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INSTITUTO DOMINICANO DE

INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS Y

FORESTALES

7mo Congreso de la Sociedad Dominicana de

Investigadores Agropecuarios y Forestales (SODIAF)

PROYECTO

CONIAF-UASD

Bávaro, Punta Cana,

República Dominicana.

10 de noviembre de 2016

“Efectividad in vitro de 18 cepas nativas de Trichoderma spp.

en el manejo de Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Athelia

rolfsii y Phytophthora capsici, patógenos de suelos bajo

ambiente protegido

Socorro García, Graciela Godoy Lutz, Colmar A. Serra

[email protected]

mailto:[email protected]

INTRODUCCIÓN

El cultivo de ají (Capsicum annuum L.) en invernaderos de la

R. D., es afectado por fitopatógenos de suelos, entre los

cuales están:

• Fusarium spp.,

• Rhizoctonia solani,

• Phytophthora capsici y

• Athelia rolfsii.

El uso continuo de fungicidas químico-sintéticos

• Aumento aparición resistencias, • Contaminación ambiental

• Incremento en el costo de producción

• Disminución rentabilidad y

• Presencia residuos en cosechas

(García et al, 2006).

INTRODUCCIÓN

La utilización del manejo biológico con el hongo Trichoderma

es una de las herramientas mas promovidas para el control de

los fitopatógenos de suelos (Cholango 2009).

Cepas de Trichoderma spp. suprimieron significativamente en

platos de Petri el crecimiento micelial de Fusarium solani,

Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp., y Athelia

rolfsii (Moya et al 2003) .

INTRODUCCIÓN

En invernadero de San José de Ocoa, Hubert (2008) reportó la

presencia en agua de riego y sustratos utilizados, los hongos:

• Fusarium (100%),

• Phythophthora (50%) y

• Rhizoctonia (41.5%)

En República Dominicana existen aprox. 520 hectáreas de

vegetales en invernadero, dedicadas principalmente:

• Ajíes (70%),

• Tomates (10%),

• Pepinos (15%),

• Hierbas aromáticas (5%), (PROMEFRIN, 2011).

En el año 2014 la producción estimada de los invernaderos fue

de 31.77 mil toneladas, 21.27 mil se exportaron y generaron

US$ 52.8 millones; el resto se comercializó internamente y

generó RD$ 449.0 millones (PROMEFRIN, 2014).

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

El uso de Trichoderma spp. para el manejo de estos

fitopatógenos, evita rechazo de exportaciones por

contaminación con residuos de plaguicidas. También se

podrían reducir los costos de producción (García et al. 2006).

El empleo de cepas nativas de Trichoderma spp. tiende a ser

mas ventajoso que las introducidas:

• Establecimiento de microempresas nacionales,

• Ahorrarían divisas, obtención de alimentos inocuos,

• Adaptadas al agroecosistema local.

OBJETIVO

Determinar el efecto antagonista in vitro de 18 cepas nativas y

2 comerciales de Trichoderma spp. comparado con fungicidas

comerciales uno orgánico y otro químico-sintético, sobre

fitopatógenos de suelos.

MATERIALES Y MÉTODOS

• Localización del estudio:

Estación Experimental del Instituto

Dominicano de Investigaciones

Agropecuarias y Forestales (IDIAF)

en Mata Larga, San Francisco de

Macorís, República Dominicana.

Altitud 150 msnm

Pluviometria

anual

1,450 mm

Temperatura

promedio

26.2 ˚C

LABORATORIO DE PROTECCIÓN VEGETAL

• Microorganismos antagónicos:

18 cepas nativas y 2 comerciales (introducidas) de Trichoderma.

Las nativas proceden de aislamientos en suelos, sustratos y raíces en

invernaderos de las provincias: La Vega, San José de Ocoa y Espaillat.

Fueron identificadas por secuenciación de la región ITS rADN.

Obtenidas bajo el proyecto, "Determinación de Alternativas Biológicas para

el Control de Patógenos de Suelos en la Producción de Vegetales en

Invernadero“.


a b c

d e f


Fig. 1. a)T.asperellum-1A; b) Tx-1D (no identificada); c)T. asperellum-2F; d)T. asperellum-6B; e) T. asperellum-

7A; f) T. asperellum-10A;

g h i

j k l


Fig. 2. g) T. asperellum-11A; h) T. longibrachiatum-12A; i) T. harzianum-13A; j) T. harzianum-16B; k) T.

harzianum-19B, l) T. asperellum-22C;

Fig. 3. m) T. asperellum-25B; n) T. asperellum-27A; o) T. asperellum-28A; p) T. asperellum-31C; q)

T.asperellum-36A; r) T. asperellum-37B.

m n o

p q r


• Material biológico comercial:

Fig. 4. T. lignorum (Mycobac ® ) Fig. 5.T. harzianum (PHC PlantShield ® )


Tabla 1. Fitopatógenos utilizados en los ensayos

Especie Código del ensayo Lugar de procedencia

Fusarium solani Fs Hermanas Mirabal

Rhizoctonia solani Rs Hermanas Mirabal

Athelia rolfsii Ar Hermanas Mirabal

Phytophthora capsici Pc Espaillat


Fig. 6. a) F. solani; b) R. solani; c) P. capsici; d) A. rolfsii

a b

c d



• Fungicidas:

Aceites orgánicos (Biomaster®), a base de varios aceites de plantas:

• aceite de clavo (6 %),

• aceite de sésamo (5 %),

• aceite de romero (3 %)

• aceite de tomillo (3 %),

• total aceites de tipo 25B (17 %).

Un fungicida químico sintético:

• (i.a. azoxystrobin o azoxistrobina);

• nombre comercial Criba 25 SC® (Mahomoya Lifesciences Pvt.. Ud., India).


• Medio de cultivo

Papa Dextrosa Agar (PDA)

-Antibiótico (Amoxicilina) 2 ml/litro

-Acido láctico (85%): 30 gotas/litro

Plato Petri: 86 mm de diámetro con 10 ml de PDA

Cultivo: Discos de micelios de 5 mm de diámetro

Incubación: 25-30°C. en la oscuridad


Figura 7 Cultivo dual

A. rolfsii T. asperellum-10A

• Tratamientos:

Tabla 2. Descripción de los tratamientos en laboratorio (40 tratamientos)

n Tratamientos Descripción

4 Testigos relativos de patógenos Cada patógeno cultivado frente a un disco PDA

solo.

20 Trichoderma vs. patógenos Cada cepa de Trichoderma spp. enfrentada con

cada patógeno.

8

Aceites orgánicos vs patógenos

Cada patógeno sembrado en medio de cultivo

(PDA) dos dosis de los aceites orgánicos.

8 Fungicida químico-sintético vs.

patógenos

Cada patógeno enfrentado con el fungicida

químico sintético en un disco de papel filtro, y

además sembrado en PDA una dosis del fungicida

químico.


• Número de ensayos

El estudio se realizó en cuatros ensayos:

No.

Tratamientos

Patógenos Cepas nativas Cepas comerciales Fungicida

químico

Aceites

orgánicos

1 F. solani

T. asperellum (13)

T. harzianum (3)

T. longibrachiatum (1)

Trichoderma sp.

(1 no id. x)

T. lignorum (Mycobac ®10 WP)¹ T. harzianum

(PHC PlantShield® 1.15 WP)²

Azoxistrobina

(Criba® 25 EC) ³ Biomaster®4

2 R. solani " " " " 3 A. rolfsii " " " " 4 P. capsici " " " "

Tabla 3. Tratamientos en los ensayos con los cuatros hongos

fitopatógenos.

Leyenda: ¹Laverlam, S. A., Colombia, 2Plant Health Care, México, 3Mahomoya lifesciences Pvt. Ud., India, 4Global Bio Tecnologies &

Trading LLC, USA


• Diseño experimental

Completamente al azar (DCA)

4 repeticiones.

Unidad experimental: 1 plato de Petri.



• Variables evaluadas:

1. Crecimiento micelial radial en mm.

Cada 24 horas hasta 192 horas

Figura 8. Crecimiento micelial radial.

Antagonista Patógeno


……Variables evaluadas

2. Nivel de supresión (Ns) del patógeno (%)

Se utilizó la fórmula de mortalidad corregida de Abbott (1925) modificada:

Ns (%) = (Cpt-CpT)

100

Cpt

donde :

Cpt= Crecimiento del patógeno en el testigo.

CpT=Crecimiento del patógeno vs. Trichoderma sp.



Se realizó análisis de varianza no paramétrica Kruskal-Wallis,

p.≤5 %, al no cumplir con los supuestos y análisis de

contrastes ortogonales, (programa estadístico Infostat 2013, Univ. Nac.

Cordoba, Argentina).

• Análisis Estadístico

Fig. 9. Porcentaje supresión crecimiento micelial de F. solani en presencia de los diferentes

tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas.

192 h

69.8 cdefgh

76.3 h

72.9 efgh

70.8 defgh

67.3 abcdef

74.0 efgh

75.3 fgh

67.2 bcdefgh

66.2 abcde

73.1 efgh

76.4 gh

67.3 cdefgh

76.3 h

68.5 bcdefg

69.7 cdefgh

72.9 efgh

59.4 abcde

71.0 defgh

69.6 cdefgh

21.3 a

26.7 ab

60.7 abcd

32.3 ab

52.7 abc

CV 9.54

p= 0.0001***

RESULTADOS

RESULTADOS

b a

c

Fig. 10. Cultivo dual entre T. asperellum- 28A (a) y F. solani (b);

Testigo= F. solani (c) a las 192 horas

Fig. 11. Cepas de Trichoderma spp. vs. Fusarium solani

RESULTADOS

Tabla 9. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial de

F. solani en presencia de los diferentes tratamientosa las 48, 72 y 192 horas.

# Contrastes

(Gupo 1 vs. Gr. 2)

Tratamientos

(Gr. 1 vs. Gr. 2)

Significancia (P=)

48 h 72 h 192 h

1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas

comerciales

T1-18, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios % 14.3-61.7 30.0-53.8 70.8-49.8

2 T. asperellum vs.

Fungicidas comerciales

T1, 3-7, 12-18 vs T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios % 13.5-67.7 32.6-53.8 71.7-49.8

3 T. harzianum vs.


T9-11, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios % 8.1-61.7 20.2-53.8 68.0-49.8

4 T. asperellum vs.

T. harzianum

T1, 3-7, 12-18 vs. T9-11, 24 <0.0001*** 0.0002*** 0.0552 ns

Promedios % 13.5-8.1 32.6-20.2 71.6-68.0

P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.

RESULTADOS

Fig. 12. Porcentaje supresión crecimiento micelial de R. solani en presencia de los

diferentes tratamientos en un périodo de 24 hasta 192 hora

a

192 h

75.6 defgh

78.1 gh

71.1 abcde

75.6 efgh

74.7 defgh

74.4 bcdefgh

76.4 fgh

75.2 defgh

71.5 abcde

74.8 defgh

74.4 cdefgh

74.7 defgh

77.2 fgh

74.0 bcdefg

70.3 abcd

78.0 gh

69.5 abcde

73.0 abcdef

78.0 h

51.2 abc

-0.03 a

78.8 fgh

35.3 a

48.8 ab

CV 4.16

p= 0.0001***

RESULTADOS

Fig. 13. Cultivo Dual entre T. asperellum-1A (a) y R. solani (b);

Testigo = R. solani (c) a las 192 horas

a

b c

RESULTADOS

Fig. 14. Cepas de Trichoderma spp. vs. Rhizoctonia solani

RESULTADOS

Tabla 7. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial

de R. solani en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192 horas

#

Contrastes

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Tratamientos

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Significancia (p=)

48 h 72 h 192 h

1 Trichodermaspp. vs.


T1-18, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 17.2-83.2 45.8-80.2 74.6-54.3

2 T. asperellum vs.


T1, 3-7, 12-18 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 17.6-83.2 45.7-80.2 74.9-54.3

3 T. harzianum vs.


T9-11, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios % 14.5-83.2 44.6-80.2 72.7-54.3

4 T. asperellum vs.

T. harzianum

T1, 3-7, 12-18 vs.

T9-11, 24

0.2824ns 0.5517ns 0.0124*

Promedios% 17.6-14.5 45.7-44.6 74.9-72.7

P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.

RESULTADOS

Fig. 15. Porcentaje supresión crecimiento micelial de A. rolfsii en presencia de los

diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas.

192 h

71.7 abcdef

67.3 abcd

73.7 cdefgh

79.3 ghi

70.1 abcde

77.7 fghi

76.1 efghi

81.3 hi

73.3 bcdefg

73.7 cdefgh

75.3 defghi

72.9 bcdefg

76.5 efghi

72.1 abcdef

76.1 efghi

77.7 fghi

52.2 abc

73.3 bcdefg

38.5 abc

-1.2 a

9.5 ab

95.2 i

85.7 fghi

100. i

CV 8.18

p= 0.0001***

RESULTADOS

Fig. 16. Cultivo Dual entre T. asperellum-22C (a) y A. rolfsii (b);

Testigo= A. rolfsii (c) a las 192 horas.

a b c

RESULTADOS

Fig. 17. Cepas de Trichoderma spp. vs. A. rolfsii

RESULTADOS

Tabla 8. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento

micelial de A. Rolfsii en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192

horas.

# Contrastes

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Tratamientos

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Significancia (p=)

48 h 72 h 192 h

1 Trichodermaspp. vs. Fungicidas

comerciales

T1-18, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 44.1-100.0 43.5-99.9 71.5-93.6

2 T.asperellum vs.


T1, 3-7, 12-18 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 39.0-100.0 45.9-99.9 74.6-93.6

3 T. harzianum vs.


T9-11, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 49.5-100 36.8-99.9 69.8-93.6

4 T. asperellum vs.

T. harzianum

T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, 24 <0.0001*** <0.0001*** <0.0043**

Promedios% 39.0-49.5 45.9-36.8 74.6-69.8

P: nivel de probabilidad; *** o **= significancia alta o moderada (P<0.001 o <0.01); ns= no significativo.

RESULTADOS

192 h

77.7 cdefgh

77.1 cdefg

73.0 abcd

80.7 ghi

71.3 abc

79.5 fghi

74.8 abcdef

80.1 ghi

74.7 abcdefg

76.5 cdefg

76.6 bcdefg

74.8 abcdef

77.7 cdefgh

74.2 abcdef

75.5 abcdefg

79.5 efghi

78.9 defghi

74.6 abcde

80.7 ghi

53.7 ab

41.5 a

88.9 hi

100. i

100. i

CV 3.39

p= 0.0001*** Fig. 18. Porcentaje supresión crecimiento micelial de P. capsici en presencia de los

diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas

RESULTADOS

Fig. 19. Cultivo Dual entre T. longibrachiatum-12A (a) y P. capsici (b);

Testigo P. capsici (c) a las 192 horas.

a b

c

RESULTADOS

Fig. 20. Cepas de Trichoderma spp. vs. P. capsici

RESULTADOS

Tabla 9. Análisis de contraste sobre el porcentajede supresión del crecimiento

micelial de P. capsici en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192

horas

# Contrastes

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Tratamientos

(Grupo 1 vs. Gr. 2)

Significancia (P=)

48 h 72 h 192 h

1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas

comerciales

T1-18, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 11.5-95.7 29.4-94.5 76.8-96.3

2 T. asperellum vs. Fungicidas

comerciales

T1, 3-7, 12-18 vs

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios% 13.6-95.7 27.0-94.5 76.3-96.3

3 T. harzianum vs. Fungicidas

comerciales

T9-11, 24 vs.

T21-23

<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***

Promedios % 5.3-95.7 32.9-94.5 77.1-96.3

4 T. asperellum vs.

T. harzianum

T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, 24 0.0129* 0.0151* 0.262 ns

Promedios % 13.6-5.3 27.0-32.9 76.3-77.1

P: nivel de probabilidad; *** o *= significancia alta o leve (P<0.001 o <0.05); ns= no significativo

RESULTADOS

Fig. 21. T- comercial PHC PlantSchield (T. harzianum) vs. fitopatogenos

RESULTADOS

Fig. 22. T-comercial Mycobac ( T. lignorum) vs. Fitopatogenos

RESULTADOS

Nivel de

Antagonismo

Fitopatógeno

F. solani R. solani A. rolfsii P. capsici

Unid. % Unid. % Unid. % Unid. %

Nulo ≤ 0

0 0 0 0 0 0 0 0

Bajo 1-25

0 0 0 0 0 0 0 0

Moderado 26-66 1 6 0 0 2 11 0 0

Alto 67-85 17 94 18 100 16 89 18 100

Muy alto ≥ 86 0 0 0 0 0 0 0 0

Total 18 100 18 100 18 100 18 100

Tabla 10. Cepas de Trichoderma spp. según el nivel de antagonismo

contra los fitopatógenos.

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Las cepas nativas de Trichoderma spp. resultaron efectivas in vitro contra los

fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici, mostrando niveles de

supresión desde moderado a alto.

Las cepas nativas y comerciales de Trichoderma spp. mostraron mayor efecto

antagónico que los fungicidas comerciales orgánicos y químico-sintéticos sobre los

fitopatógenos.

Las cepas nativas de Trichoderma spp. presentaron mayor efecto antagónico sobre

los fitopatógenos que las cepas comerciales T. harzianum y T. lignorum;

En los análisis de contraste, los grupos que mejores resultaron contra F. solani y R. solani fueron Trichoderma spp., T. asperellum y T. harzianum a las 192 horas. En cambio los fungicidas comerciales (azoxistrobina y aceites vegetales) fue el grupo que mayor eficiencia presentó contra A. rolfsii y P. capsici.

RECOMENDACIONES

Realizar experimentos probando la eficiencia de los aislados de Trichoderma frente a los fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici a nivel de invernadero y campo.

Evaluar las mismas y otras cepas nativas de Trichoderma spp.,

in vitro y bajo condiciones de ambiente protegido, para el

control de hongos fitopatógenos de suelo.

AGRADECIMIENTOS

A Dios ante todo por haberme dado la fortaleza y perseverancia necesarias

para poder alcanzar esta meta y llegar a feliz termino.

Consejo Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (CONIAF).

A mis asesores Dr. Colmar Serra y la Dra. Graciela Godoy de Lutz.

Al Ing. Elpidio Avilés por haberme permitido realizar esta investigación dentro

del proyecto del cual era líder financiado por el CONIAF, gracias.

A la Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD).

Al Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales

(IDIAF).

A todos los profesores.

A todos mis compañeros de maestría.

REFERENCIAS

García, R; Riera, R; Zambrano, C; Gutiérrez, L. 2006.Desarrollo de un fungicida biológico a base de una cepa de

Trichoderma harzianum proveniente de la Región Andina Venezolana. Fitosanidad. 10(2): p. 115-121.

García, S., Moya, JD., Núñez, P., Andújar, F., Avilés, E. 2013. Efectividad in vitro de cepas de Trichoderma spp. en la

supresión del crecimiento micelial fitopatogenos de suelos. 6to. Congreso SODIAF. Resúmenes. Juan Dolio, San

Pedro de Macorís. República Dominicana. p.18.

García P. S., Moya J.D., Avilés E., Andújar F., Núñez P.A. 2015. Efectividad de Trichoderma spp. sobre el crecimiento

micelial de fitopatógenos de suelo en plato Petri. Sociedad Dominicana de Investigadores Agropecuarios y Forestales,

Revista APF, 4(2).

Hubert, R. 2008. Diagnostico de manejo e identificación de microorganismos patógenos presentes en el cultivo de ají

(Capsicum annuum L.) bajo invernadero en San José de Ocoa, República Dominicana. Tesis para optar por el título de

Máster en Ciencias Manejo Integrado de Plagas. Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD). 70 p.

Moya, J.D.; García, S.; González, J.L. 2003. Efecto de Trichoderma spp. en el crecimiento micelial de hongos fitopatógenos

de suelo en platos de Petri. XLIX reunión anual del Programa Cooperativo Centroamericano para el Mejoramiento de

Cultivos y Animales (PCCMCA), desde 27 abril al 3 mayo, Resúmenes, p. 68. La Ceiba, Honduras.

Samuels, G. 2004.Trichoderma: a guide to identification and biology. United States Department of Agriculture.Agricultural

Research Service.Systematic Botany and Mycology Laboratory.Beltsville, USA. 40 p.

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