INGENIERÍA HONGOS METABOLISMO SECUNDARIO: HOJA DE RUTA A NUEVOS COMPUESTOS

Daniel H. Scharfa, b, Axel A. Brakhagea, b, *

RESUMEN

Los productos naturales juegan un papel importante no sólo en el medio ambiente, pero también como compuestos útiles en diversas aplicaciones como en la medicina o la protección de las plantas. Un enorme número de tales compuestos se han derivado de microorganismos que colonizan diversos hábitats. Tradicionalmente, las nuevas cepas de bacterias o los hongos han sido seleccionadas para su potencial para producir compuestos biológicamente activos. En el post era de la genómica, sin embargo, hay un número creciente de nuevos métodos basados en la ingeniería genética a obtención de nuevos metabolitos. En esta revisión, se resumen los progresos realizados recientemente en el desarrollo de nuevos enfoques prometedores para el descubrimiento de productos naturales de los hongos con la minería del genoma, la activación de silenciosos grupos de genes, la expresión heteróloga de genes de la biosíntesis, el intercambio de módulos de la enzima, así como rediseño de flujo metabólico.

INTRODUCCIÓN

Los productos naturales son compuestos de bajo peso molecular cuya función biológica se ha mantenido y optimizado durante la evolución. Algunos de estos compuestos son de gran importancia para diversas aplicaciones en la medicina o la protección de las plantas. Entre los años 1983 y 1994, se aprobaron 520 nuevos medicamentos. De estos, 40% se basaron en productos naturales. En 1999, 9 de la 20 la mayoría de los medicamentos que se venden se basan en productos naturales como compuestos derivados de hongos, tales como el inmunosupresor ciclosporina, las estatinas para bajar el colesterol o los antibióticos cefalosporina (Barber et al, 2004;. Fernandes y Miska, 2002). Por lo general, los compuestos conocidos se identificaron a partir diferente fuentes microbianas cultivadas bajo condiciones de laboratorio. Sin embargo, ya que la mayoría de los microorganismos en la naturaleza no se pueden cultivar en el laboratorio y, además, sin embargo, muchos microorganismos hacer no revelar su verdadero potencial biosintético en el laboratorio, nuevos procedimientos necesarios para establecer a descubrir nuevos compuestos de microorganismos. Hasta hoy, los métodos clásicos tienen tenido mucho éxito. Además, sin embargo, en el post-genómica época hay varias herramientas nuevas disponibles para descubrir o crear nuevos compuestos (Brakhage y Schroeckh, 2011). Con la ayuda de la ingeniería genética es posible activar la biosíntesis de silencio grupos de genes, para generar derivados de compuestos conocidos o crear tailor-made/artificial nuevas vías de biosíntesis de anterioridad metabolitos desconocidos. Muchas de estas técnicas han sido ya aplicado a los hongos con el fin de ampliar nuestro arsenal de fármacos. Sin embargo, Se requieren nuevas mejoras como la automatización para hacer estas técnicas aún más atractivo para la industria y los programas de cribado de alto rendimiento. Estas tecnologías pueden ser espera que ayude a la generación de numerosos compuestos nuevos en un tiempo y el costo de manera eficaz. Hay

varios excelentes críticas cubriendo los aspectos de esta área de investigación en hongos (Brakhage y Schroeckh de 2011, Li, 2011; Martin et al, 2010;. Sánchez et al, 2012.; Schmitt et al, 2004;. Van den Berg et al, 2010;. Wallwey y Li, 2011, Yin y Keller, 2011). En la siguiente revisión, nos centramos en la evolución reciente de la ingeniería genética para generar novela naturales productos en los hongos.

2. LAS ESTRATEGIAS PARA OBTENER NUEVOS COMPUESTOS

2.1. La activación de grupos de genes silenciosos Miles de productos naturales se puede esperar en espera de descubrimiento debido a que los microorganismos que sintetizan no han sido pero cultivada, o, si se cultivan, no mostró su verdadera potencial biosintética en el laboratorio porque la biosíntesis genes permanecen en silencio (Hertweck, 2009b). Hasta hoy en día, varios métodos basados en la ingeniería genética se han descrito para la función de hongos secundarios del metabolismo grupos de genes: muchos de ellos codifican un gen regulador vía específica. Por la sobreexpresión de la APDR gen del factor de transcripción que es parte de la seleccionada grupo de genes APD silenciosa utilizando un promotor inducible, la transcripción de todos los grupo de genes se activan y compuestos citotóxicos nunca Se identificaron antes descritos para A. nidulans aspyridones nombre (Fig. 1A). Este método se aplicó también para activar una hasta ahora desconocida grupo de genes de A. nidulans inp designado. Sorprendentemente, la sobreexpresión de la transcripción putativo SCPR gen específico de la vía del factor (Metabolismo regulador de la vía transversal secundaria), no sólo se activa la agrupación de genes inp sino también la agrupación de genes AFO en una diferente cromosoma que codifica los genes de la biosíntesis asperfuranone (Chiang et al., 2009). Otros estudios demostraron que la transcripción SCPR factor no sólo induce a los genes de la agrupación inp pero también el factor de transcripción Afoa gen asperfuranone que posteriormente activado los genes de la biosíntesis asperfuranone (Bergmann et al., 2010). Por lo tanto, un factor de transcripción putativo vía específica es capaz de activar otro grupo de genes que permite una diafoníaventre los diferentes grupos de genes. Es concebible que tal cruz hablar entre grupos de genes existe para muchos grupos de genes de hongos añadiendo otro nivel de complejidad que podrían formar la base de biosíntesis combinatoria. Del mismo modo, el promotor inducible por alca se utilizó para reemplazar el promotor nativo de la Afoa transcripcional gen regulador de la agrupación de genes de la biosíntesis de asperfuranone.

Esto se llevó a cabo en una cepa que carecen de producción de la mayor policétido esterigmatocistina como resultado de un objetivo knock-out de el esterigmatocistina vía gen stcJ. Esta supresión aparentemente hecho que la molécula de precursor de PKS malonil-CoA disponible para la producción de una novela polyketide designado asperfuranone (Chiang et al., 2009). Estos ejemplos muestran que la sobreexpresión de la vía reguladores específicos es una herramienta valiosa para activar la biosíntesis de silencio grupos de genes que conducen a nuevos compuestos, a pesar de que el éxito y la la especificidad de tal manipulación genética no se puede predecir todavía.También es posible manipular los reguladores de amplio dominio para influir en el metabolismo secundario. La supresión de una proteína Nacetyltransferase en A. nidulans condujo a la formación de pheofungins que representar nuevos metabolitos relacionados con feomelaninas en rojo pelo mostrando actividad citotóxica (Scherlach et al., 2011). La biosíntesis de pheofungins requiere la biosíntesis de ácidos orsellinic vía. El mecanismo que subyace a la

activación se desconoce. Es concebible que la falta de N-acetilación de las proteínas provoca estrés en el hongo y por lo tanto resulta en la producción de pheofungins (Fig. 1B). Alternativamente, un regulador de la vía podría han sido influenciados por el post-translacional modificación desaparecidos, lo que conduce a la activación de la biosíntesis pheofungin.Este ejemplo muestra que las enzimas involucradas en la post-traduccional modificaciones de la proteína representan objetivos interesantes para la ingeniería el metaboloma secundaria. Otro ejemplo destacado para un regulador de amplio dominio es Laea que exhibe una metiltransferasa putativo involucrados en la regulación del metabolismo secundario en hongos filamentosos. La sobreexpresión del gen aumenta la Laea producción de diversos metabolitos secundarios en varios hongos (Bok y Keller, 2004; Kale et al, 2008;. Kosalkova et al, 2009;. Sugui et al,. 2007). OIEA y la VeA factor de desarrollo regulados por la luz son ambos forman parte del complejo de terciopelo (Bayram et al., 2008), lo que sugiere, al menos en parte, un enlace entre el metabolismo secundario y el desarrollo.Hay varios otros reguladores de amplio dominio demostrado participar en la regulación de los grupos de genes de metabolitos secundarios tales como la CCAAT CBC complejo de unión y el regulador de pH PacC que se mostraron para regular al menos la biosíntesis de la penicilina en A. nidulans (Brakhage et al, 2009;. Espeso et al, 1993;.. Litzka et al, 1998). La producción de monodictyphenone y emodina derivados fue inducida por deleción dirigida del gen CCLA, cuya producto es un componente de la brújula (complejo relacionado con Set 1) complejo de A. nidulans, que metila lisina 4 de la histona H3 y por lo tanto contribuye a la regulación epigenética (Chiang et al., 2010). El complejo Saga / Ada, que regula muchos procesos celulares mediante la coordinación de la acetilación de histonas, contiene la histona GCNE acetiltransferasa y fue informado recientemente de tener un importante influir en la regulación de la penicilina, y esterigmatocistina la biosíntesis de ácidos orsellinic en A. nidulans (Nützmann et al., 2011). Otro método exitoso fue reportada por brevianamide

2.2. LA EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE GRUPOS DE GENES

La expresión de grupos de genes de metabolitos secundarios en heterólogo hongos de acogida es un campo cada vez mayor y, potencialmente, pueden resolver al menos en parte el problema de la expresión de los grupos de genes en los hongos que no son susceptibles a las técnicas genéticas todavía. Por otra parte, que puede contribuir a dilucidar y rediseñar la biosíntesis vías. Un ejemplo reciente fue reportado para la producción de monacolina K y terrequinone A en una ingeniería de Aspergillus oryzae cepa (Sakai et al., 2012). Esta cepa sobreexpresa el regulador gen Laea que dio lugar a la expresión del gen introducido racimos. A. oryzae también se utilizó como un huésped para la reconstrucción de la ruta de biosíntesis pyripyropene (Itoh et al., 2010). Este metabolito es un meroterpenoid, un producto natural híbrido de ambos terpenoides y origen polyketide. Pyripyropene es especialmente interesante como un fármaco debido a que el compuesto inhibe la acil-coenzima A: colesterol aciltransferasa. Además, otras especies de Aspergillus se utilizaron como huéspedes para la producción de diversos compuestos. La dirigida al sitio de integración de sistemas de A. nidulans se desarrolló permite la producción de un policétido (Hansen et al., 2012).

Específicamente, se produjo la dicetopiperazina prenylated tryprostatin B en A. nidulans mediante la expresión del grupo de genes correspondiente desde A. fumigatus bajo el control del promotor inducible alcA (Maiya et al., 2009). De este modo el rendimiento de tryprostatin B fue significativamente aumentó a 250 mg / l.

2.3. CAMBIO DE DOMINIO DE LAS ENZIMAS MULTI-MODULARES

Hay dos clases principales de enzimas implicados múltiples modulares en el metabolismo secundario, es decir, péptido sintetasas no ribosómicas (NRPS) y policétido sintasas (PKS) (Walsh y Fischbach, 2010). Ambas clases de enzimas están organizadas en módulos se asemejan un kit de bloque de construcción. Esta característica única es un valioso punto de partida para la ingeniería de enzimas y la recombinación combinatoria de tales módulos. Hay varios ejemplos que aplican estas técnicas para la producción de metabolitos nuevos. Algunos de ellos se discuten aquí. Genes de PKS de tipo I consisten en módulos, cada uno de codificación de la enzimática funciones (Hertweck, 2009a). Barajar o intercambio de determinadas Módulos de PKS pueden conducir a la biosíntesis de los recursos naturales "antinatural" productos. Se informó swaps de dominio para la PKS / codificación NRPS la biosíntesis de los compuestos estrechamente relacionados y tenellin desmethylbassianin (Fisch et al., 2011). Por la expresión heteróloga del correspondiente gen híbrido de PKS / NRPS en A. oryzae novela No se detectaron metabolitos, que exhibe distintas características como patrón de metilación o la longitud de la cadena que podría estar asociado conel dominio correspondiente arrastrando los pies (fig. 2A). En otro ejemplo, del dominio racional de intercambio, una PKS híbrida fue generado por cambio del A. nidulans asperfuranone ACP dominio transacilasa (SAT) con la esterigmatocistina SAT dominio del mismo organismo (Liu et al., 2011).

Este cambio condujo a la formación de un nuevo metabolito, que tenían la misma longitud de la cadena como asperfuranone (Fig. 2B). El conocimiento detallado de la reductora PKS responsable de formación hypothemycin y la creación de enzimas quimera distintas dado lugar a la producción de un diastereómero no natural (Zhou et al., 2012).

El principio de dominio arrastrando los pies no se limita a las PKS, es también aplicable a NRPS. Mediante el intercambio de dominios de los PNR involucrados en la biosíntesis de surfactina en Bacillus subtilis con dominios de hongos ? - (?-L-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetasa implicado en penicilina / biosíntesis de cefalosporina, la formación de la novela se observó derivados de surfactina (Stachelhaus et al., 1995).

2.4. REDISEÑO DE FLUJO METABÓLICO

Diseño metabólico se basa en el principio fundamental de que ingeniería el metabolismo de un organismo proporciona nuevo titular unidades para una ruta de biosíntesis o redirige el flujo metabólico hacia la acumulación de ex menores o incluso desconocidos metabolitos. Hay varios ejemplos que describen la aplicación de los métodos relacionados para moléculas importantes como ciclosporina A, lovastatina y penicilina / cefalosporina (Brakhage et al, 2009.; Manzoni y Rollini, 2002; Survase et al, 2011).. Un destacado ejemplo es la transferencia y la ingeniería de la cefalosporina ruta de biosíntesis en el hongo Penicillium productor de penicilina chrysogenum (Weber et al., 2012). P. chrysogenum fue con éxito diseñado para producir una novela carbamoilada cefalosporina mediante la expresión de Acremonium chrysogenum expandasa / hidroxilasa y Streptomyces clavuligerus carbamoiltransferasa en una penicilina Cepa G de alta producción (Harris et al., 2009). Varios También se produjeron otros compuestos de cefalosporina relacionados. Para ejemplo P. chrysogenum que lleva un gen de expandasa bacteriana produce ácido adipoil-7-aminodeacetoxycephalosporanic como la producto principal (Robin et al., 2003). Además de esto, es un subproducto formado que parece ser deacetoxicefalosporina C. Otra posibilidad para obtener nuevos compuestos es la supresión de genes de un grupo de genes de la biosíntesis. Esta inactivación de genes podría conducir a acumulación de intermediarios de la vía. Un ejemplo exitoso de esta es la vía de biosíntesis de gliotoxina, un citotóxico potente producto

natural que contiene azufre. Por inactivación de los genes de el clúster, se identificaron varios metabolitos nuevos (Davis et al., 2011; Forseth et al, 2011;. Scharf et al, 2011a, b).. La inactivaciónde la gliG gen que codifica una glutatión-S-transferasa llevado a formación de un precursor de dicetopiperazina dihidroxilado (Scharf et al., 2011b), mientras que la inactivación del gen de la oxidasa GLIT gliotoxina conduce a la formación de la reducción de gliotoxina con grupos tiol libres(Scharf et al., 2010).

Otro ejemplo para la ingeniería de vía es la combinación promiscua de la PKS RPPA de Streptomyces coelicolor, que cataliza la síntesis de varios metabolitos PKS, con la peroxidasa de soja que forma compuestos diméricos o el cloroperoxidasa del hongo Caldariomyces fumago (Jeong et al., 2005). La combinación de estas actividades enzimáticas llevó a la formación de compuestos clorados o bromados (fig. 3). La paso más es la incorporación parcial de este biosíntesis vía en un sistema de microfluidos (Ku et al., 2006).

3. ConclusionesHoy en día, basada en la ingeniería genética hay varios métodos disponibles que permiten el descubrimiento de nuevos compuestos. con el ayudar a estos métodos varios compuestos con interesantes actividades han sido ya identificados. Las aplicaciones potenciales de estos nuevas moléculas están todavía bajo investigación. Sin embargo, la mayoría de estos métodos sólo se han aplicado a los hongos que son susceptibles de manipulación genética. Para la gran mayoría de los hongos, hasta ahora no hay existe sistema de transformación genética, que podría ser un inconveniente para su manipulación genética directa. Alternativamente, heterólogo expresión de interesantes grupos de genes del metabolismo secundario en especies de hongos definidos pueden ser una opción. Una importante tarea futura será también ser la automatización de los métodos de cribado y la combinación de la manipulación genética con técnicas de ingeniería de nuevos como microfluidity. En conjunto, estos enfoques ayudarán a descubrir el depósito sin explotar de los productos naturales de la naturaleza.

AGRADECIMIENTOSEl apoyo financiero de la escuela de posgrado excelencia financiado DFGEscuela de Jena para la Comunicación Microbiana (JSMC) y la InternacionalEscuela de Investigación Leibniz para Microbiana y BiomolecularInteracciones como parte de la JSMC se agradece. laautores agradecen a Peter Hortschansky, Andreas Habel y ThorstenHeinekamp los comentarios críticos sobre el manuscrito.