Introducción

La diabetes mellitus consiste en un conjunto de sín-dromes metabólicos cuya característica común es elaumento de la glucosa sanguínea. Tanto en la diabetestipo 1 (insulino-dependiente) como en la tipo 2 (no in-sulino-dependiente) hay un déficit en la liberación deinsulina. Dicho déficit es especialmente grave en la ti-po 1, en la que por ataque autoinmune hay una pérdi-da de la población celular beta de los islotes de Lan-gerhans. Los diabéticos tipo 1 son subsidiarios deltratamiento con insulina durante toda su vida. Es poreso que se puede decir que la diabetes mellitus tipo 1es una enfermedad que tiene tratamiento, pero no tie-ne curación. Los estudios del DCCT 1 (Diabetes Con-trol and Complications Trial) y del UKPDS 2 (UnitedKingdom Prospective Diabetes Study) han demostra-do que el control intensivo de la glucemia disminuyede forma significativa la aparición de complicacionesmicrovasculares (retinopatía, nefropatía, neuropatía).Sin embargo, el efecto en las así llamadas complica-ciones macrovasculares (enfermedad cardiovascular,infarto agudo de miocardio, infarto cerebral) es menosdemostrativo. De alguna forma lo que el tratamientointensivo intenta reproducir es el control fisiológico(permanente, preciso y regulado) de la glucemia san-guínea, para ello el paciente debe someterse a un con-trol permanente de la glucemia y a la administraciónintensiva (cinco-seis veces día) de insulina, la tarea queel páncreas endocrino realiza de forma continua essustituida por la conducta de un paciente entrenado ymotivado, como afirma María de Alva 3, diabética ypresidenta de la International Diabetes Federation:«my brain is my pancreas». Un estudio reciente ha demostrado que el trasplantede islotes pancreáticos acompañado de un nuevo tra-tamiento inmunosupresor es capaz de resolver la de-pendencia de insulina por períodos de más de 12meses 4. Este nuevo protocolo, al que se dio una grandifusión en los medios de comunicación, supone unclaro avance en el trasplante de islotes; sin embargo,deja dos puntos abiertos: en primer lugar los diabéti-cos trasplantados necesitan terapia inmunosupresoracontinua y en segundo lugar para cada diabético senecesitan de dos a tres donantes. Dado que las cifrasde donantes, incluso en países como España, con unalto nivel de donación de órganos, nunca alcanzarán

las necesidades de la población de diabéticos tipo 1,se impone la necesidad de buscar otras fuentes decélulas beta para poder ser trasplantadas. Dichafuente debería cumplir las siguientes condiciones: lascélulas obtenidas deben poseer las propiedades de lacélula beta nativa, por ejemplo, un alto contenido deinsulina, ser capaces de sintetizar, almacenar y secre-tar insulina humana, poseer una secreción reguladade insulina, poseer una conversión eficiente de pre-proinsulina en proinsulina y de proinsulina en insuli-na, comportarse fisiológicamente en términos de se-creción (umbral cerca de 4 mM, respuesta secretorasuficiente en su tamaño y en su cinética bifásica), po-seer un fenotipo estable tanto in vitro como in vivoy, finalmente, poder ser producida in vitro en canti-dad suficiente como para permitir la obtención deuna masa celular beta que permita la normalizaciónde la glucemia en humanos. Posiblemente junto conestas propiedades sería oportuno disponer de siste-mas de encapsulación altamente biocompatible. Detodos estos objetivos se encarga la ingeniería celular.En abril de 1904, Ramón y Cajal 5 escribía: «Cuando elfuturo ingeniero neuronal (que así se llamará quizá den-tro de algunos miles de años) deduzca del examen de undiscurso, de un cuadro o de una invención las célulasque entraron en vibración..., entonces el hombre seráverdaderamente rey de la creación...» El comentario deCajal contiene varias condiciones implícitas, en resumen,la necesidad de un conocimiento científico exhaustivo ypreciso de la fisiología celular y tisular, y en segundo lu-gar la existencia de procedimientos para poder transfor-mar la realidad. Ramón y Cajal cifraba en «algunos mi-les de años» el tiempo necesario, y quizá sea así sihablamos de esclarecer las funciones, mecanismos yfundamentos de determinados procesos mentales. Mu-cho antes, no llega a un siglo, una nueva disciplina, laingeniería celular y tisular, nos traslada a campos quemuchos creeríamos más cerca de la ciencia ficción quede la terapéutica. El considerable avance de la biologíacelular, la biología y la genética molecular y la biologíadel desarrollo ha reunido los conocimientos necesariospara que se propongan procedimientos terapéuticos, al-gunos de ellos en fase I, en los que se utilizan los con-ceptos, métodos y conocimientos que pueden englobar-se en lo que entendemos por ingeniería celular.

Bases biofísicas y moleculares delfuncionamiento de la célula beta pancreática

Acoplamiento estímulo-secreción

Desde el punto de vista biofísico puede considerarsea la célula beta pancreática como un integrador de la

AULA MAGNA RAMÓN Y CAJAL Y SEVERO OCHOA

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Ingeniería celular y diabetes mellitus

G Berná, T. León-Quinto, E. Fuentes, E. Andreu, A. Nadal, E. Roche, F. Martín, J. A. Reig y B. Soria

Instituto de Bioingeniería. Universidad Miguel Hernández de Elche. Alicante.

Correspondencia: B. Soria.Instituto de Bioingeniería.Universidad Miguel Hernández de Elche. Alicante.03550 San Juan (Alicante).Correo electrónico: bernat.soria@umh.esAceptado para su publicación el 8 de marzo de 2001.

actividad eléctrica y metabólica. En presencia de con-centraciones estimuladoras de glucosa y otros nu-trientes, la célula beta inicia un proceso de despolari-zación y descarga oscilatoria en ráfagas que provocala entrada de calcio del espacio extracelular al espa-cio intracelular 6-10. Todo parece indicar que las oscila-ciones de calcio citosólico son las responsables de laliberación pulsátil de insulina por el islote de Langer-hans 11,12. La célula beta es un excelente biosensor deglucosa. Al carecer de efecto Pasteur su actividadmetabólica aumenta paralelamente con la concentra-ción de glucosa, siendo la glucokinasa la enzima en-cargada de establecer el umbral (aproximadamente 7 mM en ausencia de otros nutrientes). Por otra parte,la presencia de un transportador de baja afinidad yalta capacidad, el GLUT 2, permite que se equilibrenrápidamente las concentraciones intra y extracelula-res de glucosa. Como consecuencia del metabolismode los nutrientes (glucosa y aminoácidos) aumenta de50 a 70 veces la concentración citosólica de diado-enosinpolifosfatos (Ap3A y Ap4A), lo que contribuyea un bloqueo muy eficiente del canal de K+ reguladopor adenosina trifosfato (ATP) 13,14. Este canal es unrectificador de entrada encargado de mantener el po-tencial de membrana, por tanto cuando se bloqueahace que la célula pierda su potencial de membrana.La despolarización activa canales de calcio depen-dientes de voltaje, lo que a su vez provoca la entradade Ca2+ al interior de la célula. El Ca2+, que aumentade forma localizada en la vecindad de la maquinariaexocitótica 15-19, activa el sensor de calcio e induce lafusión del gránulo de secreción con la membranaplasmática 20. La célula beta pancreática está integra-da dentro del islote, del que constituye el tipo celularmás frecuente (70%-85%), establece uniones tipo«gap» con otras células beta 21, con las que oscila deforma sincrónica 22,23, no así con las no-B que poseensu propio patrón de respuesta en función de la con-centración de glucosa.

Adaptación al aumento de la demanda metabólicaDe forma simple puede decirse que el problema cen-tral de la diabetes es un desequilibrio entre la oferta yla demanda de insulina. Así, cuando se persigue lanormalización de la glucemia mediante el trasplantede islotes humanos a diabéticos tipo 1 se sabe quelos que poseen una mayor masa corporal necesitanun mayor número de islotes (se ha estimado en apro-ximadamente 12.000 equivalentes de islotes por kgde peso) como la masa necesaria para ser trasplanta-da con el fin de normalizar la glucemia 4. El páncreasendocrino posee mecanismos para adaptar su activi-dad y su masa a las necesidades del organismo. Porejemplo, durante el embarazo hay un aumento (re-versible) de la masa celular beta. Los mecanismosque subyacen a este equilibrio dinámico no son co-nocidos, aunque es probable que la prolactina estéimplicada. Los diabéticos tipo 2 obesos no solamen-te necesitan más insulina, sino que los receptores pe-riféricos pueden haber desarrollado resistencia a laacción de dicha hormona. De aquí los efectos benefi-

ciosos de la dieta (que disminuye masa corporal) y elejercicio (que disminuye la resistencia periférica a lainsulina). Una forma experimental de explorar estefenómeno es provocar artificialmente un desequi-librio disminuyendo la masa celular beta medianteuna pancreatectomía parcial que no llegue a producirhiperglucemia. En estas condiciones la célula betaaumenta su actividad desplazando la curva concen-tración-respuesta hacia concentraciones más bajas,posiblemente porque aumenta la expresión de hexo-kinasas con una constante de afinidad más baja parala glucosa (HK I-III) 24. La adaptación incluye a losefectores periféricos de forma que está aumentada lacaptación periférica de glucosa (Ruiz Palomar, Martíny Soria, datos no publicados). Por último, la célulabeta, al igual que ocurre con el resto de células denuestro organismo, puede modificar la expresión gé-nica y convertirse en términos prácticos en otra célu-la. Así, la célula beta de un diabético tipo 2 obeso ycon una cierta dislipidemia expresa unos genes dis-tintos 25 que le pueden llevar incluso a la muerte pro-gramada o apoptosis 26.Las adaptaciones descritas anteriormente implican laexistencia de numerosos mecanismos reguladores detipo nervioso y hormonal. Desde hace tiempo se co-noce la regulación nerviosa de la actividad endocrinapancreática, precisamente los mecanismos parasim-páticos 27,28 son los responsables de la fase vagal desecreción de insulina, en la que hay un aumento dela secreción antes de que aumente la digestión y ab-sorción de nutrientes. Por otra parte existen numero-sos mecanismos hormonales que modulan la activi-dad de la célula beta pancreática. Nosotros hemosdescrito recientemente la modulación por estrógenosy xenoestrógenos mediante un mecanismo nuevo,no genómico, que implica a un receptor de membra-na completamente distinto de los descritos hasta elpresente 29-31. En conclusión, la célula beta es una maquinaria pre-cisa cuyos componentes podemos distribuir en tresgrupos: a) proteínas similares a las que encontramosen otras células eucariotas, responsables del «mante-nimiento general» de la célula; son, por ejemplo, lasenzimas del ciclo de Krebs, los transportadores demembrana, etc.; b) proteínas propias de células quesintetizan, almacenan y liberan hormonas peptídicas;por ejemplo, los componentes de toda la maquinariade síntesis y procesamiento de proteínas, los meca-nismos de almacenamiento y maduración de gránu-los de secreción o los componentes de la maquinariaexocitótica, y c) componentes propios de la célulabeta como: el transportador de glucosa GLUT 2, lahexokinasa IV o glucokinasa, el canal de potasio re-gulado por ATP (KATP) y, por supuesto, la insulina.Algunos de los miembros de este último grupo pue-den estar presentes en otros tipos celulares, porejemplo, la glucokinasa también se expresa en híga-do. Esto hace que si se desea obtener una célula betaartificial mediante la transfección de genes a un tipocelular se prefiera elegir células que ya compartenmuchos componentes con la célula que se desea ob-tener. Así, por ejemplo, a una célula neuroendocrina

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habría que añadirle los genes que se expresan de for-ma específica en la célula beta (insulina, glucokinasa,GLUT2 y KATP).

¿Qué es la ingeniería celular y tisular?

La ingeniería celular y tisular es un nuevo campo in-terdisciplinar que aplica los principios de la ingenieríay de las ciencias de la vida a la obtención de sustitu-tos biológicos para restaurar, mantener o mejorar lafunción tisular 32. Para ello combina los métodos yconceptos de la ingeniería de biomateriales con losde la biología celular, biología del desarrollo, genéticamolecular y fisiología. La producción in vitro de cé-lulas y tejidos obtenidos mediante técnicas de bioin-geniería es en algunos casos una realidad (por ejemplo,piel artificial, etc.), en otros una promesa alcanzable,como la obtención in vitro de células beta pancreáti-cas. Mediante la ingeniería celular, el bioingenieroconstruye células que pueden ser utilizadas en tera-pias sustitutivas. Los avances considerables en cien-cia de los materiales, genética molecular, biología deldesarrollo, biología molecular y celular, junto con unconocimiento más profundo de la fisiología de las cé-lulas, tejidos y órganos, han permitido que por prime-ra vez se plantease la obtención de células y tejidospara su implante en humanos. En muchas ocasionesla ingeniería celular y tisular imitan a los procesosbiológicos del desarrollo intrauterino o de la recons-trucción fisiológica de tejidos para la consecución desus objetivos. Las técnicas de ingeniería celular hanpermitido hasta el momento la obtención de piel arti-ficial, tendones, ligamentos, etc. La diabetes tipo 1es una enfermedad que tiene tratamiento, pero quecarece de curación. Cabe preguntarse si las nuevastécnicas de ingeniería celular pueden ser útiles paragenerar nuevas células beta que trasplantadas al pa-ciente consigan normalizar la glucemia y evitar lascomplicaciones de la enfermedad.

Obtención de células beta artificialesmediante técnicas de bioingeniería

Bioingeniería de células de origen tumoral

En la actualidad existen muchas líneas celulares deorigen tumoral derivadas a partir de la célula betapor irradiación, como ejemplos tenemos RINm5F,INS-1, o por transformación vírica mediante SV40acoplado al promotor de la insulina (βTC). Dichas lí-neas comparten con la célula beta gran parte de pro-piedades, si bien suelen poseer una expresión bajade insulina. Las primeras propuestas consistieron entransfectar dichas líneas con los genes de aquellasproteínas que no se expresan adecuadamente y, portanto, normalizar un fenotipo defectuoso. Por ejem-plo, es muy frecuente que las líneas tumorales pre-senten un umbral demasiado bajo para la glucosa (enel rango sub mM), esto es debido a que expresan lasisoformas I-III de la hexokinasa, que posee una ma-yor afinidad por glucosa. La transfección con el gende la glucokinasa (hexokinasa IV) permite obtener un

patrón de respuesta a la glucosa en el rango fisiológi-co. Alternativamente a las líneas de origen pancreáti-co pueden utilizarse líneas tumorales de origen neu-roendocrino, que comparten con la célula beta unaserie de propiedades, como, por ejemplo, el procesa-miento, almacenamiento y secreción de péptidos. Lalínea AtT-20, derivada de la adenohipófisis de ratón,puede ser transfectada con el gen de la insulina, conlo que se obtiene la línea AtT-20 ins 33. La facilidadcon la que ciertas líneas celulares pueden ser trans-fectadas permite la «ingeniería iterativa», es decir, latransfección con otros genes como el de la glucoki-nasa y el del transportador GLUT 2 34,35. Medianteeste procedimiento se ha generado una línea celularque responde a la glucosa en el rango fisiológico, sibien posee una cinética de secreción sin primera fase(fig. 1). No obstante, las líneas tumorales presentanuna serie de problemas no bien resueltos, como, porejemplo, la inestabilidad del fenotipo, la expresión degenes no deseados y, sobre todo, su proliferación in-controlada, ya que son de origen tumoral. Con el finde controlar la proliferación celular Efrat et al 36,37 hanutilizado el sistema tet-off (fig. 2). Se trata de un gencuya expresión puede regularse con la presencia delantibiótico tetraciclina. A su vez la proteína expresa-da (tTA) es un regulador del tet-op. Cuando se inser-ta un gen quimérico en el que la zona reguladora deltet-op se fusiona al gen estructural del antígeno TagSV40, se consigue que la administración de tetraci-clina regule la expresión del oncogén Tag y, por tan-to, la proliferación celular. El inconveniente de estemétodo es que obliga a la administración continua detetraciclina. En la actualidad se dispone del sistematet-on, que permite el proceso contrario, es decir, latetraciclina dispara el proceso proliferativo.

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AtT-20hlnsGlut-2GK

0 30Tiempo (min)

Insu

lina Solo

segundafase

5Glucosa (mM)

Insu

lina

10 15

Línea celular secretora de insulina

Fig. 1. Bioingeniería de líneas celulares neuroendocrinas. Lalínea celular AtT-20 procedente de la pituitaria anterior estransfectada de forma progresiva (iterative engineering) con elgen de la insulina humana (hIns), el del transportador de glu-cosa (Glut-2) y el de la glucoquinasa (GK). La nueva línea celu-lar responde a glucosa a concentraciones fisiológicas, aunqueno está presente el primer pico de la secreción bifásica de in-sulina.

Producción ectópica de insulina

La producción ectópica de insulina puede conseguir-se mediante la transfección de células no beta con elgen de la insulina humana. Un procedimiento tera-péutico podría consistir en tomar fibroblastos del pa-ciente, transfectarlos con el gen de la insulina y de-volvérselos al propio paciente. De esta forma elpaciente podría disponer de una liberación basal,constitutiva y no regulada, de insulina. Una insuline-mia basal no permite enfrentarse a los aumentos deglucemia postprandial, pero quizá le permita el man-tenimiento de la glucemia basal. Para el control de laglucemia postprandial se puede utilizar alguna insuli-na rápida, incluso de las nuevas formulaciones de in-sulina inhalada. La ventaja de este procedimiento esque utiliza los fibroblastos del propio paciente y, portanto, no necesita inmunosupresión. Por otra parte,las células transfectadas pueden seleccionarse previa-mente, eligiendo a aquellas que mejor reproducen elefecto esperado y por último pueden criopreservar-se. Los inconvenientes son: no se ha conseguido unaexpresión estable por períodos prolongados, el fibro-blasto carece de las enzimas para transformar laproinsulina en insulina y, lo que es más importante,el fibroblasto carece de la maquinaria para procesar,almacenar y secretar insulina, por lo que la secreciónno es una secreción regulada. Un aumento, aunquediscreto, en la insulinemia basal puede ser causa dehipoglucemia, una de las complicaciones más gravesdel tratamiento mediante insulinas.

Uno de los problemas más difíciles de resolver en laterapia génica de la diabetes mellitus es reproducir laliberación finamente regulada de la insulina en res-puesta a las variaciones de glucosa. A diferencia deotras carencias en las que la presencia de la moléculapuede considerarse aceptablemente buena para unrango amplio de concentraciones, en el caso de la in-sulina el mecanismo es extraordinariamente precisoy debe ajustarse a lo que en cada momento necesitael organismo. Este planteamiento hizo que se pensa-se en la utilización de otras estrategias para conse-guir la secreción regulada de insulina en estructurasectópicas. Por ejemplo, la transfeción de hepatocitoscon un gen quimérico consistente en la fusión delpromotor de la piruvato quinasa o de la fosfoenolpi-ruvato carboxiquinasa con el gen estructural de lainsulina. Como la expresión de ambas enzimas hepá-ticas está regulada por glucosa, los aumentos extra-celulares de glucosa se traducirían en la expresiónhepática de insulina. La principal dificultad de estapropuesta terapéutica es que lo que está reguladopor la glucemia es la expresión del gen y no la libera-ción de la hormona. Como la síntesis de proteínas esun proceso lento (30-60 min), en la práctica el siste-ma de retroalimentación funciona como un loop de-masiado lento que genera períodos de hiperglucemiae hipoglucemia intensas. Esta dificultad puede resol-verse mediante la transfección de células endocrinasintestinales en las que la liberación hormonal esté re-gulada por glucosa, como ocurre con las células Kencargadas de la liberación de GIP (polipéptido insu-linotrópico dependiente de glucosa) en presencia deglucosa. El gen quimérico resulta de la fusión del pro-motor del GIP con el gen estructural de la insulina.Este procedimiento impide la progresión de la diabe-tes experimental en ratones 38. Otra alternativa es elcontrol farmacológico de la secreción proteica me-diante un procedimiento que permite la liberación rá-pida y pulsátil de proteínas terapéuticas 39. Para ellose diseña el precursor proteico de forma que se al-macena formando agregados en el retículo endoplás-mico. La secreción puede estimularse mediante unfármaco que produzca desagregación y permita laacción de las furinas, proteasas ubicuas que rompenel enlace peptídico que une la proteína terapéutica aldominio de agregación condicional. Por último, laobservación casual de que las células eucariotas pue-den capturar ADN crudo del ambiente e incorporarloa su maquinaria de producción de proteínas ha he-cho que se empiece a utilizar la inyección de ADNcrudo en la musculatura esquelética. La electropora-ción puede utilizarse in vivo para facilitar la incorpo-ración del gen de la insulina al músculo esquelético.Este procedimiento posee en este momento las mis-mas dificultades descritas para la transfección deotros tipos celulares como los fibroblastos.

Estímulo y control del crecimiento, regeneración y neogénesis de islotes

Durante el desarrollo la masa celular β aumenta pordiferenciación a partir de células precursoras del epi-

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ARIP

BRIP

SV40Tag

tetR/VP16 poly AI

mP SV40Tagtet-op

tTA

tTA

tTA

tet

tet

Inactivo

Fig. 2. Obtención de líneas celulares beta transformadas. A:El oncogén SV40 acoplado al promotor de la insulina de rata(RIP) genera la línea tumoral βTC. B: Sistema tet-off: fusióndel gen que codifica el represor de tetraciclina (tetR) con eldominio C-terminal de la proteína 16 del virus herpes simples(VP16). Esta fusión permite la conversión del tetR de proca-riota en un transactivador de eucariotas. El sistema tetR/VP16está bajo el control de RIP. La proteína codificada por este sis-tema (tTA) estimula a un promotor mínimo fusionado con la secuencia del operador de tetraciclina (tet-op) permitiendola expresión del antígeno Tag SV40 (SV40Tag) y, por tanto, laproliferación de células-β. La presencia de tetraciclina (tet) in-hibe la unión de tTA con la secuencia promotora tet-op, noactivándose la expresión de SV40 Tag e inhibiendo la prolife-ración de células-β. I: intrón. Poly A: cola de adeninas.

telio ductal del páncreas; sin embargo, parece serque tras el nacimiento la replicación de células betapreexistentes es el principal mecanismo de aumentode la masa celular. La posibilidad de que ambos me-canismos coexistan en el adulto ofrece la posibilidadde aprovechar dicha capacidad en la prevención oen el tratamiento de la diabetes 40. Susan Bonner-Weir et al 41 han desarrollado un protocolo de cultivoque permite la obtención de islotes pancreáticos apartir de las células ductales de páncreas de donantes(fig. 3). En síntesis, consiste en cultivar las células enmonocapa durante 1-2 semanas en un medio quecontiene factor de crecimiento de queratinocitos, ni-cotinamida e ITS (insulina + transferrina + selenio)hasta que las células estén casi confluentes. Acontinuación son transferidas a un medio con unapreparación de matriz extracelular (Matrigel®) durante1-7 semanas. El principal obstáculo de este procedi-miento es que se consigue una proliferación muy li-mitada y, por tanto, no se alcanza la cantidad de ma-terial necesaria para un trasplante.

Ingeniería celular de precursores

Otros autores han utilizado células beta procedentesde neonatos con PHHI, hiperinsulinemia e hipoglu-cemia persistente de los neonatos 42. En este cuadroclínico debido a una mutación del canal de potasioregulado por ATP 43,44, las células beta están perma-nentemente despolarizadas, lo que provoca la entra-da continua de calcio y la liberación persistente de

insulina. Desgraciadamente el canal mutado es insen-sible a diazóxido, por lo que los recién nacidos coneste cuadro precisan de una pancreatectomía del95% para resolver la hipoglucemia en la que se en-cuentran. A partir de las células beta obtenidas tras lapancreatectomía se ha desarrollado una línea celularque responde a concentraciones fisiológicas de glu-cosa 45. El procedimiento incluye la transfección conel gen del canal KATP y con el gen que codifica el fac-tor de transcripción PDX-1. PDX-1 es un factor detranscripción que desempeña un papel central en ladiferenciación de la célula beta pancreática y en laregulación de la expresión de la insulina 46.

Clonación terapéutica de células beta

En 1997, un equipo del Instituto Rosling de Edim-burgo dirigido por el doctor Ian Wilmut sorprendía ala comunidad científica presentando la oveja «Dolly»,un mamífero superior desarrollado a partir de la in-formación contenida en el núcleo de una célula deuna oveja adulta 47. Para ello se tomó el núcleo deuna célula de la glándula mamaria y se transfirió a unovocito anucleado. El nuevo ovocito se implantó enla trompa de una oveja receptora donde de desarro-lló un nuevo ser. Esta observación, considerada pormuchos científicos uno de los descubrimientos másimportantes de los últimos cien años, nos ha enseña-do que la información contenida en el ADN deuna célula adulta puede ser reprogramada. Las cé-lulas adultas-diferenciadas mantienen su estado dife-renciado gracias a que han silenciado muchos de susgenes. Se supone que por procesos de metilación.Una célula diferenciada sólo expresa un determinadomenú de su repertorio de genes; sin embargo, unacélula totipotencial puede aún expresarlos todos y,por tanto, dar lugar a cualquier tipo celular de losaproximadamente 200 que existen en un organismoadulto. En el caso de «Dolly» se consiguió la totipo-tencialidad; el núcleo transferido dio lugar a todos lostipos celulares, incluyendo las células germinales.Frente a ello la tecnología introducida tiene dos gran-des grupos de aplicaciones: por una parte, la clona-ción reproductiva permite la obtención de transgénicospara la producción de sustancias con aplicacionesbiotecnológicas (péptidos hormonales, etc.) o de ór-ganos para su trasplante en humanos (xenotrasplan-te). Por otro lado la clonación terapéutica que abre laposibilidad de obtener in vitro células y tejidos quepueden ser utilizados en terapia celular de enferme-dades como la diabetes, el Parkinson, etc. Un trabajoreciente de nuestro grupo demuestra que es posibleobtener células que contengan y liberen insulina apartir de células embrionarias de ratón. Dichas célu-las normalizan la glucemia en animales diabéticos 48.En síntesis, la clonación terapéutica consta de cuatropasos: a) transferencia del núcleo de una célula pro-cedente de un paciente (por ejemplo, de un fibroblas-to o de la piel), la célula receptora puede ser un ovo-cito humano, no humano (se ha ensayado con éxitolos ovocitos de ternera) u otros tipos celulares conpluripotencialidad suficiente; b) diferenciación in vi-

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Células ductales

IGF-1TGF-α (proliferación)Gastrina (diferenciación)

VEGFGen Reg

INGAP

EGF

PTH-related protein

Células de islote

TGF-β-+

+

+

+

+

+

Fig. 3. Factores de crecimiento implicados en la regeneración yneogénesis de islotes a partir de células ductales. IGF-1: factorde crecimiento parecido a la insulina-1. TGF-α: factor de creci-miento tumoral-α. TGF-β: factor de crecimiento tumoral-β;VEGF: factor de crecimiento del endotelio vascular. Reg: proteí-na regeneradora; INGAP: proteína asociada a la neogénesis deislotes; EGF: factor de crecimiento epidermal. PTH-related pro-tein: proteína relacionada con la parathormona.

tro hacia el tipo celular deseado; c) selección clonal,y d) maduración y diferenciación terminal.La diferenciación in vitro puede promoverse gene-rando unas condiciones ambientales similares a lasdel desarrollo embrionario. Por ejemplo, la polari-dad, los factores de crecimiento 49 o la presencia dematriz extracelular 49,50. Sin embargo, la obtención depoblaciones celulares puras exige la utilización detécnicas de selección clonal eficientes. En general losmétodos de selección clonal se basan en la expresiónde determinadas proteínas en la membrana celular yla selección mediante fluorescence activated cellsorting. Se puede conseguir una selección más espe-cífica utilizando la selección en función de la expre-sión de marcadores genéticos representativos del tipocelular que se desea seleccionar 51-53. La metodologíaque nosotros hemos adaptado para la selección de

células que contengan insulina consiste en transfectarlas células con un gen quimérico formado por la fu-sión funcional del promotor de la insulina acoplado aun gen de resistencia a la neomicina (fig. 4). Así, aque-llas células que contengan el complejo de transcrip-ción que activa la expresión de dicho gen tendrántambién activada la expresión del gen de resistenciaa la neomicina. Este procedimiento ha permitido laobtención de cardiomiocitos 51 y de precursores neu-rales 52 a partir de células madre embrionarias.

Normalización de la glucemia mediante el trasplante de células beta obtenidas a partir de células madre embrionarias

El método descrito previamente ha permitido la ob-tención de una línea celular que no sólo contiene in-sulina, sino que posee secreción regulada de la mis-ma. El procedimiento de obtención que se sumarizaen la figura 5 puede descomponerse en los siguien-tes pasos:1) Transfección mediante electroporación o lipofec-ción de células madre embrionarias con un construc-to similar, pero con todo el gen de insulina, al que sedescribe en la figura 4.2) Selección mediante higromicina de las célulastransfectadas.3) Diferenciación in vitro con formación de cuerposembrionarios (fig. 6) y cultivo en monocapa.

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HIP β-geo PGK-Hygror

1 Kb

e1

Fig. 4. Estructura de la construcción pHIP-β-geo/PGK-Hygro(GB2). HIP: promotor del gen de la insulina humana; β-geo:gen de resistencia a neomicina; PGK-Hygro: gen de resistenciaa higromicina bajo el promotor de la fosfoglicerato quinasa.

h Ins prom β-geo PGK-Hygro

TransfecciónR1 mESC

+ Higromicina

Diferenciación in vitro

Clones resistentes a higromicina

+ Neomicina

Células con bajo contenido en insulinaClones resistentes a neomicina

2 semanas NIC5 días NIC-baja glucosaMaduración

Células con alto contenido en insulina

Fig. 5. Diagrama de flujodel proceso de diferencia-ción desde células madreembrionarias pluripotencia-les (mESC) a células quecontienen insulina suscepti-bles de ser transfectadas.NIC: nicotinamida (modifi-cado de Soria et al57). β-geo:gen de resistencia a neomi-cina; PGK-Hygro: gen de re-sistencia a higromicina bajoel promotor de la fosfoglice-rato quinasa.

4) Selección de clones resistentes a neomicina (yque por tanto están expresando insulina).5) Maduración de clones que expresan insulina (2 se-manas en 10 mM nicotinamida y alta glucosa 25 mM+ 5 días en 10 mM nicotinamida y glucosa 5 mM)(fig. 7).6) Caracterización del clon en términos de conteni-do de insulina, secreción y liberación de la misma enrespuesta a distintos secretagogos.7) Trasplante a animales diabéticos.El clon que se seleccionó en este estudio tenía uncontenido de insulina correspondiente aproximada-

mente al 80% del contenido de insulina de islotes deratón (tabla 1). Se comprobó además que la incuba-ción en bajas concentraciones de glucosa acelerabael proceso final de maduración, ya que el contenidode insulina de los islotes y las respuestas de secreciónbasal e inducida por concentraciones estimulatoriasde glucosa (16,7 mM) o tolbutamida (100 µM) ibaaumentando con los días de incubación en glucosa.Al final obtuvimos unas células cuya liberación basalde insulina era la mitad de la de los islotes de ratón yque en respuestas a secretagogos tenían una secre-ción de insulina que correspondía aproximadamenteal 55% de la secreción de islotes de ratón (tabla 1).Un millón de estas células se trasplantaron en unmodelo de animal diabético mediante inyección deuna sola dosis intraperitoneal de estreptozotocina yse comprobó que eran capaces de mantener normo-glucémicos a dichos animales desde los primeros2 días del trasplante y durante todo el tiempo queduró el estudio (16 semanas) (fig. 8).

Encapsulación de islotes pancreáticos

La encapsulación del material que se desea trasplan-tar persigue la construcción artificial de un espacio

REVISTA CLÍNICA ESPAÑOLA, VOL. 201, NÚM. 9, SEPTIEMBRE 2001

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Fig. 6. Imagen de contraste de fase de un cuerpo embrionarioobtenido a partir de células transfectadas resistentes a higro-micina. La barra representa 100 µm.

Fig. 7. Imagen de contraste de fase de células secretoras deinsulina después del proceso de selección y maduración. Labarra representa 100 µm.

TABLA 1Estudio del contenido de insulina

del clon seleccionado

Secreción de insulina (pg/µg proteína/30 min)

n 3 mM 16,7 mM 100 µM glucosa glucosa tolbutamida

30 mM glucosa (1 d) 4 1,6 ± 0,6 2,9 ± 0,8 3,1 ± 0,5 1,6 ± 0,7

5 mM glucosa1 d 3 18,3 ± 4,2 40,3 ± 12,3 33,6 ± 9,7 3,6 ± 1,32 d 3 29,1 ± 2,8 86,8 ± 17,5 101,8 ± 15,3 4,1 ± 1,75 d 4 35,2 ± 7,3 247,1 ± 35,4 237,3 ± 39,3 13,7 ± 2,4

Contenido de insulina

(ng/µgproteína)

Condiciones de cultivo

600

0–2 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (semanas)

500

400

300

200

100Glu

cem

ia (m

g/dl

)

Fig. 8. Cambios en los niveles de glucosa en sangre después detrasplantar los clones de célula secretora de insulina. Nivelesde glucosa en sangre de ratones diabéticos controles operados(o) (n= 6), ratones trasplantados (• ) (n=4). La línea discontinuaindica el día del trasplante (indicado como semana 0).

aislado desde el punto de vista inmunitario. Los pro-cedimientos propuestos se pueden dividir en dosgrandes grupos: la macroencapsulación dentro de losasí llamados «páncreas artificiales» y la microencapsu-lación en microesferas. Mientras que la macroencap-sulación utiliza prótesis de diversas formas que suelenconectarse al sistema vascular, la microencapsulaciónutiliza las propiedades químico-físicas de ciertos hi-drogeles, como el alginato, para formar cápsulas queaíslan al islote en su interior. En síntesis, los procedi-mientos de encapsulación deben cumplir dos grandespropiedades: ser biocompatibles, permitir la oxigena-ción y el flujo de entrada y salida de nutrientes, cata-bolitos, etc., junto con la salida de insulina y por últimoconseguir un espacio inmunoprotegido. La químico-física ha avanzado en la obtención de cápsulas conun determinado tamaño de ventana, lo que permiteexcluir moléculas y otras estructuras a partir de undeterminado tamaño. Las inmunoglobulinas son pro-teínas de gran peso molecular, por lo que quedaríanexcluidas junto con cualquier tipo celular. Sin embar-go, las citokinas poseen un peso molecular muy pró-ximo a la insulina, por lo que un filtro molecular deestas características no excluye a las citokinas res-ponsables de gran parte de ataque inmunitario al material trasplantado 54. El aislamiento inmunitario me-diante microencapsulación se ha utilizado en xenotras-plantes de islotes de cerdo a humanos 55. Sin embargo,este tipo de aislamiento no se ha demostrado que pue-da proteger al receptor de los virus del donante.

Conclusiones

Considerando todo lo expuesto anteriormente, asícomo lo sugerido en publicaciones recientes 56,57, pue-den postularse las siguientes predicciones en relacióncon el trasplante de islotes pancreáticos y el uso decélulas madre en ingeniería celular y diabetes mellitus:1) En un futuro próximo se observará un aumentoen los trasplantes de islotes para el tratamiento de ladiabetes tipo 1.2) A corto y medio plazo se desarrollarán nuevosmétodos para la obtención in vitro de células beta,bien a partir de precursores, como las células ducta-les, o a partir de células madre.3) La clonación terapéutica, autorizada ya en paísescomo el Reino Unido, EE.UU. y Japón se extenderáa otras regiones (Francia, Holanda, Suecia, etc.), permi-tiendo el tratamiento de la diabetes mellitus mediantecélulas B producidas «a medida».4) A medio plazo se dispondrá de métodos para ladiferenciación a partir de células madre del adulto.Una vez resuelta la expansión necesaria para generaruna masa notable de células beta será factible tantoel alotrasplante como el autotrasplante. 5) La ingeniería celular permitirá la modificación delas células con el fin de hacerlas más resistentes alataque inmunitario, a la apoptosis, etc.6) Se desarrollarán terapias inmunosupresoras quepermitirán suprimir la respuesta autoinmune en ladiabetes tipo 1, lo que permitirá el trasplante de cé-lulas beta con efectos secundarios mínimos.

7) Desarrollo de técnicas de encapsulación que per-mitan la tolerancia al alotrasplante de células betapancreáticas. En suma, junto con la biología molecular y el conoci-miento de la estructura y función del genoma huma-no la ingeniería celular puede convertirse en la nuevarevolución biomédica del siglo XXI.

AgradecimientosRealizado en parte gracias a ayudas del Ministerio de Ciencia yTecnología (PM99-0142), Fundació Marató TV3 (99-1210), Fun-dación Salud 2000 y Juvenile Diabetes Foundation (1-2000-575).

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