a. Aumentar y mejorar la capacidad de los recursos humanos.


63

i. Desarrollar programas permanentes de capacitación.

ii. Apoyar la formación de post-títulos y post-grados.

b. Robustecer la investigación e innovación.

i. Definir agenda de investigación e innovación.

ii. Favorecer la incorporación de los temas de inocuidad de las agencias que

financian investigación.

iii. Desarrollo e innovación.

iv. Fomentar la constitución de consorcios tecnológicos

c. Fortalecer la capacidad analítica de la red de laboratorios.

i. Articular el sistema nacional de referencia.

ii. Impulsar la implementación de metodologías analíticas en ámbitos

emergentes.

3. Modificar los sistemas de control y vigilancia de los alimentos

a. Ampliar y consolidar las prácticas y mecanismo de autocontrol de los peligros

alimenticios.

i. Apoyar la implementación de sistemas de aseguramiento de la calidad en

las empresas de alimentos.

ii. Actualizar las modalidades de inspección de las empresas de alimentos.

iii. Rediseñar programas de fiscalización de la cadena alimentaria.

b. Mejorar programas de control e higiene de los alimentos.

i. Coordinar los programas de control de residuos de alimentos pecuarios e

hidrobiológicos.

ii. Coordinar los programas de control de residuos de plaguicidas en

productos vegetales.

iii. Integrar los programas de control de toxinas marinas.

iv. Implementar programas conjuntos de control de patógenos transmitidos por

alimentos.

c. Desarrollar un sistema de información de inocuidad integrado consistente y eficaz.

i. Compatibilizar los sistemas de información institucionales.

d. Modernizar la gestión de alertas alimentarias.

i. Desarrollar un sistema integrado de gestión de alertas alimentarias.

Perfeccionar el sistema de manejo de alertas vinculado a la exportación de

alimentos a la Unión Europea.

4. Favorecer el comercio internacional perfeccionando procesos de control y certificación de

exportaciones.

a. Mejorar los procedimientos de autorización de importación de los alimentos.

b. Perfeccionar los procesos de control y certificación de la inocuidad de los

productos alimenticios de exportación.

i. Definir un estándar mínimo de inocuidad de exportación.


64

ii. Evaluar la alternativa de hacer obligatoria la certificación de las

exportaciones de alimentos.

iii. Precisar las competencias institucionales para el control, inspección y

certificación de la inocuidad de los alimentos de exportación.

iv. Avanzar en la implementación de la certificación electrónica de las

exportaciones.

5. Promover la industria alimentaria en todos sus eslabones

a. Propiciar la ampliación de las capacidades técnicas y operativas de las empresas en

ámbitos de inocuidad.

i. Difundir e impulsar la aplicación de la Resolución Exenta no. 187, de 2008,

del Ministerio de Salud, referida a los sistemas de control preventivo.

ii. Intensificar el uso de los instrumentos del SENCE.

b. Perfeccionar y ampliar los instrumentos de fomento para las pequeñas y medianas

empresas.

i. Ampliar los programas de fomento relacionados con el aseguramiento de la

calidad

ii. Diseñar e implementar un programa de buenas prácticas de distribución en

las principales ferias mayoristas de alimentos.

6. Desarrollar un marco institucional que facilite y promueva la coordinación y

complementación de las entidades públicas.

a. Modernizar la institucionalidad pública relacionada con la inocuidad alimentaria.

i. Creación por Ley de la Agencia Chilena de Inocuidad de los Alimentos.

ii. Constituir un Comité Científico de Evaluación de Riesgos de los

Alimentos.

iii. Reforzar la modernización del MINSAL, SAG y SERNAPESCA.

iv. Integrar a la agencia el trabajo del Comité Nacional del Codex

Alimentarius.

b. Ampliar y mejorar los mecanismos de participación y de comunicación de los

riesgos.

i. Crear el Consejo Consultivo de la Agencia

ii. Institucionalizar las consultas públicas y la rendición de cuentas.

iii. Intensificar las campañas de información sobre los riesgos alimentarios.

iv. Fortalecer a las organizaciones de consumidores y su acción en el ámbito

de la inocuidad y calidad nutricional de los alimentos.

c. Modernizar la institucionalidad pública relacionada con la inocuidad alimentaria.

I.1.2. Food and Drug Administration Food Safety Program, Estados

Unidos de América

La unión americana cuenta con tres agencias en las cuales se regula la

inocuidad de los alimentos: el United States Department of Agriculture

(USDA), la Food and Drug Administration (FDA) y la Food Safety and

Inspection Service (FSIS).


65

Como parte de su programa se cuenta con un registro de reportes de alimentos, el cual consiste en

un portal para la industria donde puede reportar si hay una probabilidad razonable que el artículo

puede causar consecuencias de salud serias.

Se incluyen también planes de acción específicos como:

1. El plan de acción para la producción inocua

2. El plan de acción para la inocuidad en huevo

3. El plan de acción de acrilamida

El plan de protección de la FDA de 2007 establece una estrategia global e integrada de prevención,

intervención y la respuesta.

Para acceso de información al público en general está disponible el portal Food Safety.gov en el

cual se proporciona información sobre el manejo seguro de los alimentos, información básica de

patógenos, higiene, campañas, alertas, entre otros. En esta página se pueden reportar los casos por

intoxicación, así como se puede tener acceso a un experto a través de un chat. El portal está

disponible en inglés y español.

El documento principal que engloba la inocuidad de los alimentos está definido como el Food

Safety Modernization Act (FSMA) donde se incluyen títulos como:

1. Mejorar la capacidad para evitar problemas de seguridad alimentaria, donde se incluyen

temas como la inspección de los registros, el registro de instalaciones alimenticias, el

análisis de riesgos y peligros basados en los controles preventivos, normas de desempeño,

normas para la inocuidad de los productos, protección contra la adulteración intencional, la

colecta de honorarios por la autoridad, la estrategia para la agricultura nacional y la defensa

de los alimentos, consejos de coordinación para la alimentación y la agricultura, creación de

capacidad nacional, el transporte sanitario de los alimentos, manejo de alergia a los

alimentos y la anafilaxia, nuevos ingredientes de la dieta, requerimiento para la guía para el

procesamiento de la cosecha de ostras crudas, compra en el puerto e instalaciones

relacionadas con el alcohol.

2. Mejorar la capacidad para detectar y responder a los problemas de inocuidad en alimentos

donde se incluye la focalización de los recursos de inspección de las instalaciones

nacionales, las instalaciones extranjeras y puertos de entrada; informe anual, la acreditación

de laboratorios para el análisis de los alimentos, consorcio integrado por redes de

laboratorio, mejorar el seguimiento y el rastreo de los alimentos y el mantenimiento de

registros, vigilancia, autoridad de retiro obligatorio, la detención administrativa de los

alimentos, planes y normas para la descontaminación y desecho, mejorar la capacitación de

funcionarios en la inocuidad alimentos estatales, locales, territoriales y tribales, mejorar la

inocuidad de los alimentos, mejorar el registro de incidentes sanitarios.

3. Mejorar la seguridad de la comida importada que incluye el programa de verificación de

proveedores extranjeros, el programa del importador voluntario calificado, autoridad para

requerir certificaciones de importación de alimentos, notificación previa de embarques de

alimentos importados, fortalecimiento de la infraestructura de los gobiernos extranjeros con

respecto a la inocuidad de los alimentos, inspección de las instalaciones de preparación de

alimentos extranjeras, acreditación de los auditores externos, oficinas de relaciones

exteriores de la FDA y el contrabando de alimentos.


66

4. Otras disposiciones, que incluye la financiación de la inocuidad alimentaria, la protección

de los empleados, jurisdicción, autoridades, el cumplimiento de los acuerdos

internacionales determinación de los efectos presupuestarios.

Entre otros programas se incluyen:

1. El programa de la USDA y FSIS, “FY 2008-2013, Strategic plan” que tiene 6 objetivos

principales tales como:

a. Reforzar la inspección, los sistemas de ejecución y las operaciones para proteger

la salud pública.

b. Mejorar el uso del análisis de riesgos y la vulnerabilidad con el enfoque del FSIS

para proteger la salud pública.

c. Mejorar el desarrollo de la ciencia y las políticas basadas en el riesgo y los

sistemas.

d. Mejorar el desarrollo y el mantenimiento de la colección de datos y sistemas de

análisis para verificar la eficacia y eficiencia de la agencia de programas.

e. Mejorar el desarrollo y mantenimiento de una infraestructura innovadora que

soporta la misión de la agencia y sus programas.

f. Mejorar la eficacia de la agencia en divulgación y comunicaciones para alcanzar

las metas de salud pública.

2. El programa de FSIS “FY 2011-2016, Strategic Plan” que contiene tres temas

estratégicos:

a. Prevención de enfermedades producidas por alimentos: asegurar de que la

inspección de seguridad alimentaria se alinea con los riesgos existentes y

emergentes, maximizar el cumplimiento nacional e internacional con las políticas

de inocuidad de los alimentos, mejorar la educación pública y divulgación para

mejorar la manipulación de los alimentos, fortalecer la colaboración entre las

partes interesadas internas y externas a prevenir las enfermedades transmitidas por

los alimentos.

b. Comprender e influir en la cadena del campo a la mesa: utilizar con eficacia la

ciencia para entender las enfermedades transmitidas por los alimentos y las

tendencias emergentes e implementar políticas efectivas para responder a los

riesgos existentes y emergentes.

c. Fortalecer la capacitación de las personas e infraestructura: Facultar a los

empleados con la formación, recursos y herramientas para facilitar el éxitoen la

protección de la salud pública, en base de las necesidades definidas de la agencia,

desarrollar, mantener y utilizar metodologías innovadoras, procesos y

herramientas, incluyendo PHIS, para proteger la salud pública eficiente y

eficazmente y apoyar las necesidades y metas definidas por la salud pública.

I.1.3. European Commission DG Health and consumers,

SANCO

Esta comisión tiene como objetivos capacitar a los

consumidores, proteger y mejorar la salud pública, garantizar

que los alimentos en Europa (Unidad Europea, UE) sean

seguros y saludables, proteger la salud y el bienestar de los


67

animales de granja y proteger la salud de los cultivos y los bosques.

Parte de sus estrategias es a través de tres puntos básicos:

1. Vigilancia: una vez que la UE ha aprobado leyes sobre la alimentación y la seguridad

de los productos, los derechos del consumidor o la salud pública, corresponde a los

gobiernos nacionales, regionales y locales el aplicar las leyes para asegurar que los

comerciantes, los fabricantes y los productores de alimentos se adhieran a las reglas.

Parte del trabajo de la comisión es comprobar que ésto está sucediendo realmente.

2. Escuchando: para ser eficaz, sus políticas tienen en cuenta las políticas relacionadas

con la UE, por ejemplo sobre el comercio, la competitividad y el medio ambiente y las

preocupaciones de nuestros grupos de interés. A través de una amplia consulta se

enfocan en conocer la opinión de todas las partes interesadas.

3. Actuar: donde se necesita la acción de la UE, realiza propuestas que utilizan una

mezcla de leyes, el apoyo a proyectos y otras medidas. También apoya a las autoridades

nacionales o regionales.

Europa cuenta con la European Food Safety Authority (EFSA) que

es considerada la piedra angular de la Unión Europea (UE) en materia

de evaluación de riesgos e inocuidad de los alimentos. Colabora

estrechamente con las autoridades nacionales y proporciona

asesoramiento científico independiente y clara comunicación sobre

los riesgos existentes y emergentes.

El objetivo central de la política de la Comisión Europea sobre

inocuidad alimenticia es asegurar un alto nivel de protección de la salud humana y los intereses de

los consumidores en relación con los alimentos, teniendo en cuenta la diversidad, incluidos los

productos tradicionales, al tiempo que garantiza el funcionamiento eficaz del mercado interior.

La Comisión Europea tiene un portal como un sistema de alertas

conocido como RASFF (Rapid Alert System for Food and Feeds)

donde se encuentra información general, notificaciones e informes,

alertas entre otros. Además, la Comisión Europea y el RASFF

colaboran con el sistema de alerta de la Organización Mundial de la

Salud (OMS), llamada Red de Autoridades en materia de Inocuidad

de los Alimentos (INFOSAN). Esta red está formada por puntos de

contacto o centros de enlace nacionales en más de 160 países miembro que reciben información de

la OMS en forma de notas de INFOSAN en materia de seguridad alimentaria y la difunden a todos

los ministerios competentes en sus respectivos países. El RASFF colabora con INFOSAN y los dos

sistemas comparten información caso por caso.

La principal guía de la comisión es el Libro Blanco sobre seguridad slimentaria, que consiste en

aplicar un enfoque integrado del campo a la mesa involucrando a todos los sectores de la cadena

alimentaria, incluyendo la producción de piensos, producción primaria, procesamiento de alimentos,

almacenamiento, transporte y venta al por menor.

En este libro se presentan propuestas que transformarán la política alimentaria de la UE en un

instrumento anticipador, dinámico, coherente y global con el propósito de velar por un nivel


68

elevado de salud de las personas y de protección de los consumidores a través de un planeamiento

global e integrado.

Considera que la recopilación y el análisis de información son elementos esenciales de la política de

seguridad alimentaria, y resultan de especial importancia para la detección de peligros potenciales

en la alimentación animal y humana. Esto incluye una apropiada supervisión y vigilancia, sistemas

de alerta, investigación, cooperación científica, apoyo analítico, sistemas actuales de asesoramiento

científico, consulta obligatoria de comités, necesidades de redes científicas, entre otros.

Propone la necesidad de un nuevo marco jurídico para la seguridad alimentaria que esté formado

por un conjunto de normas coherentes y transparentes en materia de seguridad alimentaria.

Regulación de los alimentos para animales, de nuevos productos, aditivos, plaguicidas, ionización

en alimentos, residuos y disposición, alimentos modificados genéticamente, alimentos dietéticos,

proceso de comunicación de riesgos, etiquetado y publicidad, medidas de emergencia, toma de

decisiones, entre otros.

I.1.4. Ley Básica de Inocuidad en Alimentos, Food Safety

Commission, JAPON (2003, amd. 2006)

“En consideración a la importancia vital de las respuestas

precisas para el desarrollo de la ciencia y la tecnología, así

como al avance de la internacionalización y otros cambios que

rodean el entorno de los hábitos alimenticios de Japón, se

propone esta Ley para promover ampliamente las políticas

para garantizar la inocuidad alimenticia mediante el

establecimiento de principios básicos, al aclarar las responsabilidades de los gobiernos estatales,

locales y de la industria de los alimentos y el papel de los consumidores. Así como el

establecimiento de una dirección básica para la formulación de políticas, con el fin de garantizar la

inocuidad alimenticia”.

Esta ley está compuesta por tres capítulos principales:

1. Capítulo I. Disposiciones generales (Artículos 1-10), que contempla el propósito,

definiciones, reconocimiento básico para tomar medidas que aseguren la inocuidad de

los alimentos, medidas apropiadas en cada etapa del proceso del suministro de

alimentos, prevención de efectos adversos en la salud de los ciudadanos,

responsabilidades del estado, responsabilidades de gobiernos estatales, responsabilidad

de las empresas relacionadas con la alimentación, el papel del consumidor y medidas

legislativas.

2. Capítulo II. Dirección básica para la formulación de políticas(artículos11-21): La

aplicación de la evaluación del efecto de los alimentos en la salud, formulación de

políticas sobre la base de los resultados de la evaluación del efecto de los alimentos

sobre la salud en consideración de las condiciones de los hábitos dietéticos de los

ciudadanos y otras circunstancias, promoción de intercambio de información y

opiniones, establecimiento de un sistema para hacer frente a emergencia y otras

situaciones, cooperación cercana y mutua entre cuerpos administrativos relacionados,

establecimiento de investigación y otros sistemas, colección, organización y utilización

de información interna y externa, asegurar el etiquetado apropiado, educación y


69

aprendizaje referente a la inocuidad de los alimentos, consideración de los efectos en el

ambiente y la determinación y publicación de los asuntos básicos relativos a la

aplicación de las medidas.

3. Capítulo III. Comisión de seguridad alimentaria (artículos22-38): establecimiento,

obligaciones oficiales bajo la jurisdicción de la comisión, opinión de la comisión,

requerimiento de materiales, misión de la investigación, requerimientos en

emergencias, organización, nombramiento de los miembros de la comisión, plazo,

despido, servicio, salario de un miembro de la comisión, presidente, reuniones,

miembro experto de la comisión, secretario y la delegación de orden ministerial.

I.1.5. Programa Nacional de Inocuidad de los Alimentos, Ministerio de Salud Pública,

Viceministerio de Higiene y Epidemiología, Dirección Nacional de Salud Ambiental, Cuba 2001

Este programa se basa en el principio de integrar todos los factores tanto dentro del sector salud

como extrasectorialmente en función de la inocuidad de los alimentos para garantizar una mejor

salud para los consumidores y facilitar el comercio y exportación.

Como objetivos contempla:

1. Actualizar las actividades de vigilancia de las enfermedades transmitidas por alimentos

(ETA) integrando otros factores intra y extrasectorialmente.

2. Desarrollar la inspección sanitaria en coordinación con los organismos rectores

vinculados, productores y de servicio para la aplicación de medidas efectivas y

coherentes para la eliminación de los factores de riesgo detectados.

3. Desarrollar e impulsar la capacitación para la prevención de las ETA, entre el personal

de salud, los organismos productores, comercializadores y de servicio, asi como a la

población.

4. Desarrollar la comunicación de riesgos y la participación comunitaria para la

prevención de los ETA.

5. Establecer una red de laboratorios para profundizar en el estudio de las ETA y el

control de los alimentos en general.

6. Establecer las normas y procedimientos que correspondan para el desarrollo del

sistema, mediante la normalización y el control de calidad.

7. Coordinar y desarrollar las investigaciones necesarias entre los organismos

involucrados de investigación y docentes paraobtener información necesaria para el

control, así como la tecnología que conlleva a la reducción de ETA.

Este trabajo está orientado a atender y evaluar los riesgos que se presenten en agua, carne y

productos cárnicos (mataderos y fábricas de embutidos), alimentación colectiva, alimentación en el

hogar, distribución y conservación de alimentos y producción primaria (leche, frutas y vegetales,

otros).

I.1.6. Canadian Food Inspection Agency. Food Safety Enhancement Program Manual. Canadá.

El Gobierno de Canadá basa sus estrategias en

materia de inocuidad alimentaria en el Manual del

Programa de Mejoramiento de la Seguridad

Alimentaria (FSEP), el cual a través de la Agencia

Canadiense de Inspección Alimenticia (CFIA)


70

especifica los requisitos mínimos necesarios para una gestión de un sistema efectivo en seguridad

alimentaria.

El FSEP proporciona un mecanismo para que los operadores de los establecimientos demuestren su

capacidad para controlar los riesgos para mantener la inocuidad alimentaria con el fin de asegurar

que los alimentos sean inocuos para el consumidor. Además, ayuda a mejorar las habilidades de

producción de los establecimientos para alcanzar y mantener el cumplimiento de las disposiciones

reglamentarias.

El FSEP se basa en los principios del sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control

(Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP)) desarrollado por la Comisión del Codex

Alimentarius. HACCP es un sistema de reconocimiento internacional, basado en la ciencia de los

alimentos y su seguridad, diseñado para prevenir, reducir o eliminar las posibles amenazas

biológicas, químicas o físicas para alcanzar la inocuidad en los alimentos.

El sistema de HACCP es responsabilidad de los establecimientos. El fabricante de los alimentos

tiene el control máximo sobre el producto y de este modo puede tener el mayor impacto en la

seguridad de los alimentos producidos.

El FSEP especifica los requisitos para un sistema de HACCP eficaz que combina la siguiente clave

de elementos para garantizar la producción de alimentos seguros:

Programas de requisitos previos

Planes HACCP (puede incluir controles de procesos vinculados a un punto crítico de

control)

Validación de los puntos críticos de control

Mantenimiento y reevaluación de procedimientos

Aunque la adopción de sistemas de HACCP en todo el mundo se debe principalmente a la seguridad

alimentaria y a la protección de los consumidores, existen otros beneficios para la industria de

alimentos que se pueden realizar mediante la implementación del sistema exitoso de HACCP.

El sistema de HACCP formalmente incorpora los principios de inocuidad de los alimentos como

medidas integrales de los procesos de producción. La implementación y el mantenimiento de

medidas de control desempeñan un papel fundamental en la sensibilización de la gestión frente a la

línea de producción y el personal.

Los establecimientos que han implementado un sistema HACCP ofrecen a los consumidores un

mayor grado de confianza debido a que demuestra que el objetivo de la empresa es producir un

producto alimenticio seguro.

El mercado sigue impulsando la aplicación del HACCP en la industria alimentaria. En muchos de

los casos, las exigencias del comprador y los gobiernos extranjeros requieren la aplicación del

HACCP para mantenerse en el mercado y/o acceder a los mercados antes inaccesibles. Como los

sistemas de HACCP son aceptados en todo el mundo, el FSEP ayuda a la industria Canadiense a

mantener y ampliar sus mercados internacionales.


71

RECOMENDACIONES PARA

ESTABLECER UN PROGRAMA DE

VERIFICACIÓN INTERNO EN

MÉXICO I. JUSTIFICACIÓN DE POSIBLE IMPLEMENTACIÓN EN MÉXICO

En materia de inocuidad de los alimentos, México actualmente basa sus estrategias en el Programa

Nacional de Desarrollo 2007-2012, Objetivo 8. “Abastecer el mercado interno con alimentos de

calidad, sanos y accesibles provenientes de nuestros campos y mares”, Estrategia 8.1., que

contempla proteger al país de plagas y enfermedades, mejorar la situación sanitaria, garantizar la

aplicación de la normatividad vigente en materia de sanidad e inocuidad alimentaria y mantener el

reconocimiento y estatus sanitario en los mercados globales.

La Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA) a

través del Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) realiza

actividades siguiendo los lineamientos del Programa Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad

Agroalimentaria (2007-2012) que incluye estrategias para la regulación, la protección, la difusión

y la capacitación en materia de inocuidad con el objetivo de beneficiar a los consumidores y a los

productores de la industria agroalimentaria que permite la exportación de diversos productos a otros

países.

Como lo señala el Programa de Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria se

requieren mejores herramientas para lograr un refuerzo continuo en el área de notificación

de plagas y enfermedades, la capacitación de grupos de vigilancia y el aumento de laboratorios

de diagnóstico públicos y privados.

Con el objetivo de mejorar la difusión de alertas al público consumidor en

el país, en noviembre de 2010, el Gobierno Federal apoyado por la

European Commission lanzó el portal de internet:

Red de Alerta Rápida (RAR, www.alertas.gob.mx)

RAR es considerado el medio oficial de comunicación de alertas para los consumidores en el cual

se emiten alertas de las diferentes dependencias del Gobierno Federal en materia de salud,

protección al consumidor, sanidad, inocuidad y calidad agroalimentaria.

El alcance de esta herramienta es fortalecer los derechos de los consumidores como camino para

elevar el bienestar de los mexicanos y aumentar la eficiencia en los mercados.

En este sitio se encuentran alertas de:

la Comisión Federal de Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS),

de la Procuraduría Federal del Consumidor (PROFECO) y

http://www.alertas.gob.mx/


72

del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA).

La sección de Información al Consumidor de RAR está conformada por noticias de COFEPRIS,

PROFECO, SENASICA, Administración General de Aduanas, Noticias internacionales y CPSC.

Desafortunadamente, la sección de denuncias y contacto no están disponibles por el momento, así

como la asesoría a proveedores y preguntas frecuentes.

Este sitio web también ofrece la notificación de alertas vía correo electrónico y se encuentra

disponible en Facebook y twitter.

Se recomienda realizar una campaña más ambiciosa para dar a conocer RAR y sus

aplicaciones, esto a través de los diferentes medios de comunicación con la finalidad de invitar a

los consumidores a apoyarse en esta herramienta oficial. Un mejor soporte técnico y la

incorporación de un chat en línea que pueda resolver dudas en tiempo real enriquecerían este

portal.

Es importante que la población conozca RAR para que evite confiar en alertas con información

confusa o errónea a través de medios de comunicación no oficiales.

Sería de gran relevancia que RAR publicara el seguimiento a las denuncias presentadas por los

ciudadanos especialmente en materia de intoxicación por alimentos en mal estado y su

recurrencia.

El bajo impacto de difusión entre la población fue demostrado en el análisis de la campaña de

promoción de cultura sanitaria agroalimentaria de SENASICA en 2010. En este documento se

destaca que aunque gran parte de la población asegura tener conocimientos sobre la sanidad e

inocuidad de los alimentos, tienen poco o escaso conocimiento sobre el SENASICA. Entre las

recomendaciones de los entrevistados se incluía que era indispensable una mayor difusión de la

dependencia y sus programas a través de la radio, internet y algunos medios impresos de circulación

nacional o local. Esto brinda una excelente oportunidad a este órgano desconcentrado para

difundirse como autoridad e normativa en la materia a través de la oferta de información oportuna,

veraz y clara para la población.

En materia de vigilancia, el Gobierno Federal a partir de 2011 implementó la Red de Alerta

Rápida Interna (RARI-SENASICA) que funciona como una herramienta tecnológica que permite

obtener y analizar información de manera rápida y en tiempo real, para detectar oportunamente

amenazas que pudieran poner en riesgo el patrimonio agroalimentario del país.

La RARI-SENASICA conjunta la información que emiten las diferentes áreas

técnicas de este órgano desconcentrado de la SAGARPA: Sanidad vegetal,

salud animal, inocuidad agroalimentaria e inspección fito-zoosanitaria. En


73

tiempo real se concentra información a la RARI-SENASICA de los 232 laboratorios que integran la

red de laboratorios del SENASICA; los 322 puntos de verificación e inspección interna del

territorio nacional y de la red de vigilancia interna y externa a nivel federal que consta de 36 puntos

de verificación en inspecciones federales, 19 cruces fronterizas, 15 puertos marítimos y 29

aeropuertos.

Es por ello que en caso de que se presentara alguna emergencia sanitaria relacionada con el sector

agroalimentario de nuestro país, esta infraestructura ofrece la posibilidad de actuar eficaz y

oportunamente en su contención, pues permitiría al grupo multidisciplinario de expertos del

SENASICA analizar a detalle y en forma inmediata, la información para medir el riesgo y de esta

manera implementar rápidamente las medidas y operativos pertinentes.

Esta plataforma promueve la utilización de medidas sanitarias y de procedimientos de evaluación

acordes con la Organización Mundial de Comercio (OMC). Fue diseñada con base en los estándares

establecidos por otros organismos internacionales como la Organización de las Naciones Unidas

para la Alimentación y la Agricultura (FAO), la Organización Mundial de la Salud (OMS), la

Organización Norteamericana de Protección a las Plantas (NAPPO) y la Organización Mundial de

Sanidad Animal (OIE).

RARI es compatible con la Red de Alerta Rápida Nacional (RAR) y con las principales redes de la

Unión Europea en materia de protección al consumidor: European Rapid Alert System for non-food

consumer products (RAPEX), que funciona para productos inseguros no alimenticios; y Rapid Alert

System for Food and Feed (RASFF), para alimentos y forrajes e insumos para la producción

agropecuaria, considerados potencialmente peligrosos.

Se recomienda que RARI incorpore a un número mayor de instituciones de investigación y

académicas, así como laboratorios de servicios con el objetivo de incrementar la probabilidad de

detectar un hallazgo. Es importante que el sitio web contenga información sobre los requisitos

necesarios para ser incorporado a esta red. Un adecuado soporte técnico es la base para el

funcionamiento eficaz de este sitio.

En general, para el control en materia de inocuidad alimentaria se debe reforzar constantemente

los recursos de inspección en las instalaciones nacionales, incrementar el número de

laboratorios acreditados, hacer más eficiente la rastreabilidad, mejorar la capacitación a niveles

estatales y locales y optimizar el registro de incidentes sanitarios. Es importante, aumentar la

seguridad de la comida importada, la detención administrativa de alimentos y el retiro obligatorio.

Para dar soporte a todos estos controles es indispensable la actualización de las normas oficiales

mexicanas.

Un punto de gran relevancia para la mejora continua en materia de inocuidad en alimentos es el

papel de la investigación y la transferencia de tecnología. El Programa Sectorial de Desarrollo

Agropecuario y Pesquero SAGARPA 2007-2012, punto 1.1.4. “Investigación, transferencia de

tecnología e innovación” señala que existe un fuerte rezago en el gasto interno en investigación y

desarrollo experimental (GIDE), pues solo se aplica un 0.44 % del PIB promedio en todas las áreas

y 0.17 % en el sector agropecuario, lo cual incide en la baja competitividad de los sistemas de

producto. En el sector agropecuario se cuenta con 0.6 investigadores por cada 10 mil habitantes, lo

cual está muy por debajo de los estándares internacionales.


74

A esto es necesario agregar la edad promedio de los investigadores que es de alrededor de 50 años

con 25 años de servicio, por lo que es urgente establecer programas de formación e

incorporación de investigadores jóvenes.

La mayoría de las instituciones de investigación y educación superior, presentan un fuerte

rezago en infraestructura, equipo, renovación y formación de recursos humanos en temas de

vanguardia. No existen esquemas de capital de riesgo que estimulen la innovación tecnológica en

el sector rural. El Sistema Nacional de Investigación y Transferencia Tecnológica para el Desarrollo

Rural Sustentable (SNITT) ha organizado instrumentos importantes de trabajo, pero no ha

alcanzado la fortaleza y estructura necesaria para cumplir a cabalidad las funciones que considera la

Ley de Desarrollo Rural Sustentable.

La agenda de transferencia tecnológica del campo mexicano, se lleva a cabo a través del modelo de

las fundaciones Produce, del cual han resultado algunas innovaciones relevantes, que es necesario

replicar, para lograr mayores impactos en el medio rural.

Actualmente las instituciones de investigación y educación superior mantienen una débil

vinculación con la Secretaría de Agricultura, Ganadería Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación

(SAGARPA), con la Asociación Mexicana de Secretarios de Desarrollo Agropecuario (AMSDA) y

con el sector productivo y empresarial del sector agropecuario, lo que provoca una falta de

alineamiento de la comunidad científica con los requerimientos actuales del país.

Los sistemas de administración de las instituciones de investigación y educación superior presentan

problemas burocráticos que limitan su capacidad de respuesta. Es necesario redoblar los esfuerzos

de transferencia de tecnología para hacer llegar a los productores los resultados de la

investigación.

Se recomienda implementar un programa nacional de ensayos de aptitud, y la disposición de

materiales de referencia certificados nacionales, para la medición de los organismos

microbiológicos causantes de ETAs que coadyuven en la validación de metodología y al

aseguramiento de la calidad del resultado de una medición.

Proveedores de ensayos de aptitud acreditados

Se presenta a continuación un listado con los datos generales y de contacto de proveedores de

ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologías de detección de microorganismos patógenos en alimentos, con el propósito de reforzar las recomenadaciones y brindar opciones a los laboratorios de análisis y detección de microorganismos patógenos de los alimentos para que pueden establecer un programa de verificación interno. Estas recomendaciones atraerán clientes a dichos laboratorios certificados para usar sus servicios de análisis y detección y asu vez, los clientes tendrán la certeza de que los resultados de los análisis son confiables.


75

Proveedores de Ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologías

de detección de microorganismos patógenos en alimentos

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Acreditado por

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76

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Acreditado por

Swedac

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Cuenta de

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(30°C y

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Cobden Street

Bury, Lancashire

BL9 6AW

United Kingdom

http://www.biose

nate.com/downlo

ads-pdf-

format/senate-

m1-meat-and-

seafood-

proficiency-

testing-

scheme.htm

Acreditado por

el UKAS

(United

Kingdom

Accreditation

Service). No

de proveedor

de ensayo de

aptitud: 4335

Listeria

spp.

Detecció

n

Listeria

monocytoge

nes

Detecció

n

Enumera

ción

Escherichia

coli

O157:H7

(VT–ve)

Detecció

n

Staphyloco

ccus

coagulasa

positivo

Enumera

ción

https://www2.slv.se/absint/index.aspx?selected=start



http://www.biosenate.com/downloads-pdf-format/senate-m1-meat-and-seafood-proficiency-testing-scheme.htm










77

Vibrio

cholerae

(Non 01)

Detecció

n

Marisco

s

Vibrio spp./

V.

parahaemol

yticus

Detecció

n

Staphyloco

ccus

coagulasa

positivo

Enumera

ción

Listeria

spp.

Detecció

n

Listeria

monocytoge

nes

Detecció

n

Enumera

ción

Escherichia

coli

genérica y

coliformes

Determi

nación

por

método

petrifilm

(AOAC

17th

998.08)

Product

os y

subprod

uctos

cárnico

s

Centro

Nacional

de

Servicios

de

Constata

ción en

Salud

Animal.

Servicio

Nacional

de

Sanidad,

Inocuida

d y

Calidad

Agroali

mentaria

(SENAS

ICA)

Carretera

Cuernavaca a

Cuautla No 8534

Col. Progreso,

Jiutepec

Morelos, C.P.

62550

http://www.ema.o

rg.mx/descargas/e

nsayos_aptitud/pr

oveedores/PEA_

Reconocidos_ene

_ILACG13_2007

.pdf

Reconocido

por la ema

(entidad

mexicana de

acreditación,

a. c.). No. de

reconocimient

o: PEA-ENS-

03

Salmonella

spp.

Determi

nación

por

método

FSIS

(FSIS

MLG,

2008,

Ch. 4.04,

rev. 4

04

/02/08)

Listeria

monocytoge

nes

Aislamie

nto e

identific

ación

por

método

FSIS

(FSIS

http://www.ema.org.mx/descargas/ensayos_aptitud/proveedores/PEA_Reconocidos_ene_ILACG13_2007.pdf








78

MLG,

2009,

Ch. 8.07,

rev. 7 03

/08/09)

Escherichia

coli

0157:H7

Determi

nación

por el

método

Reveal

(BAM

1998 /

AOAC

17th,

2000.13)

E. coli

Prueba

cuantitati

va

Carne

molida

DRRR(

Servicio

de

referenci

a alemán

de

análisis

de

alimento

s y

compete

ncia en

materiale

s de

referenci

a)

Bodmanstraße 4,

87435 Kempten,

Geremany

http://www.drrr.d

e/

Acreditado por

la DAKKS (

Agencia

Alemana de

Acreditación).

No. de

reconocimient

o: D-EP-

17063-01-00

Listeria

monocytoge

nes

Ensayo

cuantitati

vo

Salmonella

Ensayo

cuantitati

vo

Staphyloco

ccus

Ensayo

cuantitati

vo

http://www.drrr.de/

http://www.drrr.de/


79

PROPUESTAS DE MEJORA A LA

NORMATIVIDAD

Observaciones y propuestas de modificación a la normativa Nacional de productos del mar

Los resultados del análisis de la normativa nacional e internacional sobre las metodologías

empleadas en la actualidad, para la detección de microorganismos patógenos responsables de las

enfermedades de transmisión por alimentos (ETAs) de origen acuático, las investigaciones sobre los

mecanismos de virulencia de los principales patógenos relacionados con las ETAs de este tipo de

alimentos, así como el conocimiento y experiencia que se tiene sobre las prácticas que se llevan a

cabo en los diferentes eslabones desde la cadena productiva o de captura hasta el consumidor, nos

permite plantear las siguientes consideraciones y recomendaciones a la Normatividad en México

relacionada con el aseguramiento de la inocuidad de productos derivados de la pesca y la

acuicultura:

Observaciones:

a) Se requiere una revisión de los criterios microbiológicos concertados en la NOM-242-

SSA1-2009 ya que no considera en algunos casos, el efecto del procesamiento del alimento,

sobre los microorganismos potencialmente presentes. Lo anterior puede ser considerado

como una posible sobrerregulación.

b) Debería aplicarse el mismo criterio microbiológico de Coliformes fecales y E. coli para

pescados, crustáceos y moluscos en la presentación de frescos, refrigerados y congelados.

c) Algunos aspectos biológicos de los patógenos, conjuntamente con la presentación de los

productos (ahumados, enlatados, envasados al vacío, frescos, congelados etc.) y los hábitos

alimenticios son considerados de manera muy superficial y posiblemente implique

modificación de los criterios, considerando principalmente la actual situación de la

acuicultura y las prácticas de pesca.

d) La normativa nacional debe estar acorde con los avances en la implantación de buenas

prácticas de pesca y producción acuícola, para poder ser homologadas con las de los países

de primer mundo en cuanto a los criterios microbiológicos.

e) La norma debería establecer de manera clara y sin ambigüedades el esquema de muestreo

para los diferentes productos, con base en un criterio científico (tamaño de muestra,

aleatoriedad, procedimiento, etc.,).

f) La búsqueda de la toxina botulínica y la enterotoxina estafilocóccica solo está considerada

para emergencias sanitarias y no están consideradas otras toxinas termoestables. Deberían

realizarse estudios epidemiológicos para sustentar lo anterior para los productos derivados

de la pesca (continental, ribereña y altamar) y acuicultura.

g) No se hace diferenciación de los criterios microbiológicos en productos ahumados en frio o

en calor, ni considera la importancia del empaque.

h) Se debería considerar el análisis de ausencia de toxina botulínica en productos salados y

seco-salados así como de Pseudomonas.

i) Debería existir una definición clara para las diferentes presentaciones de los alimentos

(crudos, semipreparados, listos para comer y diferentes combinaciones).


80

Propuestas

1. Incorporación de métodos alternos para la detección de genes relacionados con entero

toxinas en alimentos acuáticos contaminados. Por ejemplo; el gen stx1 (para Shiga

toxinas), el hlyA (para hemolisina de V. cholerae), el tdh-1 (hemolisina termoestable de

V. parahaemolyticus, el hly (para hemolisina de Listeria monocytogenes), el nuc (para

nucleasa termoestable de Staphylococcus aureus), entre otros. La determinación

específica puede estar ligada a la detección primaria del patógeno con métodos

normalizados. Importante que no represente una sobrerregulación pero si un incremento

en el nivel de seguridad para el consumidor. La generación de la capacidad diagnóstica

de las cepas toxigénicas debe o puede ser realizada por laboratorios de investigación

con procedimientos de validación estrictos y aplicarse en un estudio epidemiológico y

en casos de emergencias sanitarias.

2. Generar mecanismos que de manera rápida y transparente, sin la tramitología que

implica actualmente la modificación de normas, permitan incluir nuevos patógenos o

variantes microbiológicas a los programas de vigilancia epidemiológica en productos

acuáticos.

3. Diseño y ejecución de un programa anual (o bianual) de pruebas de desempeño y

ensayos interlaboratorios, considerando: 1) muestras de referencia, 2) métodos

convencionales (normados) y métodos alternos, 3) participación de laboratorios de

ensayos que demuestren contar con sistema de calidad implementado y que cuenten con

las técnicas estandarizadas y validadas para detección de patógenos en productos

derivados de la pesca y acuicultura, 4) los alcances específicos de cada uno de los

laboratorios involucrados y 5) participación de las autoridades correspondientes.

4. Desarrollo e implementación de un programa de prevención de ETAs, mediante la

aplicación y supervisión de leyes y normas relacionadas con la aplicación de buenas

prácticas en la producción y/o captura de organismos acuáticos. Debe contemplar la

capacitación del personal involucrado y las certificaciones correspondientes.

5. Promover y exigir sistema de trazabilidad en la producción, distribución y venta de

alimentos de origen acuático.

6. Aseguramiento de la calidad e inocuidad de los productos, mediante la supervisión

efectiva a plantas de procesamiento, transporte y venta al público (incluyendo pequeños

establecimientos). Lo anterior bajo el esquema de certificación y autorización de las

autoridades correspondientes.

7. Solicitar una revisión de la norma para evaluar vigencia de los criterios microbiológicos

y la conveniencia de incluir la identificación especifica del patógeno y/o Enterotoxina.

8. Evaluar la conveniencia de incrementar el nivel de seguridad en productos

pasteurizados con respecto a Salmonella (ausente/100g).

9. Considerando los hábitos alimenticios de un importante número de personas y los

problemas de contaminación en diferentes cuerpos de agua, donde se realizan

actividades de pesca y acuicultura, debería incluirse V. cholerae en los análisis

obligatorios para peces y crustáceos (ya que solo se consideran bajo emergencia

sanitaria) y no solo para moluscos bivalvos.

10. Debido a los cada vez mas brotes detectados de V. parahaemolyticus en camarón de

cultivo y relacionado con ETAs, que este patógeno debería ser considerado para su

incorporación como análisis obligatorio.

11. Analizar la conveniencia de crear una RED de laboratorios cuyo papel principal sea

estar a la vanguardia en las metodologías de detección de cepas patogénicas emergentes

en diferentes matrices. Dicha RED participaría, de manera obligatoria, en el programa

de evaluación de desempeño y ejercicios interlaboratorios.


81

CÁRNICOS

Propuesta para la Detección de Vibrio cholerae, V. vulnificus y V. parahaemolyticus.

Existen documentos internacionales validados para el monitoreo de las especies de Vibrio

patógenas al humano en alimentos en general y en México solo es aplicable para alimentos de

cárnicos de origen marino, que es donde la literatura refleja la mayor importancia de monitorearlos.

La revisión realizada respecto a la necesidad de monitorear especies de Vibrio patógenas al

humano, refleja que ésta es indispensable para productos cárnicos de origen marino. En el resto de

los alimentos, la contaminación con especies de Vibrio patógenas al humano es menos frecuente y

se da por contaminación cruzada con agua o alimentos de origen marino. Por tanto, no hay

evidencia contundente que conduzca a sugerir la necesidade implementar el monitoreo de estos

microorganismos en productos cárnicos diferentes al los de origen marino.

Propuesta para la detección de Salmonella spp

Con base a las validaciones y certificaciones internacionales (AOAC) de las plataformas y los

sistemas de detección comercial existentes para diagnóstico y en el hecho que son ampliamente

utilizados en la industria alimentaria para monitoreo interno de las plantas procesadoras de carne y

en que están siendo utilizadas por Estados Unidos y la Unión Europea como pruebas rápidas de

detección de microorganismos, que les permite hacer detenciones para posterior confirmación con

métodos de referencia oficial del país, se sugiere el uso de las siguientes plataformas comerciales

para la detección de Salmonella en productos cárnicos:

1) Sistema de detección genética (GDS, siglas en inglés). Biocontrol. Este sistema acopla la

detección de los microorganismos basados en anticuerpos y en la técnica de PCR en tiempo real.

2) Sistema Bax. Dupont. Este sistema de detección se basa en PCR en tiempo real.

3) ICycler. BioRad. Basado en PCR en tiempo real

4) Pathatrix pooling for Salmonella testing

FRUTAS Y HORTALIZAS

Propuesta para la detección de Salmonella spp

Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los

métodos establecidos por normas extranjeras o técnicas validadas por organismos internacionales.

Recientemente, algunas normas extranjeras hicieron actualizaciones en su esquema de análisis

microbiológicos en los medios de cultivo empleados y disponibles, así como en los métodos de

confirmación, ya que se incluyen algunos medios de cultivo (a continuación se enunciarán) y

métodos rápidos como reacciones bioquímicas rápidas (kits), métodos moleculares (principalmente

las que se basan en hibridación del ADN, incluyendo PCR) y reacciones inmunológicas (ELISA,

RIA y Aglutinación en látex), entre otras modalidades de dichos métodos. No obstante, la NOM en

cuestión no ha considerado el uso de dichos medios de cultivos nuevos (más selectivos y sensibles)


82

y los métodos rápidos de confirmación. Es importante considerar al menos uno de estos medios de

cultivo alternativos y métodos para la confirmación de Salmonella.

En el caso de los medios de cultivo, uno de los cambios recientes en la metodología del BAM/DFA

es el uso de caldo RV para la detección de Salmonella en alimentos con altos y bajos niveles de

microbiota competente. El medio Rappaport-Vassiliadis (RV) reemplaza al medio Selenito Cistina

(SC) en todos los alimentos, excepto para goma Guar. Además, el medio RV reemplaza al caldo

Lauril Triptosa (LT) para ser utilizado cuando hay levaduras activas en el alimento. El caldo

Tetrationato (TT) sigue siendo de selección como un segundo medio selectivo; sin embargo, el TT

se deberá incubar a 43 °C cuando se sospeche que la carga microbiana sea alta y a 35 °C cuando la

carga microbiana sea baja, incluyendo goma Guar. También se ha sugerido el uso del medio

selectivo Rambach (Rambarch agar, CHROMAGARTM) como alternativa a los descritos en la

norma.

El segundo cambio es la posibilidad refrigerar el medio de preenriquecimiento o los medios (caldos)

selectivos por 72 h como máximo. Este punto es importante tomarlo en cuenta, ya que por ejemplo,

si una muestra se comienza a analizar en fin de semana, permite hacer una pausa y retomar la

identificación de Salmonella al inicio de la siguiente semana (FDA/BAM, 2011).

En el caso de los métodos de confirmación, particularmente se recomienda el uso de PCR acoplado

a reacciones de serotipificación (Ésta recomendación se justifica en base a que el PCR es un método

ampliamente utilizado, rápido, sensible, específico, relativamente barato cuando se cuenta con el

equipo y en la actualidad muchos laboratorios de prueba ya cuentan con la tecnología).

En la NOM-114-SSA1-1994 se establecen una diversidad de alimentos que pueden ser analizados;

sin embargo, para frutas y hortalizas aunque están considerados, no se especifican algunos aspectos

como el que por ser la superficie de éstos la que se contamina se debe analizar de manera diferente

que la mayoría de los alimentos (Tal y como se describe en BAM/FDA, actualización al 2011, y en

APHA, 2001). Particularmente en este aspecto, se recomienda realizar el análisis por medio de

lavado del(os) fruto(s) en una cantidad de solución diluyente (Agua peptonada tamponada al 0.1 %)

igual al peso de la muestra a analizar, tal como se describe en FDA/BAM, 2011. Además,

FDA/BAM, 2011 recomienda la búsqueda de Salmonella en frutas y hortalizas en las que

recientemente se ha encontrado incidencia de la bacteria y ha sido causa de brotes epidemiológicos.

Tal es el caso de alimentos como coco (rallado), jugo de naranja, cidra y jugo de manzana, así como

el análisis de frutas y hortalizas enteras, tales como melón, mango y tomate. Es importante

considerar además a las frutas y hortalizas frescas cortadas o mínimamente procesadas y a los

vegetales de hoja verde, incluyendo especias.

Es importante también tomar en cuenta los métodos rápidos que se ofrecen en pruebas bioquímicas

como alternativas en la identificación bioquímica de Salmonella.

NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios para la determinación de Salmonella en alimentos

Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los

métodos establecidos por normas extranjeras o técnicas validadas por organismos internacionales.

1. Es necesario que en la norma nacional se incluyan las frutas y hortalizas, pero que se

especifiquen aspectos como:

a) Como evaluar frutas y hortalizas enteras.

b) Como evaluar frutas y hortalizas frescas cortadas o mínimamente procesadas.


83

2. Es necesario que se actualicen los medios de cultivo empleados en la norma nacional, ya

que al menos en BAM/FDA y APHA se han incluido nuevos medios de cultivo, ya que se ha

demostrado que ofrecen resultados confiables y más reproducibles.

3. Es importante también tomar en cuenta los métodos rápidos que se ofrecen en pruebas

bioquímicas como alternativas en la identificación bioquímica de Salmonella.

4. Se sugiere también considerar el uso de métodos moleculares para la confirmación de

Salmonella, incluyen pruebas de hibridación del ADN como PCR, pruebas inmunológicas (ELISA,

RIA, AL, entre otros), ya que éstos han demostrado mayor especificidad, selectividad, límite de

detección y demás atributos necesarios para considerarlos aptos para su uso. Tomando en cuenta lo

que se expone en BAM/FDA, en el que una reacción que resulta negativa se acepta como tal; si ésta

resulta positiva se deberá confirmar por el método de referencia oficial. No obstante, para los

laboratorios de prueba (internos y externos) es importante reducir los tiempos de análisis y

considerando que la presencia de patógenos como Salmonella en alimentos es baja, comparado con

el número de muestras que se analizan podrían aportar apoyo en términos de reducción en los

tiempos de análisis.

Propuesta para la Detección de Listeria monocytogenes

La detección de Listeria monocytogenes en frutas y hortalizas no está firmemente sustentada debido

a que la presencia de este patógeno no ha sido ampliamente reportado, esto puede ser debido a las

altas poblaciones de microbiota del alimento las cuales constituyen una barrera biótica para el

establecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. Sin embargo, se recomienda que

Listeria monocytogenes sea detectada en este tipo de alimentos cuando su consumo vaya a ser

efectuado por personas con enfermedades crónicas o inmunosupresivas, ya que este estrato de la

población es más susceptible a la adquisición de enfermedades y por consecuencias más drásticas.

Con la información disponible y consultada hasta este momento, se puede argumentar que en base a

la Norma Oficial Mexicana que actualmente se encuentra, la cual describe la detección de Listeria

monocytogenes en alimentos, para lo que se especifica en queso y leche pasteurizados y en base a la

literatura consultada, Listeria ha sido altamente asociada a otros alimentos como lo son la carne,

pollo y embutidos, lo cual ya es considerado y tomado en cuenta por algunos métodos de referencia

como lo son el de la USDA-FSIS. Por lo que la recomendación emitida es ampliar la gama de

alimentos, como los anteriormente mencionados, en los que se busque la presencia de Listeria

monocytogenes.

Los métodos basados en determinaciones moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) constituyen una herramienta útil, sensible, y de relativamente fácil uso para la detección de

Listeria monocytogenes. En este sentido, se propone este método como método alternativo de

confirmación con la utilización de primers específicos para la especie monocytogenes y de esta

manera tener la certeza que se está detectando la especie de interés que es la que tiene un impacto

directo para la salud del humano. Es posible proponer este método como un método confirmatorio

de las muestras presuntivas que han sido procesadas a través de los métodos convencionales, ya que

estos dos métodos en conjunto se complementarían para de una manera tener un resultado en menor

tiempo y al mismo tiempo asegurar que el microorganismo detectado se encuentra viable.

Finalmente, otra recomendación como método alternativo de confirmación seria el Qualicon

(Wilmington, DE) que ha desarrollado dos sistemas de identificación de Listeria basados en el

ADN, uno que es un sistema de caracterización microbiana de ribotipificación automatizado, el cual

identifica todos los cultivos puros de Listeria a nivel especie basado en el análisis de ribotipo.


84

Propuesta para la Detección de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas

En la detección de este género, de manera general, se ha propuesto a través del tiempo la detección

de E. coli. Posteriormente, E. coli O157:H7 se presentó como uno de los serotipos principales

causando gastroenteritis transmitida por alimentos como frutas y hortalizas. Sin embargo, no

únicamente este serotipo tiene la capacidad de causar daño ya que existen otros serotipos diferentes

a éste que contienen en su genoma los genes que codifican para las shiga toxinas, las cuales son las

responsables de la severidad en los cuadros gastroentéricos. Es por tanto, que se propone la

introducción de este grupo de Escherichia. Por lo que la propuesta seria la complementación de los

métodos de cultivo que involucran el uso de medios selectivos como el agar Rainbow acoplado a la

detección de genes de shiga toxina a través de la utilización de la técnica de PCR. Estos genes no

únicamente pueden involucrar los genes stx1 y stx2 si no también el gen de intimina que es otro

factor de virulencia importante dentro de las STEC, de esta manera se ampliaría el espectro de

cepas de E. coli STEC a ser detectadas mediante esta técnica.

Propuesta para la Detección de Staphylococcus aureus

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus

en Alimentos

Se considera necesario hacer algunas consideraciones para modificación de la NOM en cuestión.

1. Es necesario considerar el empleo de los tres métodos para la identificación de

Staphylococcus en alimentos descritas en las normas UNE-EN ISO 6888-1:1999, ISO 6888-2:1999,

ISO 6888-3: 2003/AC, que incluye diluciones y siembra directa en el medio de cultivo Baird-

Parker, siembra en el medio de agar de plasma de conejo y fibrinógeno y por el método de NMP.

2. Se debe considerar además la inclusión de las especies de Staphylococcus intermedius y

Staphylococcus hyicus, ya que son también potencialmente patógenos al igual que Staphylococcus

aureus.

3. En todas las normas y métodos internacionales validados se descarta el análisis de

Staphylococcus en frutas y hortalizas ya que se considera que su presencia es ocasional y en bajas

concentraciones. La presencia de dicha bacteria en frutas y hortalizas se debe a la contaminación

por contacto con las manos de trabajadores o por contaminación cruzada con alimentos en los que la

presencia de Staphylococcus es común y en concentraciones mayores a 100 células por gramo de

muestra. Sin embargo, las frutas y hortalizas frescas cortadas y mínimamente procesadas llevan un

proceso de manipulación, en el que se exponen más a la posible contaminación por Staphylococcus

en las tres especies descritas. Por lo tanto, se debe considerar la inclusión de estos alimentos en las

normas nacionales para la detección de las especies de Staphylococcus de interés.

4. También se deben considerar los métodos moleculares como alternativas para la

identificación o confirmación, ya que se reducen los tiempos de análisis y rápida liberación de lotes

del alimento cuando se determina la ausencia de la bacteria.


85

PROPUESTA DE NORMAS A continuación se compara la normatividad nacional con lo descrito por el Manual Analítico

Bacteriológico publicado por la FDA. Se sugiere que debido a la similitud entre el objetivo,

fundamento, procedimiento, reactivos y medios de cultivo, aparatos e instrumentos, preparación de

la muestra, expresión de resultados, e informe de la prueba se emitirá la concordancia de la

normatividad nacional con lo descrito en el Manual Analítico Bacteriológico reconocido

internacionalmente.


86

Microorgan

ismo Apartado BAM Chapter 5 NOM-114-SSA1-1994

Salmonella

Objetivo Identificación de Salmonella en alimentos. Establecer un método general para la


Fundamento

Preparación de la muestra, aislamiento de cepas con

medios selectivos, identificación de cepas con

pruebas bioquímicas y serológicas.

Basada en 5 pasos básicos: preenriquecimiento,

enriquecimiento selectivo, selección en medios

sólidos, identificación bioquímica y

serotipificación.


87

Procedimiento

Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la

dilución con muestra, inocular en medio selectivo

RV, TT o SC por 24 h a 35 °C, 42 °C o 43 °C

dependiendo de la muestra. A partir del inóculo

anterior, sembrar en agar BS, XLD y HE e incubar

24 h ± 2 h a 35 °C. Examinar morfología típica y

atípica. Inocular colonias presuntivas en agar

selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h ± 2 h a 35 °C.

A los cultivos que viren alcalino el medio ensayar

las pruebas bioquímicas. 2. Identificación de

Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular en

agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, incubar las

cajas durante 24 h ± 2 h a 35°C. Cultivos puros

(prueba de ureasa convencional o rápida). Prueba

serológica olivalente flagelar. Prueba serológica

Spicer-Edwards. Prueba para muestras ureasa

negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol

rojo dulcitol o caldo base púrpura con 0.5 %

dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio,

caldo malonato, prueba de indol, prueba serológica

flagelar (H) para Salmonella). Prueba serológica

somática (O) para Salmonella (prueba somática

polivalente O, prueba de grupo somática O).

Pruebas bioquímicas adicionales caldo lactosa rojo

fenol lactosa o caldo púrpura lactosa. Caldo rojo

fenol sacarosa o caldo púrpura sacarosa, caldo MR-

VP. Agar citrato de Simons. Clasificación de

cultivos. Identificación genérica presuntiva de

Salmonella (kits de pruebas bioquímicas

miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos

a la prueba flagelar (H). Envío de cultivos para

serotipificación a las oficinas de la FDA.

1. Preparación de la muestra (incluye la

incubación. 2. Aislamiento de Salmonella:

Transferir 1 ml del cultivo de preenriquecimiento

a un tubo con 10 ml de caldo de tetrationato y a

otro con 10 ml de caldo selenito cistina (Se puede

usar el medio VR para sustituir el caldo de

tetrationato). Incubar 18 h -24 h a 35°C o para

alimentos altamente contaminados 42 °C. Mezclar

el tubo con caldo selenito cistina y estriar en XLD,

VB y en un medio selectivo adicional ( Hektoen,

agar sulfito de bismuto o agar SS). Efectuar lo

mismo para el caldo tetrationato. Incubar las placas

por 24 h + 2 h a 35°C. Examinar las placas

investigando la presencia de Salmonella de

acuerdo a características específicas. 3.

Identificación bioquímica: Seleccionar al menos 2

colonias de cada medio selectivo, inocular tubos,

uno con TSI y otro con LIA por estría en superficie

inclinada y punción en el fondo, incubar por 24 h +

2 h a 35°C. Considerar positivas las que dan

reacciones específicas . Realizar la prueba de

ureasa. 4. Identificación serológica por medio del

ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella

(Antisuero polivalente O) y cuando la aglutinación

es positiva en el suero polivalente O, puede

determinarse el subgrupo empleando antisueros

para los diferentes subgrupos. Practicar si se

requiere el ensayo de antígenos flagelares de

Salmonella (Antisuero polivalente H). 5. Pruebas

bioquímicas complementarias:Agar citrato

Simmons, medio SIM, caldo RM-VP, prueba de

Voges-Proskauer, prueba de rojo de metilo, caldo

malonato, caldo manitol.


88

Reactivos y

medios de

cultivo

Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada

(reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC)

(M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio

Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio

RV debe ser preparado de ingredientes individuales.

Formulaciones comerciales no son aceptables., agar

xilosa lisina desoxicolato (XLD) (M179), agar

Hektoen entérico (HE) (M61), agar sulfato de bismuto

(BS) (M19), agar triple azúcar hierro (TSI) (M149),

caldo triptona (triptofano) (M164), caldo tripticasa de

soya (M154), caldo tripticasa de soya con sulfato de

hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya

(M160), caldo MR-VP (M104), agar citrato de

Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea

(rápido) (M172), caldo malonato (M92), agar lisina

hierro (LIA) (M89), caldo lisina decarboxilasa (M87),

prueba en medio de movilidad (semisólido) (M103),

caldo cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol

rojo carbohidrato (M121), caldo púrpura carbohidrato

(M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente

(M114), caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24),

solución de papaina 5 % (M56a), solución de celulasa

1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo

universal de preenriquecimiento (M188), caldo

universal de preenriquecimiento (sin citrato amónico

de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada

(M192), caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio

anhídrido, solución de cloro, 200 ppm, conteniendo 0.1

% dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23),

reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba Voges-

Proskauer (VP) (R89), cristales de fosfato de creatina,

solución de hidróxido de potasio, 40 % (R65), solución

hidróxido de sodio (R73), ácido clorhídrico 1 N (R36),

solución de tinción verde brillante, 1 % (R8), solución

de tinción púrpura de bromocresol, 0.2 % (R9),

Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona

tamponada y caldo lactosado. Caldos de

enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo

tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya

tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo

soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de

potasio. Medios de aislamiento: Agar verde

brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar

xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para

Salmonella y Shigella (SS), agar entérico Hektoen.

Medios para pruebas bioquímicas: Agar de tres

azúcares y hierro (TSI), agar de hierro y lisina

(LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro,

indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo

MR-VP, caldo manitol, caldo malonato, caldo

urea, caldo de urea rápido, caldo infusión cerebro

corazón. Soluciones: verde brillante al 0.1 %,

yodo-yoduro, salina al 0.85 %, salina formalizada,

reactivo de Kovac, alfa-naftol al 5 %, rojo de

metilo, hidróxido de potasio al 40 %, gelatinasa al

5 %. Antisueros: Antisuero polivalente somático

(O), antisuero polivalente flagelar (H), antisuero

Vi.


89

indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estéril,

tergitol aniónico 7 (R78), triton X-100 (R86), solución

salina fisiológica, 0.85 % (R63), solución salina

fisiológica formalinizada (R27), antisuero Salmonella

(O) somático polivalente, antisuero Salmonella (H)

flagelar polivalente, antisuero Salmonella grupo

somático (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3,

E4, F, G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero

Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H).

Aparatos e

instrumentos

Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora,

microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas

vidrio, pH metro.

Horno (180 °C), incubadora con termostato,

autoclave con termómetro, baño maría con

termostato, baño maría con termostato y

termómetro, balanza granataria, licuadora,

mechero Bunsen o Fisher, potenciómetro, matraces

Erlenmeyer (500 ml), cucharas, bisturíes, cuchillos

y pinzas, tubos de ensaye, tubos para serología,

pipetas, asa de platino o nicromel, papel pH,

ángulos de vidrio, recipientes de boca ancha.

Preparación de

la muestra

Los siguientes métodos se basan en el análisis de una

unidad analítica de 25 g en relación 1:9 muestra:

caldo. Dependiendo de la composición, añadir caldo

suficiente para mantener esta relación 1:9 a menos

que se indique lo contrario. Para las muestras

analizadas en una base de peso no exacto, por

ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones

particulares. Éstas existen para los siguientes

productos: Yema de huevo, clara de huevo secos,

huevos enteros secos, leche líquida (leche

descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y

suero de leche), mezclas preparadas en polvo

(pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche

maternizada y alimentación por vía oral o un tubo

que contiene huevo. Huevos en diferentes

presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en

polvo. Caseína. Harina de soya. Productos que

Pesar asépticamente 25 g (relación 1:9 muestra-

caldo) de la muestra en un vaso estéril de licuadora

o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador

peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del

medio de preenriquecimiento estéril (generalmente

caldo lactosado) y licuar si es necesario durante un

min. Transferir asépticamente la mezcla

homogeneizada a un recipiente estéril de boca

ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60

min a temperatura ambiente con la tapa bien

enroscada. Mezclar bien y determinar el pH

aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario,

a un pH 6.8 ± 0.2 con hidróxido de sodio 1N o

ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el

recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar

24 h ± 2 h a 35 ºC. Se especifica el procedimiento

para los siguientes productos: huevo en polvo,


90

contienen huevo (fideos, rollos de huevo,

macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas

preparadas (jamón, huevo, pollo, atún, pavo), frutas y

verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos

secos, crustáceos (camarones, cangrejo, cigalas,

langostinos, langosta), y pescado. Levadura seca

(levadura activa e inactiva). Coberturas para helado.

Especias. Revestimiento de dulces y golosinas

(incluido el chocolate). Coco. Colorantes de los

alimentos y sustancias alimenticias para colorear.

Gelatina. Carnes, sustitutos de carne, subproductos

de la carne, sustancias de origen animal, productos

glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las

ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo. Goma

guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no

pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no

pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada).

Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro.

Melones. Mangos. Tomates. Ensayos ambientales.

Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de mamey.

Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca,

lechuga romana, cilantro, perejil rizado, perejil

italiano, culantro, repollo y albahaca).

claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo,

huevos líquidos pasteurizados y congelados,

fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo

(harinas para hotcakes, galletas, donas, bisquets y

pan). Productos no pasteurizados congelados de

huevo. Leche en polvo entera, semidescremada o

descremada. Queso. Caseína. Coco. Levadura seca.

Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos,

sustancias de origen animal, productos glandulares

y harinas (pescado, carne y hueso). Dulces y

dulces cubiertos (incluyendo chocolate). Especias.

Gelatina.

Expresión de

resultados

Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de

producto.

Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml dela

muestra.

Informe de la

prueba No especifíca.

Informar presencia o ausencia de Salmonella por g

o ml de la muestra.

Concordancia

con normas

internacionales

No especifíca.

Esta norma no tiene concordancia con normas

internacionales.

Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia

con el capítulo 5 del BAM.


91

Apartado

BAM Capítulo 4

bacterias Coliformes

y Escherichia coli

NOM-112-SSA1-1994 Determinación bacterias

Coliformes técnica número más probable

NOM-113-SSA1-1994 Método para la

cuenta de microorganismos Coliformes

totales en placa

Objetivo

Enumeración de

Escherichia coli y

bacterias Coliformes.

Establecer el método microbiológico para estimar el

número de coliformes presentes en productos

alimenticios, por medio del cálculo del número más

probable (NMP) después de la incubación a 35 °C

de la muestra diluida en un medio líquido.

Establecer el método microbiológico para

determinar el número de microorganismos

coliformes totales presentes en productos

alimenticios por medio de la técnica de

cuenta en placa.

Fundamento

Fermentación de

lactosa y cálculo de

número más probable

NMP.

Se basa en que las bacterias coliformes, fermentan

la lactosa incubadas a 35 °c ± 1 °C durante 24 h a

48 h, resultando una producción de ácidos y gas el

cual se manifiesta en las campanas de fermentación.

Basado en el uso de un medio selectivo

(agar rojo violeta bilis) en el que se

desarrollan bacterias a 35 °C en

aproximadamente 24 h, dando como

resultado la producción de gas y ácidos

orgánicos, los cuales viran el indicador de

pH y precipitan las sales biliares.


92

Procedimien

to

General: Dilución,

NMP (inoculación e

incubación,

aislamiento en placa,

selección de colonias y

confirmación), conteo

en placa (inoculación e

incubación, conteo y

selección de colonias),

confirmación

(subcultivo,

confirmación

bioquímica).

confirmación en medio

sólido y filtración por

membrana.

1. Prueba presuntiva: Inoculación (tomar tres tubos

de concentración sencilla del medio selectivo de

enriquecimiento, usar una pipeta estéril para

transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la

muestra si es líquida o 1 ml de la dilución primaria

en el caso de otros productos. Para las diluciones

subsecuentes, continuar usando una pipeta diferente

para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo

con el medio). Incubación (incubar los tubos a 35

°C + 0.5 °C por 24 h + 2 h y observar si hay

formación de gas, en caso contrario prolongar la

incubación hasta 48 h +2 h. 2. Prueba confirmativa:

De cada tubo que muestre formación de gas, tomar

una asada y sembrar en un número igual de tubos

con medio de confirmación. Incubar a 35 °C + 0.5

°C por 24 h + 2 h o si la formación de gas no se

observa en este tiempo, prologar la incubación por

48 h +2 h.

1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml

de la muestra líquida directa o de la dilución

primaria, utilizando para tal propósito una

pipeta estéril. 2. Repetir el procedimiento

tantas veces como diluciones decimales se

requiera, sembrar, utilizando una pipeta

estéril diferente para cada dilución. 3. Vertir

de 15 ml a 20 ml del medio RVBA fundido

y manteniendo a 45 °C + 1 °C en baño de

agua. 4. Mezclar el inóculo con el medio con

seis movimientos de derecha a izquierda,

seis en sentido de las manecillas del reloj,

seis al contrario de las manecillas del reloj,

seis de atrás para adelante, sobre una

superficie lisa y nivelada y dejar que

solidifique. 5. Preparar una cajas control con

15 ml de medio para verificar la esterilidad.

6. Una vez solidificado el medio verter 4 ml

del medio RVBA a 45 °C + 1 °C en la

superficie del medio inoculado, dejar que

solidifique. 7. Invertir las placas y colocarlas

en la incubadora a 35°C durante 24 h +2 h.

8. Contar las colonias con el contador de

colonias. 9. Seleccionar las placas que

contengan entre 15 colonias y 150 colonias.

Las colonias típicas son de color rojo

oscuro, rodeadas por un halo de

precipitación debido a las sales biliares,

color rojo claro o rosa.

Reactivos y

medios de

cultivo

Caldo verde brillante

bilis lactosa (BGLB)

(M25), caldo lauril

triptosa (LST)(M76),

caldo EC (M49), azul

Levin de metileno-

Soluciones diluyentes: solución reguladora de

fosfatos (solución concentrada), agua peptonada.

Medios de cultivo: caldo lactosado, caldo lauril

sulfato triptosa, caldo lactosa bilis verde brillante.

Soluciones diluyentes: solución reguladora

de fosfatos (solución concentrada), agua

peptonada. Medios de cultivo: agar-rojo-

violeta-bilis-lactosa (RVBA).


93

eosina (L-EMB), agar

(M80), caldo triptona

(triptofano) (M164),

caldo MR-VP (M104),

caldo citrato de Koser

(M72), agar para

cuenta en placa

método estándar

(PCA) (M124), agua

Butterfield de tampon

de fosfatos (R11) o

diluyente equivalente

(excepto para

crustáceos), reactivo

de Kovacs (R38),

reactivo Voges-

Proskauer (VP) (R89),

reactivos para tinción

de Gram (R32),

indicador rojo de

metilo (R44), agar

bilis rojo violeta

(VRBA) (M174), agar

VRBA-MUG (M175),

medio EC-MUG

(M50), caldo lauril

triptosa MUG (LST-

MUG) (M77),

diluyente de peptona,

0.1 % (R56).


94

Aparatos e

instrumentos

Hornos, autoclaves,

incubadoras, tubos,

cajas Petri, pipetas,

varillas vidrio, asas,

pHmetro, contador de

colonias, licuadora,

frascos de dilución,

lámpara UV.

Materiales: pipetas microbiológicas, frascos de

vidrio con tapón de rosca (250 ml), utensilios

esterilizables (cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, tubos de cultivo, campanas de

fermentación (tubos de Durham), pipetas

bacteriológicas, gradillas, asa de platino. Aparatos:

horno para esterilizar, incubador con termostato,

termómetro, autoclave, potenciómetro.

Materiales: pipetas bacteriológicas, frascos

de vidrio, tubos, utensilios esterilizables

para la obtención de muestras

(cuchillos,pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, etc), cajas Petri. Aparatos e

instrumentos: horno para esterilizar,

autoclave con termómetro y manómetro,

baño de agua con control de temperatura,

licuadora, un vaso para licuadora con tapa

esterilizables o bolsas estériles para

homogeneizador peristáltico, incubadora con

termostato, contador de colonias de campo

oscuro, registrador mecánico o electrónico,

microcopio óptico, potenciómetro.

Preparación

de la

muestra

Diluciones decimales.

Las muestras deben prepararse y diluirse de acuerdo

a la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución

de Muestras de Alimentos para su Análisis

Microbiológico.

La preparación de la muestra debe ser de

acuerdo a lo establecido en la NOM-110-

SSA1-1994 "Preparación y Dilución de

Muestras de Alimentos para su Análisis

Microbiológico".

Expresión de

resultados

Tabla del Número Más

Probable (NMP),

número de

Enterobacteriaceae x

gramo o por mililitro.

Expresar en NMP/g o ml para alimentos Coliformes/g o coliformes /ml


95

Informe de

la prueba No especifíca.

Informar "Número más probable (NMP) de

Coliformes por gramo o mililitro de muestra"

Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo

violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 h

± 2 h.

En caso de emplear diluciones y no observar

crecimiento, informar utilizando como

referencia la dilución más baja utilizada, por

ejemplo dilución 10-1.

En caso de no observar crecimiento en la

muestra sin diluir se informa: "no desarrollo

de Coliformes por ml".

Concordanci

a con

normas

internacional

es

No especifíca.

Esta norma no tiene concordancia con normas

internacionales.

Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia

con el capítulo 4 del BAM.

Esta norma no tiene concordancia con

normas internacionales.

Puede sugerirse: Esta norma tiene

concordancia con el capítulo 4 del BAM.

Microorganis

mo

Apartado BAM Chapter 12 NOM-115-SSA1-1994

Sta

ph

ylo

cocc

us

au

reu

s

Objetivo Estimar el contenido de Staphylococcus aureus en

alimentos.

Establecer el método microbiológico para

determinar la cuenta de Staphylococcus aureus

presente en alimentos nacionales o de

importación.


96

Fundamento Detección de Satphylococcus spp. por el método

del número más probable (NMP) en muestras con

un número bajo esperado de Staphylococcus y

contenido de especies competitivas.

Identificación y confirmación por medio de

pruebas bioquímicas.

Estimación del contenido de Staphylococcus

aureus en alimentos, se efectúa directamente en

placas de medio de cultivo selectivo y

diferencial, con la confirmación mediante las

pruebas de coagulasa y termonucleasa.

Procedimiento Determinación del NMP. Dilución, inoculación

en medio selectivo líquido, medio selectivo

sólido, aislar en medio selectivo sólido, transferir

a medio selectivo líquido para recuento,

identificación y confirmación de S. aureus por

prueba de coagulasa, prueba de catalasa,

utilización anaeróbica de glucosa, utilización

anaeróbica de manitol, sensibilidad a

lisostafina, producción de nucleasa

termoestable, identificación de alguna

característica típica de 2 cepas de S. aureus, S.

epidermidis, y micrococci. Reportar de

acuerdo a tablas de NMP.

1. Incubación de 0.1 ml de cada dilución sobre la

superficie del agar Baird-Parker a 35 °C de 45 h a

48 h. 2. Seleccionar las placas que tienen entre 15

colonias y 150 colonias típicas de S. aureus. 3.

Sembrar las colonias en tubos con 0.5 ml de

caldo de infusión cerebro-corazón. Incubar a 35

°C durante 24 h. 4. Prueba de coagulasa. 5.

Prueba de termonucleasa.

Reactivos y

medios de cultivo

Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya

(TSA) (M152), caldo infusión cerebro corazón

(M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA

toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina

triptona extracto de levadura (M165), aceite de

parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61)

conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12),

caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 %

NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).

Soluciones diluyentes : solución reguladora de

fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo:

Medio de Baird-Parker, caldo de infusión de

cerebro-corazón (BHI), ácido

desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.

Reactivo biológico: plasma de conejo.


97

Aparatos e

instrumentos

Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas

Petri, pipetas, varillas vidrio.

Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, separador de huevo, tubos de cultivo,

cajas Petri, pipetas bacteriológicas 1ml y 10 ml,

pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5

mm de diámetro aprox. y 20 cm de largo, matraz

Erlenmeyer con perlas de vidrio, cámara húmeda.

Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con

termómetro, baño de agua con regulador de

temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 °C +

1 °C.

Preparación de la

muestra

Dependiente de la muestra. Conforme a lo establecido en la NOM-110-

SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras

de Alimentos para su Análisis Microbiológico".

Expresión de

resultados

NMP x gramo o por mL En UFC/g o UFC/g valor estimado.

Informe de la

prueba

No especifíca Si las pruebas confirmativas resultan negativas en

todas las colonias probadas, informar como: 0

UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g en

muestras de dilución 1:10 y 100 UFC/g en

muestras de dilución 1:100.

Concordancia con

normas

internacionales

AOAC 987.09. No especifíca.


concordancia con el capítulo 12 del BAM en

las pruebas bioquímicas de identificación del

microorganismo.


98

Microorg

anismo Apartado

Norma

BAM Chapter 9 NOM-242-SSA1-2009 V

ibri

o c

hole

rae

Objetivo Determinación de V. cholerae en alimentos

Establecer los requisitos sanitarios para las

instalaciones de toda la cadena productiva de

productos marinos y las especificaciones

sanitarias de dichos productos y métodos de

prueba.

Fundamento

Basado en las siguientes técnicas: crecimiento en

medio selectivo salino, pruebas bioquímicas, kit

de diagnóstico rápido API 20E, identificación por

medio de sondas de ADN, identificación por

medio de PCR.

Enriquecimiento, crecimiento en medio selectivo,

aislamiento, diferenciación, identificación y

confirmación mediante pruebas bioquímicas y

serológicas.

Procedimiento

Enriquecimiento y siembra, detección y

confirmación, pruebas bioquímicas, diferenciación

de biotipos el Tor y clásico, determinación de

enterotoxigenicidad, detección genotípica del gen

de la toxina del cólera mediante la reacción en

cadena de la polimerasa.

Preparación de la muestra, incubación, resiembra

y aislamiento, diferenciación e identificación,

confirmación.


99

Reactivos y medios de

cultivo

Agua peptonada alcalina (APW) (M10), Medio

AKI (M7), placas de arginina glucosa (AGS)

(M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de

levadura casaminoácidos (CAYE) (M34), agar

modificado celobiosa polimixina colistina

(mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC)

(M189), medio de prueba de movilidad-1 % NaCl

(M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-

p-fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente

peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampón salino de

fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50

U Difco o equivalente) (R64), solución salina 0.85

% en dH2O (R63), solución NaCl al 2 % (R71),

desoxicolato de sodio - 0.5% en dH2O (R91), agar

tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS)

(M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o

3 % NaCl respectivamente) (M163), Caldo T1N0,

T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti

soya sulfato de magnesio – 3 % NaCl (TSAMS)

(32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA)

(M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 %

glicerol, caldo urea (M171) o agar urea

Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti

suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de

detección de enterotoxina VET-RPLA TD920A

(Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio

parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio

vulnificus (VVA) (M190), reactivos y tiras

reactivas de diagnóstico API 20E (BioMerieux).

Agua peptonada alcalina, agar tiosulfato citrato

sales biliares y sacarosa (TCBS), agar

modificado con celobiosa polimixina B y colistina (mCPC), solución stock de colorantes

1000 X, agar T1N1 (Agar triptona y sal), agar

gelatina, agar gelatina con sal (GS), caldo glucosa

de Hugh-Leifson, medio base de descarboxilasa

(Arginina, lisina y ornitina), caldo triptona y

caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3, T1N6,

T1N8, T1N10, agar soya tripticasa (TSA), agar

de hierro Kligler (KIA), agar arginina glucosa

inclinado (AGS), agar triple azúcar y hierro (TSI),

agar de hierro y lisina (LIA), caldo rojo de metilo

y Vogues Proskauer (RM-VP), medio para prueba

de movilidad (Semisólida), prueba de rojo de

metilo, prueba de Vogues-Proskauer, prueba de

oxidasa, reactivo de Kovac.


100

Aparatos e

instrumentos

Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri,

pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro,

microondas, incubadoras con agitación, filtros,

membranas de naylon, pantallas de malla de fibra

de vidrio, palillos, soluciones extracción de

proteínas y ácidos nucleicos, agentes bloqueadores,

reactivos para inmunoensayos.

Licuadora, frascos de vidrio boca ancha tipo tarro

500 ml, varilla vidrio 3 mm y 20 cm largo,

balanza granatria 2000g, balanza analítica 120 g,

incubadoras 39-40°C, baño de agua 42+ 0.2°C y

35-37°C, cucharas estériles, cajas Petri estériles

15x100 mm de plástico, pipetas estériles 1, 5 y 10

ml (0.1 ml) 5 , asas bacteriológicas 3 mm

diámetro, tubos ensayo 16x150 mm y 20x150

mm, tubos ensaye 10x75 mm o 13x100 mm,

tijeras y pinzas estériles, lámpara, mecheros,

papel pH, potenciómetro, bolsas polietileno

28x37, aparato de filtración membranas 0.45

micras.

Preparación de la

muestra

La muestra debe ser enfriada inmediatamente

después de ser colectada (alrededor de 7 ⁰C a 10

⁰C), las muestras deben ser analizadas tan pronto

como sea posible. Se debe evitar el contacto

directo con el hielo para maximizar la

supervivencia y la recuperación de los vibrios. Los

vibrios pueden ser dañados por el enfriamiento

rápido, pero crecen rápidamente en productos del

mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se

recomienda congelar las muestras a una

temperatura de -80 ⁰C.

Pescado ahumado: Incubación de las muestras a

35 °C -37 °C: De cada submuestra tomar 25 g,

cortar piezas pequeñas y colocarlo en vaso de

licuadora de 500 ml de capacidad y que contenga

225 ml de agua peptonada alcalina, homogenizar

2 min a velocidad máxima, hacer 2 diluciones e

incubarlas a 35 °C -37 °C. Incubación 35 °C -

37°C y 42°C: homogenizar 50 g en 450 ml de

agua peptonada alcalina, verter 250 ml a un

recipiente estéril. Preparar dos series de

diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una serie a 35

°C -37°C y otra a 42 °C. Moluscos bivalvos:

Desconchar 10 piezas-12 piezas, incluir el

líquido. Verter 50 g en 450 ml de agua peptonada

alcalina, licuar para homogenizar durante 2 min a

alta velocidad (Dilución 1:10). Colocar 250 g de

esta dilución en un segundo recipiente estéril,

preparar diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una

serie a 35 °C -37°C y la otra a 42°C.


101

Expresión de resultados Resultado positivo o negativo. No especifíca

Informe de la prueba

El informe final para V. cholerae debe incluir la

identificación bioquímica y serológica de la cepa y

los resultados de enterotoxicidad.

No especifíca

Concordancia con

normas internacionales No especifíca

No especifíca.



Microorg

anismo Apartado BAM Capítulo 28 NOM-242-SSA1-2009

Vib

rio c

hole

rae

ente

roto

xigén

ico

Objetivo Detectar Vibrio cholerae enterotoxigénico por

PCR

No se incluye la detección de V. cholerae por

medio de PCR.

Fundamento Basado en la reacción en cadena de la polimerasa.

Procedimiento Enriquecimiento en agua peptonada alcalina,

procedimiento PCR.


cultivo

Agua peptonada alcalina (APW), primers de la

toxina de cólera, Taq ADN polimerasa, 2'-

Desoxinucleósido-5'-trifosfatos, 10X buffer PCR,

aceite mineral ligero, agua deionizada estéril, 10X

TBE, agarosa, solución de bromuro de etidio, 6X

buffer de carga de muestras, marcadores de ADN

de peso molecular.


102

Aparatos e

instrumentos

Termociclador programable automático, aparato de

electroforesis en gel horizontal, fuente de poder de

voltage para electroforesis, parrilla de

calientamiento, tubos de microcentrifuas,

micropipetas digitales, pipetas, microcentrífuga,

transluminador UV, cámara polaroide, film

polaroide.

Preparación de la

muestra

Pesar 25 g de la muestra en un recipiente tarado

(de capacidad aproximada de 500 ml). Los

productos tales como marinos o verduras puede ser

licuado o cortado en pequeñas porciones utilizando

tijeras estériles. La muestra debe ser enfriada

inmediatamente después de ser colectada

(alrededor de 7 ⁰C a 10 ⁰C), las muestras deben ser

analizadas tan pronto como sea posible. Se debe

evitar el contacto directo con el hielo para

maximizar la supervivencia y la recuperación de

los vibrios. Los vibrios pueden ser dañados por el

enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en

productos del mar a temperatura ambiente. De ser

necesario, se recomienda congelar las muestras a

una temperatura de -80 ⁰C.

Expresión de resultados Positivo o negativo.

Informe de la prueba No especifíca.

Concordancia con

normas internacionales No especifíca.


103

Microorg

anismo

Apartado

BAM Capítulo 9

NOM-242-SSA1-2009

Vib

rio p

ara

haem

oly

ticu

s

Objetivo

No se incluye en esta norma

Fundamento

Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas

bioquímicas, kit de diagnóstico rápido API 20E,

identificación por medio de sondas de ADN,

identificación por medio de PCR.

Procedimiento

1. Enriquecimiento, aislamiento y enumeración, 2.

Detección y confirmación (identificación

bioquímica de los aislados, procedimiento de

cuenta por filtración en membrana hidrofóbica

(HGMF), tipificación serológica), 3.

Determinación de patogenicidad (detección

genotípica de los genes de hemolisina de V.

parahaemolyticus).


104


cultivo

Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio




modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC)

(M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189),

medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103),

reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-

fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente





desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar



3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0,






Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), Anti







Aparatos e

instrumentos





de vidrio, palillos, soluciones extracción de



105

reactivos para inmunoensayos..

Preparación de la

muestra


después de ser colectada (alrededor de 7 ⁰C a 10

⁰C), las muestras deben ser analizadas tan pronto

como sea posible. Se debe evitar el contacto

directo con el hielo para maximizar la

supervivencia y la recuperación de los vibrios. Los

vibrios pueden ser dañados por el enfriamiento

rápido, pero crecen rápidamente en productos del

mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se

recomienda congelar las muestras a una

temperatura de -80 ⁰C.

Expresión de resultados Resultado positivo o negativo.


Concordancia con


Microor

ganismo

Apartado BAM Capítulo 9 NOM-242-SSA1-2009

Vib

rio v

uln

ific

us Objetivo

Productos para consumo humano de origen

marino.

No se incluye en esta norma

Fundamento

Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas

bioquímicas, kit de diagnóstico rápido API 20E,

identificación por medio de sondas de ADN,

identificación por medio de PCR.


106

Procedimiento

Método de identificación y recuento: 1.

Enriquecimiento, aislamiento y cuenta, 2.

Identificación bioquímica de los aislados, 3.

Identificación del gen específico de especies

específicas del gen citolisina vvhA por medio de

sonda de ADN, 4. Recuento de V. vulnificus por

sondas de ADN, 5. Confirmación de V. vulnificus

por reacción en cadena de polimerasa.


cultivo

Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio




modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC)

(M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189),

medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103),

reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-p-

fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente





desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar



3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0,






Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti






107



Aparatos e

instrumentos





de vidrio, palillos, soluciones para extracción de


reactivos para inmunoensayos.

Preparación de la

muestra


después de ser colectada (7 a 10) °C, las muestras

deben ser analizadas tan pronto como sea posible.

Se debe evitar el contacto directo con el hielo para

maximizar la supervivencia y la recuperación de

los vibrios. Los vibrios pueden ser dañados por el

enfriamiento rápido, pero crecen rápidamente en

productos del mar a temperatura ambiente. De ser

necesario, se recomienda congelar las muestras a

una temperatura de -80 °C.

Expresión de resultados Resultado positivo o negativo.


Concordancia con


Microor-

ganismo



108

Sta

ph

ylo

cocc

us

aure

us

Objetivo Estimar el contenido de Staphylococcus aureus

en alimentos.



productos marinos y establecer las

especificaciones sanitarias de dichos productos y

métodos de prueba.

Fundamento

Detección de Satphylococcus spp. por el Método

del número más probable (NMP) en muestras con

un número bajo esperado de Staphylococcus y

contenido de especies competitivas. Identificación

y confirmación por medio de pruebas

bioquímicas.

Crecimiento en medio de cultivo selectivo y

diferencial y confirmación con pruebas de

coagulasa y termonucleasa.

Procedimiento

Determinación del NMP. Dilución, inoculación en

medio selectivo líquido, medio selectivo sólido,

aislar en medio selectivo sólido, transferir a medio

selectivo líquido para recuento, identificación y

confirmación de S. aureus por prueba de

coagulasa, prueba de catalasa, utilización

anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de

manitol, sensibilidad a lisostafina, producción de

nucleasa termoestable, identificación de alguna

característica típica de 2 cepas de S. aureus, S.

epidermidis, y micrococci. Reportar de acuerdo a

tablas de NMP.

Incubación en agar Baird-Parker, selección de

colonias y siembra en caldo de infusión cerebro

corazón, incubación, prueba de coagulasa y

termonucleasa.


cultivo

Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya

(TSA) (M152), caldo infusión cerebro corazón

(M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA

toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina

triptona extracto de levadura (M165), aceite de

parafina, tampón salino de fosfato 0.02 M (R61)

conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12),

caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 %

NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).

Soluciones diluyentes : solución reguladora de

fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo:

Medio de Baird-Parker, medio base de Baird-

Parker, caldo de infusión de cerebro-corazón

(BHI), ácido desoxirribonucleico helicoidal de

timo de ternera.


109

Aparatos e

instrumentos


pipetas, varillas vidrio.

Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,

espátulas, separador de huevo, tubos de cultivo,

cajas Petri, pipetas bacteriológicas 1ml y 10 ml,

pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5

mm de diámetro aprox. y 20 cm de largo, matraz

Erlenmeyer con perlas de vidrio, cámara húmeda.

Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con

termómetro, baño de agua con regulador de

temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 °C +

1 °C.

Preparación de la

muestra Dependiente de la muestra.

De acuerdo a lo establecido en el método de

preparación y dilución de muestras de alimentos


Expresión de resultados NMP x gramo o por mL

En UFC/g. Si las pruebas confirmativas resultan

negativas en todas las colonias probadas, informar

como: 0 UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g

en muestras de dilución 1:10 y 100 UFC/g en

muestras de dilución 1:100.

Informe de la prueba No especifica No especifíca

Concordancia con

normas internacionales AOAC 987.09.

No especifíca



las pruebas bioquímicas de identificación del

microorganismo.

También puede sugerirse que se refiera a la

NOM-115-SSA1-1994.

Microorg

anismo


Lis

teri

a

mon

ocy

tog

en

es

Objetivo Detectar y enumerar L. monocytogenes en

alimentos





métodos de prueba.


110

Fundamento

Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento,

procedimiento de aislamiento, procedimiento de

identificación (PCR tiempo real, kits),

subtipificación de aislados de L. monocytogenes,

prueba de patogenicidad del ratón

inmunodeficiente, interpretación de los datos de las

pruebas, recuento.

Basada en el aislamiento y la diferenciación de

especies de Listeria spp., principalmente por la

fermentación de carbohidratos y la actividad

hemolítica de los miembros de este género.

Procedimiento

1. Procedimientos de muestreo y de

enriquecimiento: Tratamiento de la muestra, pre-

enriquecimiento y enriquecimiento,

enriquecimiento con conteo, métodos alternativos

prescritos para el cribado de las muestras

enriquecidas. 2. Procedimiento de aislamiento:

medios selectivos. 3. Procedimiento de

identificación: Morfología, tinción de Gram,

prueba de catalasa, fermentación de

carbohidratos, medio selectivo, prueba de

reducción de nitrato, pruebas de movilidad,

pruebas con kits, PCR en tiempo real, métodos

rápidos alternativos, prueba de CAMP. 4.

Subtipificación de aislados de L. monocytogenes

(obligatorio): serológica y genéticamente. 5.

Prueba de patogenicidad del ratón

inmunodeficiente (opcional). 6. Interpretación de

los datos de las pruebas. 7. Recuento (requerido).

Enriquecimiento, aislamiento, identificación,

prueba de movilidad en fresco, prueba de

catalasa, tinción de Gram, prueba de hemólisis,

prueba de reducción de nitratos, prueba de

movilidad en agar, prueba de utilización de

carbohidratos, prueba de Cristie-Atkins-

Munch-Peterson (CAMP) y serología.


111


cultivo

Ácido acético 5 N, monohidroclorido de

acriflavina, agar, N-(1-naftil) etilen diamina (R48),

reactivo α-Naftol (R48), agar base sangre No. 2,

cicloheximida, natamicina, sangre de cordero

defibrinado, etanol absoluto, tampón de anticuerpo

fluorescente, glicina anhidra, kit de tinción de

Gram, solución de peróxido de hidrogeno 3 % para

prueba de catalasa (R12), solución de KOH 40 %

(R65), juego sera Listeria-typing, agar cloruro de

litio feniletanol moxalactam (LPM) (M81) con

esculina y hierro (M82), ácido nalidíxico (sal de

sodio), medio de reducción de nitrato (M108) y

reactivo de detección de nitrato (R48), caldo

nutritivo (M114), solución salina fisiológica 0.85

% (R63), caldo base fermentación carbohidrato

púrpura (M130) conteniendo soluciones 0.5 % de

dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol, y

xilosa, medio SIM (M137) o medio de prueba de

movilidad (M103), reactivo de ácido sulfanilico

(R48), agar tripticasa de soya con 0.6 % de

extracto de levadura (TSAye) (M153), caldo

tripticasa de soya con 0.6 % extracto de levadura

(TSBye) (M157), medio Oxford (OXA) (M118),

caldo de enriquecimiento amortiguado para

Listeria (BLEB) (M52), agar PALCAM (M118a),

carragenina, agar BCM (M17a), agar MOX

(M103a), agar ALOA (M10a), agar Listeria

cromogénico (M40b), Rapid L'mono (M131a),

CHROMagar Listeria (M40a), agar y caldo

triptosa (M167).

Tinción de Gram (Alcohol-acetona, cristal

violeta, solución de yodo, solución de safranina),

reactivos para la determinación de nitritos

(Reactivo A, reactivo B, reactivo C, solución de

sulfato de cadmio al 20 %). Medios de cultivo:

Caldo soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de

levadura (CSTEL), caldo de enriquecimiento

(EB) pH 7.3, medio de cloruro de litio

feniletanol-moxolactam (LMP), medio Oxford,

agar soya tripticaseína con 0.6 % de extracto de

levadura (ASTEL), agar sangre de carnero, caldo

nitratos, medio para la prueba de movilidad

(Medio de SIM, medio MTM), caldo púrpura para

fermentación de carbohidratos.

Aparatos e

instrumentos


pipetas, varillas vidrio, microscopio de contraste de

fases, licuadora o mezcladora peristáltica.

Cajas Petri, asas bacteriológicas, aceite de

inmersión, cubreobjetos, matraces Erlenmeyer

500 ml, lámpara de luz blanca, lápiz graso, lupa

de bajo aumento, pipetas volumétricas,

portaobjetos escabado, porta asas, tubos, sistemas


112

de filtración de membranas, incubadoras,

miscroscopio.

Preparación de la

muestra

Refrigerar la muestra a 4°C. Muestras compuesta.

Una muestra de un lote de alimento debe constar

de 10 sub-muestras, porciones de 50 g o ml de

cada sub-muestra se utilizan para hacer dos

muestras compuestas (250 g cada una) con

mezcladoras peristálticas y medio de

enriquecimiento sin agentes selectivos. Muestras

no compuestas. Si no se requieren muestras

compuestas porciones analíticas simples de 25 g se

mezclan con 225 ml de medio basal de pre-

enriquecimiento/enriquecimiento BLEB en una

licuadora o mezcladora peristáltica.

Seguir lo mencionado en el método preparación y

dilución de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico.

Expresión de resultados UFC por gramo o por mL.

De acuerdo a las características bioquímicas se

puede determinar el género y especie de las cepas

aisladas. La correspondencia de resultados con

dichas características indica el género Listeria.


Cuando los resultados son positivos informar

presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Si son

negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de

muestra.

Concordancia con

normas internacionales

AOAC 992.18. 2000, AOAC 992.19. 2000, AOAC

993.09. 2000, AOAC 993.12. 2000, AOAC

994.03. 2000, AOAC 995.22. 2000, AOAC

996.14. 2000, AOAC 997.03. 2000, AOAC

999.06. 2000, AOAC 2003.12. 2005.

No especifíca



las pruebas de medios selectivos y bioquímicas

de identificación del microorganismo.

Microorg

anismo



113

Salm

on

ella

Objetivo Identificación de Salmonella en alimentos.





métodos de prueba.

Fundamento

Preparación de la muestra, aislamiento de cepas

con medios selectivos, identificación de cepas con

pruebas bioquímicas y serológicas.

Basada en 5 pasos básicos: preenriquecimiento,

enriquecimiento selectivo, selección en medios

sólidos, identificación bioquímica y

serotipificación.

Procedimiento

1. Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente

la dilución con muestra, inocular en medio

selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 °C, 42 °C o

43 °C dependiendo de la muestra. A partir del

inóculo anterior,sembrar en agar BS, XLD y HE e

incubar 24 h ± 2 h a 35 ⁰C. Examinar morfología

típica y atípica. Inocular colonias presuntivas en

agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h ± 2 h a

35 ⁰C. A los cultivos que viren alcalino el medio

ensayar las pruebas bioquímicas. 2. Identificación

de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular

en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD,

Incubar las cajas durante 24 h ± 2 h a 35 °C.

Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o

rápida). Prueba serológica polivalente flagelar.

Prueba serológica Spicer-Edwards. Prueba para

muestras ureasa negativa (caldo lisina

decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o caldo

base púrpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona

(caldo cianida de potasio, caldo malonato, prueba

de indol, prueba serológica flagelar (H) para

Salmonella). Prueba serológica somática (O) para

Salmonella (prueba somática polivalente O, prueba

de grupo somática O). Pruebas bioquímicas

adicionales. Caldo lactosa rojo fenol lactosa o

Preparación de la muestra, aislamiento,

identificación bioquímica, identificación

serológica, pruebas bioquímicas complementarias.


114

caldo púrpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o

caldo púrpura sacarosa, caldo MR-VP. Agar citrato

de Simons. Clasificación de cultivos.

Identificación genérica presuntiva de Salmonella

(kits de pruebas bioquímicas miniaturizadas).

Tratamiento de cultivos negativos a la prueba

flagelar (H). Envío de cultivos para

serotipificación a las oficinas de la FDA.


115


cultivo

Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada

(reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC)

(M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio

Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA:

Medio RV debe ser preparado de ingredientes

individuales. Formulaciones comerciales no son

aceptables, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

(M179), agar Hektoen entérico (HE) (M61), agar

sulfato de bismuto (BS) (M19), agar triple azúcar

hierro (TSI) (M149), caldo triptona (triptofano)

(M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo

tripticasa de soya con sulfato de hierro (M186),

caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo

MR-VP (M104), agar citrato de Simmons (M138),

caldo urea (M171), caldo urea (rápido) (M172),

caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA)

(M89), caldo lisina decarboxilasa (M87), prueba en

medio de movilidad (semisólido) (M103), caldo

cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol

rojo carbohidrato (M121), caldo púrpura

carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91),

caldo nutriente (M114), caldo infusión cerebro

corazón (BHI) (M24), solución de papaina 5 %

(M56a), solución de celulasa 1 % (M187), agar

base triptosa sangre (M166), caldo universal de

preenriquecimiento (M188), caldo universal de

preenriquecimiento (sin citrato amónico de hierro)

(M188a), agua peptonada amortiguada (M192),

Caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio

anhídrido, solución de cloro, 200 ppm,

conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a),

etanol, 70 % (R23), reactivo de Kovacs (R38),

reactivo de prueba Voges-Proskauer (VP) (R89),

cristales de fosfato de creatina, solución de

hidróxido de potasio, 40 % (R65), solución

Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona

tamponada y caldo lactosado. Caldos de

enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo

tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya

tripticasa, leche descremada reconstituida,

caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito

de potasio. Medios de aislamiento: Agar verde

brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar

xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para

Salmonella y Shigella (SS), agar entérico

Hektoen. Medios para pruebas bioquímicas: Agar

de tres azúcares y hierro (TSI), agar de hierro y

lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para

sulfuro, indol y movilidad), agar citrato de

Simmons, caldo MR-VP, caldo manitol, caldo

malonato, caldo urea, caldo de urea rápido, caldo

infusión cerebro corazón. Soluciones: verde

brillante al 0.1 %, yodo-yoduro, salina al 0.,85%,

salina formalizada, reactivo de Kovac, alfa-naftol

al 5 %, rojo de metilo, hidróxido de potasio al 40

%, gelatinasa al 5 %. Antisueros: Antisuero

polivalente somático (O), antisuero polivalente

flagelar (H), Antisuero Vi.


116

hidróxido de sodio (R73), ácido clorhídrico 1 N

(R36), solución de tinción verde brillante, 1 %

(R8), solución de tinción púrpura de bromocresol,

0.2 % (R9), indicador rojo de metilo (R44), agua

destilada estéril, tergitol aniónico 7 (R78), triton

X-100 (R86), solución salina fisiológica, 0.85 %

(R63), solución salina fisiológica formalinizada

(R27), antisuero Salmonella (O) somático

polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar

polivalente, antisuero Salmonella grupo somático

(O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F,

G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero

Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H).

Aparatos e

instrumentos

Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora,

microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas

vidrio, pH metro.

Horno (180 °C), incubadora con termostato,

autoclave con termómetro, baño maría con

termostatoaño maría con termostato y

termómetro, balanza granataria, licuadora,

mechero Bunsen o Fisher, potenciómetro,

matraces Erlenmeyer (500 ml), cucharas,

bisturíes, cuchillos y pinzas, tubos de ensayo,

tubos para serología, pipetas, asa de platino o

nicromel, papel pH, ángulos de vidrio, recipientes

de boca ancha.

Preparación de la

muestra

Los siguientes métodos se basan en el análisis de

una unidad analítica de 25 g en relación 1:9

muestra: caldo. Dependiendo de la composición,

añadir caldo suficiente para mantener esta relación

1:9 a menos que se indique lo contrario. Para las

muestras analizadas en una base de peso no exacto,

por ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones

particulares. Éstas existen para los siguientes

productos: Yema de huevo, clara de huevo seca,

huevos enteros secos, leche líquida (leche

descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y

Pesar 25 g de muestra en vaso estéril de

licuadora/bolsa stomacher y agregar 225 ml del

medio de preenriquecimiento. Licuar durante 1

min. Transferir a un recipiente con rosca, dejar

reposar 60 min y ajustar a pH 6.8 con NaOH 1 N

o HCl 1 N. Incubar a 24 h a 35°C. Productos con

huevo, frutas, crustáceos y pescado: no

descongelar la muestra, usar caldo lactosado y

licuar 2 min. Carnes y derivados cárnicos secos y

procesados térmicamente: si la muestra está en

polvo el licuado puede omitirse; para emulsionar


117

suero de leche), mezclas preparadas en polvo

(pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche

maternizada y alimentación por vía oral o un tubo

que contiene huevo. Huevos en diferentes

presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en

polvo. Caseína. Harina de soya. Productos que

contienen huevo (fideos, rollos de huevo,

macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas

preparadas (jamón, huevo, pollo, atún, pavo),

frutas y verduras frescas, congeladas o secas,

carnes de frutos secos, crustáceos (camarones,

cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y

pescado. Levadura seca (levadura activa e

inactiva). Coberturas para helado. Especias.

Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el

chocolate). Coco. Colorantes de los alimentos y

sustancias alimenticias para colorear. Gelatina.

Carnes, sustitutos de carne, subproductos de la

carne, sustancias de origen animal, productos

glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las

ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo.

Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no

pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no

pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada).

Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para

perro. Melones. Mangos. Tomates. Ensayos

ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de

mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas

(espinaca, lechuga romana, cilantro, perejil rizado,

perejil italiano, culantro, repollo y albahaca).

las grasas se puede agregar un detergente. Carnes

crudas o altamente contaminadas: pesar 25 g de

producto en dos vasos de licuadora, agregar 225

ml de caldo selenito cistina o de caldo

tetrationato, licuar por 2 min y pasar a matraces

Erlenmyer de 500 ml, dejar reposar y ajustar pH.

Expresión de resultados Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de

producto.

Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de

la muestra.

Informe de la prueba No especifíca. No especifíca.

Concordancia con


No especifíca.



118


las pruebas de medios selectivos y bioquímicas

de identificación del microorganismo

Microorg

anismo Apartado BAM Capítulo 4

NOM-242-SSA1-2009 Diluciones en tubo

múltiple

Esc

her

ich

ia c

oli

y b

act

eria

s coli

form

es

Objetivo Enumeración de Escherichia coli y bacterias

coliformes.





métodos de prueba.

Fundamento Fermentación de lactosa y cálculo de número

más probable.

Basado en la propiedad de los microorganismos

coliformes para producir gas a partir de glucosa y

fermentación de lactosa dentro de las 48 h de

incubación a 35 °C (coliformes ) y 44.5 °C

(Coliformes fecales y E. coli).

Procedimiento

General: Dilución, NMP (inoculación e

incubación, aislamiento en placa, selección de

colonias y confirmación), conteo en placa

(inoculación e incubación, conteo y selección de

colonias), confirmación (subcultivo, confirmación

bioquímica), confirmación en medio sólido y

filtración por membrana.

Prueba presuntiva, prueba confirmatoria

(Confirmar en por lo menos el 10 % de las

pruebas con resultados positivos a coliformes

fecales por cultivo en placas de agar McConkey a

partir de los tubos que demostraron la presencia

de gas en la prueba confirmativa. Incubar las

placas a 35 °C ± 0.5 °C durante 24 h ±2 h,

observar las colonias típicas fermentadoras de

color rojo rodeadas de un halo opaco de

precipitación de sales biliares.Seleccionar una o

más colonias aisladas y pasar a tubos de

fermentación con caldo lauril triptosa. Hacer

tinción de Gram para observación de la

morfología de las

colonias.


119


cultivo

Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25),

caldo lauril triptosa (LST)(M76), caldo EC

(M49), azul Levin de metileno-eosina (L-EMB),

agar (M80), caldo triptona (triptofano) (M164),

caldo MR-VP (M104), caldo citrato de Koser

(M72), agar para cuenta en placa método estándar

(PCA) (M124), agua Butterfield de tampon de

fosfatos (R11) o diluyeente equivalente (excepto

para crustáceos), reactivo de Kovacs (R38),

reactivo Voges-Proskauer (VP) (R89), reactivos

para tinción de Gram (R32), indicador rojo de

metilo (R44), agar bilis rojo violeta (VRBA)

(M174), agar VRBA-MUG (M175), medio EC-

MUG (M50), caldo lauril triptosa MUG (LST-

MUG) (M77), diluyente de peptona 0.1 % (R56).

Caldos: Caldo lauril, caldo EC, agar McConkey,

agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L),

caldo triptona al 1 % (triptofano), caldo MR-VP,

caldo citrato de Koser. Reactivos: reactivo de

Kovacs, para prueba de indol, prueba de Voges-

Proskauer, coloración de Gram, indicador rojo

de metilo, medio EC-MUG

Aparatos e

instrumentos


pipetas, varillas vidrio, asas, pHmetro, contador de

colonia, licuadora, frascos de dilución, lámpara

UV.

Baño de agua con agitación cubierto y con

termostato, termómetro, tubos de cultivo,

campanas de fermentación (tubos Durham),

gradillas, asas, lámpara de luz ultravioleta, lentes

protectores.

Preparación de la

muestra Diluciones decimales.

Preparar la muestra como se indica en el método

Preparación y dilución de muestras de alimentos

para análisis microbiológico; y de acuerdo con el

tipo de producto, utilizar las diluciones

apropiadas, según se indica en el procedimiento

de la densidad microbiana por la técnica del

número más probable.

Expresión de resultados Tabla del número más probable (NMP),

número de Enterobacteriaceae x gramo o por

mililitro.

Expresar en NMP/g o ml para alimentos

Informe de la prueba No especifíca. No especifica

Concordancia con


No especifica.



Apartado BAM Capítulo 4A Escherichia coli


120

Microorg

anismo

diarreogénica

Esc

her

ich

ia c

oli

Objetivo

Identificar y aislar cepas patógenas de E. coli en

base a sus propiedades únicas de virulencia en los

alimentos para consumo humano.

Fundamento

Enriquecimiento en medio líquido, selección de

cepas fermentadoras de lactosa, caracterización

primaria y secundaria por pruebas bioquímicas,

pruebas mediante cultivo de tejidos, sondas de

ADN, PCR en tiempo real de enterotoxigénicidad,

enteroinvasivadad, enteropatógenicidad, detección

sistemática de E. coli serotipo O157:H7.

Procedimiento

A. Enriquecimiento de cepas patógenas de E. coli.

Caldo BHI, caldo de doble fuerza TP incubar 20 h

a 44.0 ⁰C ± 0.2 ⁰C. Plaquear en medio selectivo,

incubar 20 h a 35 ⁰C. B. Selección. Características

fenotípicas en medio selectivo. C. Análisis e

identificación bioquímica. Primera y segunda

inspección con pruebas bioquímicas tradicionales o

como alternativa, API20E o el ensayo de pruebas

bioquímicas automatizado VITEK. D. Pruebas de

E. coli enterotoxigénica (ETEC), por análisis de

hibridación de colonias con sondas de ADN,

cultivo de tejidos, prueba del ratón lactante,

pruebas comerciales de RPLA y ELISA para

detectar toxinas, ensayos de PCR. E. Pruebas de E.

coli enteroinvasiva (EIEC), por la prueba de

Sereny o el ensayo queratoconjuntivitis con

cobayos, ensayo de tejido de células HeLa , técnica

de tinción en vitro usando naranja de acridina,

sondas de ADN y PCR. F. Pruebas de Escherichia

coli enteropatógena (EPEC), por cultivo de tejidos,

PCR y sondas. G. Detección de E. coli serotipo

O157: H7. Medio de enriquecimiento, medio


121

sólido selectivo, identificación fenotípica,

serología y la prueba de genes de la Shiga toxina

por PCR y PCR en tiempo real. H. Preparación de

la muestra, enriquecimeinto. I. Análisis de PCR en

tiempo real. Preparación del molde de ADN,

controles de PCR positivo y negativo, protocolo de

la reacción del Smart Cycler II y análisis de datos.

J. Análisis y detección de los cultivos aislados. De

positivos por el ensayo de PCR en tiempo real.

Proceso de aislamiento. Diluir y crecer en medio

sólido selectivo y agar cromógeno, identificar

fenotípicamente, pruebas de antígenos, ensayar en

medio selectivo y pruebas bioquímicas, pruebas

confirmatorias (bioquímicas, con antígenos,

antisueros comerciales, PCR tiempo real). K.

Métodos de análisis para cepas STECno-O157.

Enriquecimiento, aislamiento en medio selectivo,

pruebas confirmatorias de los aislados por API20E

o VITEK, PCR, electroforesis en gel en campos

pulsados.


cultivo

Caldo triptona fosfato (TP) (M162), caldo infusión

cerebro corazón (BHI) (M24), agar azul Levine

azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80), agar

MacConkey (M91), agar triple azúcar hierro(TSI)

(M149), agar base sangre(BAB) (M21), caldo

triptona (triptofano) (M164), caldo púrpura de

bromocresol (M26) suplementado individualmente

con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azúcares:

glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa,

manitol y lactosa, caldo urea (M171), caldo

Falkow lisina decarboxilasa (M87), caldo cianida

de potasio (KCN) (M126), caldo MR-VP (M104),

medio indol nitrito (nitrato triptico) (M66), agar

acetato (M3), caldo mucato (M105), caldo mucato

control (M106), caldo malonato (M92), caldo


122

citrato de Koser (M72), solución acuosa de

bicarbonato de sodio 10 % (R70), Discos de

ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido) (R53),

solución salina amortiguador de fosfatos (PBS)

(R60), agua diluyente de Butterfield amortiguador

de fosfatos (BPBW) (R11), reactivo de Kovac

(R38), reactivo VP (R89), reactivo de prueba de

oxidasa (R54), reactivo de detección de nitritos

(R48), acite mineral pesado (R46), reactivos de

tinción de Gram (R32). Para pruebas en PCR

tiempo real: Agua peptonada amortiguada con

piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-

Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a),

oligonucleótidos iniciadores y sondas para

STEC/O157 específicos para la plataforma de PCR

en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM

reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher),

LightCycler FastStart DNA Master Hybridization

Probes M-Grade (Roche Applied Science, Catalog

#3 383 393), Agar MacConkey telurito cefixima-

sorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromogénico

selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F® agar (R&F

Laboratories), agar Rainbow® O157 (BIOLOG),

agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80)

(solo sección R), agar tripticasa de soya con

extracto de levadura (TSAYE) (M153),

amortiguador de fosfato Butterfield (R11) (pH 7.2

± 0.2), agua destilada, agua grado molecular,

solución fisiológica salina (0.85 % NaCl),

ColiComplete Discs - conteniendo sustrato

fluorogénico MUG para GUD y X-gal

cromogénico para GAL (BioControl), reactivo

Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o

VITEK GNI (BioMerieux).


123

Aparatos e

instrumentos


pipetas, varillas vidrio, licuadora, estomaquer,

mezclador rotatorio, vortex, separador magnético

con gradilla magnética, Baño de agua,

microscopio, pHmetro, microcentrífuga,

Termociclador SmartCycler II, tubos para PCR,

instrumento LightCycler 2.0 PCR tiempo real,

capilares LightCycler para PCR tiempo real.

Preparación de la

muestra

Refrigere las muestras inmediatamente después de

su recepción. No congelar, excepto para mantener

los productos congelados hasta justo antes del

análisis. Analizar las muestras tan pronto como sea

posible. Si el recuento lo requiere, preparar un

homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o

BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o

BPBW) de la placa de homogeneizado e inocular

en cajas directo en agar MacConkey para obtener

colonias aisladas. Después de incubar las placas

durante 20 horas a 35°C, realizar levantamiento de

las colonias y pruebas de hibridación con sondas

genéticas específicas para los genes de virulencia.

Pruebas con sondas y PCR: Productos con hojas -

añade un peso igual de amortiguador fosfato de

Butterfield a por lo menos 200 g de producto en un

recipiente estéril o bolsa resellable de plástico y

agitar suavemente durante 5 minutos. Pesar 125 g

del producto enjuagado en 125 ml de (2X)

mBPWp doble fuerza. Jugo, leche u otras muestras

de bebidas turbias - asépticamente centrifugar 200

ml de muestra a 10.000 xg durante 10 min.

Después de decantar el sobrenadante, resuspender

el material precipitado en 225 ml de mBPWp.

Agua embotellada u otros líquidos no turbios -

pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. También

seguir este procedimiento con líquidos en el que no


124

sea visible un precipitado después de la

centrifugación. Todos los demás alimentos - pesar

25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o

mezclar con un stomaquer según sea necesario.

Preparación del molde de ADN: Enriquecer la cepa

durante una noche, centrifugar, resuspender el

precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar,

resuspender el precipitado en agua estéril,

mantener a 100 °C durante 10 min, centrifugar,

retirar y guardar el sobrenadante como molde de

ADN (Esto puede ser congelado, mínimo a -20 °

C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una

dilución 1:10 de este molde.

Expresión de resultados Número de E. coli por gramo o por mililitro.


Concordancia con


125

Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios.

Método para la cuenta e identificación de Escherichia coli

diarreogénica.

PREFACIO

En la elaboración de la presente propuesta de norma participaron los siguientes Organismos e

Instituciones:

CENAM

ÍNDICE

Contenido

1. Objetivo y campo de aplicación

2. Fundamento

3. Referencias

4. Definiciones

5. Símbolos y abreviaturas

6. Reactivos y materiales

7. Equipo

8. Preparación de la muestra

9. Procedimiento

10. Expresión de los resultados

11. Concordancia con normas internacionales

12. Cepas de referencia

13. Bibliografía


1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un método general para el enriquecimiento y el

aislamiento de E. coli en base a sus propiedades únicas de virulencia en los alimentos para consumo

humano.

1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las

personas físicas y morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de

importación, para fines oficiales.


126

2. Fundamento

2.1 Enriquecimiento en medio líquido, selección de cepas fermentadoras de lactosa, caracterización

por pruebas bioquímicas, PCR en tiempo real para determinar enterotoxigénicidad,

enteroinvasivadad, enteropatógenicidad, detección de E. coli serotipo O157:H7.

3. Referencias

Esta norma se complementa con lo siguiente:

NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos


NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico.

4. Definiciones

Para fines de esta norma se entiende por:

Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35

°C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en NOM-112-

SSA1-1994 o bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35

°C fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire

del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares según lo

especificado en la NOM-113-SSA1-1994.

Dilución primaria: es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una

cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de

diluyente.

Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un

determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que

por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones

decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.

Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen

determinado de la suspensión inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y

repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilución

adecuado para la inoculación del medio de cultivo.


127

Escherichia coli: Bacteria que a 44 ⁰C forma colonias indol positivas (color rosa) bajo las

condiciones descritas en la presente norma.

Enterobacteriaceae: Microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reacción negativa a

oxidasa cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al método especificado.

Escherichia coli O157; E.coli O157: Microorganismos que forman colonias características en la

superficie del medio en placa empleado en esta norma, y que producen indol y aglutinan

específicamente con antisuero frente al antígeno O157.

Método: es un proceso o camino sistemático establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin

de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento científico seguido en la ciencia para hallar

la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea específica en la clase o módulo.

Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser

utilizada para inspección o para análisis.

Muestra representativa: es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido

seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del

que procede.

Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un

producto determinado (o de un grupo de productos) para la detección o la determinación del número

de un microorganismo específico (o de un grupo de microorganismos).

Porción para análisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la

muestra para el laboratorio para emplearse en la preparación de la suspensión inicial.

Procedimiento: es un término que hace referencia a la acción que consiste en proceder de alguna

forma. El concepto, por otra parte, está vinculado a un método ó una manera de ejecutar algo. Un

procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una

labor de manera eficaz.

Suspensión inicial (dilución base): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un peso o

volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del

producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las

partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.

Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un

peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a

partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando

que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.


128

Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de

la totalidad del lote o partida.


± más menos

/ por

⁰C grado Celsius

% por ciento

cm centímetro

g gramo

h hora

kg kilogramo

l litro

μl microlitro

M molar

ml mililitro

mm milímetro

min minuto

p peso

PCR reacción en cadena de la polimerasa



seg segundo


v volumen



En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones

impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.

Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado

analítico.

6.1 Reactivos


129

Caldo triptona fosfato (TP) (M162)

Triptona 20 g

K2HPO4 2 g

KH2PO4 2 g

NaCl 5 g

Polisorbato 80 (Tween 80) 1.5 ml

Agua destilada 1 litro.

Preparación

Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Esterilizar por 15 min at 121 °C. pH

final , 7.0 ± 0.2.

Caldo infusión cerebro corazón (BHI) (M24)

Medio 1:

Infusión de cerebro de ternera 200 g

Infusión de corazón de res 250 g

Peptona proteosa (Difco) o polipeptona (Bioquest) 10 g

NaCl 5 g

Na2HPO4* 2.5 g

Dextrosa 2.0 g

Agua destilada 1 litro.

*Difco no especifica aguas de hidratación.

Medio 2:

Infusión cerebro corazón 6.0 g

Digerido péptico de tejido animal 6.0 g

NaCl 5.0 g

Dextrosa 3.0 g

Digerido pancreático de gelatina 14.5 g

Na2HPO4** 2.5 g

Agua destilada 1 litro

**BBL no especifica aguas de hidratación.

Preparación

Medio 1: Disolver los ingredientes del medio 1 en agua destilada con calentamiento suave.


130

Medio 2: Suspender los ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir durante 1 min hasta

disolver completamente. Para ambos medios 1 y 2, verter el caldo dentro de botellas o tubos para su

almacenamiento. Esterilizar 15 min a 121°C. pH final , 7.4 ± 0.2.

El medio BHI comercial también es aceptable.

Agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80)

Peptona 10 g

Lactosa 10 g

K2HPO4 2 g

Agar 15 g

Eosin Y 0.4 g

Azul de metileno 0.065 g

Agua destilada 1 L.

Preparación

Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullición si es necesario. Añadir agua para

obtener el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml y esterilizar en autoclave

por 15 minutos a 121 °C. pH final 7.1 ± 0.2

Agar MacConkey (M91)

Peptona proteosa o polipeptona 3 g

Peptona o gelisado 17 g

Lactosa 10 g

Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares 1.5 g

NaCl 5 g

Rojo neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.001 g

Agar 13.5 g

Agua destilada 1 L.

Preparación

Suspender los ingredientes y calentar con agitación hasta disolver. Hervir 1 min -2 min. Esterilizar

15 min a 121 °C, enfriar a 45 °C – 50 °C y verter en porciones de 20 ml dentro de cajas Petri


131

estériles de 15 mm x 100 mm. Secar a temperatura ambiente con la tapa cerrada. No usar cajas

húmedas, . pH final 7.1 ± 0.2.

Agar triple azúcar hierro (TSI) (M149)

Medio 1:

Extracto de carne 3 g

Extracto de levadura 3 g

Peptona 15 g

Peptona proteosa 5 g

Cloruro sódico (NaCl) 5 g

Lactosa 10 g

Sacarosa 10 g

Glucosa 1 g

Sulfato férrico 0.2 g

Tiosulfato sódico 0.3 g

Rojo fenol 0.024 g

Agar 12 g

Agua 1 L

Medio 2:

Polipeptona 20 g

NaCl 5 g

Lactosa 10 g

Sacarosa 10 g

Glucosa 1 g

Fe(NH4)2(SO4)2Â·6H2O 0.2 g

Na2S2O3 0.2 g

Rojo fenol 0.025 g

Agar 13 g

Agua destilada 1 L

Preparación (Puede utilizarse cualquiera de los dos medios).


132

Medio 1: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si

fuera necesario. Se reparte el medio en tubos de ensayo. Se esteriliza en autoclave regulado a 118

°C durante 15 min. pH 7.3 ± 0.2.

Medio 2: Se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave regulado a

121 °C durante 15 min. pH 7.4 ± 0.2.

Agar base sangre (BAB) (M21)

Infusión de 375 g de músculo de corazón

Tiotona 10 g

NaCl 5 g

Agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Calentar suavemente hasta disolver. Esterilizar 20 min a 121°C. pH final 7.3 ± 0.2. También puede

utilizarse agar de infusión de corazón deshidratado comercial.

Caldo triptona (triptofano) (M164)

Triptona o tripticasa 10 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver y verter porciones de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm o 16 mm x 150 mm.

Esterilizar 15 min a 121 °C. pH final 6.9 ± 0.2.

Caldo púrpura de bromocresol (M26) suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno

de los azúcares: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea

(M171)

Base:

Peptona 10 g

Extracto de carne de res 3 g

NaCl 5 g

Púrpura de Bromocresol 0.04 g


133

Agua destilada 1 L

Preparación

Verter porciones de 2.5 ml de solución base dentro de tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm

conteniendo tubos de fermentación invertidos de 6 mm x 50 mm. Esterilizar 10 min a 121°C. pH

final 7.0 ± 0.2. Esterilizar en autoclave, por separado, soluciones madre de carbohidratos (50 % p/v)

o preferentemente por filtración (0.2 µm tamaño de poro). Adicionar 0.278 ml ± 0.002 ml de la

solución madre de carbohidratos a 2.5 ml de medio basal para dar una concentración final de

carbohidratos de 5 % p/v.

Caldo urea (M171)

Urea 20 g

Extracto de levadura 0.1 g

Na2HPO4 9.5 g

KH2PO4 9.1 g

Rojo de fenol 0.01 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver los ingredientes en agua destilada. No calentar. Esterilizar por filtración a través de una

membrana de 0.45 µm. Verter asépticamente porciones de 1.5 ml - 3.0 ml dentro de tubos de ensayo

de 13 mm x 100 mm. pH final 6.8 ± 0.2.

Caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87)

Peptona 5 g


Glucosa 1 g

L-lisina 5 g

Púrpura de bromocresol 0.02 g

Agua destilada 1 L

Preparación


134

Calentar hasta disolver. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca de 16 mm x

125 mm. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. pH final 6.8 ± 0.2.

Caldo cianuro de potasio (KCN) (M126)

Cianuro de potasio (KCN) 0.5 g

Proteasa peptona Nº 3 o polipeptona 3 g

NaCl 5 g

KH2PO4 0.225 g

Na2HPO4 5.64 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C.

Enfriar y refrigerar entre 5 °C y 8 °C. pH final 7.6 ± 0.2. Preparar el KCN disolviendo 0.5 g de

KCN en 100 ml de agua destilada estéril y a una temperatura entre 5 °C y 8 °C. Pipetear 15 ml de

la solución fría de KCN a 1 L del medio base estéril y frío. Mezclar y distribuir porciones de 1 ml -

1.5 ml en tubos de ensayo estériles. Utilizando una técnica aséptica tapar los tubos con tapones de

corcho impregnados con parafina. Almacenar los tubos a 5 °C - 8 °C. No pipetear con la boca.

Usar guantes. No almacenar por más de 2 semanas.

Caldo MR-VP (M104)

Medio 1:

Agua peptonada amortiguada en polvo 7 g

Glucosa 5 g

K2HP04 5 g

Agua destilada 1L

Medio 2:

Digerido pancreático de caseína 3.5 g

Digerido péptico de tejido animal 3.5 g

Dextrosa 5 g

Fosfato de potasio 5 g

Agua destilada 1 L

Medio 3:


135

Peptona 5 g

Glucosa 5 g

Amortiguador de fosfato 5 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Medio 1 y 2: Disolver los ingredientes en agua con agitación y calentamiento moderado. Distribuir

porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118 °C

-121 °C. pH final 6.9 ± 0.2.

Medio 3: Disolver los ingredientes en agua. Verter 10 ml dentro de tubos de ensayo de 16 mm x

150 mm y esterilizar en autoclave 15 min a 121°C. pH final , 7.5 ± 0.2.

Medio indol nitrito (nitrato tríptico) (M66)

Tripticasa 20 g

Na2HPO4 2 g

Dextrosa 1 g

KNO3 1 g

Agar 1 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Calentar con agitación suave. Mezclar y verter porciones de 11 ml dentro de tubos de 16 mm x 150

mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118°C. pH final 7.2 ± 0.2.

Agar acetato (M3)

Acetato de sodio 2 g

NaCl 5 g

MgSO4 (anhidro) 0.2 g

Fosfato de amonio 1 g

K2HPO4 1 g

Azul de bromotimol 0.08 g

Agar 20 g

Agua destilada 1 L


136

Preparación

Adicionar todos los ingredientes excepto MgSO4 a un litro de agua destilada. Calentar a ebullición

con agitación. Adicionar MgSO4 y ajustar el pH. Verter porciones de 8 ml dentro de tubos de 16

mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. Inclinar los tubos para obtener inclinación de 5 cm, pH

final 6.7.

Caldo mucato (M105)

Peptona 10 g

Ácido mucico 10 g


Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver la peptona. Disolver el ácido mucico añadiendo lentamente NaOH 5 N y agitando. Verter

porciones de 5 ml dentro de tubos con tapón de rosca de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a

121°C. pH final 7.4 ± 0.1.

Caldo mucato control (M106)

Peptona 10 g


Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver los ingredientes. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos de tapón de rosca de 13 mm x

100 mm. Esterilizar 10 min a 121°C. pH final 7.4 ± 0.1.

Caldo malonato (M92)


(NH4)2SO4 2 g

K2HPO4 0.6 g

KH2PO4 0.4 g

NaCl 2 g


137

Malonato de sodio 3 g

Glucosa 0.25 g


Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver calentando si es necesario. Verter porciones de 3 ml dentro de tubos de ensayo de 13 mm

x 100 mm. Esterilizar 15 min a 121°C. pH final , 6.7 ± 0.2.

Caldo citrato de Koser (M72)

NaNH4HPO4·4H2O 1.5 g

KH2PO4 (monobásico) 1 g

MgSO4·7H2O 0.2 g

Citrato de sodio·2H2O 3 g,

Agua destilada 1 L

Preparación

Verter el medio dentro de tubos de tapón de rosca como se desee. Esterilizar 15 min a 121°C. pH

final 6.7 ± 0.2. Esta formulación se enlista en los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC

Internacional y los métodos estándar para la examinación de aguas residuales de la APHA. La

composición difiere del medio deshidratado comercial. Este último es satisfactorio.

Caldo lauril sulfato triptosa (LST)

Triptosa 20 g

Lactosa 5 g

K2HPO4 2.75 g

KH2PO4 2.75 g

NaCl 5 g

Lauril sulfato de sodio 0.1 g

Agua destilada 1 L

Preparación


138

Disolver los componentes en 1 L de agua. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con

dimensiones de 16 mm x 160 mm, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en

autoclave por 15 minutos a 121 °C ± 1.0 °C. pH final 6.8 ± 0.2

Agar recuento en placa (métodos estándar)

Triptona 5 g


Dextrosa 1 g

Agar 15 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Calentar para disolver los ingredientes. Colocar el medio en tubos o frascos. Esterilizar 15 min a

121 °C, pH final 7.0 ± 0.2.

Solución acuosa de bicarbonato de sodio 10 % (R70)

Bicarbonato de sodio 100 g

Agua destilada para aforar a 1 L

Discos de ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido) (R53)

Solución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7:

NaH2PO4·H20 6.9 g

Agua destilada 45 ml

Solución NaOH 30 % (p/v) 3 ml

o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG) 0.0133 M:

ONPG 80 mg

Agua destilada a 37°C 15 ml

Solución de fosfato de monosodio 1.0 M pH 7 5 ml.

Preparación

Solución de fosfato monosódico 1.0 M pH 7: disolver el NaH2PO4·H2O en agua destilada.

Adicionar la solución de 30 % NaOH y ajustar a pH 7. Aforar a 50 ml con agua destilada y

almacenar en refrigeración (alrededor de 4 °C).


139

0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG): disolver el ONPG en agua destilada a 37 °C.

Adicionar la solución 1.0 M de NaH2PO4. La solución no debe tener color. Almacenar en

refrigeración (alrededor de 4 °C). Calentar una porción suficiente para el número de pruebas a 37

°C antes de usar.

Solución salina amortiguador de fosfatos (PBS) (R60)

Solución Madre (Stock, 0.1 M):

Na2HPO4 (anhidro) 12.0 g

NaH2PO4 · H20 2.2 g

NaCl 85 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver los ingredientes en agua destilada y aforar a 1 litro. Diluir la solución madre 1+9 en agua

doble destilada. Mezclar bien. Ajustar pH a 7.5 con 0.1 N HCl o 0.1 N NaOH si es necesario. Se

encuentra disponible comercialmente en Difco Laboratories y BBL en su forma deshidratada.

Agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11)

KH2PO4 34 g


Preparación

Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15 min a 121 °C.

Almacenar en el refrigerador. Blancos de dilución: Tomar 1.25 ml de la solución madre descrita

anteriormente y aforar a 1 litro con agua destilada. Verter dentro de frascos a 90 ml o 99 ml ± 1

ml. Esterilizar 15 min a 121 °C.

Reactivo de Kovacs (R38)

p-Dimetilaminobenzaldehido 5 g

Alcohol Amílico (normal) 75 ml

HCl (concentrado) 25 ml

Preparación


140

Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico normal. Lentamente adicionar HCl.

Almacenar a 4 °C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de un

cultivo de 24 h en caldo triptona. Una capa color rojo oscuro en la superficie es una prueba positiva

para la prueba de indol.

Reactivo VP (R89)

Solución 1:

α-Naftol 5 g

Alcohol (absoluto) 100 ml

Solución 2:

Hidróxido de potasio 40 g


Preparación

Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y añadir 0.6 ml de la solución 1 ml y 0.2 ml de la solución 2.

Agitar después de cada adición. Para intensificar y apresurar la reacción, añadir unos cristales de

creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados después de 4 h de

adicionar los reactivos.

Reactivo de prueba de oxidasa (R54)

N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenediamina·2HCl 1 g


Preparación

Usar un preparado fresco. Sin embargo, el reactivo puede ser usado hasta por 7 días si es

almacenado en un frasco de vidrio oscuro en refrigeración. Aplicar la solución recientemente

preparada (fresca) directamente a un cultivo joven (24 h) en cajas Petri o tubos inclinados. Las

colonias oxidasa-positivas desarrollan un color rosa que progresivamente se torna púrpura oscuro.

Transferir las colonias fuera del reactivo dentro de 3 min, si es que los cultivos se van a conservar

debido a que el reactivo es tóxico para los organismos. Método opcional: Transferir una pequeña

cantidad de cultivo a un papel filtro impregnado con el reactivo. Un color púrpura oscuro dentro de

10 s indica una prueba positiva. Usar un asa de platino, un aplicador de madera o un palillo estéril

debido a que las asas que contienen hierro (ejemplo asa de nicromo) dan reacciones falsos positivos.


141

Alternativamente, la prueba se puede hacer con una solución al 1 % de hidroclórido de N,N-dimetil-

p-fenilenediamina. Aplicar la solución directamente al cultivo en caja o tubo inclinado.

Reactivo de detección de nitritos (R48)

Reactivo ácido sulfanilico: Ácido sulfanílico 1 g

Ácido acético 5 N 125 ml

Reactivo N-(1-naftil)etilendiamina:

N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro 0.25 g


Reactivo α-Naftol:

α-Naftol 1 g


Reactivos alternativos para la prueba:

El ácido sulfónico 5-Amino-2-naftileno (Ácido de Cleve) y N,N-dimetil- 1-naftilamina han sido

recomendados como sustitutos para la preparación del reactivo B. Etanol absoluto puede ser

sustituido por ácido acético en el reactivo C. Sin embargo, se deberán realizar evaluaciones

comparativas antes de sustituir los reactivos originales.

Preparación

Para preparar el ácido acético 5 N, adicionar 28.75 ml de ácido acético glaciar a 71.25 ml de agua

destilada. Almacenar los reactivos en frascos color ámbar. Almacenar los reactivos en frascos de

vidrio color café con tapón. Para realizar la prueba adicionar 0.1 ml -0.5 ml de los reactivos A y

reactivos B o reactivos C (según lo descrito en el método) a un cultivo en medio líquido o

semisólido. El desarrollo de un color rojo-violeta con los reactivos A y B o un color naranja con los

reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Debido a que el color producido por

los reactivos A y B puede desvanecerse o desaparecer en muy pocos minutos, la reacción debe

registrarse tan pronto como el color aparezca. Si no se desarrolla color, la prueba de presencia de

nitrato por la adición de una pequeña cantidad de polvo de zinc. Si se desarrolla color, el nitrato no

ha sido reducido. Prueba de reducción del nitrato para E. coli enteropatogénica. Para 3 ml de un

cultivo de 18 h -24 h en medio indol-nitrito, adicionar 2 gotas de los reactivos A y B. Un color rojo-

violeta indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Revisar las pruebas negativas añadiendo

pequeñas cantidades de polvo de zinc; si el color rojo-violeta no aparece, el nitrato ha sido reducido.


142

Aceite mineral pesado (R46)

Esterilizar 30 min a 121°C. Usar contenedores con tapón de rosca a la mitad de su capacidad con 20

ml -50 ml.

Reactivos de tinción de Gram (R32)

Cristal violeta de Hucker

Solución A: Cristal violeta (90 %) 2 g, Etanol (95 %) 20 ml

Solución B: Oxalato de amonio 0.8 g, Agua destilada 80 ml.

Preparación

Mezclar las soluciones A y B. Almacenar 24 h y filtrar con papel filtro.

Lugol

Yodo 1 g

Yoduro de potasio (KI) 2 g


Preparación

Colocar el yoduro de potasio en el mortero, añadir el yodo, moler de 5 min a 10 min. Añadir de

manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada aplicación. Verter

esta solución en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y adicionar a la botella

del reactivo.

Contraste de Hucker (solución stock)

Safranina O 2.5 g


Preparación

Solución de trabajo: añadir 10 ml de la solución stock a 90 ml de agua destilada.

Tinción de Gram

Transferir a una laminilla la muestra del cultivo. Pasar la laminilla por la flama varias veces muy

rápido y esperar que la muestra se seque. Añadir una gota de cristal violeta, esperar 1 min a que


143

seque. Lavar con agua. Esperar a que se seque. Colocar una gota de LUGOL, dejar secar y lavar con

agua. Secar. Decolorizar con etanol al 95 %. Lavar con agua. Dejar secar. Agregar una gota de

safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente. Observar al microscopio.

Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) (M192a)

Peptona 10 g

NaCl 5 g

Na2HPO4 3.6 g

KH2PO4 1.5 g

Casaminoácidos 5 g


Lactosa 10 g

Piruvato de sodio 1 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Esterilizar en autoclave. pH 7.2 ± 0.2.

Suplemento de acriflavin-Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a)

Acriflavin 1.125 g

Cefsulodin 1.125 g

Vancomicina 0.90 g

Preparación

Disolver cada uno de los suplementos en 500 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Añadir

1 ml de cada uno a 225 ml de mBPWp.

Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139)

Peptona proteosa o polipeptona 3 g

Peptona o gelisado 17 g

Sorbitol 10 g

Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares 1.5 g

NaCl 5 g


144

Rojo neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.001 g

Agar 13.5 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Disolver los ingredientes en agua destilada, con calentamiento y agitación. Esterilizar en autoclave

15 min a 121 °C. pH final, 7.1 ± 0.2.

Agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194)

Telurito de potasio 2.5 mg/L

Cefixima 0.05 mg/L

Preparación

Preparar Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) como se indica. Después de esterilizar y

temperar añadir los 2 aditivos. Esterilizar por filtración.

Agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80)

Peptona 10 g

Lactosa 10 g

K2HPO4 2 g

Agar 15 g

Eosina Y 0.4 g

Azul de metileno 0.065 g

Agua destilada 1 L

Preparación

Hervir para disolver la peptona, el fosfato y el agar en 1 litro de agua. Añadir agua para completar

el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml cada vez y esterilizar en autoclave

15 minutos a no más de 121 ºC. Antes de su uso, añadir a cada porción de 100 ml: 5 ml de solución

estéril de lactosa al 20 %; 2 ml de solución acuosa de eosina y al 2 %; y 4.3 ml de solución acuosa

de azul de metileno al 0.15 %. Cuando se usa el producto deshidratado completo, hervir para


145

disolver todos los ingredientes en un litro de agua. Distribuir porciones de 100 ml o 200 ml.

Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. El pH final 7.1 ± 0.2.

Agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153)

Agar soya tripticaseína 40 g


Agua destilada 1 L

Preparación

Pesar los ingredientes, adicionar agua y mezclar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C. pH final

7.3 ± 0.2.

Amortiguador de fosfato Butterfield (R11)

KH2PO4 34 g


Preparación

Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 0.1 N. Ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Esterilizar

15 min a 121 °C. Almacenar en refrigeración. Dilución de los blancos: Tomar 1.25 ml de la

solución madre anterior y ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Distribuir en botellas de

90 ml o 99 ml ± 1 ml. Esterilizar 15 minutos a 121 °C.

Reactivo de Kovacs (R38)

ρ-dimetilaminobenzaldehido 5 g

Alcohol amílico 75 ml

HCl (concentrado) 25 ml

Preparación

Disolver el ρ-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico. Lentamente adicionar HCl. Almacenar

a 4 °C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de cultivo bacteriano de

24 h en caldo triptona.

Para pruebas en PCR tiempo real:


146

Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-Cefsulodin-

Vancomicina (ACV) (M192a), oligonucleótidos iniciadores y para STEC/O157 específicos para la

plataforma de PCR en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR

(Cepheid o Fisher), LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes M-Grade (Roche

Applied Science, Catalog #3 383 393), agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC)

(M194), agar cromogénico selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F® agar (R&F Laboratories), agar

Rainbow® O157 (BIOLOG), agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo sección R),

agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato

Butterfield (R11) (pH 7.2 ± 0.2), agua destilada, agua grado molecular, solución fisiológica salina

(0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato fluorogénico MUG para GUD y X-gal

cromogénico para GAL (BioControl), reactivo Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o

VITEK GNI (BioMerieux).

Tabla 2. Secuencias de oligo/sonda para su uso en la plataforma SmartCycler II.

Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

Stx1F934 M19473 26 gTg gCA TTA ATA CTg AAT TgT CAT CA

Stx1R1042 M19473 21 gCg TAA TCC CAC ggA CTC TTC

Stx2F1218 X07865 24 gAT gTT TAT ggC ggT TTT ATT TgC

Stx2R1300 X07865 26 Tgg AAA ACT CAA TTT TAC CTT Tag CA

UidAF241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg

UidAR383 AF305917 22 ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T

IAC55F2 17 ATg ggT gCC gTT CgA gc

IAC186R2 19 Cga gaC gAT gCa gCC aTT C

Sonda1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

Stx1P990 M19473 31 TxRd-TgA TgA gTT TCC TTC TAT gTg TCC ggC AgA

T-BHQ2

Stx2P1249 X07865 25 6FAM-TCT gTT AAT gCA ATg gCg gCg gAT T-BHQ1

UidAP266 AF305917 15 TET-ATT gAg CAg CgT Tgg-MGB/NFQ

ICP-Cy52,3 26 Cy5- TCT CAT gCg TCT CCC Tgg TgA ATg Tg-BHQ2

1 Nombre de oligo / sonda compuesto por gen de interés (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), oligo

reverso (R) o sonda (P), posición de la base 5' del oligonucleótido en la respectiva secuencia del gen

especificada en la columna 2.


147

2 Los oligos y sondas para control interno de amplificación (IAC) están cubiertos por U.S. Patent

Application 0060166232.

Tabla 3. Secuencias de los oligos y sondas para su uso en la plataforma LightCycler 2.0.

Oligos1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

uidA F 241 AF305917 21 CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg

uidA R

383 AF305917 22 ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T

stx1 F 406 M19573 25 gAg gAA ggg Cgg TTT AAT AAT CTA C

stx1 R 667 M19573 27 CAC TAT gCg ACA TTA AAT CCA gAT

AAg

stx2 F 492 X07865 28 gTT TTg ACC ATC TTC gTC TgA TTA TTg

A

stx2 R 737 X07865 22 ACT CCA TTA ACg CCA gAT ATg A

Sondas1 GenBank # Bases 5' → 3' Secuencia

uidA 705 LC

288 AF305917 27

LCRed705-CTT TCC CAC CAA CgC TgC TCA ATT

CCA-Phosphate

uidA FL P 319 AF305917 29 CAC AgC AAT TgC CCg gCT TTC TTg TAA Cg-

Fluoroscein

stx1 610 LC 552 M19573 32 LCRed610-gTC Tgg TgA CAg TAg CTA TAC CAC

gTT ACA gC-Phosphate

stx1 FL P 524 M19573 26 CCT TTC CAg gTA CAA CAg Cgg TTA CA-

Fluoroscein

stx2 670 LC 670 X07865 28 LCRed670-gCT ggA ACg TTC Cgg AAT gCA AAT

CAg T-Phosphate

stx2 FL P 642 X07865 26 gTT ATA CCA CTC TgC AAC gTg TCg CA-

Fluoroscein 1 Nombre del oligo / sonda compuesto por el gen de interés (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F),

oligo inverso (R) o una sonda (610LC, 670LC, 705LC, o P FL), posición de la base 5 ' de los

oligonucleótidos en el secuencia del gen respectivo especificado en la columna 2.

Reactivos para pruebas de PCR

Agua peptonada alcalina (APW)

Peptona 10.0 g

NaCl 10.0 g


Preparación:

Ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2. Distribuir en tubos con

tapón de rosca. Esterilizar 10 min a 121 °C.


148

Solución maestra de oligos para PCR 10 pmol/µl (ver sección específica)

Taq ADN polimerasa (nativa disponible de múltiples proveedores) o Amplitaq® (Perkin-Elmer)

Solución maestro de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de

cada dNTP

Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)

Aceite mineral ligero

Agua desionizada estéril

10X TBE (0.9 M Tris-borate, 0.02 M EDTA, pH 8.3)

Agarosa (grado electroforesis de ácidos nucleicos)

Solución de bromuro de etidio, 10 mg/ml

Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.0 3% azul de bromofenol, 0.03

% cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989]

Marcadores de peso molecular de ADN (ejem., escalera 123 bp, Bethesda Research Laboratories,

Gaithersburg, MD)

7. Equipo

Balanza, ≥ 2 kg con 0.1 g de sensibilidad

Licuadora, Waring o modelo equivalente con operación a baja velocidad a 8000 rpm, con vaso de

vidrio o metal de 1 litro

Incubadoras, 35 °C ± 0.5 °C y 44 °C ± 1 °C

Cajas Petri 20 mm x 150 mm

Pipetas Pasteur

Potenciómetro o tiras reactivas de pH, intervalo 6.0-8.0

Frascos esterilizables para enriquecimiento

Opcional: homogeneizador tipo estomaquer con bolsas plásticas de 250 ml

Bolsas plásticas resellables de 200 g de capacidad

Incubadoras: 36 °C ± 1 °C y 42 °C ± 1 °C

Cajas Petri de 20 mm x 150 mm

Tubos para centrífuga (0.5 ml a 2.0 mL)

Tubos cónicos para centrífuga (50.0 mL)

Micropipetas (0.5 µL -20 µL, 20 µL -200 µL, 200 µL -1000 µL)

Microcentrífuga (capacidad de 15000 x g)

Pipetas (1 ml a 10 ml)


149

Puntas para pipeta (0.2 µl a 1000 µl) (puntas resistentes a aerosol)

Mezclador Vortex

Papel filtro

Baño de agua o bloque de calentamiento capaz de mantener 100 °C

Termociclador SmartCycler II PCR (Cepheid, Sunnyvale, CA) capaz de llevar a cabo los

parámetros de ciclos descritos y detección simultánea de la secuencia en tiempo real para colorantes

FAM, TET, Texas Red y Cy5

Tubos de reacción para PCR SmartCycler (volumen mínimo de reacción de 25 µl) y racks

compatibles con el termociclador

Microcentrífuga con adaptadores capilares (#11909312001) o centrífuga LC Carousel 2.0 (#03 709

507 001) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)

Instrumento de PCR en tiempo real LightCycler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) capaz

de llevar a cabo los parámetros de ciclos descritos y detección simultánea de la secuencia en tiempo

real para colorantes LightCycler LC610, LC670 y LC705

Tubos capilares para PCR LightCycler (volumen mínimo de reacción de 20 µl, #04929292001) y

bloque de enfriamiento (#11909339001) compatible con el termociclador

Hielo

Pinzas estériles

Guantes de látex o equivalentes

Termociclador automático programable

Aparato para gel de electroforesis horizontal

Fuente de poder para electroforesis con voltaje constante

Transiluminador UV

Cámara Polaroid o digital

Película Polaroid


8.1 Preparación de los alimentos para el aislamiento de E.coli patógena. Las muestras deben

prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparación y

dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

8.2 Procedimiento general para la preparación de muestras


150

Refrigere las muestras inmediatamente después de su recepción. No congelar las muestras, excepto

para mantener los productos congelados hasta justo antes del análisis. Analizar las muestras tan

pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere, preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml

de PBS o BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o BPBW) del homogeneizado y plaquear

directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Después de incubar las placas durante

20 horas a 35 °C, realizar levantamientos de las colonias y pruebas de hibridación con sondas

genéticas específicas para los genes de virulencia. Este procedimiento de recuento es más eficaz si

E. coli constituye al menos el 10 % del crecimiento microbiano en agares de aislamiento y está

presente a un nivel de > 1 000 células/g.

8.3 Pruebas con sondas y PCR

Productos de hojas - añade un peso igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200

g de producto en un recipiente estéril o en una bolsa resellable de plástico y agitar suavemente

durante 5 minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado con el amortiguador fosfato de Butterfield y

adicionarlo en 125 ml de mBPWp doble fuerza (2X).

Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - asépticamente centrifugar 200 ml de muestra a 10

000 x g durante 10 min. Resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp después de

decantar el sobrenadante.

Agua embotellada u otros líquidos no turbios - pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. También

seguir este procedimiento con líquidos en los que no sea visible un precipitado después de la

centrifugación.

Todos los demás alimentos - pesar 25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un

estómaquer según sea necesario.

Preparación del ADN molde: Enriquecer la cepa durante una noche, centrifugar, resuspender el

precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar, resuspender el precipitado en agua estéril, mantener a

100 ⁰C durante 10 min, centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como ADN molde (Esto puede

ser congelado, mínimo a -20 ° C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una dilución 1:10 de este

molde.


151

9. Procedimiento

9.1 Enriquecimiento

9.1.1 Enriquecimiento para cepas patógenas de E. coli

Lo que aquí se recomienda permite la determinación cualitativa de la presencia de cepas patógenas

de E. coli patógena. Pesar asépticamente 25 g de muestra en 225 ml de caldo BHI (factor de

dilución de 1:10). Dependiendo de la disponibilidad de la muestra, si es necesario el tamaño de la

muestra puede variar de los 25 g, siempre y cuando el diluyente se ajuste proporcionalmente.

Mezclar o colocar brevemente el homogeneizador tipo estomacher. Incubar el homogeneizado

durante 10 min a temperatura ambiente con agitación periódica, luego dejar asentar la muestra por

gravedad durante 10 minutos. Decantar el medio cuidadosamente en un recipiente estéril e incubar

durante 3 horas a 35 °C para resucitar las células dañadas. Transferir el contenido de 225 ml de

caldo TP de concentración doble en un recipiente estéril e incubar durante 20 horas a 44.0 °C ± 0.2

°C. Después de la incubación, estriar en agar L-EMB y agar MacConkey. Incubar estos agares

durante 20 horas a 35 °C.

9.1.2 Enriquecimiento para pruebas con PCR

Incubar estáticamente el homogenizado a 37 °C ± 1 °C durante 5 horas, luego adicionar 1ml de cada

suplemento ACV e incubar estáticamente a 42 °C ± 1 °C durante toda la noche (18-24 h).

Se debe realizar el enriquecimiento para las cepas control: 465-97 del USDA (stx1-, stx2

- uidA

+).

Como alternativa, utilice ATCC43890 (stx1+, stx2

-, uidA

+), ATCC 43888 (stx1, stx2

- uidA

+) o su

equivalente si 465-97 no está disponible. Nota: estas cepas carecen de ambos genes stx y no debe

utilizarse como controles en la PCR.

OPCIONAL: El uso de separación inmunomagnética (IMS) previo a la etapa de selección puede

resultar útil cuando se sospecha de la contaminación con O157:H7, sobre todo en los alimentos con

altos niveles de la flora microbiana competidora tales como los brotes o carnes crudas. Varios

procedimientos de IMS están disponibles, incluyendo Dynabeads® anti-E.coli O157 (Invitrogen

Corp, Carlsbad, CA) y sistema de inmunocaptura Pathatrix de E. coli O157 (Matriz de Micro Ltd.,

Reino Unido) y algunos de ellos ya han sido probados en alimentos seleccionados. Realizar la IMS

en el enriquecimiento de 5 h o de toda la noche (dependiendo del sistema IMS utilizado). Sembrar

en placa o ensayar el PCR en tiempo real desde la suspensión final de las esferas de IMS

(aproximadamente 100 µl), tal como se describe más adelante.


152

9.2 Selección

Las colonias típicas que fermentan lactosa en agar L-EMB aparecen con centro color negro, planas

con o sin brillo metálico. Las colonias típicas en agar MacConkey que fermentan lactosa presentan

color rojo ladrillo. Los biotipos no fermentadores de lactosa en ambos agares producen colonias

incoloras o ligeramente rosado.

NOTA: Algunas colonias de EIEC no fermentan la lactosa y pueden haber cepas atípicas no

fermentadoras de lactosa en otros grupos de E. coli patógenos, por lo tanto, deberán seleccionarse al

menos 20 colonias (10 típicas y 10 atípicas) para su posterior caracterización.

9.3 Detección bioquímica convencional e identificación de E. coli

Realizar la tinción de Gram. Todos los cultivos que aparezcan como bacilos cortos Gram-negativos

deben ser ensayados con las reacciones IMViC y se deberán inocular en caldo LST para confirmar

la producción de gas. Sin embargo, debido a que muchas bacterias entéricas también puede crecer

en el caldo de enriquecimiento TP, además también se debe considerar la realización de pruebas

adicionales para aquellas cepas de E. coli anaerogénicas, no móviles y no fermentadoras o

lentamente fermentadoras de lactosa. Algunas de estas nuevas o modificadas reacciones se discuten

a continuación.

9.3.1 Pruebas bioquímicas tradicionales:

Producción de indol. Inocular un tubo de caldo triptona e incubar por 24 horas ± 2 horas a 35 °C.

Ensayar para prueba de indol mediante la adición de 0.2 ml -0.3 ml de reactivo de Kovacs. La

aparición de un distintivo color rojo en la capa superior es positiva para la prueba.

Reactivo Voges-Proskauer (VP). Inocular un tubo de caldo MR-VP e incubar 48 horas ± 2 horas a

35 °C. Transferir 1 ml a un tubo de 13 mm x 100 mm. Añadir 0.6 ml de α-naftol y 0.2 ml de KOH

al 40 % y agitar. Añadir unos pocos cristales de creatina. Agitar y dejar reposar durante 2 horas. La

prueba es positiva si se desarrolla eosina color rosa.

Reactivo rojo de metilo. Después de la prueba VP, incubar un tubo adicional de MR-VP por 48

horas ± 2 horas a 35 °C. Agregar 5 gotas de la solución de rojo de metilo a cada tubo. Un color rojo

característico indica una prueba positiva. Un color amarillo indica una reacción negativa.


153

Citrato. Inocular ligeramente tubos de caldo citrato de Koser, evitar una turbidez detectable. Incubar

durante 96 horas a 35 °C. El desarrollo de turbidez distintiva indica una reacción positiva.

Producción de gas de lactosa. Inocular un tubo de LST e incubar 48 horas ± 2 horas a 35 °C. La

producción de gas (desplazamiento del medio en el vial interno) o efervescencia después de una

ligera agitación indica una reacción positiva.

Interpretación: Todos los cultivos que (a) fermentan la lactosa con producción de gas dentro de 48

horas a 35 °C, (b) aparecen como bacilos Gram-negativos no formadores de esporas y (c) dan

patrones de IMViC ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2) se considerarán como E. coli.

NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba de IMViC puede utilizar API20E o las

pruebas bioquímicas automatizadas VITEK para identificar el organismo como E. coli. Utilizar el

crecimiento en los cultivos inclinados de PCA y realizar estos ensayos como lo describe el

fabricante.

9.3.2 Pruebas no tradicionales:

a) Inspección primaria. Transferir las colonias sospechosas a agar TSI, agar BAB, caldo triptona,

caldo arabinosa y caldo urea. Incubar por 20 horas a 35 °C. Rechazar las cepas H2S-positivas,

ureasa positivas, arabinosa no fermentadora, e indol-negativa. Para probar la reacción ONPG,

suspender el crecimiento obtenido en el medio TSI en solución salina al 0.85 % para dar turbidez

detectable. Añadir un disco impregnado con ONPG e incubar 6 horas a 35 °C. El color amarillo

indica una reacción positiva. Rechazar las cepas aerogénicas ONPG-negativas. Algunas cepas

Alcalescens-Dispar (es decir, E. coli anaerogénica) son ONPG-negativas.

b) Inspección secundaria (48 h de incubación a 35 °C a menos que se especifique lo contrario). Para

identificar los cultivos y subdividir Escherichia spp se deben ensayar las reacciones adicionales que

se muestran en las Tablas 3 y 4.

c) Como alternativa, puede utilizar API20E o el ensayo de pruebas bioquímicas automatizadas

VITEK para identificar el organismo como E. coli.

Tabla 3. Lista parcial de los kits bioquímicos miniaturizados y sistemas automatizados para la

identificación de las bacterias transmitidas por los alimentos *.

Sistema Formato Fabricante Organismos


154

APIb Bioquímica bioMerieux

Enterobacteriaceae, Listeria,

Staphylococcus, Campylobacter,

No-fermentadoras, anaerobias

Cobas IDA Bioquímica Hoffmann LaRoche Enterobacteriaceae

Micro-IDb Bioquímica REMEL Enterobacteriaceae, Listeria

EnterotubeII Bioquímica Roche Enterobacteriaceae

Spectrum 10 Bioquímica Austin Biological Enterobacteriaceae

RapID Bioquímica Innovative Diag. Enterobacteriaceae

BBL Crystal Bioquímica Becton Dickinson Enterobacteriaceae, Vibrionaceae,

No-fermentadoras, anaerobias

Minitek Bioquímica Becton Dickinson Enterobacteriaceae

Microbact Bioquímica Microgen

Enterobacteriaceae, Gram

negativas, No-fermentadoras,

Listeria

Vitekb Bioquímica

a bioMerieux


negativas, Gram positivas

Microlog Oxidación de Ca Biolog


negativas, Gram positivas

MISb Ácidos grasos

a Microbial-ID


Bacillus, Staphylococcus,

Campylobacter

Walk/Away Bioquímicaa MicroScan



Campylobacter

Replianalyzer Bioquímicaa Oxoid



Campylobacter

Riboprinter Ácidos nucleicosa Qualicon

Salmonella, Staphylococcus,

Listeria, Escherichia coli

Cobas Micro-ID Bioquímicaa Becton Dickinson


negativas, No-fermentadoras

Malthusb Conductancia

a Malthus Salmonella, Listeria,


155

Campylobacter, E. coli,

Pseudomonas, coliformes

Bactometer Impedanciaa bioMerieux Salmonella

* Tabla modificada de: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed.

a Sistemas automatizados.

b Sistemas adoptados por la AOAC.

NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista métodos disponibles conocidos. La

presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en

análisis de alimentos.

Tabla 4. Lista parcial de ensayos de ácidos nucleicos comercialmente disponibles utilizados para la

detección de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos.

Organismo Nombre comercial Formato Fabricante

Clostridium botulinum Probelia PCR BioControl

Campylobacter AccuProbe Prueba GEN-PROBE

GENE-TRAK Prueba Neogen

Escherichia coli GENE-TRAK Prueba Neogen

E. coli O157:H7 BAX PCR

a Qualicon

Probelia PCR BioControl

Listeria

GENE-TRAKc Prueba Neogen

AccuProbe Prueba GEN-PROBE

BAX PCR Qualicon


Salmonella

GENE-TRAKc Prueba Neogen

BAX PCR Qualicon

BINDb Fago BioControl


Staphylococcus aureus AccuProbe Prueba GEN-PROBE

GENE-TRAK Prueba Neogen

Yersinia enterocolitica GENE-TRAK Prueba Neogen


a Reacción en cadena de la polimerasa.

b Diagnóstico bacteriano por nucleación de hielo.


156

c Adoptado por AOAC.

NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista métodos disponibles conocidos. La

presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en


9.4 Pruebas de detección de genes de virulencia de E. coli mediante PCR punto final.

9.4.1 Pruebas para E. coli enterotoxigénica (ETEC), genes de enterotoxina termo-lábil (LT) y genes

de enterotoxina estable al calor (ST)

Existen pruebas comerciales disponibles de RPLA y ELISA para la detección de toxinas LT y ST

(Tabla 5), así como también se pueden realizar ensayos de PCR punto final con los oligos

específicos tomados de Nataro y Kaper, 1998

.

STI

5'-TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3'

5'-CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3'

LT

5'-GGCGACAGATTATACCGTGC-3'

5'-CCGAATTCTGTTATATATGTC-3'

Las enterotoxinas termo-lábiles (LT) de E. coli son un grupo de proteínas estrechamente

relacionado que se distinguen de enterotoxinas termoestables (ST) por ser inmunogénicas y por ser

inactivadas por calentamiento a 60 °C durante 10 min. Las toxinas estimulan la adenilato ciclasa y

pueden ser detectadas mediante ensayos de cultivo de tejidos de células de ovario de hámster chino

o células suprarrenales de ratón Y-l.

La enterotoxina estable al calor (ST) de E. coli se distingue de la LT (arriba) por la estabilidad al

calor y falta de inmunogenicidad. Puede ser detectada por el bioensayo de ratón lactante y actúa

mediante la estimulación de guanilato ciclasa. Hay al menos dos tipos diferentes: ST I (también

conocido como STa y STP) y ST II (también conocido como STb y STH). La última toxina no es

activa en el ensayo del ratón lactante. Estos genes se han clonado y las secuencias de nucleótidos de

la región codificante STa y STb se ha determinado.


157

Tabla 5. Lista parcial de pruebas comercialmente disponibles basadas en ensayos de anticuerpos

para la detección de patógenos y toxinas*.

Escherichia coli

EHEC**c

O157:H7 RIM LA REMEL

E. coli O157 LA Unipath

Prolex LA PRO-LAB

Ecolex O157 LA Orion Diagnostica

Wellcolex O157 LA Murex

E. coli O157 LA TechLab

O157&H7 Será Difco

PetrifilmHEC Ab-blot 3M

EZ COLI Tube-EIA Difco

Dynabeads Ab-beads Dynal

EHEC-TEK ELISA Organon-Teknika

Assurancee ELISA BioControl

HECO157 ELISA 3M Canada

TECRA ELISA TECRA

E. coli O157 ELISA LMD Lab

Premier O157 ELISA Meridian

E. coli O157:H7 ELISA Binax

E. coli Rapitest ELISA Microgen

Transia Card E. coli O157 ELISA Diffchamb

E. coli O157 EIA/capture TECRA

VIPe Ab-ppt BioControl

Reveal Ab-ppt Neogen

Quix Rapid O157 Ab-ppt Universal HealthWatch

ImmunoCardSTAT Ab-ppt Meridian

VIDAS ELFAb bioMerieux

EiaFOSS ELISAb Foss

Shiga toxina (Stx) VEROTEST ELISA MicroCarb

Premier EHEC ELISA Meridian

Verotox-F RPLA Denka Seiken


158

ETECc

Toxina labil (LT) VET-RPLA RPLA Oxoid

Toxina estable

(ST)

E. coli ST ELISA Oxoid

Enterotoxina SET-EIA ELISA Toxin Technology

SET-RPLA RPLA Unipath

TECRAe ELISA TECRA

Transia Plate SE ELISA Diffchamb

RIDASCREEN ELISA R-Biopharm

VIDAS ELFAb bioMerieux

OPUS ELISAb TECRA

VET-RPLAd RPLA Unipath


a Abreviaturas: ELISA, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzima; ELFA, ensayo por

fluorescencia ligado a enzima; RPLA, aglutinación pasiva reversa de látex; LA, aglutinación de

látex; Ab-ppt, inmunoprecipitatión.

b ELISA automatizada.

Reacción en cadena de la polimerasa.

b Diagnóstico bacteriano por nucleación de hielo.

c EHEC - E. coli Enterohemorágica; ETEC - E. coli enterotoxigénica.

d También detecta la enterotoxina LT de E. coli.

e Adoptado por AOAC.

** ATENCION: a menos que los ensayos afirmen que son específicos para el serotipo O157: H7, la

mayoría de estas pruebas sólo detectan el antígeno O157, por lo que también reaccionan con las

cepas O157 que no son del serotipo H7. Estas cepas O157 no H7, por lo general no producen Shiga

toxinas y son consideradas como no patógenas para los humanos. Además, algunos anticuerpos para

O157 también pueden producir reacciones cruzadas con Citrobacter, E. hermanii y otros

organismos entéricos.

NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista los métodos disponibles conocidos.

La presencia en esta lista no indica la verificación, endose o la aprobación de la FDA para su uso en


9.4.2 Pruebas para E. coli enteroinvasiva (EIEC)


159

Si un aislado es sospechoso de ser EIEC, el potencial invasivo de la cepa puede ser probado

mediante la prueba de PCR punto final usando la secuencia del gen invA de EIEC.

Oligos tomados de Lampel y col. (1990):

KL1 (5'-TAATACTCCTGAACGGCG-3', oligo sentido) 18 bases de longitud, temperatura de

disociación 54 °C.

KL8 (5'-TTAGGTGTCGGCTTTTCTG-3', oligo antisentido) 19 bases de longitud, temperatura de

disociación 52 °C.

Precaución: Dado que tanto EIEC y Shigella darán resultados positivos en las reacciones de PCR

con esas sondas, es fundamental que los organismos sean identificados primero como E. coli.

Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998

5'-CTGGATGGTATGGTGAGG-3'

5'-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'

9.4.3 Pruebas para E. coli enteropatógena (EPEC)

Las cepas EPEC se identifican a partir de 3 características fundamentales: la adherencia, la eficacia

de la lesión (A/E), la adherencia localizada en las células y la ausencia de producción de Shiga

toxina (Stx). Este último rasgo también se utiliza para distinguir las cepas de EPEC de las cepas

EHEC. Existen sondas de PCR para el plásmido EAF que codifica para la adherencia localizada y el

gen eae que codifica para la intimina que causa el fenotipo A/E. Precaución: Existen múltiples

variantes del gen eae y algunas cepas EPEC llevan variantes del gen eae idénticos a los serotipos de

EHEC, por lo que estas pruebas detectan las cepas patógenas de ambos grupos.

Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998

EAF 5'-CAGGGTAAAAGAAAGATGATAA-3'

5'-TATGGGGACCATGTATTATCA-3'

9.5 Procedimiento para la amplificación de secuencias de genes tóxicos de E. coli usando caldo de

enriquecimiento APW mediante PCR de punto final.

Preparación de las muestras y enriquecimiento con APW

9.5.1 Preparación del lisado enriquecido en APW. Preparar lavados o mezclas con APW. Muestrear

y congelar de manera inmediata. Después del enriquecimiento (6 h – 24 h), preparar lisados crudos


160

de APW para PCR mediante el calentamiento a ebullición de 1 ml de las muestras en tubos de 1.5

ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados deberán ser usados para el ensayo de PCR de

manera inmediata o almacenar en congelamiento a -20 °C hasta su uso.

NOTA: Debido a las enormes posibilidades de amplificación con PCR, pequeñas cantidades de

contaminación podrían generar falsos positivos. Es recomendable que la preparación de la muestra,

preparación de la reacción y el análisis de los productos de PCR deben estar separados físicamente

uno de otro para minimizar la contaminación. Usar puntas de pipetas resistentes a aerosol para

preparar las muestras y los reactivos para las reacciones de PCR y si es posible separar un juego de

pipetas para el análisis de los productos de reacción.

9.5.2 Preparación de la reacción de PCR. Para minimizar la contaminación cruzada de los reactivos

de PCR es recomendable que las mezclas de soluciones maestras sean separadas en alícuotas y

almacenadas en congelamiento. Las mezclas maestras deberán contener todos los reactivos excepto

la Taq polimerasa y los lisados a amplificar. Las reacciones finales deberán contener 10 mM Tris-

HCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a

5% (v/v) del lisado APW; 0.5 µM de cada oligo (ver 9.4.1-9.4.3) y 2.5 U Taq polimerasa por 100

µl; los volúmenes de reacción de 25 µl -100 µl pueden ser utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a

la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta homogeneizar, todo dentro de un tubo de reacción de

0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 µl -70 µl de aceite mineral.

9.5.3 Temperatura de los ciclos. Mientras exista cierta variabilidad en la dinámica del calentamiento

y la refrigeración de los termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del régimen de ciclos de

temperatura siguiente, debe producir una amplificación eficaz del fragmento del gen ctx:

desnaturalización durante 1 min a 94 °C, la hibridación del oligo durante 1 minuto a 55 °C y la

extensión del oligo a 72 °C durante 1 min, repetido durante no más de 35 ciclos. El aumento en el

número de ciclos más allá de 35 ciclos a menudo conduce a la formación de productos de

amplificación no específicos, incluyendo dímeros de cebadores.

9.5.4 Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR. Mezclar porciones de 10 µl -20 µl de las

reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel

de agarosa 1.5 %-1.8% sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Después

de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa


161

con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del marcador de peso

molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados.

9.5.5 Controles adecuados. No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control

para garantizar una interpretación precisa de los resultados de PCR. Como mínimo, para el análisis

por PCR de tipos de alimentos previamente optimizados para este método, incluir un control de

contaminación con mezcla maestra que no contiene lisado y un control positivo de E. coli APW en

todos los análisis. Para cada mezcla nueva de alimento para ser analizado por este método de PCR,

se deben determinar los posibles efectos inhibitorios de estos los alimentos. Mínimamente, esto

implica la adición de 1 ml de una dilución 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento

con aproximadamente 5 x 106 organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control

positivo). Una comparación directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin

alimento) que contenga números idénticos de células ctx+, permitirá determinar si se produce

cualquier inhibición en cualquiera de las dos concentraciones de alimento y prevendrá la aparición

de falsos negativos. Es poco probable que los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras)

inhiban la reacción de PCR a menos que los frutos están magullados y el lavado aporte acidez

excesiva para el APW lavado.

9.6 Método de detección para E. coli del serotipo O157:H7 a partir de los alimentos.

Este método de detección utiliza agua peptonada amortiguada modificada con piruvato (mBPWp),

la cual contiene varios reactivos antimicrobianos que inhiben efectivamente el crecimiento de la

flora normal y los competidores no objetivo, sin embargo, permite el crecimiento de las células

viables de O157:H7 (incluyendo otras STEC) y es capaz de detectar <1 ufc/g en los alimentos.

El ensayo de PCR en tiempo real configurado tanto para las plataformas del SmartCycler II o

LightCycler® 2.0, es específico para los genes stx1 y stx2 y para el polimorfismo de un solo

nucleótido +93 en el gen uidA que codifican para la enzima β-D-glucuronidasa (GUD). El SNP +93

está altamente conservado en las cepas O157:H7 y O157:H- que producen Stx y sirve como un

marcador para la identificación precisa de estos patógenos. El ensayo de PCR en tiempo real

también detecta otras cepas STEC, algunas de las cuales son conocidos patógenos humanos.

Las muestras que son positivas en la detección por PCR en tiempo real, requieren la confirmación

por cultivo, involucrando el crecimiento en placas con agar diferencial para establecer la


162

incapacidad de la cepa para fermentar el sorbitol, identificar el aislado como E. coli, y tipificar

serológicamente para los antígenos O157 y H7. También es aconsejable que los aislados se pongan

a prueba una vez más por PCR para los genes stx1 y stx2 para confirmar su potencial toxicológico.

9.7 Detección con PCR en tiempo real

A continuación se describe el montaje de PCR en tiempo real y los protocolos de análisis de datos

para dos plataformas de instrumentos; SmartCycler II y Light Cycler 2.0. El uso de otras

plataformas y protocolos debe ser validado primero.

1. Preparación del ADN plantilla:

a. Transferir 1 ml del enriquecimiento de toda la noche a un tubo de microcentrífuga y

centrifugarlo a 12 000 x g por 3 min.

b. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml 0.85 % NaCl.

c. Centrifugar a 12 000 x g por 3 min.

d. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml de agua estéril.

e. Colocar en un baño de agua o bloque de calentamiento a 100 °C por 10 min.

f. Centrifugar a 12 000 x g por 1 minuto, retirar y guardar el sobrenadante como ADN

plantilla (éste puede congelarse para pruebas futuras de PCR mínimo a -20 °C).

g. Hacer una dilución 1:10 de esta plantilla y usar 1 µl para la prueba de PCR en tiempo real.

h. Para los cultivos puros (incluyendo los cultivos control), suspender 1 ml del caldo de

cultivo o una colonia crecida en agar, en solución salina 0.85 % y prepararlos como se

indicó anteriormente (pasos a-g). Las plantillas pueden ser congeladas para su posterior uso

a mínimo -20 °C.

2. Controles de PCR:

a. Para un control positivo de PCR incluir una plantilla de E. coli O157:H7 de la cepa ATCC

43895 (EDL 933) o ATCC 43894, ambas cepas poseen los tres genes de interés (stx1+, stx2

+

y uidA+).

b. Si no se incorpora un control de amplificación interno en la reacción, preparar un tubo de

reacción incluyendo 1 µl de una dilución 1:10 de la plantilla control EDL 933 y 1 µl de una

dilución 1:10 de la plantilla de la muestra del alimento.

c. Incluir siempre un tubo de control negativo sin plantilla (agua) en cada corrida.

3. Smart Cycler II – Ensamble de reacción y protocolo de análisis de datos:

a. Ensamble de la reacción


163

i. Preparar una mezcla maestra de PCR a partir de los componentes de reacción y las

concentraciones finales para STEC/O157 enlistadas en la Tabla 4. Mantenga todas

las reacciones y los reactivos descongelados en hielo. Alternativamente se puede

preparar una mezcla maestra de PCR mediante el paquete inserto para STEC/O157

CSR y OmmiMix HS o SmartMix HM.

ii. Añadir 24 µl de mezcla maestra a cada tubo SmartCycler y taparlo libremente.

iii. Añadir 1 µl de la plantilla de muestra o control y taparlo con fuerza.

iv. Centrifugue brevemente para llevar todo el líquido a la parte inferior del tubo y

colocarlo en el termociclador.

v. Crear una "corrida" en la SmartCycler II. Dé a cada corrida un nombre de corrida

única, seleccione el conjunto de colorante FTTC25, seleccione el protocolo de PCR

de 2 pasos como se describe a continuación y asigne los lugares apropiados en el

bloque SC.

Paso Criterio

Activación inicial 60 s a 95 °C

40 ciclos

10 s a 94 °C, (óptica apagado)

40 s a 63 °C, (óptica encendido)

Tabla 4. Componentes de reacción para el protocolo de amplificación Smart Cycler II1.

Volumen/rxn Componente Concentración

final

Ajustar a 25 µl 2 Agua destilada estéril

0.625 µl Oligo stx1F934 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM

0.625 µl Oligo stx1R1042 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM


0.375 µl Oligo IAC55F (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM


0.625 µl Oligo uidAF241 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM

0.625 µl Oligo uidAR383 (10 µM solución de trabajo) 0.25 µM

0.375 µl Oligo IAC186R (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM


164

0.375 µl Sonda stx1PTxRd990 (10 µM solución de

trabajo) 0.15 µM

0.0625 µl Sonda stx2PFAM1249 (10 µM solución de

trabajo) 0.025 µM

0.25 µl Sonda uidAPTET-MGB266 (10 µM solución de

trabajo) 0.1 µM

0.375 µl Sonda ICPCy5 (10 µM solución de trabajo) 0.15 µM

Plantilla de ADN IAC3

0.5 esferas OmniMix-HS o SmartMix-HS

1-5 µl Plantilla (Muestra o control)

1 Todos los oligos, sondas así como también los oligos y sondas de ADN IC se encuentran

liofilizados en las esferas CSR STEC/O157.

2 Se adicionará el volumen de agua estéril adecuado dependiendo del volumen de plantilla a utilizar.

3 Molécula de ácido nucleico de longitud completa (252 pb) de control interno como se describe en

U.S. Patent Application 0060166232. La cantidad de plantilla IAC necesita ajustarse dependiendo

de la concentración de la solución madre para reportar el umbral de ciclo en alrededor de 25 ciclos-

35 ciclos cuando ningún inhibidor está presente en la reacción.

4. Análisis de datos cualitativos

En el instrumento SmartCycler II, establezca los siguientes parámetros de análisis para FAM, TET,

TxRd y canales Cy5. Actualice los parámetros de análisis si éstos se cambian antes de registrar los

resultados. Nota: El umbral de ciclo (Ct) del control interno (CI) es específico para cada lote de

CSR (Ct = 25-35). Si el Ct no se presenta consistentemente en la IC (Cy5, canal 4) dirija el tubo de

control negativo sólo a 15 fsu. Recomendaciones específicas del lote para el establecimiento manual

del umbral para el Cy5 pueden ser solicitadas.

Usage: Assay

Curve Analysis: Primary

Threshold Setting: Manual

Manual Threshold Fluorescence Units: 15.0

Auto Min Cycle: 5

Auto Max Cycle: 10

Valid Min Cycle: 3

Valid Max. Cycle: 60


165

Background subtraction: ON

Boxcar Avg. Cycles: 0

Background Min. Cycle: 5

Background Max. Cycle: 40

Las curvas de fluorescencia principales que cruzan el umbral será registrado como "POS" y el

número del ciclo cuando se cruzó el umbral se mostrará en la tabla de resultados (Figura 1A). Los

resultados negativos se muestran como "NEG". Los FAM, TET, TxRd y los canales de Cy5 se

correlacionan con stx2, +93 uidA, stx1 y los IC objetivo, respectivamente. Los resultados también

se pueden ver de forma gráfica. Por ejemplo, la Figura 1B representa una gráfica de los cuatro

canales para una cepa aislada EDL 933 de E. coli O157:H7 que lleva los 3 objetivos.

Figura 1. Ejemplo del resultado de salida del Smart Cycler II. A. Resultados vistos en forma de

tabla, B. representación gráfica de los resultados.

A. Resultados de la vista de tabla

B. Vista gráfica de los resultados

5. Protocolo LightCycler 2.0


166

a. Archivo de compensación de color: Antes de la configuración es necesario ejecutar un

archivo de compensación de color para los múltiples tintes [para una de las sondas de

fluoresceína marcadas utilizadas en este experimento (es decir stx1 FL P524), stx1 610LC

552, stx2 670LC 670, uidA 705LC 288 o tener archivos de compensación equivalentes en el

instrumento. Consultar el manual de instrucciones para la corrida y almacenamiento de un

archivo de compensación de color. Si el archivo de compensación del color ya existe para

los canales adecuados, proceder a continuación con la ejecución del programa de la

muestra.

b. Ensamble de la reacción:

i. Preparar una mezcla maestra de acuerdo con la Tabla 5 para obtener el número

deseado de reacciones.

Tabla 5. Componentes de reacción para el protocolo de amplificación LightCycler 2.0

Volumen/rxn Componente Concentración final

Ajustar a 181 µl Agua destilada estéril





0.54 µl Oligo uidAF241 (10 µM solución de trabajo) 0.30 µM

0.36 µl Oligo uidAR383 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µ M

0.36 µl Sonda stx1 610LC552 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

0.36 µl Sonda stx1 FL524 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

0.36 µl Sonda stx2 670LC670 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

0.36 µl Sonda stx2 FL642 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

0.36 µl Sonda uidA 705LC288 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

0.36 µl Sonda uidA FL319 (10 µM solución de trabajo) 0.20 µM

1.44 µl MgCl2 (25 mM) 3.0 mM

1.8 µl FastStart DNA Master2

1-5 µl Plantilla (muestra o control)

1 El volumen de reacción se ajusta a 18 µl en lugar de los 20 µl estándares. La cantidad apropiada

de agua destilada estéril se añade en función del volumen de la plantilla muestra utilizada.

2Preparar las mezclas de sondas de hibridación grado M FastStart DNA Master según lo

especificado por el fabricante.


167

ii. Asegure una completa mezcla en el tubo pipeteando suavemente o con agitación lento,

y centrifugue rápidamente el tubo para que el contenido se vaya al fondo.

iii. Pipetear 17 µl de la mezcla maestra al número deseado de tubos capilares de vidrio (de

20 µl de capacidad), incluidos los controles.

iv. Añadir 1 µl de ADN plantilla a cada uno de los capilares para completar un volumen

total de 18 µl y colocar la tapa.

v. Crear un nuevo experimento LightCycler.

vi. Programe la corrida en 4 segmentos (Tabla 6) en su instrumento LightCycler.

vii. Introducir la información de programación como se indica::

Canal por defecto: 530

Temperatura de solicitud: 30

Max. Pos Solicitud: Número de muestras a ser analizadas en el instrumento: 6 Ch.

Capacidad del capilar: 20 µl

viii. Cargar los capilares dentro del carrusel de tubos de 20 µl y coloque el carrusel en la

centrífuga para bajar las muestras contenidas en los tubos. Nota: Los tubos pueden ser

centrifugados de manera individual usando adaptadores apropiados.

ix. Coloque el carrusel en el LightCycler y en el módulo de “corrida” “comience la

corrida".

x. Introduzca un nombre de corrida único y continúe. Dentro del módulo “muestras”,

introduzca un identificador en el lugar del capilar.

Tabla 6. Parámetros de programa para LightCycler

Nombre

del

programa

Cicl

os

Modo de

Análisis

Temperatura de los objetivos

Objeti

vo

(°C)

Manten

er

(m o s)

Velocid

ad de la

rampa

(°C/s)

Objeti

vo Sec

(°C)

Tama

ño de

la

etapa

(°C)

Retra

so en

la

etapa

(ciclos

)

Modo de

adquisici

ón

Activación 1 ninguno 95 10 m 20 0 0 0 Ninguno

Amplificaci

ón 40

cuantificaci

ón

95 10 s 20 0 0 0 Ninguno

63 40 s 20 0 0 0 Único

Fundido 1

fundido 95 0 s 20 0 0 0 Ninguno

curvas 55 15 s 20 0 0 0 Ninguno

95 0 s 0.1 0 0 0 Continuo


168

Enfriamient

o 1 ninguno 40 30 s 20 0 0 0 Ninguno

c. Análisis cuantitativo de los datos:

i. Seleccionar “Análisis” de la barra del menú. Escoger “Detección Cualitativa” bajo el título

“Análisis de amplificación”.

ii. Bajo la "Compensación de color" del menú desplegable, seleccionar el archivo de

compensación de color previamente creado por este ensayo.

iii. Seleccionar el canal 610 en el menú desplegable que corresponderá con el gen stx1

objetivo. Haga clic en la pestaña "Avanzado" y amplié la barra de la ventana que le

permitirá ver el CP (punto de cruce) y la puntuación de los valores asignados a la llamada.

Los datos pueden ser registrados capturando la pantalla e importar en Excel o Word a través

de las instrucciones del fabricante o siguiendo los procedimientos establecidos.

iv. Seleccione el canal 670 (stx2) en el menú desplegable y repita el paso 3.

v. Seleccione el canal 705 (uidA) en el menú desplegable y repita el paso 3.

d. Análisis de la curva de fusión de stx1, stx2 y uidA +93 SNP (O157: H7):

i. Seleccione "Análisis" en la barra de menú superior. Seleccione la opción "Llamar Tm" en la

sección "Análisis de la curva de fusión"

ii. Bajo la "Compensación de color" del menú desplegable, seleccione el archivo de

compensación del color creado previamente para este ensayo.

iii. Seleccione el canal 610 en el menú desplegable de canal que corresponderá con los genes

stx1 objetivo. En la sección del menú desplegable "Display" seleccione la pestaña con la

opción "Altura máxima". Ajuste la ventana para ver los datos si es necesario.

iv. Un pico predominante de fusión alrededor de 68 °C es indicativo de stx1.

v. Seleccione el canal 670 (stx2) del menú desplegable. stx2 exhibe un pico de fusión

predominante alrededor de 70 °C.

vi. Seleccione el canal 705 (uidA) del menú desplegable. Los picos de fusión predominante

son los siguientes:

E. coli Tm ≈ 65 °C

E. coli O157:H7 Tm ≈ 71 °C

Nota: Si hay un pico de fusión a ~ 71 °C es positivo para O157: H7. También puede haber

un pico de fusión a ~ 65 °C cuando alguna otra E. coli pueda estar presente.


169

Si la muestra contiene el gen stx1 y stx2, se le denomina "positivo" en el módulo de

detección cualitativo para el canal 610 y 670 respectivamente. Ninguno de los genes está

presentes si es "negativo" en ambos canales.

La muestra es positiva para el +93 uidA SNP indicativo de O157:H7 si el módulo de

detección cualitativo para el canal 705 muestra "positivo" y un pico de fusión se observa en

~ 71 °C. Otros E. coli serán "positivos" en el canal 705 del módulo de detección cualitativo,

pero no presentará un pico de fusión a 71 °C.

Figura 2. Ejemplo del resultado de salida de Light Cycler 2.0. A. Resultados de amplificación, B.

Resultados de la curva de fusión.

A. Llamada de resultados, punto de cruce (CP) y gráfico de la curva de amplificación para stx2

(Canal 670). Pantallas de resultados similares para stx1 en el canal 610.

B. Vista de resultados del análisis de la curva de fusión para uidA +93 SNP, (canal 705).

O157: H7 tienen una temperatura de fusión (Tm) de ~ 71 °C en comparación con una Tm de ~ 65

°C para E. coli.


170

6. Interpretación de los resultados del PCR en tiempo real (Smart Cycler II y LightCycler 2,0)

i. Muestras negativas: Los tres genes objetivo - stx1, stx2 y +93 uidA SNP son "negativos" y

los picos de control de PCR son positivos para uno o más objetivos. Si un control interno

(IC) se incorpora en la reacción como esferas CSR y es positivo, indicaría que las

reacciones funcionaron correctamente. No se necesitan más análisis.

ii. Probables muestras O157 positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es positivo por sí mismo

o en combinación con cualquier positivo de stx1, stx2 o ambos. Proceda a la sección 9.8

para el aislamiento del cultivo y la confirmación.

iii. Probables muestras STEC positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es negativo pero

cualquiera o ambos stx1 y stx2 son positivos, la muestra puede contener un STEC no-O157

o posiblemente el +93 uidA SNP objetivo no se amplificó por encima del ruido de fondo.

Continúe con la sección 9.8. También vea la sección 9.9, para obtener información

adicional.

NOTA: Es posible tener una IC negativa cuando uno o más genes objetivos son positivos,

la amplificación de los genes objetivo puede competir con el control interno de los

reactivos disponibles. En esos casos, el análisis sigue siendo válido, siempre que la

amplificación del gen objetivo haya cruzado el umbral para indicar el éxito de la PCR.

Continúe con la sección P para el aislamiento. Sin embargo, si todos los genes objetivos

son negativos, así como los picos del control de los alimentos o IC se invalida el análisis

de PCR. Solucionar los problemas de la reacción y vuelva a ejecutar el ensayo o estríe en

medio de enriquecimiento como se describe en la sección 9.8.


171

9.8 Asilamiento del cultivo y análisis presuntivo del aislado.

Para las muestras enriquecidas durante la noche que se encuentran como probable positivo mediante

el ensayo de PCR en tiempo real, se requiere la confirmación del cultivo. Del mismo modo, para las

muestras que no han sido analizadas por PCR en tiempo real siga estos procedimientos para el

aislamiento del cultivo.

9.8.1 Aislamiento del cultivo.

a. Realice diluciones seriadas de la muestra enriquecida durante la noche en amortiguador

fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente

0.05 mL de las diluciones 10-2

y 10-4

debe producir aproximadamente 100 colonias-300

colonias aisladas) por duplicado en TC-SMAC y un agar cromógeno (agar Rainbow ®

O157 o agar R&F® E. coli O157: H7). También, de manera opcional se puede incluir una

caja estriada.

b. Incubar las placas a 37 °C ± 1 °C durante 18 h a 24 h. Las colonias O157:H7 típicas en

TC-SMAC son incoloras o neutro/gris con un centro color humo y de 1 mm-2 mm de

diámetro. Bacterias fermentadoras de sorbitol tales como la mayoría de E. coli aparecen

como colonias de color rosa a rojo. En agar Rainbow® O157 o agar R&F® E. coli O157:

H7, las colonias de E. coli O157H7 debe aparecer como colonias color negro o negro

azulado.


172

Figura 3. Apariencia típica de E. coli O157:H7 en TC-SMAC, agar Rainbow® O157 y agar

R&F® E. coli O157:H7.

c. Analice colonias típicas tomando una porción de cada colonia sospechosa aislada del agar

de aislamiento y realice pruebas para el antígeno O157 por aglutinación de látex (Remel

kit).

d. Tome todas las colonias típicas que den positivo (hasta 10, si > 10 están presentes) en el

agar de aislamiento y estríe en placas TSAYE para comprobar su pureza.

e. Coloque un disco ColiComplete (CC, BioControl, Bellevue, WA) en el área más densa

del estriado en la placa TSAYE. Preparar una placa de TSAYE similar utilizando una cepa

de E. coli MUG-positiva como control positivo. Incubar las placas 18 horas-24 horas a 37

°C ± 1 °C. CC posee un ensayo cromogénico para galactopiranosidasa (X-gal) y un ensayo

fluorogénico para glucuronidasa (MUG) en el mismo disco. El control positivo debe

mostrar color azul sobre y alrededor del disco (indicativo de coliformes) y fluorescencia

azul alrededor del disco bajo luz UV de onda larga (365 nm) (indicativo de E. coli). Las

cepas O157:H7 son X-gal (+) pero MUG (-).

Colonias típicas de E. coli O157:H7 en agar selectivo


173

Figura 4. Resultados del disco ColiComplete (CC) para E. coli y E. coli O157:H7

f. Prueba de la mancha de indol: Ponga en contacto el crecimiento de la placa TSAYE con

un papel filtro humedecido con el reactivo de Kovac. E. coli O157:H7 es indol positivo.


174

Figura 5. Resultados indol positivos típicos para E. coli O157:H7.

9.9 Pruebas confirmatorias del aislado

9.9.1 Para las colonias típicas que muestran ser X-gal positivo, MUG negativo e indol positivo,

realice las siguientes pruebas de confirmación de la colonia aislada en TSAYE.

a. Confirmar la presencia de la O157 y antígenos H7 utilizando antisueros comerciales y

siguiendo las instrucciones del fabricante. RIM E. coli O157:H7 Latex Test (Remel,

Lenexa, KS, 800-255-6730), o equivalente proporciona resultados satisfactorios.

NOTA: Si el aislamiento es O157 y H7 positivo, es evidencia de que el aislado es del

serotipo O157:H7. Pero si el aislado es O157 (+) pero H7 (-), proceder con pasos de

confirmación descritos a continuación, ya que puede ser una variante no móvil (O157:NM),

por lo tanto, tiene que ser ensayado mediante PCR para determinar su potencial toxigénico.

El aislamiento también se puede subcultivar en agar sangre para inducir la motilidad y

reanalizar la reacción H7.

Precaución: Asegúrese de probar el aislamiento con el látex de control suministrado con el

kit, para descartar la posibilidad de cepas de E. coli autoaglutinantes que reaccionarán con

los dos reactivos. Además, no utilice el reactivo látex H7 sin probar primero con el reactivo

O157 debido a que otros serotipos de E. coli también puede llevar el antígeno H7.


175

Figura 6. Resultado de aglutinación de latex típico para E. coli O157:H7.

b. Pruebe las cepas O157 y H7 positivas con API20E o VITEK para identificar como E.

coli.

NOTA: Un aislado que es sorbitol (-), indol (+), MUG (-), serológica (+) para O157 y H7 y

se identifica como E. coli es un positivo confirmado para E. coli O157: H7.

c. Los aislados que han sido confirmados como cepas O157:H7 y cepas que son O157 (+)

pero H7 (-), deben ser reexaminados para verificar su potencial toxigénico. Hay varios

ensayos que se pueden utilizar como el PCR en tiempo real (Smart Cycler II o LightCycler

2.0) y el otro es 5P PCR multiplex que simultáneamente ensaya para stx1, stx2, el +93 uidA

SNP, así como otros 2 factores de virulencia O157:H7: los de los genes de enterohemolisina

(ehxA) y el alelo gamma (γ) intimina (eae), que se encuentra principalmente en O157:H7 y

otros pocos serotipos. El protocolo 5P se describe a continuación.

9.9.2 5P PCR Multiplex para la confirmación de O157:H7.

i. Las secuencias de los oligos y los tamaños esperados de los amplicones de 5P PCR se

muestran en la Tabla 7.


176

ii. Para el control positivo, usar el ADN de una cepa O157:H7, tal como EDL933 o

cualquier otra cepa O157:H7 que se conoce como portadora de todos los 5 genes objetivos.

iii. Preparar una mezcla maestra de oligos 10X que contenga concentraciones 2 000 nM de

cada uno de los 10 cebadores. La mezcla maestra de cebadores se puede almacenar

congelado a -20 °C. Usar 5 µl por 50 µl de volumen de reacción para producir una

concentración de uso final de 200 nM de cada cebador.

iv. Usar el crecimiento de la placa en el paso TSAYE 9.9.1 para preparar moldes de ADN

para el análisis de PCR. Preparar el molde de ADN mediante la resuspensión de una colonia

o una asada de la siembra crecida en TSAYE en 100 µl de agua. Mezclar y calentar durante

5 min en un baño de agua hirviendo. Centrifugar para peletizar los desechos. Utilizar 2 µl

de reacción por sobrenadante. Las plantillas pueden ser almacenadas congeladas a -20 °C.

v. La mezcla de PCR de 50 µl contienen amortiguador de Taq polimerasa 1X (Qiagen,

Valencia, CA), 3 mM MgCl2, 250 mM de dNTP, 2 µl de plantilla de ADN crudo, mezcla

maestra de oligos 1X, 3.75 U de HotStarTaq (Qiagen) y agua estéril. Las condiciones de

PCR son: 95 ºC durante 15 min, luego los 25 ciclos, consistiendo cada ciclo de: 95 ºC

durante 1 min, 56 ºC por 1 min y 72 ºC durante 1 min y una extensión final a 72 ºC de 5

min. Examinar los amplicones en electroforesis en gel de agarosa (1 %) en 1X TBE (Tris-

borato-EDTA) pH 8.2. Los resultados esperados se muestran en la figura 7.

Tabla 7. Secuencias de los oligos 5P PCR y tamaños esperados del amplicón.

Gen Oligo Secuencia Amplicón

stx1 LP30 5' - CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG - 3' 348 pb

LP31 5' - CACCAGACAATGTAACCGCTG - 3'

stx2 LP43 5' - ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG - 3' 584 pb

LP44 5' - GCGTCATCGTATACACAGGAGC - 3'

+93 uidA PT-2 5' - GCGAAAACTGTGGAATTGGG - 3' 252 pb

PT-3 5' - TGATGCTCCATCACTTCCTG - 3'

γ - eaeA AE22 5'- ATTACCATCCACACAGACGGT - 3' 397 pb

AE20-2 5'- ACAGCGTGGTTGGATCAACCT - 3'

ehxA MFS1Fb 5'- GTTTATTCTGGGGCAGGCTC - 3' 166 pb


177

MFS1R 5'- CTTCACGTCACCATACATAT - 3'

Figura 7. Gel de agarosa de los amplicones 5P PCR. Las muestras son: 1. O157:H7 y 2. Genéricos

de E. coli (control negativo).

NOTA: Un aislado O157:H7 y O157:NM que lleva stx es considerado patógeno. Sin

embargo, una cepa O157:NM que no lleva stx u otros factores de virulencia de EHEC

probablemente no es patógena. Hay muchos serotipos de E. coli O157 que llevan antígenos

distintos al H7 (es decir: H3, H12, H16, H38, H45, etc.), y estos a menudo no tienen

factores de virulencia de EHEC. Pero las variantes de estos NM han sido aisladas.

a. La posterior caracterización de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en

campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados para PFGE de PulseNet

para subtipificar todas las cepas de E. coli O157:H7 y O157:NM.

9.10 Método de análisis para las cepas STEC no-O157.

Tanto los genes stx1 y stx2 como las formas alélicas de estos genes se encuentran en ~ 200 serotipos

STEC, pero muchos de ellos no han sido implicados en la enfermedad y pueden ser encontrados en

la flora intestinal de los seres humanos sanos. Tenga en cuenta que el ensayo de PCR en tiempo

real, que se describe en la sección 9.7 también detectará estas cepas STEC. Así, un resultado para


178

uidA +93 (-), pero stx1 y/o stx2 (+) de PCR en tiempo real, es sólo indicativo de que la muestra

posiblemente contiene un STEC, pero no se debe interpretar que es una STEC patógena.

Las EHEC como grupo son un subconjunto de STEC y se compone de cepas patógenas, de las

cuales la O157:H7 es la cepa prototípica (seropatotipo A). Se conocen varias cepas de EHEC que

han causado enfermedad en todo el mundo: O26, O111, O121, O103, O145, O45, etc (seropatotipo

B). Pueden darse situaciones, como en análisis de alimentos asociadas con un brote de

enfermedades no-O157 de EHEC, donde el analista tendrá que perseguir el aislamiento de esta

probable STEC (+). La siguiente sección describe los procedimientos de aislamiento y la

confirmación de la no-O157 STEC.

NOTA: El procedimiento de enriquecimiento y el ensayo de análisis de PCR en tiempo real descrito

en las secciones 9.1 y 9.8 también se han validado para la detección y la recuperación de otros

productos STEC no O157. Consulte las secciones 6, 7, 9.1, 9.6 y 9.7 para el equipo necesario, los

medios y reactivos, preparación de muestras, enriquecimiento y los procedimientos de detección de

PCR en tiempo real.

1. Procedimiento de aislamiento.

Se requiere la confirmación en cultivo para las muestras de enriquecimiento durante la

noche que se encontraron como presuntos positivos para STEC (positivo para uno o ambos

de los genes objetivo de stx) por el ensayo de PCR en tiempo real. Del mismo modo, para

las muestras que no han sido seleccionadas por PCR en tiempo real debido a la falta de

instrumentación, siga estos procedimientos para el aislamiento de cultivo.

a. Diluya las muestras enriquecidas durante la noche de manera seriada en amortiguador

fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente

0.05 ml de las diluciones 10-2

y 10-4

deben producir aproximadamente 100 colonias-300

colonias aisladas) por duplicado en agar L-EMB (M80) y un agar cromogénico como se

describe en la sección 9.8. De manera opcional también se puede incluir una placa

estriada.

b. Incubar las placas a 37 °C ± 1 °C durante 18 h a 24 h. En L-EMB, las colonias típicas

de E. coli aparecen como colonias planas y con centro oscuro, con o sin un brillo

metálico.

c. Elegir colonias típicas de E. coli a partir de L-EMB (hasta 10) y la placa estriada en

TSAYE con CC (véase la Sección 9.8.1.e.). E. coli será X-gal (+), pero puede ser MUG

(+) o (-).


179

Figura 8. Apariencia típica de colonias de E. coli en agar L-EMB

d. Pruebe los aislamientos X-gal positivos con la prueba mancha de indol (Sección

9.8.1.f.).

2. Pruebas confirmatorias de los aislados.

Confirmar los aislados que aparecen como E. coli típicos en L-EMB y son X-gal (+), MUG

(+) o (-) e indol positivo.

b. Identificar los aislados como E. coli utilizando API20E o VITEK siguiendo las

instrucciones del fabricante.

c. Los aislados identificados como E. coli necesitan ser reexaminados para el potencial

toxigénico (ver sección 9.9.1.c.).

d. La posterior caracterización de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en

campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados de PulseNet para PFGE.


Informar resultado negativo o positivo con UFC/g o ml de muestra.


180


Esta norma es prácticamente una traducción del capítulo 4A y capítulo 28 del Bacteriological

Analytical Manual (2011).


E. coli 465-97 USDA (stx1-, stx2- uidA+), ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+), ATCC 43888 (stx1-,

stx2- uidA+) o equivalente, ATCC 43895 (EDL 933) o ATCC 43894 (stx1+, stx2+ and uidA+).

13. Bibliografía

FDA. 2011. Capítulo 4A. Diarrheagenic Escherichia coli. Bacteriological Analytical Manual.

Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11:132-

201.

Lampel, K.A., J.A. Jagow, M. Trucksess, and W.E. Hill. 1990. Polymerase chain reaction for

detection of invasive Shigella flexneri in food. Appl. Environ. Microbiol. 56:1536-1540.

Weagant, S. D., K. C. Jinneman, and J. H. Wetherington. 2000. Use of multiplex polymerase chain

reaction for identification of enterotoxigenic Escherichia coli. FDA LIB 4227.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.


181

Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios.

Método para la detección de Vibrio cholerae enterotoxigénico.

PREFACIO

En la elaboración de la presente propuesta de norma participaron los siguientes organismos e

instituciones:

CENAM

ÍNDICE

Contenido


2. Fundamento

3. Referencias

4. Definiciones



7. Equipo


9. Procedimiento




13. Bibliografía

14. Anexo


1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un método general para el enriquecimiento, detección y

confirmación de Vibrio cholerae enterotoxigénico, V. parahaemolyticus y V. vulnificus en base a

sus propiedades únicas de virulencia en los alimentos para consumo humano mediante la técnica de

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y crecimiento en medios selectivos.


182

1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las

personas físicas y morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de

importación, para fines oficiales.

2. Fundamento

2.1 Enriquecimiento de la muestra, detección por medio de PCR y confirmación morfológica en

medio selectivo.

3. Referencias

Esta norma se complementa con lo siguiente:

NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos


NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico.

NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del

número más probable.

NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.

4. Definiciones

Para fines de esta norma se entiende por:

Dilución primaria: es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una

cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción del

diluyente.

Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un

determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que

por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones

decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.

Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen

determinado de la suspensión inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y

repitiendo esta operación con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilución

adecuado para la inoculación del medio de cultivo.


183

Método: es un proceso o camino sistemático establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin

de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento científico seguido en la ciencia para hallar

la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea específica en la clase o módulo.

Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser

utilizada para inspección o para análisis.

Muestra representativa: es un número de unidades tomadas de un lote, que han sido

seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del

que procede.

Norma específica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el análisis de un

producto determinado (o de un grupo de productos) para la detección o la determinación del número

de un microorganismo específico (o de un grupo de microorganismos).

Porción para análisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la

muestra para el laboratorio para emplearse en la preparación de la suspensión inicial.

Procedimiento: es un término que hace referencia a la acción que consiste en proceder de alguna

forma. El concepto, por otra parte, está vinculado a un método ó una manera de ejecutar algo. Un

procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una

labor de manera eficaz.

Suspensión inicial (dilución base): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un peso o

volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del

producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las

partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.

Suspensión inicial (dilución primaria): suspensión, disolución o emulsión obtenida cuando un

peso o volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a

partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando

que las partículas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.

Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de

la totalidad del lote o partida.


± más menos

/ signo de división

⁰C grado Celsius

% por ciento


184

cm centímetro

g gramo

h hora

kg kilogramo

l litro

μl microlitro

M molar

ml mililitro

mm milímetro

min minuto

p peso

pb pares de bases

PCR reacción en cadena de la polimerasa




v volumen



En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones

impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.

Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado

analítico.

6.1 Reactivos

Agua peptonada alcalina (APW)

Peptona 10.0 g

NaCl 10.0 g

Agua destilada 1 000 ml

Preparación:

Ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 8.5 ± 0.2. Distribuir en tubos con

tapón de rosca. Esterilizar por 10 min a 121 °C.


185

Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)


Peptona 10.0 g

Sacarosa 20.0 g

Tiosulfato de sodio 10.0 g

Citrato de sodio 10.0 g

Bilis seca de bovino 8.0 g

NaCl 10.0 g

Citrato férrico 1.0 g


Azul de timol 0.04 g

Agar 8.0 a 18.0 g


Preparación:

Añadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullición y retirar

inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 °C y verter en cajas Petri.

Ajustar el pH a 8.6 ± 0.2

Caldo soya tripticasa (TSB-2 % NaCl).

Peptona de tripticasa (triptona) 17.0 g

Peptona de fitona (soytona) 3.0 g

Cloruro de sodio 20.0 g

Fosfato dipotásico 2.5 g

Dextrosa 2.5 g


Preparación:

Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar suavemente hasta su completa disolución.

Distribuir 225 ml en matraces de 500 ml. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 °C. El pH

final debe ser de 7.3 ± 0.2.

Solución salina fisiológica 0.85 % (estéril)


186

NaCl 8.5 g


Preparación:

Disolver el NaCl en el agua. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C. Almacenar a temperatura

ambiente.

Amortiguador fosfato salino (PBS), pH 7.4

NaCl 7.65 g

Na2HPO4 anhidro 0.72 g

KH2PO4 0.210 g


Preparación:

Disolver los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 0.1 N). Esterilizar por

15 min a 121 °C.

Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)


Peptona 10.0 g

Sacarosa 20.0 g

Tiosulfato de sodio 5•H2O 10.0 g

Citato de sodio 2•H2O 10.0 g

Colato de sodio 3.0 g

Oxgall 5.0 g

NaCl 10.0 g

Citrato férrico 1.0 g


Azul de timol 0.04 g


Preparación:


187

Preparar en un matraz de al menos 3 veces más grande que el volumen requerido de medio. Añadir

los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullición y retirar

inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 °C y verter en cajas Petri.

Agar modificado celobiosa-polimixina B-colistina (mCPC)

Solución 1:

Peptona 10.0 g

Extracto de carne 5.0 g

NaCl 20.0 g

Solución stock de colorante 1000X 1.0 ml

Agar 15.0 g


Solución 2:

Celobiosa 10.0 g

Colistina 400 000 unidades

Polimixina B 100 000 unidades


Preparación:

Solución 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 °C -55 °C. Solución 2:

disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Añadir los antibióticos.

Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:

verde oscuro a verde marrón.

Solución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100

ml. Disolver los colorantes en etanol para una solución stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta

solución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por

litro.

Solución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfriar. Adicionar los

antibióticos y esterilizar por filtración. Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada, mezclar, y

distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde café.

NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilización por autoclave. El

medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeración.


188

Agar celobiosa-colistina (CC)

Solución 1:

Peptona 10.0 g

Extracto de carne 5.0 g

NaCl 20.0 g

Solución stock colorante 1000X 1.0 ml

Agar 15.0 g


Solución 2:

Celobiosa 10.0 g

Colistina 400 000 unidades


Preparación:

Solución 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 °C -55 °C. Solución 2:

disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Añadir el antibiótico.

Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final:

verde oscuro a verde marrón.

Solución stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100

ml. Disolver los colorantes en etanol para una solución stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta

solución por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por

litro.

Solución 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfirar. Adicionar los

antibióticos y esterilizar por filtración. Adicionar la solución 2 a la solución 1 enfriada, mezclar y

distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde café.

NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilización por autoclave. El

medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeración.

Tiras reactivas de diagnóstico y reactivos API 20E (BioMerieux)

Solución maestra de oligos de Vibrio cholerae enterotoxigénico para PCR 10 pmol/µl ((5'-

TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3', 5'-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3')

Taq ADN polimerasa (nativa disponible de múltiples proveedores) o Amplitaq® (Perkin-Elmer)


189

Solución maestra de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de

cada dNTP

Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)

Aceite mineral ligero

Agua desionizada estéril

10X TBE (0.9 M Tris-borato, 0.02 M EDTA, pH 8.3)

Agarosa (grado electroforesis de ácidos nucleicos)

Solución de bromuro de etidio, 10 mg/ml

Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.03 % azul de bromofenol, 0.03

% cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989]

Marcadores de peso molecular de ADN (p. ejem., escalera 123 pb, Bethesda Research Laboratories,

Gaithersburg, MD)

7. Equipo

Microondas

Cajas Petri

Homogeneizador

Termociclador programable automático

Aparato de electroforesis en gel horizontal

Fuente de poder de voltaje para electroforesis

Parrilla de calentamiento

Tubos para microcentrífuga

Micropipetas digitales

Pipetas

Microcentrífuga

Transiluminador UV

Cámara Polaroid o digital

Film Polaroid


8.1 Preparación de los alimentos para la identificación de Vibrio cholerae enterotoxigénico. Las

muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-


190

1994. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

8.2 Procedimiento general para la preparación de muestras

Refrigere las muestras inmediatamente después de su recepción. No congelar las muestras, excepto

para mantener los productos congelados hasta justo antes del análisis. Analizar las muestras tan

pronto como sea posible.

9. Procedimiento

9.1.1 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. cholerae

Pesar 25 g de muestra en un frasco tarado (capacidad de aproximadamente 500 ml). Los productos

tales como mariscos o verduras se pueden mezclar o se pueden cortar en trozos pequeños con tijeras

estériles.

Añadir 225 ml de APW al frasco o recipiente del homogeneizador. Mezclar la muestra durante 2

min a alta velocidad.

Incubar el APW a 35 ºC ± 2 ºC durante 6 horas a 8 horas. Volver a incubar el frasco durante la

noche si la muestra hubiera sido procesada de alguna forma. Para el análisis de ostras crudas, incluir

un segundo matraz tarado con 25 g de producto con 2 475 ml APW. Este matraz se incubará de 18

horas a 21 horas a 42 ºC ± 0.2 ºC en un baño de agua.

9.1.2 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus

Pesar 50 g de muestra de mariscos en recipiente de licuadora. Obtener la superficie de los tejidos,

las agallas y el intestino de los peces. Las muestras de mariscos son la carne y el líquido propio de

la muestra. Normalmente se mezclan 12 animales a alta velocidad durante 90 segundos y 50 g de

este homogeneizado será utilizado para el análisis. Para los crustáceos como el camarón debe usarse

el animal entero, si es posible y si es demasiado grande, se debe seleccionar la parte central que

incluye las branquias y el intestino. Nota: lo mismo se recomienda para V. vulnificus

Añadir 450 ml de TSB-2 % NaCl y mezclar durante 1 min a 8 000 rpm. Esto constituye la dilución

1:10. De ser necesario preparar diluciones 1:100, 1:1 000, 1:10 000 o superiores en TSB-2 % NaCl.

Para los moluscos mezclar 12 animales durante 90 segundos con un volumen igual de TSB-2 %

NaCl (dilución 1:2). Prepare una dilución 1:10 transfiriendo 20.0 g (se recomienda que se utilice el

peso porque las burbujas de aire en la dilución 1:2 evita una transferencia volumétrica precisa) de la

dilución 1:2 a 80 ml de TSB-2 % NaCl. Pueden prepararse diluciones decimales adicionales

volumétricamente; es decir, 1 ml de 1:10 a 9.,0 ml de TSB-2 % NaCl para una dilución de 1:100.


191

Para el producto que ha sido procesado, es decir calentado, secos, o congelado, inocular porciones

de 3 x 10 ml de la dilución 1:10 en 3 tubos con 10 ml de TSB-2 % NaCl 2X. Esto representa la

porción de 1 g. Del mismo modo, inocular 3 x 1 ml de las diluciones 1:10, 1:100, 1:1 000 y 1:10

000 en 10 ml de concentración simple de TSB-2 % NaCl. Si se espera un número elevado de V.

parahaemolyticus, la exploración puede comenzar en la dilución 1:10 del producto.

Incubar durante toda la noche a 35 ºC ± 2 ºC.

Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga durante 3 min a 15.000 x g.

Lavar el sedimento dos veces con solución salina fisiológica.

Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min.

Almacenar la plantilla o molde a -20 ºC hasta su uso.

9.1.3 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus

Preparar una dilución inicial 1:10 de la muestra en PBS siguiendo el procedimiento descrito para V.

parahaemolyticus. Preparar diluciones decimales en PBS. Preparar una dilución 1:10 a partir del

homogeneizado de ostra como se describe a continuación: pesar 20 gramos del homogeneizado en

un frasco estéril y añadir PBS para diluir hasta un peso final de 100 g. Mezclar por agitación.

Diluciones decimales adicionales pueden prepararse volumétricamente (es decir, 1 ml de 1:10 a 9.0

ml de PBS para una dilución 1:100).

Inocular porciones x 3 de 1 ml de las diluciones en 3 tubos que contengan 10 ml de APW. Si se

espera un número bajo, porciones de 2 g (1 g de ostra) pueden ser inoculadas directamente desde el

homogeneizador en 3 x 100 ml APW.

Incubar los tubos durante 18 horas a 24 horas a 35 ºC ± 2 ºC.

Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga durante 3 min a 15.000 x g.

Lavar el sedimento dos veces con solución salina fisiológica.

Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min.

Almacenar la plantilla o molde a -20 ºC hasta su uso.

9.2 Preparación del lisado del enriquecimiento APW para detectar V. cholerae

Preparar los lavados o mezclas con APW. Tomar las muestras y congelarlas inmediatamente

(aproximadamente 1 ml). Preparar lisados crudos del APW para la PCR después del

enriquecimiento (6 h -24 h) mediante la ebullición de las muestras de 1 ml en tubos para

microcentrífuga de 1.5 ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados pueden ser utilizados para

la PCR inmediatamente o almacenarse en un congelador a -20 ºC hasta su posterior uso.


192

NOTA: Debido a la enorme amplificación posible con la PCR, los niveles de contaminación que

pueden dar lugar a falsos positivos deben ser minimizados. Se recomienda que la preparación de las

muestras, la puesta en marcha de la PCR y el análisis del producto de PCR deban estar separados

físicamente, uno del otro, para minimizar la contaminación. Como mínimo es absolutamente

necesario el uso de una técnica aséptica en el manejo de todos los reactivos de PCR. Usar puntas de

pipeta aerosol resistente para la preparación de muestras y reactivo para la PCR y si es posible,

deberá utilizar un juego de pipetas diferente para el análisis de productos de la PCR.

9.3 Preparación de la reacción de PCR para detectar V. cholerae

Para minimizar la contaminación cruzada de los reactivos de PCR es recomendable que las mezclas

de soluciones maestras sean separadas en alícuotas y almacenadas en congelamiento. Las mezclas

maestras deberán contener todos los reactivos excepto la Taq polimerasa y los lisados a amplificar.

Las reacciones finales deberán contener 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200

µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a 5 % (v/v) del lisado APW; 0.5 µM de cada oligo

y 2.5 U Taq polimerasa por 100 µl; los volúmenes de reacción de 25 µl -100 µl pueden ser

utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta

homogeneizar, todo dentro de un tubo de reacción de 0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 µl -

70 µl de aceite mineral.

9.4 Temperatura de los ciclos para detectar V. cholerae

Mientras exista cierta variabilidad en la dinámica del calentamiento y la refrigeración de los

termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del régimen de ciclos de temperatura siguiente,

debe producir una amplificación eficaz del fragmento del gen ctx: desnaturalización durante 1 min a

94 °C, la hibridación del oligo durante 1 min a 55 °C y la extensión del oligo a 72 °C durante 1 min,

repetido durante no más de 35 ciclos con una extensión final durante 3 min a 72 ºC. El aumento en

el número de ciclos más allá de 35 ciclos, a menudo conduce a la formación de productos de

amplificación no específicos, incluyendo dímeros de cebadores.

9.5 Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para detectar V. cholerae

Mezclar porciones de 10 µl -20 µl de las reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y

cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE

conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje

constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar


193

las bandas en relación a la migración del marcador de peso molecular. Los oligos iniciadores

generan un fragmento de 777 pb. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para

documentar los resultados.

9.6 Controles adecuados para detectar V. cholerae

No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control para garantizar una

interpretación precisa de los resultados de PCR. Como mínimo, para el análisis por PCR de tipos de

alimentos previamente optimizados para este método (por ejemplo, lavados vegetales, ostras,

cangrejos y camarones mezclas; Koch, et al. 1993) deben incluir en todos los análisis una mezcla

maestra de control de contaminación que no contenga lisado y un control de APW V. cholerae

positivo. Determinar los posibles efectos inhibitorios para cada mezcla de alimento nuevo a ser

analizados por este método PCR. Como mínimo se deberá realizar la adición de 1 ml de una

dilución 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento con aproximadamente 5 x 106

organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control positivo). Una comparación

directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin alimento) que contenga números

idénticos células ctx+, permitirá determinar si se produce cualquier inhibición en cualquiera de las

dos concentraciones de alimento y prevendrá la aparición de falsos negativos. Es poco probable que

los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras) inhiban la reacción de PCR a menos que los

frutos están magullados y el lavado aporte acidez excesiva para el APW lavado.

9.7 Confirmación por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioquímicas para detectar V.

cholerae.

Se recomienda que los caldos de enriquecimiento con agua peptonada alcalina (APW) utilizados

para el análisis de PCR también se siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas

bioquímicas descritas en el anexo B.19 Técnicas y procedimientos para la investigación de Vibrio

cholerae de la NOM-242-SSA1-2009 para el aislamiento y la confirmación directa de la presencia

de V. cholerae en muestras que den resultados positivos de PCR.

9.7.1 Aislamiento en medio selectivo para detectar V. cholerae

Preparar placas secas de agar TCBS.

Transferir una asada (con asa de 3 mm) de la película en la superficie del cultivo en APW a la

superficie de una placa seca TCBS y estriar de una manera que producirá colonias aisladas.

Incubar las placas con el agar TCBS estriadas durante toda la noche (18 h a 24 h) a 35 ºC ± 2 ºC.


194

Las colonias típicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 mm a 3 mm), lisas, de color

amarillo y ligeramente aplanadas con centro opaco y de periferia translúcida.

9.8 Otros Vibrios

9.8.1 Detección de V. parahaemolyticus mediante PCR Multiplex

Preparar plantillas o moldes a partir de un cultivo crecido durante toda la noche a 35 ºC ± 2 ºC en

TSB-2 % NaCl.

El conjunto de oligos iniciadores que deben utilizarse para la detección de V. parahaemolyticus son

los siguientes:

Oligos iniciadores

Genes tlh espcíficos de la especie (450 pb) L-TL 5' aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 3'

R-TL 5' gct act ttc tag cat ttt ctc tgc 3'

Gen trh (500 pb) VPTRH-L 5' ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 3'

VPTRH-R 5' cat aac aaa cat atg ccc att tcc g 3'

Gen tdh (270 pb) VPTDH-L 5' gta aag gtc tct gac ttt tgg ac 3'

VPTDH-R 5' tgg aat aga acc ttc atc ttc acc 3'

Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la detección de V. parahaemolyticus

Reactivo Volumen de reacción

(concentración final)

H2O desionizada 28.2 µl

10× Buffer.MgCl2 5.0 µl

dNTPs 8.0 µl

Mezcla de oligos (6 oligos) 7.5 µl

Templado o molde 1.0 µl

Taq polimerasa 0.3 µl

Volumen total 50.0 µl

Se deberán usar las siguientes condiciones de PCR para la detección de V. parahaemolyticus:

Condiciones de PCR:

Desnaturalización 94 °C 3 min

94 °C 1 min


195

Alineamiento 60 °C 1 min

Extensión 72 °C 2 min

Extensión final 72 °C 3 min

Mantener 8 °C Indefinido

25 ciclos

Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la detección de V. parahaemolyticus

Mezclar 10 µl de producto de PCR con 2 µl de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de

muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de

etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el

gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del

marcador de peso molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los

resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo así como

también un control de reactivo con cada corrida de PCR.

9.8.2 Detección de V. vulnificus por PCR

Partir de las plantillas obtenidas en el procedimiento para el enriquecimiento de la muestra

presuntiva de V. parahaemolyticus (9.1.3).

Los oligos iniciadores para PCR vvhA son parte del gen de citolisina de la posición 785 a la 1 303.

Los oligos a utilizar son los siguientes:

Vvh-785F 5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'

Vvh-1303R 5'cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'

Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la detección de V. vulnificus:

Reactivo Volumen de reacción

(concentración final)

H2O desionizada 28.2 µl

10× Buffer.MgCl2 5.0 µl

dNTPs 8.0 µl

Mezcla de oligos (6 oligos) 7.5 µl

Templado o molde 1.0 µl

Taq polimerasa 0.3 µl


196

Volumen total 50.0 µl

Se deberán usar las siguientes condiciones de PCR para la detección de V. vulnificus

Condiciones de PCR:

Desnaturalización 94 °C 10 min

94 °C 1 min

Alineamiento 62 °C 1 min

Extensión 72 °C 1 min

Extensión final 72 °C 10 min

Mantener 8 °C Indefinido

25 ciclos

Análisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la detección de V. vulnificus

Mezclar 10 µl de producto de PCR con 2 µl de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de

muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de

etidio. Después de la apropiada migración con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el

gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relación a la migración del

marcador de peso molecular. Tome fotografías Polaroid o digitales de los geles para documentar los

resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo así como

también un control de reactivo con cada corrida de PCR.

9.9 Confirmación por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioquímicas para detectar V.

parahaemolyticus y V. vulnificus

Se recomienda que los caldos de enriquecimiento utilizados para el análisis de PCR también se

siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas bioquímicas para el aislamiento y la

confirmación directa de la presencia de V. parahaemolyticus y V. vulnificus en muestras que den

resultados positivos de PCR.

Estriar con un asa de 3 mm desde 1 cm de la parte superior de los tubos con APW con las tres

diluciones más altas de la muestra que mostraron crecimiento en TCBS (y agares mCPC o CC para

el aislamiento de V. vulnificus).

Incubar las placas de TCBS a 35 ºC ± 2 ºC (y las placas de mCPC o CC preferiblemente a 39 ºC -

40 ºC o 35 ºC -37 ºC si no es posible a 39 ºC -40 ºC) durante toda la noche.


197

El crecimiento de colonias típicas de V. parahaemolyticus en agar TCBS aparece como colonias

redondas, opacas, verde o azul, de 2 mm a 3 mm de diámetro. Colonias interferentes competitivas

de V. alginolyticus son grandes, opacas y de color amarillo. La mayoría de las cepas de V.

parahaemolyticus no crece en agar MCPC o CC. Si se produce el crecimiento, las colonias serán de

color verde-púrpura debido a la falta de fermentación celobiosa.

Purificar los aislados y almacenarlos.

La identificación bioquímica de los aislados puede ser realizada utilizando las pruebas diagnósticas

API 20E preparando una suspensión de células de los cultivos sospechosos en 2 % de NaCl (Anexo

1).

Cuando las colonias sean identificadas bioquímicamente finalmente como V. parahaemolyticus se

deberán referir a las diluciones positivas originales en el caldo de enriquecimiento y aplicar las

tablas de NMP para 3 tubos descritas en la NOM-112-SSA1-1994 para el recuento final del

organismo.


Informar resultado negativo o positivo con UFC o NMP por g o ml de muestra.


Esta norma es prácticamente una traducción y adaptación del capítulo 9 y 28 del Bacteriological

Analytical Manual (2011).


Cepa de colección de Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus.

13. Bibliografía

FDA. 2001. Capítulo 28. Detection of enterotoxigenic Vibrio cholerae in foods by the polymerase

chain reaction. Bacteriological Analytical Manual.

FDA. 2004. Capítulo 9. Vibrio. Bacteriological Analytical Manual.


198

Koch, W.H., W.L. Payne, B.A. Wentz, and T.A. Cebula. 1993. Rapid polymerase chain reaction

method for detection of Vibrio cholerae in foods. Appl. Environ. Microbiol. 59:556-560.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

14. Anexo

199

Tabla 1. Características bioquímicas de Vibrionaceae patogénico para el humano comúnmente encontrado en alimentos marinos.

V. alginolyticus V. cholerae V. fluvialis V. furnissii V. hollisae V. metschnikovii V. mimicus V. parahaemolyticus V. vulnificus A. hydrophilia **

P. shigelloides **

Agar TCBS Y Y Y Y NG Y G G G Y G

Agar mCPC NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG

Agar CC NG P NG NG NG NG NG NG Y NG NG

AGS KA Ka KK KK Ka KK KA KA KA KK nd

Oxidasa + + + + + − + + + + +

Arginina dihidrolasa − − + + − + − − − + +

Ornitina descarboxilasa + + − − − − + + + − +

Lisina descarboxilasa + + − − − + + + + V +

Crecimiento en (p/v):

0 % NaCl − + − − − − + − − + +

3 % NaCl + + + + + + + + + + +

6 % NaCl + − + + + + − + + + −

8 % NaCl + − V + − V - + - - -

10 % NaCl + − − − − − − − − − −

Crecimiento a 42 °C + + V − nd V + + + V +

Ácido a partir de:

Sacarosa + + + + − + − − − V −

D-Celobiosa

− − + − − − − V + + −

Lactosa − − − − − − − − + V −

Arabinosa − − + + + − − + − V −

D-Manosa + + + + + + + + + V −

D-Manitol + + + + − + + + V + −

ONPG − + + + − + + − + + −

Voges- Proskauer

+ V − − − + − − − + −

Sensibilidad a:

10 µg O/129

R S R R nd S S R S R S

150 µg O/129

S S S S nd S S S S R S

Gelatinasa + + + + − + + + + + −

Ureasa − − − − − − − V − − −

** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides

Abreviatyras: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares -sacarosa; mCPC, celobiosa-polimixin B-colistina modificado; AGS, placa arginina-glucosa; Y = amarillo NG = nulo o pobre crecimiento S = susceptible nd = no determinado G = verde V = variable entre las cepas R = resistente P = púrpura, V = variable , KK = Placa alcalina / Fondo alcalino KA = Placa alcalina /Fondo ácido, Ka = Placa alcalina / Fondo ligeramente ácido


200

CONCLUSIONES

Con la realización del presente informe correspondiente a la Demanda 6.- “Desarrollo de

normatividad y métodos para detección y medición de organismos microbiológicos en alimentos”

del proyecto CONACYT SAGARPA-2011-09-172352 “Desarrollo de materiales de referencia

certificados, validación de métodos y fortalecimiento de la infraestructura de las redes de

laboratorios para la Inocuidad y Calidad Alimentaria” se puede concluir de manera resumida lo

siguiente:

10. En el estado actual, las metodologías microbiológicas nacionales para el análisis

microbiológico de productos cárnicos, frutas, verduras y marinos, en comparación con las

internacionales, (metodologías propuestas y validadas por organismos de reconocimiento

internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de técnicas de biología

molecular, pruebas automáticas y ensayos rápidos mediante kits comerciales, pero si son

concordantes ó parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologías

tradicionales de identificación bioquímica y medios selectivos.

11. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para análisis de

microorganismos patógenos de los alimentos y se proporciona el fundamento científico y la

factibilidad técnica en relación a la actualización de la normatividad nacional y su

aplicación referente a estudios microbiológicos en productos cárnicos, frutas, verduras y

marinos.

12. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad

de los alimentos, y se sugiere su adopción en México.

13. Una vez considerado que la presentación de las normas internacionales se realiza por

patógeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de

Norteamérica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado

por Estados Unidos de Norteamérica, se sugiere elaborar un manual con los métodos de

determinación de los patógenos en las diferentes matrices, al cual se podría hacer referencia

en las normas, lo que facilitaría y mantendría actualizados los métodos de medición sin la

necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualización de una

norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podría contener los

métodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados

Unidos de Norte América, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el

usuario pueda elegir el adecuado para su propósito, sin restringirlo a un kit, equipo ó

método especifico, sin embargo sería un requisito el utilizar patrones de medición ó

Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad,

incertidumbre y calidad del resultado de la medición realizada. b) En el caso de seguir el

modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patógeno para las

diferentes matrices alimentarias de interés, en lugar de tener una norma por producto para

los diferentes patógenos.

14. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluación,

validación y aplicación de nuevos métodos para la detección de Vibrio cholerae, Vibrio

paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las

diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados

Unidos de Norteamérica.

15. Se realizó un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicación actual y un

estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de


201

investigación, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector

productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluación de la inocuidad de los

alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas

nacionales sobre la detección y/o cuantificación de microorganismos patógenos en

alimentos en sus diferentes matrices.

16. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente sección del

BAM y con los métodos de análisis reconocidos a nivel internacional para la determinación

de los patógenos de interés requeridos para los productos exportables hacia los Estados

Unidos de Norteamérica y/o los distintos socios comerciales de México.

17. Se sugiere la implementación de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la

experiencia de proveedores de ensayos de análisis de microorganismos patógenos de los

alimentos internacionales.

18. Se propone trabajar en las comparaciones del recién formado grupo de trabajo de

microbiología del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales

tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la

determinación de los patógenos motivo de este estudio en alimentos.

19. A continuación se propone la ruta ó cadena de trazabilidad al mol de las mediciones en

microbiología usando el procedimiento de PCR digital, el cual es considerado como

potencialmente primario.


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