Instituto de Nutrición de Centro América Panamá ...

Instituto de Nutrición de Centro América y Panamá Laboratorios de Microbiología y Virolog ía

INFORME FINAL DEL PROYECTO FODECYT 59-98 Transferencia e implementación de técnicas para el diagnóstico y

estimación de la prevalencia de microsporidios en niños desnutridos en comunidades urbana y rural de Guatemala

Presentado por: M.Sc. Rafael Pratdesaba Z.

TEMA

lndice

Resumen Ejecutivo

1. Introducción

2. Antecedentes

3. Objetivos

4. Metodología 4.1 Obtención de muestras 4.2 Recolección de muestras 4.3 Coloraciones 4.4 Aislamiento de ADN

5. Resultados 5.1 Análisis de muestras por coloración 5.2 Evaluación de coloraciones 5.3 Análisis de muestras por PCR

6. Discusión de resultados 6.1 Análisis de muestras por coloración 6.2 Evaluación de las coloraciones 6.3 Análisis por PCR

7. Conclusiones y Recomendaciones

8. Bibliografía

9. Ejecución Presupuestaria

Página

RESUMEN EJECUTIVO

El presente trabajo se realizó de marzo 1999 a febrero 2000. Los objetivos principales fueron identificar la presencia de esporas de microsporidios en nifios desnutridos, evaluar los metodos disponibles para diagnóstico de esta parasitosic e implementarlos en Guatemala y evaluar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como herramienta diagnóstica y confinatoria de la presencia de este parásito en las heces.

Previo a la colección de muestras se realizó un entrenamiento en los métodos de diagnóstico en el Centro de Estudios en Primates de la Universidad de Tulane, New Orieans bajo la supervisión de la Dra. Elizabeth Didier. Durante el periodo de tiempo mencionado se recolectaron muestras de heces de un total de 242 niños desnutridos provenientes del Hospital General San Juan de Dios, Hospital Infantil San Juan Sacatepéquez, del Hospital Nacional de San Marcos y de la colección de muestras obtenidas por el INCAP en Santa María de Jesús durante los afios de 1988-1990. Estas muestras fueron analizadas utilizando 4 diferentes coloraciones: Ziehl Neelsen, Tncrómica Modificada, Gram Cromótropo y Calcoflúor. Al mismo tiempo se realizó una evaluación de estos métodos para obtener el método que pudiera servir como método de referencia. Después de ser analizadas por medio de las coloraciones, las muestras fueron analizadas con el metodo de PCR, el cual fue previamente estandarizado.

De las 242 muestras evaluadas se obtuvieron un total de 7 muestras sospechosas para microsporidios que debieron ser confirmadas por PCR. Al realizar el análisis molecular a las muestras resultaron todas negativas. Al obtener los resultados de la evaluación de las coloraciones se decidió descartar la de Ziehl Neelsen como método diagnóstico para microsporidiosis; las otras tres coloraciones funcionaron bien, pero es necesario tener una combinación de la menos dos (calcoflúor y tricrómico o Gram) para poder confinar o descartar la presencia de esporas del parásito en la muestra. El PCR es una técnica rápida, sensible y específica para realizar el diagnóstico; de las 242 muestras analizadas con esté método, ninguna dio resultado positivo.

Al analizar los resultados obtenidos se puede conluir que estos parásitos no estaban presentes en la población estudiada. Sin embargo, antes de descartarlos como parásitos importantes para la población inmunodeficiente es necesario realizar una búsqueda activa durante varios años para poder incluir factores como cambios de temperatura, precipitación pluvial, migración de poblaciones, etc.

Al terminar el proyecto se ejecutó un 80% del presupuesto incluyendo los gastos administrativos. El 20% restante no fue ejecutado ya que se encontraron diferentes problemas burocráticos para poder realizar la ejecución. Se recomienda que para agilizar los trámites en el futuro se trasladen los fondos completamente a la institucibn en donde labora el investigador principal, realizando obviamente las auditorías necesarias para poder garantizar la correcta ejecución de los fondos.

INFORME FINAL DEL PROYECTO 59-98

NOMBRE DEL PROYECTO: Transferencia e implementación de técnicas para el diagnóstico y estimación de la prevalencia de microsporidios en niños desnutridos en comunidades urbana y rural de Guatemala

NUMERO DEL PROYECTO: 59-98

UNIDAD EJECUTORA: Instituto de Nutrición de Centro América y Panamá

DURACION TOTAL DEL PROYECTO: 20 MESES

NOMBRE DEL INVESTIGADOR PRIIVCIPAL: M.Sc. Rafael Pratdesaba

INVESTIGADORES ASOCIADOS: Dr. Elizabeth Didier M.Sc. Mario González

ASISTENTES DE INVESTIGACION: Lic. Karen Contreras Lic. Cecilia Díaz

El inicio de la pandemia de SlDA en los años 80 hizo necesario profundizar en el estudio de agentes causales de enfermedades que normalmente no atacan al hospedero inmunocompetente. Estos estudios no se limitan a personas afectadas por el SIDA, sino incluyen pacientes que padecen otras enfermedades que causan inmunosupresión, cronica o transitoria, como es el caso del cáncer, desnutrición, enfermedades virales, etc.

La desnutrición es común en los niños de los paises en vias de desarrollo. La relación entre desnutrición y diarrea fue descrita hace muchos años, y se refiere a que el paciente con desnutrición es más propenso a tener diarrea y el paciente con diarrea es más propenso a sufrir desnutrición. La desnutrición moderada y severa son condiciones en las que el paciente sufre de cierto tipo de inmunodeficiencia y por lo tanto está suceptible a sufrir enfermedades diarreicas causadas por agentes oportunistas. Entre estos parásitos están los microsporidios, que son capaces de producir diarrea cronica en hospederos inmunocomprometidos y aun no se han estudiado como agentes causantes de diarrea en niños desnutridos.

Dada la alta prevalencia de desnutrición en los niños guatemaltecos (hasta un 40% en las poblaciones rurales) es importante determinar la presencia de estos parásitos para poder contribuir al conocimiento de los agentes causales de diarrea en Guatemala y favorecer su tratamiento.

2. ANTECEDENTES

Como consecuencia del curso precongreso cobre microsporidios dado por la Dra. Elizabeth Didier de la Universidad de Tulane durante el XI Congreso Centroamericano de Microbiología realizado en Guatemala, quedó la inquietud de investigar, en colaboración con el INCAP, la situación de estos parásitos en Guatemala, donde la población de niños desnutridos está a riesgo de infecciones intestinales. La Dra. Didier accedid a colaborar en el proyecto y a establecer una transferencia de tecnología, entrenando personal para realizar las pruebas moleculares para que, de esta manera, pueda ofrecerse el servicio de diagnóstico de la infección por estos parásitos a la población guatemalteca.

El Instituto de Nutrición de Centro América y Panamá (INCAP) es un organismo internacional que se ha dedicado durante 40 años al mejoramiento del estado nutricional y del nivel de pobreza de la población centroamericana. Entre sus mayores logros se encuentra el desarrollo de harinas compuestas y alimentos fortificados para mejorar la calidad nutricional de los alimentos accesibles para la población de escasos recursos. Parte importante de los programas de mejoramiento nutricional son los estudios de diagnóstico e identificación de agentes etiológicos de diarrea y de prevalencia parasitaria realizados en los laboratorios de Microbiología y Virología de la división de Nutrición y Salud del Instituto.

El inicio de la pandemia de SlDA en los años 80 hizo necesario profundizar en el estudio de agentes causales de enfermedades que normalmente no atacan al hospedero inmunocompetente. Estos estudios no se limitan a personas afectadas por el SIDA, sino incluyen pacientes que padecen otras enfermedades que causan inmunosupresión, crónica o transitoria, como es el caso del cáncer, desnutrición, enfermedades virales, etc.

La desnutrición es común en los niños de los paises en vías de desarrollo. Tomando como indicador la relación de peso para edad, se calcula que el 12% de los niños menores de seis años de la región del Caribe y Latinoamérica están desnutridos (Daza y Peña, 1997). Una encuesta nacional realizada en Guatemala en 1990 revela que casi el 40% de los niños que se encuentran entre estas edades presentan un retraso de peso para edad (desnutrición moderada o grave) y que un 60% presenta retraso de talla para edad, lo que indica que la desnutrición se debe a un proceso crónico de subalimentación asociado a factores hereditarios y a condiciones inadecuadas de saneamiento ambiental (Daza y Peña, 1997).

La desnutrición protéico-calórica (DPC) moderada o grave afecta los mecanismos de defensa, principalmente los linfocitos T (Chandra et al, 1977), la capacidad bactericida y fagocitica de los neutrófilos, el sistema de complemento y la IgA (Uauy y Castillo-Duran, 1997). La falta de ingestión de micronutrientes (necesarios como antioxidantes, para proliferación linfocitica, en los mecanismos de replicación y diferenciacion tisular, etc.) y el estado de anorexia que acompaña a las infecciones ocasiona que el hospedero desnutrido se encuentre en un estado de inmunodepresión (Caballero, 1997; Bentley et al, 1997). Los requerimientos energéticos del paciente con DPC con infección son muy altos ya que el limitado acceso a carbohidratos y la inhabilidad de utilizar las reservas lipidicas hacen que el cuerpo recurra a las reservas proteicas de los músculos, a través de la gluconeogénesis; si el hospedero además presenta fiebre, por cada "C que aumenta la temperatura, el cuerpo aumenta la tasa metabólica en un 13% (Keusch, 1986). Todos este gasto de energía y la falta de reposición de las reservas energéticas provoca que el cuerpo no tenga defensas suficientes para combatir las infecciones.

Durante muchos años se ha conocido la relación que existe entre diarrea y desnutrición. Esta asociación constituye una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad entre los niños de los paises en vias de desarrollo y evita que los niños alcancen el peso debido para su edad (Guerrant et al, 1992; Yip y Sharp, 1993). Existe evidencia que demuestra que mientras mayor es el grado de desnutrición que presenta el niño, mayor es el riesgo de sufrir múltiples episodios de diarrea y la duración de esta se incrementa (Black et al, 1984; Samani et al, 1988). La diarrea en niños desnutridos puede ser por causas infecciosas o no infecciosas; se conoce una gran cantidad de agentes de diarrea infecciosa, mientras que los mecanismos que causan la diarrea no infecciosa no están claros. Lo Único que se conoce con certeza, es que la desnutrición favorece el desarrollo de diarrea, mientras que la diarrea agrava la situación de desnutrición (Behar, 1975).

Guatemala es un país que presenta altas tasas de morbilidad y mortalidad debidas a la diarrea. Existen varios estudios realizados por el INCAP que estableckn los principales agentes causales de diarrea en niños, entre los que se encuentran adenovirue y astrovirus (Cruz et al, 1 990; Cruz et al, 1 992), bacterias como Shigella sp, Campylobactqr jejuni, Escherichia col; enterotoxigénica (ETEC), etc. (Cruz et al, 1988a; Cruz et al, 1989; Crirz et al, 1994) y parásitos considerados como oportunistas (Cruz et al, 1988b). Existen otros pahsitos oportunistas, como

los microsporidios, que son capaces de producir diarrea crónica en hospederos inmunocomprometidos (Beauvais et al, 1994) y que, aunque aún no se han estudiado como agentes causantes de diarrea en niños desnutridos, si se han reportado en niños con ciertas deficiencias inmunológicas (Bretagne et al, 1993).

El término "microsporidios" es un término no taxonómico utilizado para referirse al grupo de parásitos intracelulares que pertenecen al phylum Microspora (Sprague 1977). Incluidas en este phylum se encuentran mas de 1000 especies agrupadas en aproximadamente 100 géneros, de los cuales por lo menos 13 especies se sabe que infectan a mamiferos aunque estos organismos son capaces de infectar las cinco clases de vertebrados y a casi todos los invertebrados. Económicamente tienen importancia ya que afectan cultivos de peces, criaderos de insectos, animales de laboratorio, granjas de zorros, etc. Filogenéticamente, los microsporidios se pueden clasificar como eucariotas tempranos, ya aunque tienen núcleo verdadero poseen ribosomas parecidos a los procariotas, y carecen de mitocondrias y aparato de Golgi (Didier et al, 1998).

El ciclo de vida de estos parásitos es complicado. El organismo maduro es la espora, que, en los organismos que infectan mamiferos, es oval a piriforme y mide 2.0-7.0 vm de largo por 1.5-5.0 vm de ancho y se encuentra formada por una exospora compuesta principalmente por glicoproteínas y una endospora que contiene quitina (Didier et al, 1998). La espora le confiere al organismo resistencia a factores ambientales, y entre los contenidos internos de esta se encuentran el núcleo (esporoplasma), un filamento polar con su disco de anclaje que se encuentra enrollado en la parte interior de la endospora, una vacuola posterior, citoplasma, etc. (Deluol y Cenac, 1994). Al momento que la espora entra en contacto con el hospedero (las vías primarias de infección pueden ser por ingestión, trauma, contacto, transplacentaria, inhalacidn) y a causa de ciertas condiciones bioquímicas especiales en el+$ito de infeccidn que incluyen presencia de polianiones, cambios de pH y entrada de iones Ca a la espora, el mecanismo de anclaje se dispara y penetra la célula blanco (sin afectar la membrana celular) descargando en el citoplasma los contenidos celulares a través del filamento polar (Canning y Hollister, 1987). Una vez dentro de la célula se pueden presentar dos fases: una de divisiones celulares por fisión binaria o múltiple (merogonia) y otra dedicada a la produccidn de esporas (esporogonia) (Canning y Hollister, 1987). Las esporas salen de las células infectadas y pueden invadir nuevas células o salir al medio ambiente a través de las secreciones corporales.

De las 7 especies que se sabe infectan al ser humano, solamente dos se han asociado con infección intestinal: Enterocytozoon bieneusi que solamente se ha reportado a nivel intestinal, y Encephalitozoon intestinalis que es capaz de causar infección diseminada además de la intestinal. Las formas más comunes de contagio se supone que involucran transmisidn por consumo de agua o alimentos contaminados, contaminación fecal y10 urinaria (las esporas del género Encephalitozoon pueden eliminarse a través de la orina) de las manos o instrumentos que se llevan a la boca, ya que las esporas son infectivas al momento de salir del cuerpo humano (Didier et al 1998; Kotler y Orenstein, 1998). La patogénesis de la enfermedad intestinal esta relacionada con la muerte de los enterocitos como resultado de la infección celular. Clínicamente se presenta como diarrea y pérdida de peso como resultado de daño a nivel del intestino delgado, mostrando atrofia parcial de las vellosidades e hiperplasia de las criptas y malabsorción (Kotler y Orenstein, 1998). Los pacientes usualmente no presentan fiebre y reportan de 3 a 10 episodios de diarrea al día, siendo estos en su mayoría evacuaciones líquidas y de gran volumen. Los pacientes con enfermedad moderada reportan intolerancia a la lactosa y grasa. Si la diarrea es severa, los síntomas son producidos por la mayoría de los alimentos, y está asociada a deshidratacidn y anormalidades electrolíticas (Kotler y Orenstein, 1998). Enc. intestinalis puede producir infecciones diseminadas, afectando principalmente el riñbn, pudiendo producir falla renal. Sin embargo, Enc. intestinalis puede llegar a producir la muerte a causa de una falla multisistémica (Kotler y Orenstein, 1998).

Los animales más comúnmente infectados por microsporidios son carnívoros jóvenes, conejos y otros roedores. Se cree que los humanos con mayor riesgo de infección son los que están comprometidos inmunológicamente. Muchas de las cosas que se conocen sobre estos parásitos están basadas en observaciones y estudios realizados con Enc. cuniculi. Los mamíferos infectados con microsporidios pueden presentar tres diferentes tipos de reacciones:

1. Hospederos jóvenes que desarrollan una enfermedad aguda que a menudo es letal 2. Hospederos adultos inmunocompetentes que desarrollan infecciones crónicas y subclínicas 3. Hospederos inmunodeficientes que desarrollan infecciones clínicas que pueden ser letales

en ciertas circunstancias

Las infecciones en humanos más conocidas pertenecen al tipo 3 y usualmente se presentan en pacientes con recuentos de linfocitos CD4+ menores a 100/mm3 (Orenstein, 1991). Se ha observado que la respuesta inmunológica del hospedero es crítica para mantener una relación balanceada entre el parásito y el hospedero; una respuesta baja o muy aumentada altera la relación y puede resultar sumamente dañina para el hospedero. Los niveles de IgG se elevan dentro de las primeras dos semanas de la infección, mientras los de IgM alcanzan su pico a las 5-6 semanas y se cree que persisten de por vida. Se ha observado en animales que niveles altos de inmunoglobulinas coinciden con la presencia de microsporidios. En humanos inmunocompetentes se han encontrado niveles altos de anticuerpos, pero no se ha podido relacionar con la presencia de esporas de estos parásitos, mientras que los pacientes HIV positivos presentan una respuesta sumamente variable a la infecci6n (Didier et al, 1998). La respuesta celular es un poco más confusa, pero se supone que los linfocitos secretan citoquinas y otros factores estimulantes de macrófagos (Schmidt y Shadduck, 1984). Existen varias observaciones que sugieren que los linfocitos T específicos juegan un papel muy importante en la resistencia a la infección por microsporidios (Didier et al, 1998).

Las respuestas de estos parasitos a los agentes terapkuticos es variable; mientras que las infecciones producidas por el género Encephalitozoon responden muy bien a la Fumagalina (Enc. hellem) y al Albendazol (Enc. intestinalis), la infección por Ent. bieneusi es problemática ya que no existe ninguna droga efectiva y solamente se han obtenido resultados muy limitados como respuesta al tratamiento con Albendazol (Kotler y Orenstein, 1998; Didier E, com. pers.) En este caso, lo Único que puede hacerse es someter al paciente a una terapia de reposición de electrolitos y nutrientes, ya que la diarrea producida por este organismo puede ser sumamente debilitante. De aquí, la importancia de identificar correctamente al organismo causante de la infección, para poder establecer correctamente la terap2utica a utilizar.

Durante mucho tiempo la confirmación del diagnóstico de microsporidiosis debía hacerse por microscopía electrónica de transmisión. Aún ahora, esta tecnologia es necesaria ya que la clasificación se basa en características ultraestructurales, como el tamaño y morfología de las esporas, el número de vueltas que el filamento polar da en el interior de la espora, el ciclo de vida y la relacibn hospedero-parásito (Weiss y Vossbrinck, 1998). Sin embargo, debido a la necesidad de obtener un diagnóstico rápido, confiable y sencillo, se han ido desarrollando nuevas pruebas para identificar estos parásitos. El primer caso diagnosticado en humanos fue en un niiío de 9 años a quien se le aisló Enc. cuniculi de orina y liquido cefalorraquídeo (Matsubayashi et al, 1959); con el tiempo, se han desarrollado pruebas de diagnóstico serológico por lnmunofluorescencia Indirecta utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales, inmunoensayos con carbón, y ELlSA (Hollister y Canning, 1987; Abdalla et a l 1994). Para el diagnóstico de infecciones intestinales inicialmente se utilizaban coloraciones en biopsias, que daban resultados variables (Beauvais et al, 1993) hasta que se desarrollaron modificaciones a la coloración tricrómica y aplicaciones de tinciones fluorescentes que detectan las esporas directamente en las heces, sin necesidad de realizar procedimientcrs invasivos (Weber et al, 1992; van Gool et al 1993). Actualmente la tinción más utilizada es Ig tricrómica modificada por Weber et al (1 992), aunque recientemente se han desarrolladq otras coloraciones que disminuyen el tiempo de tinción de la tricrómica (Didier et al, 1995a) o'la utilizan como base para otras coloraciones (Moura et al, 1996; lgnatius et al, 1997).

Todas las tinciones anteriormente mencionadas sirven para diagnosticar la presencia del parásito en heces; sin embargo, para identificar la especie causante de la enfermedad aun es necesaria la microscopía electrónica de transmisión, ya que, como se mencionó anteriormente, esta permite observar características ultraestructurales específicas de cada organismo. Actualmente se están aplicando tecnologías que utilizan la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para identificar las especies a partir de las heces (Fedorko et al, 1995; Del Aguila et al, 1998; Rinder et al, 1998). Además, esta técnica ha permitido establecer que existe cierta diversidad genética, al identificar cepas distintas de Enc. cuniculi y Ent. bieneusi, lo cual permitiría en cierto momento establecer las fuentes de infección para el humano (Didier et al, 1995b; Liguory et al, 1998).

3.1 General lmplementar en Guatemala los métodos de diagnóstico molecular y de coloración de los microsporidios, lo cual favorecerá y mejorará el diagnóstico y tratamiento de las diarreas no explicadas en niños. - Establecer la presencia de microsporidios en niños desnutridos en Guatemala - Identificar las especies causantes de microsporidiosis en Guatemala - lmplementar las pruebas como servicio de diagnóstico de la enfermedad

3.2 Específicos Entrenar personal en la identificación de microsporidios por técnicas moleculares y de tinción. - Entrenamiento en el Centro Regional de Investigación en Primates de la Universidad de

Tulane. lmplementar las técnicas de tinción y PCR en los laboratorios de Microbiología del INCAP. - Adquisición de los Útiles necesarios para realizar los procedimientos - Montaje y estandarización del PCR y las coloraciones en los laboratorios - Entrenamiento al personal técnico de la institución

Determinar la efectividad del PCR como método de diagnóstico en muestras de archivadas - Establecer la presencia de microsporidios por tinción y PCR en las muestras obtenidas

en Santa María de Jesús - Comparar los resultados obtenidos por las diferentes técnicas y establecer diferencias

El presente trabajo fue una investigación descriptiva con transferencia de tecnología. Se utilizaron las técnicas de tinción siguientes: tricrómica modificada, Gram-cromótropo y ácido resistencia. También se utilizó la técnica de PCR para establecer la presencia de los parásitos y confirmar su especie.

4.1 Obtención de las muestras Se realizaron tres fases distintas. En la primera se hizo un análisis retrospectivo

estableciendo la presencia de esporas y10 ADN de microsporidios en las muestras de heces del estudio realizado por el INCAP en 1988 en Santa María de Jesús (Sacatepequez), que fueron preservadas en congelación. En la segunda fase se recolectaron durante el primer semestre de 1999 muestras de heces de los niños asistentes al Hospital Nacional de San Marcos. En la tercera fase se recolectaron durante el primero y segundo semestre de 1999 muestras de heces de niños asistentes al Hospital General San Juan de Dios.

4.2 Recolección de las muestras Se recolectaron muestras de heces de niños menores de 5 años asistentes a las

instituciones mencionadas. Las muestras fueron procesadas de la siguiente manera: Se agregó porciones de la muestra a dos recipientes: uno con formalina al 1 O%, porción a la que se le realizó la tinción de Ziehl Neelsen modificado (Pratdesaba, 1991; Garcia y Bruckner, 1993), la coloración tricrómica modificada (Didier et al, 1995a), y la tinción de Gram-cromótropo (Moura et al, 1996) para establecer la presencia de esporas de microsporidios. El otro recipiente contenía dicromato de potasio al 2.5%; esta porción se analizó con la prueba de PCR.

Al inicio del estudio se realizó un entrenamiento en los laboratorios del Centro Regional de Investigaciones en Primates de la Universidad de Tulane para preparación y realización del PCR y las técnicas de coloración. Este personal estuvo a cargo de la implementación de ambas tecnologias en los laboratorios del Microbiología y Virologia del INCAP.

4.3 Coloraciones:

A. Coloración de Ziehl Neelsen modificada Realice un frote delgado de las heces y dejar secar a temperatura ambiente. Fije el frote al calor y dejar enfriar Coloque en una bandeja y cubrirlo con fucsina básica fenolada según Kinyoun Caliente con una llama hasta que saque vapores blancos y dejar por 5 minutos Lave con agua de chorro Decolore con alcohol-ácido o ácido sulfúrico al 5% por 1 minuto. Repetir Lave con agua de chorro Cubra con azul de metileno por 1 minuto. Lave con agua de chorro y dejar secar a temperatura ambiente Observe al microscopio con aumento 100X

B. Coloración tricrómica modificada Realice un frote delgado de las heces y dejar secar a temperatura ambiente Fije en metano1 por 5 minutos Coloque en cromótropo 2R a 37°C por 30 minutos Lave con alcohol-&cid0 por 10 segundos Lave con alcohol etilico 95% por 10 segundos Coloque en alcohol etilico 100% por 5 minutos Coloque en xileno por 5 minutos Deje secar a temperatura ambiente Observe al microscopio con aumento 100X

C. Coloración Gram-cromófm~o Realice un frote delgado de las heces y dejar secar a temperatura ambiente Coloque en cristal violeta 1 % por 30 segundos Lave en agua de chorro Coloque en solución de yodo por 30 segundos Decolore y lavar Coloque en cromótropo 2R al 1 % por 1 minuto Lave con agua de chorro y dejar secar a temperatura ambiente Observe al microscopio con aumento 100X

4.4 Aislamiento de ADN de microsporidos de las heces (Orlandi y Lam~el. 2000)

A. Preparación, obtención v purificación del ADN Homogenice la muestra y transferir 1 ml a un tubo de microcentrifuga Centrifugue a 14,000 rpm por 2-3 minutos Descarte cobrenadante Lave 6 veces en agua destilada centrifugando a 14,000 rpm por 3 minutos Decante el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 100-500 p1 de agua destilada dependiendo del tamaño del sedimento Resuspenda la muestra y homogenizar en vórtex Transferiera 5 p1 de muestra a los filtros FTA Coloque los filtros con las muestras sobre una placa caliente a 60°C por 15 minutos colocando una hoja de blotting paper o papel filtro entre la muestra y la placa para evitar que se queme Coloque los filtros con las muestras a un recipiente plástico y realice 2 lavados con buffer FTA de dos minutos cada uno con agitación. Realice dos lavados con buffer TE de 2 minutos cada uno con agitación Coloque en la placa caliente durante 45 minutos Con un sacabocados separe el filtro con la muestra y colóquelo en un tubo para PCR

4.5 Reacción en cadena de la ~olimerasa (PCR) Para realizar la amplificación del ARN nbosomal de los genes de microsporidios, se utilizan cebadores seleccionados de secuencias conservadas para el phylum Microspora. Las secuencias de estos cebadores con: MicroF (5'-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA-3') MicroR (5'-TAATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAAC-3'); con esto se obtiene un producto de 1,300 pares de bases. Si alguna de las muestras sale positiva con estos cebadores deben utilizarse cebadores específicos para identificación de genero y especie. Las especies importantes en humanos se detectan con las siguientes secuencias:

Entemytozzon bieneusi EBlEF 1 (5'-GAAACTTGTCCACTCCTTACG-3') y EBlER (5'- CAATGCACCACTCCTGCCATT-3'); con esto se obtiene un producto de 607 pb. Encephalitozoon cuniculi ECUNF 1 (5'-ATGAGAAGTGATGTGTGTGCG-3') y WCUNRl (5-TGCCATGCACTCACAGGCATC-3'); con esto se obtiene un producto de 549 pb. Encephalitozoon hellem EHELFI (5'-TGAGAAGTAAGATGTTTAGCA-3') y WHELR1 (5'- GTAAAAACACTCTCACACTCA-3') con lo que se obtiene un producto de 547 pb.

La amplificación genética por PCR se realiza en reacciones de 100 pL conteniendo 10% de leche descremada, 0.05 pM de cada cebador, 0.2 mM de cada dinucleótido, 10 mM Tris-HCI pH 9.0, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 1 unidad de Taq DNA polimerasa, aproximadamente 100 ng de DNA genómico y 100 pL de aceite mineral. Las reacciones de PCR se realizan en el termociclador Perkin Elmer. Se hacen 35 ciclos con el perfil siguiente:

30 segundos a 94°C 30 segundos a 55°C 90segundosa72"C al terminar los 35 ciclos se hace una extensión final a 72°C por 10 min

Realice electroforesis en geles con 1.2% de agarosa con 2.6 pI de bromuro de etidioI100 ml cargado con alícuotas de 5 pI de los productos y visualice los productos con un transiluminador UV. Guarde el resto de los productos de PCR a 4°C

5. RESULTADOS

5.1 Análisis de muestras por coloración

Se analizaron un total de 242 muestras distribuidas de la siguiente forma: 100 provenientes de las muestras preservadas en congelacidn y que fueron colectadas en Santa María de Jesús en 1988-1 990 142 muestras correspondientes a nitíos desnutridos provenientes del Hospital General San Juan de Dios, Hospital Nacional de San Marcos y Colonia Infantil de San Juan Sacatepéquez.

Las muestras se analizaron utilizando las coloraciones de Kinyoun, tricrdmica modificada, calcoflúor y gram cromdtropo. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Kinyoun: no se logrd identificar esporas de microsporidios en ninguna de las muestras observadas.

Calcoflúor: 7 sospechosas que debieron ser confirmadas con PCR y 235 negativas Tricrdmica modificada: 5 sospechosas que debieron ser confirmadas con PCR y 237 negativas Gram cromótropo: 3 sospechosas que debieron ser confirmadas con PCR y 239 negativas

5.2 Evaluación de coloraciones

Las esporas se titíen de diferente color con las diferentes coloraciones. Con la coloracidn tricrdmica se titíen de color rojo sobre fondo verde (Figura 1); con la coloracidn de Gram se titíen de color azul sobre fondo claro (Figura 2) y con la coloración de Calcoflúor se observan celestes sobre fondo oscuro (Figura 3).

Figura 1: Microsporidios tetíidos con tincidn tricrdmica. La flecha setíala un grupo de esporas teñidas de rojo

Figura 3: Microsporidios teñidos con Calcoflúor. La flecha sefíala dos esporas fluorescentes teñidas de color azul 1

Para lograr determinar la sensibilidad y especificidad de las coloraciones se realizaron los experimentos sig u ientes:

1. De las cepas de microsporidios obtenidas por cultivo, se realizaron frotes con 20 u1 de 5 diluciones diferentes y se titíeron con las 4 coloraciones los resultados son presentados en la Tabla 1. En cada frote se observaron 100 campos con objetivo de inmersión y se contaron las esporas observadas. Los frotes fueron realizados por duplicado y observados por dos personas distintas.

TABLA No. 1 Evaluacibn de coloraciones

2. Después de obtener estos resultados se decidió utilizar las coloraciones de 150 y 15 esporaslul para evaluar la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de las coloraciones. Los resultados se muestran en las Tablas 2 a 7. Para realizar esto se hicieron 30 frotes de cada concentracion, 25 de ellos positivos y 5 negativos. Esto dio un total de 180 frotes.

Dilución utilizada1 Coloraciones

Tricrómica Calcofluor Gram Cromótropo Kinyoun

15 esporaslul (se indica cantidad total de esporas observada) 16 3 13 O

1.5 x 10' esporaslul (se indica cantidad total de esporas observada)

150 esporaslul (se indica cantidad total de esporas observada)

30 2 5 22 1

3 esporaslul (se indica cantidad total de esporas observada)

600 700 500 O

1 1 18 30 1

3 1 2 O

1300 1200 1000 1

1 esporalul (se indica cantidad total de esporas observada)

600 700 650 O

3 2 2 2

2 1 1 1

3 2 1

, O

TABLA No. 2 Coloración tricrómica modificada

Concentración: 16 esporaslpl

Los resultados que no concordaron están resaltados en negrita. Par@ esta coloración y a esta concentración de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:

Positivos: Negativos: Falsos positivos: Falsos negativos: Sensibilidad: Especificidad: Valor predictivo positivo: Valor predictivo negativo:

- . . . -. r '

-. 1 . . P\ DF :/ck,,.

:- ,<)N#,.. . .. p l.:

' r ;,,y ..) -.,q, ..,

, ")

: ?<, 2, -...- ..-. 1 - -5

* 7 Q (; 2 ,; ' S ? , < t ' . k & l t , < , .,,

e. ; 8 . * , , : r

:c.: c., ¿ JMiHxd;/$y :: '. . ' - . -- . , .

i 1 -. ,' < < .%>.'\, , . '. ,. - .,

. . h ' \ . ,; ,y\ ,--- .:' , 5 :'

\,..(- iv,$,i:, !< -,.d.'

\.---H.

TABLA No. 3 Coloración tricrómica modificada


Los resultados que no concordaron están resaltados en negrita. Para esta coloración y a esta wncentracidn de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:

Positivos: Negativos: Falsos positivos: Falsos negativos: Sensibilidad: Especificidad: Valor predictivo pos¡ tivo: Valor predictivo negativo:

TABLA No. 4 Coloración Gram cmmotmpo Concentración: 16 esporaslpl

Los resultados que no concordaron están resaltados en negrita. Para esta coloración y a esta concentración de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:


TABLA No. 5 Coloración Gram cromotropo Concentración: 161 esporaslpl

Los resultados que no concordaron están resaltados en negrita. Para esta coloración y a esta concentraci6n de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:


TABLA No. 6 Coloración Calcofluor


Lámina No. Resultado práctico Resultado teórico

32 33 34 35 36 37 38 39 40 4 1 42

Los resultados que no concordaron estan resaltados en negrita. Para esta coloración y a esta concentraci6n de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:

43


Negativo Negativo Positivo

Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

Negativo Positivo 44 Positivo Positivo

TABLA No. 7 Coloración Calcofluor

Concentración: 161 esporasl~l

Los resultados que no concordaron están resaltados en negrita. Para esta coloración y a esta concentración de esporas se obtuvieron los siguientes resultados:


5.3 Análisis de muestras por PCR

Para poder analizar las muestras fue necesario realizar una estandarización de la técnica. Las primeras 15 muestras se corrieron en duplicado; una de las muestras había sido inoculada con esporas de microsporidios (más de 1 x l o6 esporasJuL) para asegurar que la muestra diera una respuesta positiva. Estas muestras se corrieron junto con un estandar conocido, siguiendo el procedimiento sugerido por Oriandi y Lampel (2000) (figura 1 y 2)

Figura No. 2: Gel correspondiente al total de 15 muestras corridas junto con un control inoculado. En la primera fila (izquierda) se corrieron

* No se aplico muestra ** Todas estas son muestras problema, que no fueron inoculadas con esporas. Las muestras control inoculadas con esporas se encuentran en la segunda fila (derecha).

Figura No. 2 (cont): En la segunda fila (derecha) se corrieron las siguientes muestras:

Después de realizar la estandarización de la técnica de PCR, se procedio a correr las muestras de los pacientes. En las figuras 3 a 9 se muestran los resultados obtenidos. Todas las muestras corridas dieron resultado negativo. Es importante hacer notar que en todos los geles se incluyeron controles positivos y negativos.


Figura No. 3: Gel correspondiente muestras corridas a partir de la muestra 16. En la primera fila (izquierda) se corrieron las siauientes muestras:

23 18 33 24 19 Ctrl Pos

"

~ ~

1 0 125 120 1 g / Ctrl Ne Todas estas son muestras ~roblema. que no fueron inoculadas con esporas. ' i

Muestra 26 27

Pozo 1 2

Muestra 16 17

Pozo 11 12

Figura No. 4 Gel correspondiente muestras corridas a partir de la muestra 51. En la primera fila (izquierda) se corrieron las

~ o d a s estas son muestras problema, que no fueron inoculadas con esDoras.


l


Figura No. 5: Gel correspondiente muestras corridas a partir de la muestra 85. En la primera fila (izquierda) se corrieron las

Todas estas son muestras problema, que no fueron inoculadas con esDoras.


Figura IVo. 7: Gel correspondiente muestras corridas a partir de la muestra 155. En la primera fila (izquierda) se corrieron las


Instituto de Nutrición de Centro América Panamá ...

Documents

Transcript of Instituto de Nutrición de Centro América Panamá ...