Los anticuerpos o inmunoglobulinas son glucoprotenas producidas por los linfocitos B (convertidos en clulas plasmticas) en respuesta a una protena extraa o antgeno

INMUNOHISTOQUMICA

Los anticuerpos estn formados por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Contienen un dominio constante y otro variable en cada una de las cadenas ligera y pesada. La regin de unin al antgeno est conformada por los dominios variables de la cadena pesada y ligera en el extremo amino terminal del monmero de anticuerpo La regin constante se llama as porque es similar en las distintas molculas de inmunoglobulinas de una especie

En el laboratorio los anticuerpos pueden purificarse del suero de animales tras inyectrsele el antgeno que se quiere identificar en la preparacin

El continuacin el anticuerpo que reconoce a la protena que deseamos identificar puede:

conjugarse con un fluorocromo: inmunofluorescencia

conjugarse con una enzima que catalice una reaccin que genere un cromforo: mtodos enzimticos

INMUNOHISTOQUMICA

ESTRUCTURA BSICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Propiedades IgG IgM IgA IgD IgE

Cadenas pesadas

Cadenas ligeras o o o o o

% en sangre 80 15 5

Existen varios tipos de anticuerpos, de los cuales los IgG son los ms abundantes en suero y los que ms utilidad tienen en tcnicas de laboratorio

Antgeno es la molcula a la cual se une el anticuerpo. Son de muy distinta naturaleza. Fundamentalmente los Ac reconocen protenas, pero tambin se sintetizan Ac contra carbohidratos, lpidos, ac. nucleicos, compuestos orgnicos sintticos, etc. La regin del antgeno a la cual se une el anticuerpo se denomina eptopo. Los eptopos pueden estar formados por regiones contiguas o no en la secuencia de aminocidos de una protena.

La unin antgeno-anticuerpo es una unin reversible y de alta afinidad. La produccin de anticuerpos consiste bsicamente en:

a) Preparacin del antgeno,

b) Inyeccin de este a un animal y

c) Obtencin del suero del suero del animal.

INMUNOHISTOQUMICA

Se administran varias inyecciones al animal, separadas por varias semanas (Generalmente se ponen 3 inyecciones para que la cantidad de Ac fabricada sea mayor. Una inyeccin cada 4 semanas)

A la 10 semana se desangra el animal

OBTENCIN DEL SUERO:

El suero contiene multitud de anticuerpos diferentes contra diferentes molculas, incluso en animales superinmunizados contra un antgeno, los anticuerpos circulantes contra ese antgeno no superan la dcima parte del total.

Los anticuerpos contra nuestro antgeno presentes en el suero no son de un slo tipo: hay multitud de ellos, que reconocen diferentes partes del antgeno (anticuerpos policlonales).

INMUNOHISTOQUMICA

Proceso de obtencin del suero: cromatografa de afinidad En esta tcnica se une el antgeno (el mismo que se utiliz para la inoculacin)

a unas bolitas

Una vez recubiertas por el antgeno se empaquetan las bolitas en un tubo fino (se le llama columna) y se hace pasar el suero que se desea purificar

Los anticuerpos especficos para el antgeno son retenidos y el resto de los anticuerpos y protenas del suero salen

El paso final es la ruptura de las uniones entre antgeno y anticuerpos cosa que se hace aadiendo a la columna una solucin hipertnica u otra con pH cido, con lo que los anticuerpos especficos se eluyen (salen) por la parte inferior

INMUNOHISTOQUMICA

ANTICUERPOS POLICLONALES

Inmunizacin del conejo (rabbit) Con el antgeno deseado (GFAP-h)

Extraccin de Acs policlonales del suero sanguneo del conejo (Ej. Rabbit anti-human GFAP)

Reconocen diferentes regiones en un antgeno. Son menos especficos y ms baratos. Se obtienen directamente del suero del animal

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Linfocitos B (bazo ratn) +

C. Mieloma Mltiple de ratn

HBRIDO (produce Acs monoclonales)

Clonacin de HBRIDOS ms productivos (Ej: Mouse anti-human GFAP)

Inmunizacin del ratn (mouse) con el antgeno deseado (GFAP-h)

alta especificidad (reconocen una regin especfica del antgeno). Son ms caros

Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B del bazo de un animal que ha sido expuesto al antgeno. Estas clulas B son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con clulas tumorales de mieloma mltiple (un tipo de cncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a las membranas celulares ms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rpida e indefinidamente, puesto que son clulas tumorales despus de todo y pueden producir gran cantidad de anticuerpos

Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales producen slo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de unirse a un antgeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva.

OBTENCIN ANTICUERPOS MONOCLONALES

INMUNOHISTOQUMICA INMUNOHISTOQUMICA DIRECTA: es la ms antigua. Se sirve de un Ac primario maracado con un fluorocromo. Comprende un solo paso. Seal dbil. Fue reemplazado por los mtodos indirectos

INMUNOHISTOQUMICA INDIRECTA: Al anticuerpo primario se une ms cantidad de anticuerpo secundario marcado, efecto de amplificacin. Ms sensible

En el mtodo directo el antgeno especfico es inyectado a un animal ej. ratn y posteriormente se conjuga con una enzima o un fluorocromo

En el mtodo indirecto el anticuerpo primario se sintetiza de la misma forma pero no se marca (ej. en un ratn). El anticuerpo secundario debe reconocer la regin constante del anticuerpo de ratn y por tanto se genera en otro animal ej. cabra. Los anticuerpos de cabra anti-ratn van a ser capaz de reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones dado que reconocen la porcin constante (que no vara) de una inmuglobulina especfica). Por tanto, en un laboratorio se procurar que el anticuerpo primario sea desarrollado siempre en el mismo animal (ej. ratn) y se tendr un nico secundario marcado (ej cabra-anti-ratn) que reconocer a cualquiera de los primarios independientemente del antgeno que reconozcan. Su uso presenta ciertas ventajas econmicas, por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios marcados

INMUNOHISTOQUMICA

El anticuerpo secundario se marca con un fluorocromo y la preparacin se observa en el microscopio de fluorescencia

La muestra marcada con fluorescencia est hidratada y la vida media de la preparacin es ms corta, adems la fluorescencia tambin se degrada con el tiempo

INMUNOHISTOQUMICA Inmunofluorescencia

ab2433: anti p53

TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS

A.- DIRECTA

B.- INDIRECTAS

Ac conjugado con fluorforo o enzima

Rpido, caro, poco sensible

B1.- DOS CAPAS DE Acs Ac 1ario NO conjugado Ac 2ario Conjugado ej. Fluorocromo Ms sensible que anterior

B2.- TRES CAPAS: Muy sensibles, mayor riesgo de uniones inespecficas B2.1..- Mtodo PAP/APAAP Acs 1ario y 2ario No conjugados Ac 2ario en exceso (puente) Complejo PAP/APAAP realizado en el mismo animal que el Ac 1ario

B2.2.- Mtodo ABC Ac 1ario NO conjugado Ac 2ario biotinilado Avidina conjugada con peroxidasa Revelado de la peroxidasa DAB + H2O2 DAB oxidada(marrn) + 2H2O + O2

El anticuerpo secundario o terciario se conjuga con una enzima que cataliza una reaccin que genera con cromforo

INMUNOHISTOQUMICA Tcnicas enzimticas

Peroxidasa-Antiperoxidasa (PAP): tres capas La peroxidasa es una enzima que en presencia de perxido de hidrgeno es capaz de

oxidar a un compuesto denominado diaminobencidina (DAB) generando un producto marrn insoluble (Nota: la DAB es altamente txica y cancergena lo que requiere extremo cuidado durante su manipulacin)

La peroxidasa se inyecta a un animal y se obtienen los anticuerpos anti-peroxidasa. A continuacin se forma un complejo de peroxidasa-anticuerpo (peroxidasa-antiperoxidasa)

El proceso consta de tres pasos: Se aade el Ac primario que reconoce el Ag (ej. en ratn) Se aade el anticuerpo secundario cabra- anti-ratn en exceso. El secundario va a

reconocer tanto al primario como al terciario (complejo peroxidasa-antiperoxidasa)

Se aade el terciario (complejo PAP), que tiene que haber sido desarrollado en el mismo animal que el primario

Se aade H2O2 y DAB y se forma el precipitado coloreado. Observacin en microscopio ptico

El aumento de sensibilidad en esta tcnica se debe a que por cada unin antgeno-anticuerpo, existen numerosas molculas de peroxisasa

NOTA: es necesario el uso de tres anticuerpos porque en el complejo PAP, la enzima est unida al anticuerpo en el lugar de reconocimiento al antgeno

TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS

A.- DIRECTA

B.- INDIRECTAS

Ac conjugado con fluorforo o enzima

Rpido, caro, poco sensible

B1.- DOS CAPAS DE Acs Ac 1ario NO conjugado Ac 2ario Conjugado Ms sensible que anterior

B2.- TRES CAPAS Muy sensibles, mayor riesgo de uniones inespecficas B2.1..- Mtodo PAP/APAAP Acs 1ario y 2ario No conjugados Ac 2ario en exceso (puente) Complejo PAP/APAAP realizado en el mismo animal que el Ac 1ario

B2.2.- Mtodo ABC Ac 1ario NO conjugado Ac 2ario biotinilado Avidina conjugada con peroxidasa Revelado de la peroxidasa DAB + H2O2 DAB oxidada(marrn) + 2H2O + O2 mayor sensibilidad

INMUNOHISTOQUMICA Tcnicas enzimticas

Mtodo de la avidina-biotina: Mtodo ABC (Avidin Biotin Complex)

Se basa en la gran afinidad que tienen la avidina y la biotina que se conjugan fcilmente mediante unin fuerte (no inmune)

Adems la biotina se conjuga muy fcilmente con anticuerpos (se considera que 150 molculas de biotina se unen a una sola molcula de anticuerpo)

El anticuerpo primario no est conjungado y se une al antgeno El anticuerpo secundario est marcado con biotina (anticuerpo biotinilado) Tras la incubacin con los anticuerpos se aade a la muestra un complejo de

avidina unida a peroxidasa

Se aade H2O2 y DAB La sensibilidad se ve aumentada de manera notable al producirse una extensa

malla que contiene molculas de peroxidasa por cada unin de antgeno anticuerpo

Este mtodo es muy usado debido a la gran sensibilidad y el fuerte enlace no inmune entre avidina-biotina

VENTAJAS E INCONVENENTES DE INMUNOFLUORESCENCIA VS. TCNICAS ENZIMTICAS CON PEROXIDASA

La preparacin de inmunofluorescencia tiene una vida media corta dado que la muestra est hidratada y el fluorocromo se degrada. La imagen se puede conservar digitalizada. Se necesita tener un microscopio de fluorescencia para observar estas preparaciones

Las preparaciones realizadas mediante el mtodo de las peroxidasa se conservan deshidratadas en medio de montaje de forma indefinida. Adems la observacin se realiza mediante un microscopio ptico comn

Obtenido de: Histologa y embriologa del ser humano Escrito por Aldo R. Eynard,Mirta A. Valentich,Roberto A. Rovasio

Factores que influyen en la inmunomarcacin En la evaluacin de las inmunomarcaciones son importantes dos elementos: 1) el factor preanaltico (intrnseco) y 2) el factor analtico (extrnseco). 1) El factor pre-analtico se refiere a las caractersticas del tejido y su preservacin antignica. La conservacin adecuada de las caractersticas antignicas del tejido depende del tipo de fijador empleado, de la fijacin adecuada, y del tiempo de la fijacin. El formol buffer al 10% es el fijador ms utilizado. El pH del formol tiene influencia directa en la conservacin antignica del tejido y la variacin de este puede alterar la estructura proteica de los eptopes. Algunos procedimientos tcnicos, como el sobrecalentamiento del tejido, la descalcificacin y la congelacin, tambin pueden afectar la preservacin antignica.73 2) Los factores analticos (extrnsecos) son los elementos externos al tejido que pueden controlarse en el laboratorio de inmuohistoqumica e incluyen: el tipo de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y dilucin, el sistema de deteccin, los cromgenos empleados, el mtodo de recuperacin utilizado y la interpretacin de la reaccin.

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Obtenido de: El Diagnstico en Clnica Estomatolgica. Escrito por Eduardo L. Ceccotti

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Falsos positivos por biotina endgena La biotina es una protena que acta como cofactor en la reaccin de descarboxilacin, es parte del complejo de la vitamina B, y se encuentra en clulas ricas en mitocondrias, como en las clulas de los tbulos contorneados proximales del rin, los hepatocitos, las clulas apcrinas y las clulas de Hrthle de la tiroides. La forma de solucionar esta marcacin de biotna endgena es con la inmunomarcacin con un bloqueo avidina-biotina o un sistema de deteccin alternativo que no incluya avidina-biotina, como el sistema peroxidasa-antiperoxidasa Falsos positivos por peroxidasa endgena Cualquier mtodo de marcaje con peroxidasa encierra el inconveniente de que en los tejidos hay peroxidasa endgena que puede dar falsos positivos. Por eso es muy importante inhibir la actividad endgena de dicha enzima con agua oxigenada en una solucin tamponada

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HIBRIDACIN IN SITU

Hibridacin: describe la capacidad de las molculas monocatenarias de ADN y ARN de hibridar con secuencias complementarias

Debido a la alta especificidad de la hibridacin es posible demostrar con gran especificidad la presencia de determinadas secuencias de ADN o ARN en su localizacin celular

Para la tcnica de hibridacin in situ se utiliza un sonda (probe) formada por una secuencia de cido nucleico monocatenario con una secuencia de bases conocida complementaria a la secuencia de bases que se desea demostrar

Las sondas pueden tener entre 20-40 nucletidos como mnimo y permite la deteccin de secuencias de nucletidos tan pequeas como 10 o 20 copias de mRNA o DNA por clula

Las sondas se producen en el laboratorio y originalmente se marcaban con un istopo radiactivo (ej. clonando en bacterias o mediante PCR en presencia de [-32P]-dCTP)

Los istopos (3H, 32P, 35S, 125I ) emiten radiacin ionizante debido a la inestabilidad de sus ncleos) capaz de imprimir pelculas/emulsiones fotogrficas

HIBRIDACIN IN SITU

Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro asociado

a la utilizacin de radiactividad. Para evitar este peligro se desarrollaron otros mtodos de marcaje basados en anticuerpos.

Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula que puede ser reconocida por anticuerpos como la digoxigenina

La digoxigenina (DIG) se enlaza en la posicin C5 de la uridina. Los nucletidos marcados con DIG pueden ser incorporados a las sondas de cidos nucleicos por DNA polimerasas o RNA polimerasas

Las sondas DIG-marcadas son detectadas con una alta especificidad por

anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son conjugados a fosfatasa alcalina, peroxidasa, fluorocromos (este es el caso de la tcnica FISH) u oro coloidal

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HIBRIDACIN IN SITU

Si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de ADN en las clulas de un corte histolgico o en un preparado especial de cromosomas:

Primero se expone el preparado a un pH bsico que induce la separacin de la doble cadena de ADN por desnaturalizacin

Despus se agrega la sonda que puede poseer una cadena complementaria de ADN o ARN

Una vez hibridada con zonas complementarias en los cromosomas del ncleo, la sonda se hace visible bien por su marcaje radiactivo mediante autorradiografa , bien por su marcaje fluorescente en la tcnica FISH o mediante otras tcnicas

Si se desea demostrar la presencia de molculas especficas de RNA (es decir, la expresin de determinados genes) no se efecta ningn tratamiento previo de los cortes a pH elevado, dado que no interesa que las cadenas de ADN estn separadas y puedan pegarse a la sonda

En este caso es suficiente incubar los cortes con la sonda

TCNICA FISH

Significa hibridacin in situ con fluorescencia La sonda bien se marca directamente con fluorocromos o indirectamente

(uniendo a la sonda molculas que son reconocidas por anticuerpos marcados ej. digoxigenina o biotina)

Tiene un uso muy difundido en clnica para las pruebas genticas Ej. la hibridacin de una sonda con cromosomas en metafase puede usarse para la localizacin cromosmica de un gen

Tambin puede usarse en expresin gnica y distribucin de productos gnicos como protenas anormales

Actualmente hay sondas disponibles en el mercado para deteccin de cncer de cuello uterino, deteccin de clulas infectadas por HIV, para determinar nmero de translocaciones cromosmicas (ej. en linfocitos de astronautas son un indicador de la radiacin absorbida)

Tambin se emplea en deteccin de alteraciones cromosmicas en el diagnstico prenatal

ncleos en interfase de clulas procedentes de lquido amnitico

AUTORRADIOGRAFA

Se utiliza como mtodo de revelado en la tcnica de hibridacin in situ con marcaje radiactivo que vimos en el apartado anterior

Gracias a l se puede localizar la situacin concreta de material radiactivo dentro de un tejido concreto, dentro de una clula o de una parte de ella

Tambin se utiliza para seguir el camino de una sustancia. En este caso puede llevarse a cabo una autorradiografa in vivo o in vitro en cuyo caso, se inyecta al animal vivo o se aade al cultivo celular las molculas precursoras marcadas con radiactividad (nucletidos o aminocidos)

Este tipo de autorradiografa ha servido para el estudio de procesos como la sntesis de ADN y la divisin celular, la sntesis y secrecin de protenas o su ubicacin en la matriz o en el interior celular

Los cortes de las muestras o los preparados celulares en los que se ha incorporado el material radiactivo se montan en un portaobjetos

En la oscuridad el portaobjetos se sumerge brevemente en una emulsin fotogrfica de sales de plata (AgBr)

La radiacin ionizante tiene el mismo efecto que los fotones que inciden en la pelcula fotogrfica de modo que en el lugar donde exista emisin de radiacin el in Ag+ se transforma en metal generando una mancha negra

El perodo de exposicin puede durar das o semanas se aplica un revelador qumico

AUTORRADIOGRAFA

Los preparados se pueden teir antes de la exposicin y revelado o despus

En la observacin con microscopio se distinguen los granos de plata metlica como pequeas manchas o puntos negros en los sitios de localizacin de sustancia radiactiva

autorradiograga replicacin bacterias bidireccional

John Cairns (Australiano) trabaj con bacterias (E. Coli) y las cultiv en un medio con timidina titriada (H-3), luego rompi las celulas, extrajo el ADN y le hizo una autoradiografa. La autoradiografa mostr que el ADN muestra una burbuja de replicacin, que crece hasta replicar totalmente el cromosoma bacteriano circular. La replicacin

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