Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Proyecto de investigación curricular

Que como uno de los requisitos para obtener el título de:

Químico Farmacéutico Industrial

Presenta:

Janeth Mora Zenil

En asesoría de:

Dra. Julia D. Toscano Garibay

Coasesoría:

Biol. Elizabeth Guarneros Bañuelos

México D.F. Enero de 2013

Obtención y cultivo de células troncales mesenquimales

derivadas de médula ósea de conejo e identificación por

RT-PCR.

El presente trabajo fue realizado en el laboratorio no. 5 de Medicina

regenerativa, del depto. de Investigación y Enseñanza del Hospital

Juárez de México bajo la asesoría de la Dra. Julia D. Toscano Garibay

y coasesoría de la Biol. Elizabeth Guarneros Bañuelos.

Agradecimientos

Como algunos de los que me conocieron recordaran, las palabras no eran algo que fluyera

fácilmente de mi boca, por lo que al leer estos párrafos puede que muy sencillos; sin embargo las

personas aquí mencionadas han participado de manera importante en mi formación y mi vida.

A mis padres.

Por haberme dado la oportunidad de vivir, cuidarme a lo largo de estos años, incluso cuando no lo

permito y además de permitirme conocer diferentes mundos.

A mis hermanas.

Por preocuparse por mi e intentar cuidarme.

A mis tios.

Principalmente a Rosa Reyna quien ha sido como una segunda madre y ha estado en los momentos

más difíciles.

A mi novio.

Julio Daniel por enseñarme un mundo de cosas nuevas, incluyendo el aprender a vivir. Por estar

conmigo en los momentos más difíciles de mi vida sin importar el peligro o las consecuencias, por

escucharme y apoyarme en todo momento, incluso cuando no lo permitía. También gracias a su

familia, la cual nunca lo alejo de mí y siempre me apoyo.

A mis amigos.

Susana, Amhed, Edgar, Alejandro, Claudía y Ana Laura que cuando los necesitaba siempre

estuvieron ahí a pesar de la distancia y las ocupaciones.

A mis profesores.

Elizabeth, Gerardo, Eliezer, Martha, Ma. Estela, Everardo, Dulce María, Lucia, Adela y Juan Arturo

los cuales marcaron mi estancia durante la carrera por su inteligencia, interés por los alumnos y

entusiasmo por compartir sus conocimientos con nosotros y muchos de ellos también su visión de la

vida.

A mi asesora.

Julia D. Toscano porque sin ella no hubiese sido posible este trabajo. A ella y Javier Flores por su

disposición y por compartir sus conocimientos conmigo.

Índice general

Índice de tablas y figuras .......................................................................................................................... i

Abreviaturas ............................................................................................................................................. ii

Resumen ................................................................................................................................................ iii

1. Marco teórico ......................................................................................................................................... 1

1.1 Introducción .......................................................................................................................... 1

1.2 Definición de células troncales .............................................................................................. 1

1.3 Clasificación de las células troncales .................................................................................... 1

1.4 Definición de células troncales mesenquimales (MSC) ......................................................... 2

1.5 Historia de las MSC .............................................................................................................. 3

1.6 Criterios de identificación de la Sociedad Internacional de Terapia Celular ........................... 3

1.7 Fuentes de obtención de las MSC ........................................................................................ 4

1.8 Aplicaciones clínicas ............................................................................................................. 5

1.9 Cultivo de MSC ..................................................................................................................... 5

1.10 Características de las MSC ................................................................................................. 6

1.10.1 Morfología............................................................................................................. 6

1.10.2 Fenotipo ............................................................................................................... 6

1.10.3 Genotipo ............................................................................................................... 6

2. Justificación .............................................................................................................................................................. 9

3. Objetivos ................................................................................................................................................................. 10

3.1 Objetivo general ................................................................................................................. 10

3.2 Objetivos particulares ....................................................................................................................... 10

4. Hipótesis ................................................................................................................................................................. 11

5. Parte experimental ................................................................................................................................................ 12

5.1 Materiales, reactivos y equipos .......................................................................................... 12

5.2 Metodología ....................................................................................................................................... 12

5.2.1 Aislamiento de MSC ............................................................................................. 12

5.2.2 Cultivo de MSC ..................................................................................................... 13

5.2.2.1 Primer protocolo ..................................................................................... 13

5.2.2.2 Segundo protocolo ................................................................................. 15

5.2.3 Extracción de RNA ............................................................................................................ 15

5.2.3.1 Homogenización ..................................................................................... 15

5.2.3.2 Separación de fases ............................................................................... 16

5.2.3.3 Aislamiento de RNA ............................................................................... 16

5.2.4 RT-PCR ................................................................................................................ 16

6. Resultados ............................................................................................................................................................. 19

6.1 Cultivos de MSC ................................................................................................................. 19

6.1.1 Células control ...................................................................................................... 19

6.1.2 Primer protocolo ................................................................................................... 19

6.1.1 Segundo protocolo................................................................................................ 20

6.2 Extracción de RNA............................................................................................................................. 26

6.3 RT-PCR .............................................................................................................................. 27

7. Discusión ................................................................................................................................................................ 28

8. Conclusiones.......................................................................................................................................................... 31

9. Bibliografía ............................................................................................................................................................. 32

10. Apéndice 1 ............................................................................................................................................................. 34

11. Apéndice 2 ............................................................................................................................................................. 35

i

Índice de figuras

Figura 1.- Desarrollo embrionario y clasificación de las células troncales. ........................................................ 2

Figura 2.- Células troncales mesenquimales. ................................................................................................... 3

Figura 3.- Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. ..................................................... 8

Figura 4.- Diagrama de flujo del aislamiento de MSC. .................................................................................... 13

Figura 5.- Diagrama de flujo del cultivo de MSC utilizando el primer protocolo. .............................................. 14

Figura 6.- Diagrama de flujo del cultivo de MSC utilizando el segundo protocolo............................................ 15

Figura 7.- Seguimiento del cultivo de células C33 (Control) durante 16 días. ................................................. 19

Figura 8.- Seguimiento del cultivo de MSC durante 16 días. ........................................................................... 20

Figura 9.- Cultivos de MSC al día 3 en medios de cultivo s/aane. ................................................................... 21

Figura 10.- Cultivos de MSC al día 9 en medios de cultivo c/aane y s/aane. ................................................. 22

Figura 11.- Prueba de viabilidad de las MSC, día 14. .................................................................................... 23

Figura 12.- Seguimiento a los largo de 9 días de los cultivos de MSC. ........................................................... 24

Figura 13.- Seguimiento a los largo de 15 días de los cultivos de MSC. ......................................................... 25

Figura 14.- RNA íntegro y resultados de las extracciones realizadas en el laboratorio ................................... 27

Figura 15.- Revelado de la RT-PCR en gel de agarosa al 2%.. ..................................................................... 27

Índice de tablas

Tabla 1.- Comparación de las tres principales fuentes de obtención de MSC.. ................................................. 4

Tabla 2.- Fenotipo de las MCS. ......................................................................................................................... 6

Tabla 3.- Composición de los diferentes medios de cultivo utilizados.. ............................................................ 14

Tabla 4.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de RT-PCR de un paso. ........................................................................................................................................................................ 17 Tabla 5.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados en la síntesis de cDNA.. ...................... 17 Tabla 6.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción de RT-PCR de dos

pasos.. ............................................................................................................................................................. 18

Tabla 7.- Rendimientos obtenidos experimentalmente para los diferentes cultivos obtenidos por conteo celular

usando citometría de flujo ................................................................................................................................ 26

Tabla 8. Análisis bioquímico del suero de ternera y fetal bovino de dos lotes distintos ................................... 29

ii

Abreviaturas

ADN Ácido desoxirribonucleico

BLAST Herramienta de búsqueda local de alineamiento básico

c/aane Presencia de aminoácidos no esenciales CD Grupo de diferenciación cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario DMEM Medio modificado de Dubelco DMSO Dimetilsulfóxido EDTA Ácido etilendiaminotetraacético FWD Primer iniciador GADPH Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (gen) HLA Antígeno leucocitario humano ISCT Sociedad Internacional de Terapia Celular mL Mililitro mM Milimolar µL Micromolar MOC Médula ósea completa MOF Médula ósea purificada con Ficoll-Paque MSC Célula troncal mesenquimal oct Octámero PBS Buffer de fosfatos PCR Reacción en cadena de la polimerasa RNA Ácido ribonucleico RNAm Ácido ribonucleico mensajero rpm Revoluciones por minuto RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa s/aane Ausencia de aminoácidos no esenciales SBF Suero fetal bovino TBE Buffer tris/borato/EDTA UFC-F Unidades formadoras de colonias de fibroblastos Uv Ultravioleta V Volts

iii

Resumen

Las células troncales o mejor conocidas como células madre son un grupo de células indiferenciadas con un

alto potencial proliferativo, capacidad de autorrenovarse y diferenciarse a distintos linajes celulares. Dentro de

este tipo de células se encuentran las células troncales mesenquimales (MSC), que son células troncales

adultas multipotentes, capaces de autorrenovarse, dar origen a diferentes tejidos mesodérmicos como: Hueso,

cartílago, músculo, células estromales, tendón, tejido adiposo y tejido conectivo, y tejidos provenientes de

otras capas embrionarias como: Cardiomiocitos, vasos sanguíneos, células nerviosas, pulmonares, islotes de

células beta pancreáticas y células epiteliales corneales (plasticidad).

En los últimos años el interés por las MSC ha crecido de manera importante, debido a sus posibles

aplicaciones clínicas. Éstas han sido muy estudiadas y se han generado diferentes y muy variados protocolos

de aislamiento y cultivo de las mismas. Si se revisa la literatura se encuentran cultivos en los que se utiliza

DMEM con diferentes variantes, como: presencia de piruvato, concentración de glutamina, concentración de

glucosa, factores de crecimiento, etc e incluso la utilización de otros medios, como Ham´s F10. También se

encuentran artículos donde la cantidad de suero fetal bovino es variable (10-50%) e incluso algunos donde se

sustituye el suero fetal bovino por suero de ternera o por gelatina. Además de esto en los protocolos

desarrollados los crecimientos celulares son pobres y se requiere de un tiempo muy prolongado para obtener

una concentración alta de células in vitro (generalmente 30 días), y en algunos casos las células nunca llegan

a crecer.Debido a lo anterior se busca optimizar este tipo de cultivos a las condiciones de trabajo del

laboratorio; así como caracterizar éstas células por medio de la reacción en cadena de la polimerasa con

transcriptasa invesa (RT-PCR).

Inicialmente se tomó como base el protocolo de aislamiento y cultivo propuesto por Soleimani (2009); sin

embargo, con este protocolo las células perdían refringencia, se agregaban y nunca adquirían la forma

fibroblastoide característica de las MSC. Por estas razones se decidió alargar el tiempo del primer cambio de

cultivo y aumentar el número de variables, como: Método de obtención, tipo de suero, concentración de

piruvato y glutamina y la presencia o ausencia de aminoácidos no esenciales. Con el segundo protocolo se

lograron aislar las células con morfología fibroblastoide y obtener las mejores condiciones para el cultivo de

las MSC: purificación de la médula ósea con Ficoll-Paque, y la composición del medio: DMEM + L-

GLUTAMINA (5.84mg/ml) + PIRUVATO (2.2 mg/ml) + AANE+FBS 15%.

No se logró caracterizar éstas células por medio de la RT-PCR por problemas con la estandarización de la

técnica; sin embargo, compañeros del laboratorio encontraron los antígenos de superficie característicos de

las MSC en los cultivos. Lo que nos indica que se encuentran MSC en los cultivos celulares obtenidos.

1

1. MARCO TEÓRCO 1.1 Introducción Las células troncales o mejor conocidas como células madre son un grupo de células indiferenciadas con un

alto potencial proliferativo, con capacidad de autorrenovarse y diferenciarse, características que se

comentaran más adelante. En los últimos años el interés por éstas células ha crecido de manera exponencial

debido a las expectativas que se tienen sobre sus posibles aplicaciones clínicas, principalmente en la

medicina regenerativa. A pesar de su importancia aún no se cuanta con un método estándar de obtención y

cultivo de las mismas, por lo que en el presente trabajo se buscar estandarizar la técnica de extracción y

cultivo; pero antes es necesario saber, ¿Qué son las células troncales?.

1.2 Definición de células troncales

Como se mencionó las células troncales son un grupo de células indiferenciadas con un alto potencial

proliferativo, que presentan dos características fundamentales:

1. Autorrenovación. Estas células pueden proliferar sin diferenciarse durante periodos de tiempo

prolongados. Además de automantener su población mediante división asimétrica, en la cual cada

célula troncal al dividirse produce dos células hijas; una que con las mismas características que la

célula madre y otra que se derivará hacia un determinado linaje (Perez y Lorenti, 2006).

2. Diferenciación. Pueden diferenciarse a distintos tipos de células especializadas (Flores y cols., 2006).

1.3 Clasificación de las células troncales Existen dos criterios de clasificación para éstas células: 1.- Con base en su capacidad de diferenciación:

Células troncales totipotenciales. Son capaces de producir tejido embrionario y extraembrionario

(placenta).

Células troncales pluripotenciales. Tienen con la capacidad de diferenciarse a células de tejidos

derivados de las tres capas embrionarias (endodermo, ectodermo y mesodermo).

Células troncales multipotenciales. Son capaces de diferenciarse a tejidos provenientes de la

misma capa embrionaria. Un ejemplo de este tipo de células son las contenidas en la médula ósea, las

cuales son capaces de generar todos los tipos celulares de la sangre y del sistema inmune.

Células troncales unipotenciales. Son capaces de diferenciarse únicamente en una línea celular.

Ejemplos de ésta son las células troncales linfoides, las cuales solo pueden generar linfocitos.

El óvulo fecundado es una célula troncal totipotente, el cual va perdiendo potencialidad a lo largo de su

desarrollo hasta llegar a ser una célula troncal unipotente; la cual únicamente tiene la capacidad de generar

un único tipo de células especializadas como: Hepatocitos, cardimiocitos, etc (figura 1).

2

2.- Con base en su origen (figura 1):

Células troncales embrionarias. Son células derivadas de la capa interna del blastocito en una etapa

anterior a la implantación en la pared uterina. Éstas son pluripotentes y pueden autoreplicarse; sin

embargo, actualmente son poco utilizadas debido al problema ético que representa trabajar con las

mismas. Además de esto se ha encontrado que producen tumores al administrarlas en modelos

animales (Kirschtein, 2001).

Células troncales adultas o somáticas. Son células indiferenciadas, multipotenciales y con

capacidad de autorrenovarse; sin embargo diferentes estudios han demostrado que éstas también

pueden diferenciarse en células de tejidos de otras capas embrionarias (presentan plasticidad), como

es el caso de las células troncales hematopoyéticas que son capaces de diferenciarse a hepatocitos,

músculo cardiaco y endotelio. Estas tienen la función principal de mantener la homeostasis tisular,

remplazando las células que mueren a causa de la degeneración del tejido, lesiones o por enfermedad

(Kirschtein, 2001). Dentro de este grupo de células se encuentran las células troncales mesenquimales

(MSC por su siglas en inglés) que son con las que se trabajaron durante este protocolo.

Figura 1.- Desarrollo embrionario y clasificación de las células troncales. Tomado de

˂http://herenciageneticayenfermedad.blogspot.mx/2009/09/celulas-madre-conceptos-indispensables.html˃

1.4 Definición de células troncales mesenquimales (MSC)

Como ya se mencionó, las MSC son células troncales adultas multipotentes, capaces de autorrenovarse,

generar diferentes tejidos mesodérmicos como hueso, cartílago, músculo, células estromales, tendón, tejido

adiposo y tejido conectivo; además de sustentar el proceso de hematopoyesis (Battula y cols., 2009).

3

1.5 Historia de las MSC

El estudio de las MSC comenzó con Friedenstein y cols. en la década de los 70´s, quien describió por primera

vez una población de células adherentes con morfología fibroblastoide (figura 2), aisladas de médula ósea.

Las cuales fueron denominadas como unidades formadoras de colonias de fibroblastos (Flores y cols., 2006).

En la década de los 80’s Owen demostró que estas células tenían la capacidad de diferenciarse hacia células

de origen mesodérmico como osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Figura 2.- MSC con tinción de Papanicolaou (izquierda). Se observan las células en forma e huso.

Tomado de Flores y cols., 2006 y Lubis y cols., 2011.

Otros estudios realizados in vivo e in vitro han demostrado la plasticidad de estas células, dando origen a

otras células como cardiomiocitos, vasos sanguíneos, células nerviosas, pulmonares, islotes de células beta

pancreáticas y células epiteliales corneales (Flores y cols., 2006); como ejemplo de estos trabajos se

encuentra el de Prockop (1997) quien cultivó MSC; posteriormente las trasplantó en ratones

inmunodeprimidos y cinco meses después observó que estas células representaban hasta 12% de las células

de médula ósea, bazo, hueso, cartílago y pulmones. Azizi y cols. (1998) demostraron que tras la infusión

directa de MSC de rata o humano en ganglios basales de rata se observa cómo éstas se integran y migran en

el tejido huésped. A los 72 días de la inyección de MSC se observó que las células son viables y no existen

signos de respuesta inflamatoria o rechazo. Otro ejemplo es el trabajo de Sánchez-Ramos y cols. (2000),

quienes aseguran por primera vez que estas células, tanto de humano como de rata adulta, tras ser

expandidas en cultivo durante más de 20 pases como células indiferenciadas, pueden ser inducidas a exhibir

un fenotipo neural mediante un tratamiento químico.

1.6 Criterios de identificación de la Sociedad Internacional de Terapia Celular Debido a que en los diversos estudios antes mencionados sobre las MSC se dieron diferentes nombres a

estas células como: células de estroma medular, unidades formadoras de colonias fibroblastoides,

precursores estromales, etc., en el 2006 la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT por sus siglas en

inglés) propuso tres criterios para definir las MSC:

1. Deben ser adherentes al plástico en condiciones normales de cultivo.

2. El 95% de la población debe expresar los grupos de diferenciación 73, 90 y 105 (CD por sus siglas en

inglés) medido por citometría de flujo en ausencia de CD34 (expresado en células hematopoyéticas),

4

CD45 (expresado en leucocitos), CD14 y CD11b (expresado en monocitos y macrófagos), CD79a o

CD19 (expresado en linfocitos B) y antígeno leucocitario humano de clase II (HLA por sus siglas en

inglés).

3. Diferenciarse in vitro en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, bajo condiciones estándares de cultivo.

Adicional a lo anterior se debe tener en cuenta que éstas deben realizar procesos de autorrenovación y ser

capaces de desarrollar diferenciación hacia tejidos de diferentes capas embrionarias, ectodermo y endodermo

(Dominici y cols., 2006).

1.7 Fuentes de obtención de las MSC Ya se sabe cómo identificar una MSC, pero ¿Dónde las encuentro?. Aunque estas fueron extraídas de médula

ósea por primera vez, también se han encontrado en otros tejidos, como son: Tejido adiposo, sangre

periférica, sangre de cordón umbilical, tejido fetal hepático y pulmonar, placenta, páncreas, músculo

esquelético, dermis, membrana sinovial, hueso trabecular, pulpa dental y ligamento peridontal. Sin embargo,

las fuentes más utilizadas y por lo tanto más estudiadas son médula ósea (que contiene un 0.003%), sangre

de cordón umbilical y tejido adiposo. En la tabla 1 se muestra una comparación de las principales fuentes de

obtención de MSC (Arévalo y cols., 2007). En esta se puede observar que la mejor fuente de obtención es el

tejido adiposo, por su éxito de aislamiento y la cantidad de UFC-F obtenidas; sin embargo durante este

protocolo se trabajó con médula ósea, debido a que en el hospital ésta se desecha y es una buena fuente de

obtención.

Tabla 1.- Comparación de las tres principales fuentes de obtención de MSC.

UFC-F: Unidades formadoras de colonias de fibroblastos. Tomado de Arévalo y cols., 2007.

5

1.8 Aplicaciones clínicas Posterior a esto podemos preguntarnos ¿Realmente son tan importantes éstas células, como para ser tan

estudiadas? La importancia de estudiar las MSC es por las expectativas que se tienen acerca de sus posibles

aplicaciones. Inicialmente su estudio permitirá la generación de conocimientos básicos sobre su biología y

manipulación in vitro para su posible aplicación clínica; además de la generación de conocimientos acerca del

desarrollo embrionario. Con base a sus aplicaciones clínicas las podemos dividir en cuatro diferentes grupos:

Terapia génica. Según Prósper y Verfailie (2003): “Estas células podrían ser empleadas como

vehículo terapéutico de genes, por ejemplo en el caso de enfermedades como la hemofilia o como

vehículos para terapias antitumorales”.

Medicina regenerativa. Por su potencial de diferenciación pueden ser utilizadas para regenerar

tejidos destruidos o dañados, evitando los problemas de rechazo inmunológico. Estas aplicaciones

abarcan enfermedades del sistema nervioso, esquelético, cardíaco, hematopoyético entre otros;

teniendo como base resultados obtenidos con diferentes modelos animales e incluso humanos.

Ejemplo de estos son los estudios de Horwitz (1999) quien realizó tres trasplantes alogénicos de

médula ósea en niños con osteogénesis imperfecta severa y encontró que las MSC incrementaron la

formación de hueso en los tres niños. En la enfermedad de Parkinson se han utilizado células de

origen fetal en ensayos clínicos en humanos. Estudios in vitro e in vivo han demostrado que tanto las

células troncales embrionarias como las adultas son capaces de diferenciarse a neuronas

dopaminérgicas. Sin embargo, no está claro hasta qué punto dichas células son capaces de

restablecer los circuitos neuronales destruidos y por lo tanto eliminar los síntomas de la enfermedad

(Flores y cols., 2006).

Desarrollo de fármacos. Pueden cambiar dramáticamente la manera en que se desarrollan los

fármacos y sus pruebas de seguridad. Por ejemplo, los nuevos medicamentos se podrían probar

inicialmente usando cultivos primarios humanos, lo que daría una mejor visión de los posibles efectos

del fármaco en humanos.

Podrían utilizarse para restaurar la función inmune en pacientes inmunodeprimidos (Prósper y

Verfailie, 2003).

1.9 Cultivo de MSC

Debido a las posibles aplicaciones clínicas, las MSC han sido muy estudiadas y se han generado diferentes y

muy variados protocolos de aislamiento y cultivo de las mismas. Si se revisa la literatura se encuentran

variantes del método de obtención como: médula ósea completa, médula ósea purificada con Ficoll, médula

ósea purificada con el gradiente de Percoll, etc (Flores y cols., 2006). Cultivos en los que se utiliza DMEM con

diferentes componentes, como: presencia de piruvato, concentración de glutamina, concentración de glucosa,

factores de crecimiento, etc e incluso la utilización de otros medios, como Ham´s F10. Además de esto

también se encuentran artículos donde la cantidad de suero fetal bovino es variable (10-50%) e incluso

algunos donde se sustituye el suero fetal bovino por suero de ternera o por gelatina (Estrada y Venegas,

2007; Aparecida de Camargo y cols. 2005; Campagnoli y cols., 2001 y Solemani, 2009). Además de esto en

los protocolos desarrollados los crecimientos celulares son pobres y se requiere de un tiempo muy prolongado

para obtener una concentración alta de células in vitro (generalmente 30 días), y en algunos casos las células

6

nunca llegan a crecer (Estrada y Venegas, 2007). Por todo lo anterior es necesario estandarizar este tipo de

cultivos a las condiciones de trabajo del laboratorio.

1.10 Características de las MSC Estandarizado el método de cultivo es importante caracterizar las células obtenidas para asegurar que se trata

de MSC y no fibroblastos (principal contaminante), pero ¿Cómo identifico a las MSC?

1.10.1 Morfología

Se caracterizan por tener una morfología en forma de huso (figura 2), con núcleo alargado central que

contiene de dos a tres nucléolos. Los cultivos de estas contienen células morfológica y funcionalmente

distintas. En los estudios de Owen (1998) se describen colonias que contenían células en forma de huso, las

cuales formaban colonias compactas y colonias abiertas y otro tipo de células que eran más pequeñas y

morfológicamente semejantes a células epiteliales. Posteriormente Mets y Verdonk (1981) encontraron dos

tipos celulares: células pequeñas y fusiformes y células más grandes, aplanadas y que proliferan más

lentamente. Recientemente Prockop (1997) describió tres tipos de células: células pequeñas y agranulares,

células pequeñas y granulares y células más grandes y granulares.

1.10.2 Fenotipo Fenotipicamente aún no se ha logrado identificar una molécula de superficie específica para las MSC; sin

embargo, se cuenta con un inmunofenotipo aceptado para la identificación de las MCS; estos son la expresión

de los grupos de diferenciación 29, 44, 73, 90, 105 (CD por sus siglas en ingles) y el antígeno leucocitario

humano I (HLA por sus siglas en inglés) en ausencia de CD34 y CD45. Además de estos, las células

presentan otras moléculas de superficie, las cuales se muestran en la tabla 2 (Macías-Abraham, 2010).

Tabla 2.- Fenotipo de las MCS. Muestra los antígenos de superficie encontrados

por diferentes autores y los exigidos por la ISCT

Tomado de Macías-Abraham, 2010

1.10.3 Genotipo

El genotipo está dado por la expresión de ciertos genes, que dan la capacidad de pluripotencia a las células

troncales en general. En el 2007, Takahashi y cols. hicieron el análisis de un grupo inicial de 24 genes, cuya

expresión se había asociado de forma específica con células embrionarias y mediante experimentos de

transfección en fibroblastos embrionarios de ratón, fueron eliminando uno a uno los genes. Al final, se redujo

la lista a solo 4 genes: oct4, sox2, kfl4 y c-Myc. Posteriores experimentos han demostrado que la adición de

oct4, sox2, kfl4 y c-Myc a células fibroblastoides de ratón y humano genera células pluripotentes

indistinguibles de las células troncales embrionarias. He incluso, se ha minimizado el número de genes,

7

habiendo experimentos donde solo se introduce oct4, sox2 y la exposición a drogas que inhiban determinada

rutas metabólicas (Lavaut-Sánchez y Hernández, 2010). A continuación se da una pequeña descripción sobre

cada uno de estos genes:

oct4. Pertenece a la familia de factores de transcripción oct (octámero) y está fuertemente involucrada

en el mantenimiento de la autorrenovación y pluripotencia (Lavaut-Sánchez y Hernández, 2010). Una

baja expresión de éste conduce a la diferenciación a trofodermo, mientras la sobreexpresión induce

diferenciación en varios linajes, incluyendo endodermo y mesodermo. Éste coopera activamente con

Sox2 en la regulación de genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia como nanog

(Sánchez-Sánchez, Camp y Mullor, 2011).

nanog. Es un factor de transcripción cuya actividad esencial es el mantenimiento in vivo e in vitro de

las células troncales. Se ha visto que este presenta una baja regulación durante la diferenciación y su

ausencia da como resultado la diferenciación primitiva del endodermo (Sánchez-Sánchez, Camp y

Mullor, 2011).

sox2. Es parte de una gran familia de 20 proteínas que comparten una unión al ADN. Coopera

activamente con oct4 en la regulación de genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia

como Nanog. Una baja regulación de este factor promueve diferenciación celular (Lavaut-Sanchéz y

Hernández, 2010).

kfl4. Es un miembro de la familia de factores de transcripción Kruppel-like y parece desempeñar una

doble función como oncogén y antioncogén. Parece estar relacionado con la inhibición de p53, que

evita la salida de las células del ciclo celular y contrarresta la acción de c-Myc en la inducción de

apoptosis y la diferenciación. Su sobreexpresión conduce a expresión sostenida de oct4 y la inhibición

de la diferenciación celular (Lavaut-Sanchéz y Hernández, 2010).

c-Myc.- Es un potente oncogén implicado en la proliferación celular, la inhibición de la diferenciación y

la metástasis. Éste fue eliminado de la trasfección debido a que su activación fuera de control puede

causar tumores (Lavaut-Sanchéz y Hernández, 2010).

Otros genes encontrados son dppa4, dppa2, fth117, sal14, rex1, utf1, tcl1, dppa3, catenina, stat3, grb2, y

otros más los cuales engrosarían una larga lista con otros miembros tales como piwi (hiwi en humanos), hes-

1, hif, foxD3, eras, pax3, pumilio o bam (Chaparro y Beltrán, 2009).

Según Chaparro y Beltrán (2009): “La pérdida de la pluripotencia y la diferenciación a diversos linajes

celulares conlleva cambios en los patrones de expresión génica que incluyen el silenciamiento de genes que

codifican para factores de transcripción claves para el mantenimiento de la pluripotencia, la expresión de

genes inductores de la diferenciación y cambios epigenéticos de la cromatina”; por esta razón se utilizó como

método de identificación la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR

por sus siglas en inglés). Ésta técnica permite saber si el gen se está expresando por medio de la generación

cDNA a partir de RNAm y posteriormente la amplificación de esa sección, como se puede observar en la figura

3. Por lo tanto nos permite identificar las células que expresan estos genes (células troncales) de las que solo

lo poseen en el genoma, pero está silenciado.

8

Figura 3.- Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. Se observa cómo se parte de RNAm para generar cDNA y

posteriormente continuar con la técnica de PCR que consiste en tres pasos (desnaturalización de DNA, Hibridación a los primers y

extensión) para amplificar exponencialmente el cDNA. Tomado de ˂ http://9e.devbio.com/article.php?id=293˃.

9

2. Justificación

Debido a las expectativas que se tienen sobre las posibles aplicaciones de las MSC, principalmente en

medicina regenerativa, es importante contar con un método de extracción, cultivo e identificación de MSC.

Esto con la finalidad de facilitar futuras investigaciones, así como, la generación de un banco celular (como

objetivo a largo plazo).

10

3. Objetivos

3.1 General:

• Estandarizar el método de extracción, cultivo e identificación de MSC de médula ósea de conejo.

3.2 Particulares:

• Extraer MSC derivadas de médula ósea.

• Establecer las condiciones óptimas para el cultivo de las MSC derivadas de médula ósea.

• Identificar las MSC por medio de la expresión de diferentes genes de pluripotencia (nanog, sox2 y oct4),

utilizando la técnica de RT-PCR.

11

4. Hipótesis

Se sabe que los genes sox2, nanog y oct4 son genes importantes para el mantenimiento de la pluripotencia,

por lo tanto se debe poder identificar a las MSC por técnicas como la RT-PCR por medio de la expresión de

estos genes.

12

5. Parte experimental

5.1 Materiales y reactivos

Revisar apéndice 1.

5.2 Metodología

La metodología se dividió en cuatro partes principales, que son: Aislamiento de MSC, cultivo de MSC,

extracción de RNA y RT-PCR. Parte de la metodología tiene diferentes subdivisiones como es el caso del

cultivo de MSC, el cual cuenta con dos. Éstas surgen de la necesidad de realizar modificaciones de los

protocolos tomados como base, para optimizar los resultados obtenidos.

5.2.1 Aislamiento de MSC

Para extraer el fémur se sacrificó al conejo de acuerdo a la NOM-033-ZOO-1995 “Sacrificio humanitario de los

animales domésticos y silvestres” por sobredosis de pentobarbital vía intracardiaca. Posteriormente, se limpió

el esqueleto del animal con etanol al 70%, para disminuir la cantidad de pelo y la carga microbiana; se hizo

una incisión alrededor del perímetro del fémur y se quitó la piel tirando hacia el pie (para reducir el contacto de

ésta con el fémur). Se cortó la articulación de la rodilla y eliminó el músculo y tejido conectivo del fémur por

raspado de la diáfisis. Cuando estuvo lo más limpio posible se cortaron los ligamentos que unen el fémur y la

cresta iliaca y se limpió los últimos restos de músculo por raspado. Se almacenaron los fémures en tubos

Falcón con medio modificado de Dubelco (DMEM, por sus siglas en inglés) complementado con suero fetal

bovino (SBF, por sus siglas en inglés) y antibiótico (penicilina-estreptomicina).

La extracción de la médula ósea se realizó en un área aséptica, generada dentro de una campana de flujo

laminar. Se cortaron las epífisis del fémur e insertó una aguja conectada a una jeringa de 1 mL con medio de

cultivo completo, para retirar el tapón de la médula ósea y recibir en una placa de cultivo de 6 pozos. Se

homogenizó el tapón medular con ayuda de la jeringa y se procedió a la purificación de las MSC.

Para la purificación de las MSC se utilizaron dos métodos:

1. Médula ósea completa (MOC). Se transfirió la médula ósea en tubos Falcon y se centrifugó a 1700

rpm por 3 min. Posteriormente se tomó la porción donde se encuentran los glóbulos blancos con ayuda

de una micropipeta y se llevó a 1.2 mL con PBS para su cultivo.

2. Ficoll-Paque (MOF). Se adicionó Ficoll-Paque en tubos Falcon, en proporción 1:3 de médula ósea;

posteriormente se transfirió la médula ósea cuidando de no mezclar ambas fases.Se centrifugó a 2000

rpm por 30 minutos en una centrifuga sin freno. Se tomó la porción donde se encuentran las células

mononucleares y se lavó 2 veces con PBS (El lavado consiste en: centrifugar a 1700 rpm por 3

minutos, desechar el sobrenadante y resuspender en 1.2 mL PBS). Se cultivaron las células

resuspendidas.

13

Antes de cultivar las células se determinó viabilidad por la técnica de exclusión con azul de tripano. Para esto

se añadió 90 μL de la suspesión celular y 10 μL de azul de tripano. Se Mezcló e incubó por 3 min y se verificó

viabilidad con ayuda de un microscopio invertido.

En la figura 4 se resume este punto en un diagrama de flujo, donde MOC y MOF son los métodos de

purificación y los recuadros rojos indican la porción tomada para su posterior cultivo.

Figura 4.- Diagrama de flujo del aislamiento de MSC.

Los cuadros rojos indican la porción tomada para su posterior cultivo. MOC: Médula ósea completa y MOF: Médula purificada por Ficoll-Paque.

5.2.2 Cultivo de MSC

5.2.2.1 Primer protocolo.

Se tomó como base el protocolo propuesto por Soleimani (2005). Se cultivaron las células obtenidas de los

métodos de purificación (médula ósea completa) con 0.2 mL de la suspensión celular, en placas de cultivo de

6 pozos con 1.5 mL de medio completo (A2, s/aane; ver tabla 3). Se incubaron las placas a 37°C con 5% de

CO2 en una cámara húmeda. Después de 3 h se eliminaron las células no adheridas, cambiando el medio de

cultivo y sustituyéndolo con medio de cultivo completo fresco; 8 h después del cultivo se remplazó el medio

con medio de cultivo completo fresco. A partir de entonces se repitió este paso cada 8 h por aproximadamente

72 h de iniciado el cultivo. Terminado este proceso se hizo un lavado con PBS y se adicionó medio de cultivo

completo. Se cambió el medio de cultivo cada 3 días.

Dos semanas después de iniciado el cultivo se lavaron las células con PBS e incubaron con tripsina 0.25%,

EDTA 1 mM y PBS 1:1:1 por 3 minutos a 37°C. Se realizó un pasaje lavando las células con PBS y

posteriormente se incubaron con tripsina 0.25%, EDTA 1 mM y PBS 1:1:1 por 3 minutos a 37°C. Se

despegaron las células con ayuda de una micropipeta y se transfirieron a tubos Falcón que ya contenían

medio completo, para neutralizar la tripsina. Se centrifugaron a 1700 rpm por 3 min y se desechó el

14

sobrenadante. Se lavó con PBS 2 veces, resuspendiendo y centrifugando a 1700 rpm por 3 min, y se

cultivaron en frascos de cultivo con 10 mL de medio de cultivo completo fresco y se cambió el medio de cultivo

cada 3 días. En la figura 5 se muestra el diagrama de flujo para el cultivo de MSC utilizando el primer

protocolo.

Tabla 3.- Composición de los diferentes medios de cultivo utilizados. En la

última columna se muestra la nomenclatura utilizada en la metodología.

NOTA: Durante este protocolo se trabajó con células congeladas. El proceso de congelamiento se llevó a

cabo realizando una dilución 1:2 de medio de cultivo con DMSO al 10% y la suspensión celular. La solución

anterior se guardó a -70°C en un tubo para congelamiento.

Debido a que con este protocolo no se lograron aislar las células deseadas se decidió alargar el tiempo del

primer cambio de cultivo y aumentar el número de variables (protocolo 2). Cabe recalcar que se contó con

cultivos de células C33 (control), los cuales crecieron adecuadamente y no cambiaron sus características

morfológicas a las condiciones de trabajo.

Figura 5.- Diagrama de flujo del cultivo de MSC utilizando el primer protocolo. Las horas

marcadas son después de iniciado el cultivo.

15

5.2.2.2 Segundo protocolo.

Se cultivaron las células obtenidas de los métodos de purificación (médula ósea completa y Ficoll-Paque) con

0.2 mL de suspensión celular para placas de cultivo con 1.5 mL de medio de cultivo completo y toda la

suspensión celular para frascos de cultivo con 10 mL de medio de cultivo completo (en la tabla 3 se muestra la

composición de los diferentes medios completos utilizados). Se incubaron las placas a 37°C con 5% de CO2

en una cámara húmeda. El primer cambio de medio de cultivo se realizó 24 h después, para eliminar las

células no adherentes. Posteriormente se cambió el medio de cultivo cada 3 días y se evaluó el crecimiento

celular todos los días con ayuda de un microscopio invertido.

Al llegar las células a un 60-80% de confluencia se despegaron las células como se mencionó en el punto

5.2.2.1. Se cultivaron todas las células en frascos de cultivo con 10 mL de medio de cultivo completo fresco y

se cambió el medio de cultivo cada 3 días hasta llegar a una confluencia del 60-80%. Una vez que los frascos

de cultivo llegaron a la confluencia mencionada algunas se continuaron expandiendo como se describió arriba,

con otras se realizó conteo celular por citometría de flujo y con las ultimas se procedió a su identificación por

RT-PCR, por lo que fue necesario realizar extracciones de RNA. En la figura 6 se muestra el diagrama de flujo

del cultivo de MSC utilizando el segundo protocolo.

Figura 6.- Diagrama de flujo del cultivo de MSC utilizando el segundo protocolo. Las horas marcadas

son después de iniciado el cultivo.

5.2.3 Extracción de RNA

Para el aislamiento de RNA se utilizó la técnica de aislamiento de RNA en un solo paso con reactivo de Trizol.

Este método se divide en tres fases principales que son: homogenización, separación de fases y aislamiento

de RNA.

5.2.3.1 Homogenización

Se despegaron las células del frasco de cultivo y se añadió 500 μL del reactivo de trizol a la última pastilla

obtenida después de los lavados con PBS. Se lisaron las células pipeteando de arriba a abajo varias veces.

16

5.2.3.2 Separación de fases

Se incubó la muestra homogeneizada durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la disociación

completa del complejo de nucleoproteínas. Al finalizar los 5 minutos se adicionaron 100 μL de cloroformo, se

tapó el tubo y agitó vigorosamente por 15 segundos. Se incubó de 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y

posteriormente se centrifugó la muestra a 13,000 rpm por 3 min a 4°C. Se extrajo la fase acuosa de la

muestra con ayuda de una pipeta inclinando el tubo a 45 ° y se colocó la fase acuosa en un tubo nuevo.

5.2.3.3 Aislamiento de RNA

Se adicionar 500 μL de isopropanol al 100% e incubó a temperatura ambiente por 10 min y se centrifugó a

13,000 rpm por 30 minutos a 4°C. Se eliminó el sobrenadante del tubo y se lavó el sedimento con 500 μL de

etanol al 75%. Se agitó brevemente y centrifugó el tubo a 13,000 rpm por 3 min a 4°C y se desechó el

sobrenadante. Obtenida la pastilla se dejó secar de 5 a 10 minutos; sin dejar secar por completo porque la

pastilla puede perder solubilidad. Una vez seca se resuspendió la pastilla en agua libre de nucleasas.

Se verifico la integridad del RNA por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% con TBE como buffer de

electroforesis. Se colocó en los pocillos 3 μL de muestra y 2 μL de buffer de carga y se dejó correr a 115 V

hasta una distancia considerable. Para visualizar los resultados se utilizó un transiluminador de luz UV. Si el

RNA estaba integro se procedía a realizar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

(RT-PCR, por sus siglas en inglés).

5.2.4 RT-PCR

Para el diseño de los primers se utilizó el programa primer BLAST. Inicialmente se buscó la secuencia que se

desea amplificar en el BLAST (programa informático para alineamiento de secuencias de DNA,RNA y

proteínas) y posteriormente se establecieron los parámetros. Para este protocolo se diseñaron primers para

GADPH (sirvió como control, gen que codifica para la 3-gliceraldehido-deshidrogenasa), nanog, ox2 y oct4 de

conejo albino; con una Tm óptima de 55°C y 1°C de diferencia entre los primers (FWD y REV). Para

corroborar el resultado se revisó compatibilidad en el BLAST. Las características de los primers para cada gen

se muestran en el apéndice 2.

La reacción de RT-PCR se realizó en un paso. Se utilizó los primers a una concentración de 5 µM, la taq

polimerasa para el control de negativo DNA y platinum taq polimerasa para la muestra y el control negativo

(tabla 4). La reacción se llevó a cabo en un termociclador techne a las siguientes condiciones:

Síntesis de cDNA: 1 ciclo de 30 min a 50°C.

Eliminar el RNA: 1 ciclo de 2 min a 94°C.

PCR: 30 ciclos de 30s a 94°C, 30s a 55°C y 1 min 30s a 72°C.

Extensión: 1 ciclo de 10 min a 72°C.

17

Tabla 4.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados en la reacción

de RT-PCR de un paso.

FWD y REV son los primers de iniciación y terminación, los cuales se trabajaron a una

concentración de 5 µM. Los números 1 y 2 indican la enzima utiliza; 1 para P-Taq (contine la

reverso transcriptasa y la Taq polimerasa) y 2 para la Taq polimerasa para 100 reacciones.

La reacción se reveló por electroforesis en gel de agarosa al 2% con TBE como buffer. Se colocó en los

pocillos 3 μL de muestra y 2 μL de buffer de carga y se dejó correr a 115 V hasta una distancia considerable.

Los resultados se visualizaron en un transiluminador de luz UV.

Debido a que no se logró amplificar con los reactivos para RT-PCR en un paso, se decidió trabajar la reacción

en dos pasos. Para la reacción de dos pasos inicialmente se sintetizó el cDNA con el MgCl2 a 20 mM y la

enzima reverso transcriptasa para 100 reacciones (tabla 5). Se mantuvor en hielo mientras se prepara el tubo

de reacción e incubó a 55°C por 50 min y posteriormente a 65 °C por 5 min y se dejó en hielo.

Tabla 5.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados en la

síntesis de cDNA.

La enzima es la reverso transcriptasa para 100 reacciones. El MgCl2 se trabajó a 20 mM.

Para la PCR se utilizaron los primers a una concentración de 5 µM, los dNTPs a 100 µM, el MgCl2 a 20 mM y

la taq polimerasa (tabla 6). La reacción se llevó a cabo en un termociclador techne a las siguientes

condiciones:

Eliminar el RNA: 1 ciclo de 3 min a 94°C.

PCR: 45 ciclos de 20s a 94°C, 40s a 50°C y 1 min 30s a 72°C.

Extensión: 1 ciclo de 10 min a 72°C.

Muestra Agua

(µL)

Buffer

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FWD

(µL)

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(µL)

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(µL) 1 2

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Control

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Control

positivo 6.25 12.5 2 2 2 0.25 -----

Muestra 6.25 12.5 2 2 2 0.25 -----

Muestra Agua

(µL)

Buffer 2x

(µL)

MgCl2

(µL)

Enzima

(µL) RNA (µL)

Control

negativo 8.25 12.5 2 2 -------

Control

positivo 6.25 12.5 2 2 2

Muestra 6.25 12.5 2 2 2

18

Tabla 6.- Componentes y concentraciones de los reactivos utilizados

en la reacción de RT-PCR de dos pasos.

FWD y REV son los primers de iniciación y terminación, los cuales se trabajaron a una concentración de 5 µM.

Los dNTPs se trabajaron a una concentración de 100 µM y el MgCl2 a 20 mM.

El revelado se llevó a cabo como se describió para la RT-PCR en un solo paso.

Muestra Agua

(µL)

Buffer

2x (µL) dNTPs ( µL)

FWD

(µL)

PREV

(µL)

RNA

(µL) MgCl2

Taq-Pol

Control

negativo 11.3 2.5 1.0 1.3 1.3 ------- 0.25 0.5

Control

positivo 2.3 2.5 1.0 1.3 1.3 9 0.25 0.5

Muestra 2.3 2.5 1.0 1.3 1.3 9 0.25 0.5

19

6. RESULTADOS

Los resultados se dividieron en tres secciones principales: Cultivos de MSC, extracción de RNA y RT-PCR. La

sección de cultivo de MSC esta subdividida en tres secciones para facilitar la presentación de los resultados.

6.1 Cultivos de MSC

6.1.1 Células C33 (Control de crecimiento celular).

Este se utilizó para asegurar que las condiciones de trabajo eran las adecuadas como: los factores

ambientales dados por la incubadora y la campana de flujo laminar, la forma de trabajo, los reactivos y los

procedimientos. Estas células presentaron una morfología romboide cuando se encontraban adheridas;

morfología que se conservó durante todo el tiempo de trabajo (figura 7). El crecimiento de éstas fue elevado,

de tal manera que se realizaron pasajes cada semana, ya que los botes presentaron una confluencia del 95-

100% e incluso algunos casos ya se encontraban varias células despegadas. Cuando se realizó la tinción con

azul de tripano se observó que las células eran viables (células no coloreadas y que presentan refringencia),

figura 7.

Figura 7.- Seguimiento del cultivo de células C33 (Control) durante 16 días vistas a 10x. Se observa

la morfología romboide, que se conserva a lo largo de los 16 días de cultivo. La prueba de viabilidad, realizada

con azul de tripano, no observaron células muertas (células teñidas de azul).

6.1.2 Células MSC. Primer protocolo

Se utilizaron células congeladas con dimetilsulfóxido (DMSO), como sustancia crioprotectora. Al inicio del

cultivo las células presentaron una morfología esférica y refringencia; además de una gran cantidad de

residuos, lo cuales se fueron eliminando con los cambios de medio. Durante los primeros 7 días no se

apreciaron cambios en la morfología celular; sin embargo si se logra observar un aumento en la confluencia

hasta alcanzar un 20%, así como aumento del tamaño celular, figura 8.

Al día 7 se realizó un cambio de suero (de suero fetal bovino a suero de ternera, accidentalmente), lo que

provocó una disminución de la tasa de crecimiento celular (visible al día 9), visto por la confluencia, la cual no

DÍA 16

20

era mayor a un 25%, figura 8, día 9. Para el día 14 no se observó crecimiento celular, las células han perdido

la característica de refringencia, hay disminución del tamaño celular, pérdida de la morfología y aumento la

cantidad de residuos, figura 8. Para el día 27 ya no se observó ningún cambio en las diferentes placas de

cultivo, las imágenes correspondientes a este día son similares a las obtenidas el día 16, razón por la cual no

se incluyen. Al realizar la prueba de viabilidad (día 16) se observó que las células son viables (células de

coloración azul); sin embargo, existe una gran cantidad de células aglomeradas, de residuos y muchas de las

células han perdido la morfología, figura 8.

Figura 8.- Seguimiento del cultivo de MSC durante 16 días, visto a 10 x, correspondiente al primer protocolo. Se

observa cómo disminuye el número de células a lo largo del tiempo, pierden su morfología original y se van aglomerando.

6.1.3 Células MSC. Segundo protocolo

Se llevaron a cabo dos experimentos. En ambos se utilizó una suspensión celular fresca, a diferencia del

protocolo 1, que se trabajó con células congeladas. En el primer experimento se trabajó con placas de cultivo

de 6 pozos. Al inicio del cultivo las células presentaron una morfología esférica y la característica de

refringencia. Para el 3 día ya existían diferencias entre las placas de cultivo, hubo mayor cantidad de células

en las placas donde se trabajó con MOF (confluencia 30-40%) respecto a MOC (confluencia 10-20%), figura

9.

21

Figura 9.- Cultivos de MSC al día 3 en medios de cultivo s/aane visto a 10x. Se observa un mayor no. de células en los cultivos de

MOF; sin embargo, aún no se logra observar la morfología deseada. s/aane: Ausencia de aminoácidos no esenciales, MOF: Médula

ósea purificada con Ficoll, MOC: Médula ósea completa, 1: Suero de ternera, 2: Suero fetal bovino, A: Medio de cultivo con piruvato,

B: Medio de cultivo con glutamina y AB: Medio de cultivo con piruvato y glutamina.

Para el día 9 se lograron observar diferencias entre las placas. Inicialmente se observó mayor confluencia (45-

50%) en presencia del suero 1 comparado con el suero 2 (10-20%) en todos los casos, sin embargo el tamaño

de las células es pequeño y carecen de refringencia comparadas con las obtenidas en el suero 2, figura 10.

En ausencia de aane se observó mayor cantidad de residuos, acúmulos de las mismas y células no

adheridas, figura 10. En cuanto al método de obtención el mayor crecimiento se observó en las placas de

MOF (confluencia 20-50%) comparado con MOC (10-50%), esto fue más visible entre los sueros 2, figura 10.

Para este día aún no se había logrado observar células con morfología fibroblastoide, ver figura 10.

DÍA 0 DÍA 3

22

Figura 10.- Cultivos de MSC al día 9 en medios de cultivo c/aane (imagen de la izquierda, AB) y s/aane visto a 10x. Se observa un

mayor no. de células en los cultivos de MOF y en el suero 1; sin embargo, se observaron varias células sin adherir, acúmulos de las

mismas y aún no se logra observar la morfología deseada. Los resultados obtenidos para los medios c/aane con las diferentes

composiciones fueron similares a los obtenidos con los medios s/aane, razón por la cual solo se incluyen las del medio AB.

s/aane: Ausencia de aminoácidos no esenciales, MOF: Médula ósea purificada con Ficoll, MOC: Médula ósea completa, 1: Suero de

ternera, 2: Suero fetal bovino, A: Medio de cultivo con piruvato, B: Medio de cultivo con glutamina y AB: Medio de cultivo con piruvato y

glutamina.

Para el día 14 no se observaron modificaciones sobre la confluencia de varias placas de cultivo

(principalmente las que tienen suero 2 y C/aane). En las otras placas se observó una gran cantidad de células

despegadas, grumos celulares y un mayor crecimiento en medio AB; sin embargo, no se logró observar la

morfología fibroblastoide, varias células habían perdido la capacidad de refringencia y en algunos casos hasta

su forma. La prueba de viabilidad demostró que había más células muertas en las placas s/aane,

posteriormente en las placas con suero 1 y finalmente en las placas con suero 2, sin diferencias visibles entre

los diferentes medios, ver figura 11.

23

Figura 11.- Prueba de viabilidad día 14, realizada con azul de tripano, de las MSC en medios de cultivo AB, c/aane visto a

10x. Se observaron grumos celulares y células no viables, células marcadas. Los resultados obtenidos para las diferentes variables

fueron similares a los presentados en estas fotos. c/aane: Presencia de aminoácidos no esenciales, MOF: Médula ósea purificada con

Ficoll, MOC: Médula ósea completa, 1: Suero de ternera, 2: Suero fetal bovino y AB: Medio de cultivo con piruvato y glutamina.

Para el segundo experimento del segundo protocolo se eliminó el suero 1 y los medios s/aane y se trabajó en

botes de cultivo. Para el día 0 se observó que las células cultivadas presentaban refringencia y una morfología

esférica. Para el quinto día se apreciaron las primeras células con morfología fibroblastoide y también se

lograron ver diferencias entre los diferentes métodos de purificación. Para los cultivos de MOC la tasa de

crecimiento es menor, con una confluencia del 10%, comparada con la de MOF (confluencia 15%); además de

esto se observaron más células esféricas en los botes de MOC comparado con los de MOF, figura 12. En

cuanto a los diferentes medios de cultivo utilizados para el día 5 se observó mayor confluencia en el medio B y

AB (60-75%) comparados con el medio A (40%), figura 13.

Para el día 7 las células continuaron creciendo adecuadamente y cada vez se lograron apreciar más

diferencias entre las diferentes condiciones de trabajo y una disminución del número de células esféricas.

Para este día se observó menor confluencia en los botes de MOC (40%) comparada con los de MOF (60%);

además de una mayor cantidad de células esféricas en los botes de MOC comparado con MOF, figura 12. En

los diferentes medios de cultivo utilizados se observó mayor confluencia en los medios B y AB (60%)

comparados con el medio A (40%). Entre el medio B y AB no se observaron diferencias, ver figura 13. Para

estos días los cultivos presentan un 40-60% de confluencia, sin embargo las células se encontraban formando

colonias y no ocupan todo el frasco de cultivo.

24

Fig

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12

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26

Para el día 9 los frascos de cultivo ya presentaban un 80 % de confluencia para MOF y un 70% para MOC; sin

embargo el crecimiento no era homogéneo ya que al formarse colonias algunas partes del frasco de cultivo no

presentaban crecimiento, por esta razón se continuó con el cambio de medio hasta el día 15. Se observó que

en el caso de MOC disminuyó su tasa de crecimiento comparado con el MOF, llegando a un punto donde ya

no se observa crecimiento, figura 12. Para los diferentes medios de cultivo utilizados se observó una mayor

confluencia en los medios B y AB (95- 100%) comparados con el medio A (70%), que al igual que MOC

disminuye su tasa de crecimiento. Entre el medio B y AB no observaron diferencias; figura 13.

El rendimiento reportado se obtuvo por conteo celular de cada frasco de cultivo utilizando un citómetro de

flujo. De los resultados arrojados de este conteo se realizaron relaciones, en las que la cuenta más alta

corresponde al 100. En la tabla 7 se reportan los rendimientos obtenidos con cada medio de cultivo. Para

estos días se realizaban pasajes o caracterización de las células de los frascos de cultivo MOF B y AB.

Tabla 7.- Rendimientos obtenidos experimentalmente para los diferentes

cultivos en porcentaje. Este se obtuvo por conteo celular en un citómetro de flujo.

Medio de cultivo Rendimiento (%)

MOF, A2, c/aane 5.25

MOF, B2, c/aane 94.35

MOF, AB2, c/aane 100.00 MOF: Médula ósea purificada con Ficoll, MOC: Médula ósea completa, 2: Suero fetal bovino,

C/anne: presencia de aminoácidos no esenciales, A: Medio con piruvato, B: Medio con glutamina y

AB: Medio con piruvato y glutamina.

6.2 Extracción de RNA

Se realizaron varias extracciones de diferentes frascos de cultivo y posteriormente se revelaron en gel de

agarosa al 2 %. Al revelar las diferentes muestras se observaron dos bandas definidas para las muestras 2 y 3

(figura 14), que indican que el RNA está íntegro y puede utilizarse para la RT-PCR. En el caso de la muestra 1

y 4 las bandas se encuentran barridas (figura 14) por lo que no es conveniente utilizarlos para la RT-PCR ya

que puede amplificar secciones de diferentes tamaños o no amplificar. Además de lo anterior en el caso de la

muestra 4 también hay presencia de DNA (figura 14, banda en el carril), lo que puede generar un falso

positivo a la hora de realizar la RT-PCR.

27

Figura 14.- RNA integró y resultados de las extracciones realizadas en el laboratorio. En la figura A se observa una imagen tomada de

la bibliografía la cual nos indica cómo se debe visualizar un RNA intacto. La figura B son extracciones realizadas en el laboratorio.

M: Muestra. Figura A tomada de ‹http://epidemiologiamolecular.com/autor/›

6.3 RT-PCR

Como se mencionó en la metodología se realizaron diferentes experimentos tanto para la RT-PCR de un paso

como dos pasos, modificando la temperatura de apareamiento de los primes y el número de ciclos. A pesar de

esto no se logró estandarizar la técnica; por tal razón al realizar el revelado por medio de electroforesis en gel

de agarosa al 2% no se obtuvieron bandas, tanto para el gen control (GADPH), figura 16 izquierda, como para

los genes de pluripotencia (nanog, sox2 y oct4) y el control positivo de la reaccion, figura 16 derecha. Los

resultados obtenidos con la RT-PCR de dos paso son similares a los mostrados en la figura 16. En algunos

casos se lograron apreciar bandas tenues, como la señalada en la figura 16; sin embargo no se pudieron

definir por lo que no se puede asegurar la amplificación del gen.

Figura 16.- Revelado de la RT-PCR en gel de agarosa al 2%. En la figura de la izquierda se muestra un experimento llevado a cabo

únicamente para GADPH, donde no se observaron bandas para pozo. En la figura derecha se observa un gel para todos los genes,

incluyendo un control positivo (Experimento previamente estandarizado); en este solo se observa una banda tenue en el control

positivo.

M1 M2 M3 M4

28

7. DISCUSIÓN

Como se mencionó en la metodología, para el primer protocolo de cultivo de MSC se tomó como base el

descrito por Soleimani (2009), debido a que este menciona que se pueden obtener cultivos de alta pureza

después de 21 días de iniciado el cultivo; sin embargo, como puede observarse en los resultados del primer

protocolo, figura 8, no se alcanzaron niveles de confluencia adecuados, se obtuvo una gran cantidad de

residuos y no se lograron obtener células con morfología fibroblastoide, contrario a lo que describe Soleimani

(2009), el cual menciona que al tercer día comienzan a aparecer las primeras células fibroblastoides y para el

día 8 los cultivos alcanzan una confluencia de 65-70%. Revisando la literatura se encontró que muchos

autores realizan el primer cambio de medio de 24 a 72 h después de iniciado el cultivo (Lubis y cols., 2011;

Campagnoli y cols., 2001). Según Zhu y cols. (2010) las MSC derivadas de médula ósea de ratón no pueden

ser fácilmente aisladas por la adhesión al plástico, debido a la contaminación de los cultivos con células

hematopoyéticas. Al cultivar la médula ósea completa los cultivos contenían células hematopoyéticas y al

realizar el cambio de medio a las 3 h de iniciado el cultivo la cantidad de MSC adheridas fue mínima. Además

de lo anterior cabe destacar que las células utilizadas se congelaron 6 meses atrás y según Arévalo y cols

(2007) la población de MSC es muy baja (0.003%), por lo que pudieron no haber soportado el proceso de

congelación. Debido a estos resultados se decidió modificar las condiciones de cultivo como alargar el tiempo

del primer cambio y aumentar el número de variables: concentración de piruvato, glutamina, presencia de

aminoácidos no esenciales y tipo de suero.

En el primer experimento del segundo protocolo no se obtuvieron células con la morfología deseada, además

de una tasa de crecimiento muy pobre (figuras 9 y 10); sin embargo, este experimento permitió eliminar

algunos de los parámetros evaluados. De éste se pudo observar que:

- Existe un mayor crecimiento en presencia de suero de ternera, pero las células no presentan la forma

deseada y además de esto tienden a agregarse y perder refringencia (figuras 9 y 10). Revisando la

literatura la mayoría de los protocolos de aislamiento utilizan suero fetal bovino, debido a que éste al

ser tomado de sangre fetal tiene altos niveles de nutrientes, una óptima combinación de factores de

crecimiento y un bajo contenido de anticuerpos, lo que minimiza riesgos de que estos reaccionen con

las células (www.atlantabio.com) comparado con el suero de ternera. En la tabla 8 se observa que la

concentración de glucosa es 6 veces superior en SFB respecto al de ternera y con respecto a

proteínas, se observa que sus concentraciones son superiores en un 85% en el caso del suero de

ternera respecto del SFB (Mucci y cols., 2006). Al estar las MSC en constante división el SBF es el

más adecuado ya que contiene más nutrientes y factores de crecimiento, y una menor cantidad de

proteínas, lo que reduce la probabilidad de que las MSC se diferencien.

29

Tabla 8. Análisis bioquímico del suero de ternera y fetal bovino de dos lotes distintos

Tomado de Mucci y cols. 2006.

- Una gran cantidad de las células cultivadas en las placas donde no había presencia de aane no se

adhirieron y además se generan una gran cantidad de residuos. Estos aminoácidos favorecen la tasa

de crecimiento celular; debido a que las células no requieren sintetizar estos aminoácidos y pueden

utilizarlos para su metabolismo, como por ejemplo en síntesis de proteínas para la división celular o

que pueden funcionar como factores de crecimiento (Mucci y cols., 2006), figuras 9 a 10. Debido a la

gran cantidad de residuos generados se decidió eliminar esta variable y trabajar únicamente con

sueros con aane.

Con los resultados obtenidos con el primer experimento no se puede decir cuáles son las condiciones de

cultivo óptimas, pero si se pudieron descartar ciertos parámetros como son: el suero de ternera y los medios

con ausencia de aane.

Para el segundo experimento del segundo protocolo se cultivó toda la suspensión celular en botes de cultivo,

esto con la finalidad de concentrar las MSC y tener mayor probabilidad de que estas células crecieran. En

este experimentó para el día 5 ya se presentaban varias células con morfología fibroblastoide. Esto es acorde

con los trabajos de Lubbis y cols. (2011) en donde al día 5 ya se tenían células con morfología fibroblastoide,

aunque el crecimiento reportado por ellos es menor, ya que tardan 28 días en obtener cultivos con una

confluencia al 100%, mientras en el laboratorio tardaban 15 días. Esto pudo deberse a la cantidad de suero

adicionado que es del 15% y la presencia de aane, por lo que hay más nutrientes y factores de crecimiento.

En el segundo experimento también se observaron variaciones entre algunas de las condiciones evaluadas,

figura 12 y 13:

- Los cultivos de MOC tienen una menor tasa de crecimiento comparados con los cultivos de MOF y

tienen mayor cantidad de células esféricas. Mientras para el día 9 los cultivos de MOF prácticamente

no tienen células esféricas, los cultivos de MOC aun presentan gran cantidad de estas, figura 13. Esto

es debido a que el número de células cultivadas en MOF es menor (solo células mononucleares de

baja densidad), por lo que las células tienen más nutrientes, no compiten tanto por el espacio como

las de MOC y la contaminación con células hematopoyéticas es menor, por lo que las MSC se pueden

adherir al plástico más fácilmente (Heng y cols., 2010)

30

- Para los diferentes medios. Es evidente la diferencia entre la tasa de crecimiento del medio A

comparada con la de los medios B y AB, figura 13. Esto se debe a la presencia de glutamina que es un

aminoácido importante del metabolismo de la célula y por lo tanto favorece su crecimiento. Ya

comparando los medio B y AB se encontró que existe mayor crecimiento en AB esto se debe a que el

medio B tiene más glutamina, pero no tiene piruvato (participa como regulador de pH) (Cultek, 2002),

por lo que es más fácil que se modifique el pH del medio y por lo tanto se afecte a la célula. Caso

contrario al medio AB donde tiene glutamina y piruvato, por lo que es más difícil que se modifique el

pH.

Fue necesario identificar a las células y asegurar que realmente se están cultivando MSC y no fibroblastos,

que son la mayor fuente de contaminación y generan confusión ya que también presentan morfología

fibroblastoide, razón por la cual la ISCT exige la diferenciación a condrocitos, osteocitos y adipocitos. En la

figura 16 se muestran las diferentes extracciones de RNA realizadas, sin embargo sólo se trabajó con RNA

íntegro (los que presentan dos bandas definidas que es el RNAm y RNA microsomal), ya que no se sabe si el

RNAm que se está buscando también se degrado en las otras muestras, y por lo tanto al momento de

amplificar y revelar se observan varios fragmentos de diferentes tamaños.

Al realizarlal RT-PCR no se logró observar bandas en el gel de agarosa, figura 15. Por esta razón no se

puede asegurar que lo que se cultivó realmente sean MSC y no fibroblastos, solo con este experimento; sin

embargo, compañeros del laboratorio sí identificaron los antígenos de superficie de las MSC como CD90, el

cual solo se expresa en fibroblastos procedentes de piel (Halfon y cols. 2011). Estos trabajos también

arrojaron que la pureza de los cultivos era baja (30%), cosa que también pudo influir para que no se llevara a

cabo la amplificación de los genes de pluripotencia.

Si se observa la figura 15, los controles positivos (GADPH y control positivo de amplificación) tampoco es

visible la banda, solo muy tenue en el control positivo de amplificación, aun modificando la temperatura de

apareamiento de los primers y número de ciclos, por lo que se puede asumir que existen problemas

relacionados con la estandarización de la técnica, que van desde equipo y. reactivos, hasta concentración de

RNA, por lo que los ensayos son inválidos. Se sabe que estos genes se expresan en las células troncales, ya

que existen estudios donde se observa que la mayor expresión de estos genes es tejidos embrionarios y

prácticamente no se expresan en tejidos adultos (Wang y cols. 2011).

31

8. Conclusiones

Las condiciones óptimas para el cultivo de células provenientes de MSC son:

• Purificación de la suspensión celular con Ficoll-Paque.

• Medio con: DMEM + L-GLUTAMINA (5.84mg/ml) + PIRUVATO (2.2 mg/ml) + AANE+FBS 15%.

Las células obtenidas de los cultivos no se identificaron por la técnica de RT-PCR por problemas con la

estandarización de la técnica, debido probablemente a:

• Problemas con los reactivos.

• Problemas con el equipo.

• Baja pureza de los cultivos.

32

9. Bibliografìa

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33

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34

Apéndice I Materiales

Aislamiento y cultivo de MSC.

Conejos albinos de 1.5 a 3 Kg.

Medio modificado de Dulbecco´s Eagle con 2 mM L-glutamina Medio modificado de Dulbecco´s Eagle con piruvato y sin L-glutamina.

Suero fetal bovino (FBS) (GIBCO, cat. 10270-106).

Suero de ternera.

Tripsina 0.25%/ 1mM de ácido etilendiaminotetraacético/ PBS (GIBCO, cat.no. 27250-018).

Penicilina/estreptomicina

Campana para el cultivo celular con flujo laminar vertical y luz UV. .

Centrífuga.

Incubadora con control de temperatura y composición de gases.

Microscopio óptico invertido.

Autoclave.

Equipo quirúrgico con fórceps (rectas y curvas).

Tijeras.

Jeringas de 1 ml con agujas calibre 27.

Placas de cultivo de 0.6 (100mm)

Frascos de cultivo 0.25 cm2.

Solución reguladora de fosfatos.

Solución de aminoácidos no esenciales.

Azul de tripano.

Dimetilsulfóxido al 10%. Extracción de RNA

Cloroformo

Alcohol isopropilico

Etanol al 75% (tratado con agua con dietilpirocarbonato (DECP)).

Agua libre de RNAsa o 0.5% SDS

Microcentrifuga (12,000 rpm)

Tubos de polipropileno de microcentrífuga

Hielo

Cámara de electroforesis.

Agarosa

TBE RT-PCR

Termociclador

Primers FWD y REV para GADPH, nanog, oct4 y sox2.

Kit para RT-PCR en un solo paso.

Kit para RT-PCR en dos pasos.

Baño de agua con control de temperatura.

Agarosa

Cámara de electroforesis

TBE

Tubos de polipropileno

35

Apéndice II Diseño de Primers

Del diseño de los primers para GADPH se obtuvieron las siguientes características:

Secuencia (5'->3') Tamaño Tm % GC

Forward primer GCCATCACCATCTTCCAG 18 55.07 55.56

Reverse primer TGAGATGATGACCCTTTTGG 20 55.02 45.00

Tamaño del producto 150

Lugar de unión Este se diseñó de exón a exón

Tabla 1.- En esta tabla se resumen las principales características de los primers. G,C,A y T corresponden a las diferentes bases

nitrogenadas, %GC: Porciento de guanina-citosina y Tm: la temperatura a la cual la mitad de la concentración de los primers esta

apareada y la mitad no.

La secuencia obtenida se comparó en el BLAST y se obtuvo una cobertura del 100% para el conejo albino.

Del diseño de los primers para nanog se obtuvieron las siguientes características:

Sequence (5'->3') Tamaño Tm GC%

Forward primer GAAGGGAAACATCCAACCTT 20 55.51 45.00

Reverse primer AGGTTTTAACCTGTTTGTAGC 21 54.31 38.10

Tamaño del producto 331

Lugar de unión Este se diseñó de exón a exón

Tabla 2.- En esta tabla se resumen las principales características de los primers. G,C,A y T corresponden a las diferentes bases

nitrogenadas, %GC: Porciento de guanina-citosina y Tm: la temperatura a la cual la mitad de la concentración de los primers esta

apareada y la mitad no.

La secuencia obtenida se comparó en el BLAST y se obtuvo una cobertura del 100% para el conejo albino.

36

Del diseño de los primers para oct4 se obtuvieron las siguientes características:

Sequence (5'->3') Tamaño Tm GC%

Forward primer AAGGAGAAGCTGGAGCAA 18 55.67 50.00

Reverse primer GCTTACACATGTTCTTGAAACT 22 55.23 36.36

Tamaño del producto 223

Lugar de unión Este se diseñó de exón a exón

Tabla 3.- En esta tabla se resumen las principales características de los primers. G,C,A y T corresponden a las diferentes bases

nitrogenadas, %GC: Porciento de guanina-citosina y Tm: la temperatura a la cual la mitad de la concentración de los primers esta

apareada y la mitad no.

La secuencia obtenida se comparó en el BLAST y se obtuvo una cobertura del 100% para el conejo albino.

Del diseño de los primers para sox2 se obtuvieron las siguientes características:

Sequence (5'->3') Tamaño Tm GC%

Forward primer CGGATTATAAATACCGGCCC 20 55.84 50.00

Reverse primer AGCTGGTCCTGCATCAT 17 55.20 52.94

Tamaño del producto 217

Lugar de unión Este se diseñó de exón a exón

Tabla 4.- En esta tabla se resumen las principales características de los primers. G,C,A y T corresponden a las diferentes bases

nitrogenadas, %GC: Porciento de guanina-citosina y Tm: la temperatura a la cual la mitad de la concentración de los primers esta

apareada y la mitad no.

La secuencia obtenida se comparó en el BLAST y se obtuvo una cobertura del 100% para el conejo albino.