INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Y CITOMETRIA DE FLUJO
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Dr. EDGAR MATOS BENAVIDES MEDICO INMUNOLOGO PRESIDENTE DE SPI DIAGNOSTICO DE IDPs POR CITOMETRIA DE FLUJO [email protected]
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Dr. EDGAR MATOS BENAVIDESMEDICO INMUNOLOGO
PRESIDENTE DE SPI
DIAGNOSTICO DE IDPs POR CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunodeficiencias Primarias
Las inmunodeficiencias son desórdenes que afectan algún componente importante en la respuesta inmunológica, provocando una respuesta inadecuada a infecciones por diversos microorganismos y susceptibilidad al desarrollo de neoplasias
Tres Niveles de Defensa
Lisozima en secreciones
Integridad de la piel
Clearance ciliar y mucus de las vías respiratorias
Presencia de comensales
Ph bajo estómago
Complemento
Neutrófilo
Células NK
Células T
Células B
DC
Que se necesita para establecer el diagnóstico de una IDP
CITOMETRO DE FLUJO
SECUENCIADOR
CITOMETRIA DE FLUJOEs una poderosa tecnología para la caracterización y análisis de células. Mide y analiza simultáneamente Múltiples características físicas de las células, cuando estas se mueven en un flujo a través de un haz de luz.
CASO CLINICO
• 14 Julio 2012• Niño, 10 años• Infecciones recurrentes
desde los 2 años de edad• 11 neumonías y 3 meningitis
bacterianas• 2 Episodios de Otitis con
tratamiento ATB
• IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓• Leucocito 9,800 cel /uL• Linfocitos 970 cel /uL
Citometría de flujo
10 -1 10 0 10 1 10 2 10 310 -1
10 0
10 1
10 2
10 3
10 -1 10 0 10 1 10 2 10 310 -1
10 0
10 1
10 2
10 3
15.8% 0.39%
Control PacienteC
D3
CD20
Citometría de flujo
• IgG ↓, IgA ↓, IgM ↓• Linfocitos B ↓
• ¿Diagnóstico?• Agammaglobulinemia
¿Ya tenemos el diagnóstic
o?
Citometría de flujo
CASO CLINICO
Detección de Btk por citometría de flujo• Diagnóstico de deficiencia de Btk
• Menos costo que secuenciamiento genético• Más rápido
• ¿En qué células se hace el estudio?• Monocitos
• ¿Qué actitud tomar si se detectan valores normales de Btk en monocitos?
• Secuenciamiento genético si hay alta sospecha• Puede haber proteína no funcionante
CELULAS B
Son leucocitos de los cuales depende la inmunidad mediada por anticuerpos
Constituyen 5 al 20% de los linfocitos totales en sangre periférica
Dan origen a las células plasmáticas encargadas de secretar anticuerpos
Y
Y Y
Y
Y
Ig/Ig
IgM
PLC2
Btk
Fyn
Blk
Lyn
Syk
BLNK
Vav
IP3
Citoesqueleto
JNK
NF-BPKC
DAG
Calcio
Y
Células B transicionales: Niveles altos se han sido reportados en infección por VIH , la deficiencia BAFFR (Receptor del Factor de supervivencia de la células B). Plasmablastos: El aumento de números de plasmablastos se correlaciona con la actividad de la enfermedad en LES.
Células B vírgenes: El aumento en el número de estas células se ven en algunas patologías es debido a una disminución de las células B de memoria (HiperIgM y ICV). Células B de memoria sin cambio de isotipo: La reducción se han descrito deficiencias tales como CD19, CD81 , LRBA, la enfermedad linfoproliferativa LX.
Células B de memoria con cambio de isotipo: Se han descrito en el síndrome de Wiskott-Aldrich , el síndrome linfoproliferativo LX, AID, UNG, CD40L, TACI así como algunos pacientes con ICV.
Las células B dobles negativas: El aumento se han observado en LES, enfermedad infecciosa crónica (VIH, malaria) y en algunos pacientes con ICV.
• Niño, 3 años• Lesiones granulomatosas en
piel desde los 7 meses de edad
• Serratia, Proteus• 3 neumonías• BK Negativo
Caso Clínico
• IgG, IgA, IgM: normales• Poblaciones linfocitarias: normales
• ¿Diagnóstico clínico?• Enfermedad granulomatosa crónica
¿Cómo confirmar el diagnóstico?
Caso Clínico
Oxigeno Molecular O2
Radical superóxido O2-H2O2
HOClOH-
Destrucción de Bacterias y hongos fagocitado
¿Qué gen está
fallando en nuestro
paciente?
RESULTADOS:PMN (Eventos contados) MFI
Muestra basal: 5000 225 Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 29 955Muestra con estimulo PMA: 5000 993 441
NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 33
Muestra Normal
Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620.
PMN (Eventos contados) MFIMuestra Basal: 5000 1 151Muestra con 1,2,3 DHR: 5000 8 214Muestra con estimulo PMA: 5000 11 827NOI (Indice Oxidativo de los Neutrofilos): 1.4
Muestra de Paciente con EGC
Epling, C. L., D. P. Stites, T. M. McHugh, H. O. Chong, L. L. Blackwood, and D. W. Wara. 1992. Neutrophil function screening in patients with chronic granulomatous disease by a flow cytometric method. Cytometry13:615–620.
VALORES NORMALES• NOI > 30 De acuerdo con un estado normal, no consistente con el
diagnostico de CGD.
• NOI < 5 Consistente con el diagnostico de CGD.
• NOI > 30 y NOI < 5 De acuerdo con un estado de portador de la ligada al cromosoma X forma de CGD en una mujer si hay 2 poblaciones claramente separadas de los granulocitos.
• En la actualidad hay más de 300 mutaciones descritas en el gen CYBB y se han registrado en la XCG Dbase
(http://bioinf.uta.fi/CYBBbase). 2012
1er uso de citometría en IDP…
• Determinación de poblaciones linfocitarias• Linfocitos B: CD19, CD20
• Naive• “Switched” memory• “Unswitched” memory• Transicionales, etc.
• Linfocitos T: CD3, CD4, CD8• Naive• Memory, etc
• Linfocitos NK: CD16, CD56
1er uso de citometría en IDP…
• Determinación de poblaciones linfocitarias• Linfocitos B:
• Agammaglobulinemia• Inmunodeficiencia común variable
• Linfocitos T:• Inmunodeficiencias combinadas:
• T-B-NK-• T-B-NK+• T-B+NK-• T-
• Linfocitos NK:• Deficiencias NK
• Detección de expresión proteica (membrana, intracelular)
• BTK: agammaglobulinemia ligada al X• WASP: síndrome de Wiskott-Aldrich• γC: X-SCID• SAP: síndrome linfoproliferativo ligado al X tipo 1• CD40L: síndrome hiper-IgM• FOXP3: IPEX• IL12Rβ1: MSMD• CD18: LAD 1• …
2do uso de citometría en IDP…
PROBLEMA: disponibilidad
• Pruebas funcionales:• Estallido respiratorio: CGD• Fosforilación de proteínas intracelulares para evaluar
señalización de receptores• Proliferación de linfocitos T en respuesta a mitógenos
3er uso de citometría en IDP…
PROBLEMA: disponibilidad
