Inmunoensayos

Análisis forense

Servicio Medico Legal Santiago,Chile

Ethel Guerrero-Víctor Vidal

Test preliminares

Basados en la exactitud de los hallazgos analíticos, un procedimiento analítico puede ser considerado preliminar o método concluyente.

Los métodos de análisis preliminares son útiles para propósitos de “screening”

Test preliminares

Los ejemplos típicos de la categoría

de métodos preliminares donde no es necesaria la instrumentación son

Test de color y los inmunoensayos

de panel

Test preliminares

Métodos preliminares que requieren instrumentación

Radio inmunoensayo Enzimo inmunoensayo Fluorescencia polarizada Luminiscencia

El protocolo en el cual es usado un método preliminar, requiere de dos pasos cuando un resultado es positivo

Los presuntivos positivos tiene que ser testeado para una droga especifica y sus metabolitos por cromatografía gaseosa /espectrometría de masasSolo esas drogas pueden ser reportadas como positivas

Valores de corte

Si se utiliza un inapropiado valor de corte (cutoff)

Si es adoptado un bajo nivel de corte, habrá un exceso de resultados negativos analizados por GC/MS

Por el contrario si el cutoff es muy alto en el test preliminar, las muestras positivas pueden ser reportadas como negativa sin el proceso de GC/MS

Causando al proceso de testeo de drogas una técnica ineficiente

ADULTERANTES

La presencia de adulterante comunes y accesibles afectan la respuesta del común de los inmunoensayos .

El efecto del adulterante varía con la categorías de las drogas testeada y la metodología de inmunoesayos usados

Los adulterantes que causan interferencias significativas han sido revisada (1)

1.Cody J T, : Specimen adulteration in drug uranalysis ; forensic Sci Rew 2:63,90

Adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

amonio 5,10%

5,10,14%

10%

14%

RIA

RIA

FPIA

FPIA

COC

THC

BAR

THC

-

+/-

+/-

+/-

- -+++

+++/++

+++/+

2

2,3

3

4

Hidróxido de potasio

0.5,5M

5M

RIA

FPIA

THC

THC+/-

+/-

++++

+++

3

3

Bicarbonato

de sodio

40mg/ml

40mg/ml

EMIT

RIA

BAR

AMF,

BAR

THC

+

+/-

++

++

5

5

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

Blanqueador liq

12ul/ml

23UL/ML

24ul/ml

125ul

10%

5%

50%

5,10,50%

EMIT

EMIT

EMIT

EMIT

RIA

RIA

RIA

FPIA

THC

AMF

BAR OP

COC

BEN

THC OP

AMF

THC

THC

THC

+

+

+

+

-

+/-

+

- - - --- - -

-- - --- - -

-

+++++

----

6

6

6

6

2

2

3

3

adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

Vanish 1-10%

1-10%

5%

10%

RIA

RIA

RIA

FPIA

AMF,OP

THC

THC

THC

+

+

-

-

--

--

+++

+

2

2

2

4

Detergent iónico

10%

10-5%

10%

10%

RIA

RIA

FPIA

FPIA

COC

THC

BAR

THC

+

+/-

+/-

-

--

+

++

2

2

4

4

Vinagre 125ul/ml

0.5gotas/ml

50%

10%

EMIT

EMIT

RIA

FPIA

THC

THC

THC

THC

+

+

-

+

--

-f

++

---

6

7

3

4

adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

SAL 025%

50mgml

50mg/ml

50mg/ml

75mg/ml

50mg/ml

10%

50mg/ml

10%

EMIT

EMIT

EMIT

EMIT

THC

OP,BAR

AMF

COC

OPI

THC

BEN

BAR

A,BARCOP,THC

THC

BEN

THC

+

+

+/-

+

+

+

+

+

+

-f

----

----

----

----

----

--

--

--

7

8

9

9

6

6

2

9

4

AdulterantesI

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

Detergente y jabón liq

1got/10ml EMIT THC + -f 7

1got/5ml EMIT THC + -f 7

10% RIA THC +/- +++ 2

5-10% RIA THC + ---- 3

5-10% FPIA THC - ++ 3,4

10% FPIA BAR +/- ++++ 4

Adulterante II

cantidad método droga muestra efecto ref

12ul/ml EMIT THC + ---- 4

23ul/ml EMIT BAR + ---- 4

42ul/ml EMIT BEN + ---- 4

2% EMIT THC,BEN +/- ---- 9

2% EMIT BAR + ++ 9

2% RIA THC,BEN +/- ++++ 9

2% FPIA ANF,BAR,THC,BEN +/- +++ 9

sustancia cantidad método droga muestra efecto refFosfato 5%10%

5% 10%

10%

10%

10%

RIA

RIA

RIA

RIA

FPIA

COC

THC

AMF

BAR

OP

+

+/-

+/-

+/-

+

----

+++

++

+++

----

2

2

2

2

4

Etilen glicol 20%

20%

RIA

FPIA

THC

THC

+

+

+

+

9

9

2-propanol 20%

50%

20%

50%

RIA

RIA

FPIA

FPIA

THC

THC

THC

THC

+

+/-

+

+/-

+

+++

+

++

9

3

9

3

adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto refEtanol 20%

20%

RIA

FPIA

THC

THC

+

+

+

+

9

9

SANGRE 1gota/10ml

10%EMIT

FPIA

THC

THC

+

+/-

-

--

7

4

Ácido ascórbico

10%

10%

10%

RIA

RIA

FPIA

AF OP

THC

THC

THC

+

-

+

-

--f

2

2

3

7

adulterantes

sustancia cantidad método droga muestra efecto ref

Visine 125ul/ml

107ul/ml

10%

10%

EMIT

EMIT

RIA

FPIA

THC

BEN

THC

THC

+

+

+

+

----

---

--

--

6

6

2

7

Agua

oxigenada

6ul/ml

6ul/ml

6ul/ml

6ul/ml

EMIT

RIA

FPIA

FPIA

BEN

THC

BEN

THC

+

+

+/-

+

--

++

++

++

9

9

9

9

Adulterantes

La mayoría de los estudios analizados no han comparado los efectos de los adulterantes bajo las mismas condiciones

Dificulta hacer declaraciones generales concerniente a la robustez de una metodología sobre otra.

Sin embargo los ensayos de marihuana son más susceptibles a los efectos de los adulterantes

Realidad Médico Legal

En el departamento de laboratorios de Santiago se realizaron 6762 pericias toxicológicas

de los cuales 33% de estas pericias, no es para determinar la causa de muerte, sino para entregar más elementos a la investigación

1007 corresponden a informes sobre consumo de drogas de abuso

Análisis toxicológico

Grupo G1 tanatología

Diagnóstico de muerte por arma blanca, arma de fuego, golpe contundente y atropello

clínica y sexología forense pericias que corresponde a consumo de

drogas de abuso, psiquiatría forense

son sometidas a un rastreo de drogas de abuso incluyendo alcohol

Toma de decisión

La Administración de Justicia necesita de respuestas oportunas

debido a la gran cantidad de peritajes, se tomó la decisión de utilizar la técnica de inmunoanálisis, para el rastreo de drogas de abuso.

por GC-MS considerada actualmente el “gold standar” de la técnicas confirmatorias.

INMUNOENSAYOS

en la actualidad la mayoría de los laboratorios forenses realizan screening de drogas de abuso mediante técnicas de inmunoensayo debido que dichas técnicas presentan una elevada sensibilidad y son rápidas de usar (10)

Orina

La orina es el fluido biológico preferido para el análisis de uso de drogas ilegales y sus metabolitos.

Mientras la tendencia reciente ha sido aplicar tecnología de laboratorio a nuevos medios biológicos, debería tenerse en cuenta que el análisis de orina es una tecnología bien conocida en la que la mayoría de los problemas ha sido descubiertos y resueltos ,o por lo menos , definido.

Orina

La importante ventaja de la orina para los test de detección de drogas es que generalmente esta disponible en cantidad suficiente, es fácil de recoger y las drogas y sus metabolitos tienden a estar presente en concentraciones relativamente altas

Comparación de inmunoensayo y equivalencia

Cada analito de los paneles fue evaluado en comparación entre panel EMITR y CG/MS

Todos los resultados fueron confirmados por CG/MS

Opiáceos

PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL

(+) 7 0 7

(-) 1 70 71

TOTAL 8 87.5% 70 100% 78 98.7%

PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL

(+) 7 0 7

(-) 0 70 70

TOTAL 7 100% 70 100% 77 100%

Cocaína

PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL

(+) 29 4 33

(-) 0 67 67

TOTAL 29 100% 71 94.3% 100 96%

PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL

(+) 33 0 33

(-) 1 66 67

TOTAL 34 97% 66 100% 100 99.0%

Marihuana THC

PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL

(+) 32 0 32

(-) 6 63 69

TOTAL 38 84.21% 63 100% 101 98.4%

PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL

(+) 30 2 32

(-) 0 69 69

TOTAL 30 100% 71 98.3% 101 99%

ANFETAMINAS

PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL

(+) 25 0 25

(-) 3 70 73

TOTAL 28 89.2% 70 100% 98 97%

PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL

(+) 21 4 25

(-) 0 73 73

TOTAL 21100% 81 90.1% 98 96%

METANFETAMINAS

PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL

(+) 14 1 14

(-) 0 26 26

TOTAL 14 100% 27 97% 3098.3%

Cada método de screening tiene sus ventajas y desventajas

Unos u otros pueden ser más económico bajo diferentes series de circunstancias

Cada laboratorio tendrá que considerar esas circunstancias y elegir el método que le entregue el screening mas eficiente para un grupo de drogas en particular

SANGRE

La sangre es considerada como la muestra más útil para la identificación de drogas en análisis cuantitativo.

Dado que Las sustancias psicoactivas que se testean a menudo abandonan la sangre rápidamente esta es más útil para para la identificación del consumo reciente

Generalmente los valores de están en la sangre en concentraciones bajas, típicamente en un rango de 5ng (10-9) -5g(10-6)

sangre

Existen diversos procedimientos de detección de drogas en sangre para las drogas que se abusa más frecuentemente

La CL es una de las técnicas más empleadas, ya que es capaz de identificar al mismo tiempo diversos compuestos similares

La GC-MS por si misma permite el análisis de sangre pero se debe realizar una derivatización para incrementar la sensibilidad

inmunoensayo

Los inmunoensayo para las drogas de abuso están diseñados para la determinaciones en orina y en sangre,

Es con la sangre con lo que la versatilidad y la sensibilidad del RIA y posteriormente del ELISA son particularmente ventajosa

Sangre En1978 se publicó la aplicación de inmunoensayo a un

fluido distinto de la orina (10).desde esa fecha la comunidad toxicológica ha manifestado interés hacia la aplicación de los inmunoensayos a diversas muestras biológicas como; suero , sangre total, bilis, humor vítreo y tejidos (11)

La extensión de los inmunoensayos a las muestras de sangre conlleva la modificación de los procedimientos utilizados en el análisis de orina, por lo que las muestra de sangre total no pueden ser analizadas de forma directa.

Presentan altos niveles de absorbancia que interfieren con los medidas a realizar por los métodos inmunoenzimaticos, por lo que es necesario una preparación de la muestra antes de someterla al análisis(12)

sangre

Durante estos últimos meses en nuestro Laboratorio ha estado desarrollando un método para detectar presencia de de drogas de abuso en sangre mediante la aplicación de técnica de inmunoensayo

DROGAS DE ABUSO ESTUDIADAS

DROGA Cut-off (ng/mL)

Conc. Terap.

(ng/mL)

LD a pH 9

(ng/mL)

LD a pH 11

(ng/mL)

ANFETAMINA 1000 200-1000 NEG(1050) 230

BENZOILECG 300 44* 20 20

OXAZEPAM 300 230* 230 180

NORTRIPTIL 1000 50-250 408 408

FENOBARBIT 100 20000-40000 75 15

METAMFET 1000 500-1000 NEG (1020) 968

MORFINA 300 10-120 207 207

METADONA 300 100-450 293+- 43

MDMA 500 500-1000* 460+- 80

COCAINA 300 350 NEG(1200)

referencia

11.Vogel J, Hednett CN;Detection of drugs in blood, bile and tssues with an enzyme inmunoassay technique, J Anal Toxicol,:5;307-309;81

12.Lillsunde P, Michenson L, ForsstronT, KurteT SchultzE, Ariniemi K .. Comprehensive drug screening in blood for detecting abused drugs or drug potencially hazardous for traffic safety. Forensic Scien Innt,77,191-210

13. Screenig de drogas de abuso en sangre total mediante inmunoesayo enzimático CEDIA originalmente diseñados para el análisis de orina .aplicación en caso forense.R Garcia E Moreno T Soriano

referencias

2. Cody JT Schawarzhopff R:Impact of adulterants on RIA analysis of urine for drugs of abuse; J Anal. Toxicol13:277;89

3. Bronner W,Nyman P.,von Minden D.Dectectability of phencyandclidine 11-nor-9-tetrahidrocannabinol-9-carboxylic acid in adulteratedurineby

radioinmunoassay and flurescence polarization inmunoassay; J AnalToxicol 14:368;90

4. Schawarzhopff R, Cody JT; the effects of adulterrants agents on FPIAanalysisof urine drugs of abuse: J Anal Toxicol 17:14;93

5. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89

6. MIKKELSEN s l,Ash KO: Adulterants causingfalse negative in ilicite drugs testing: Clin Chem:34:2333;88

7. Schwarts R H, Hayden GF , RiddileM:Laboratory detection marijuana use ;Am J D iseases of Children 139:1093;85

8. Kim HJ ,Cerceo E: Interference by NaCl with the Emit method od f analysis for drugs of abuse; Clin Chem: 22:1935,76

9. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89

10 iwerse-Bergman A, Schomolldt: Direct semiquantitative screening of drugs of abuse in serum and whole blood by means of CEDIA DAU urine inmunoassays; J Anal Toxicol, 23;247-256:99