INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALLa quitina es el compuesto orgánico más abundante en el planeta...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

TITULO:

“CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR DE

QUITINASAS EN CEPAS MEXICANAS DE B. thuringiensis”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN

CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

PRESENTA

BIÓLOGO JUAN MAURICIO FORTUNA GONZÁLEZ

Reynosa, Tam. Diciembre 2009

“Caracterización bioquímica y molecular de quitinasas en cepas mexicanas de B. thuringiensis”


El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotenología

Ambiental del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico

Nacional, bajo la dirección de la Doctora Ninfa María Rosas García y la co-

dirección del Doctor Eleazar Barboza Corona.


DEDICATORIA

A mi esposa Patricia Eugenia y a mi hijo Mauricio Bernabé, quienes son la razón mas

importante de mi vida.


AGRADECIMIENTOS

Al centro de Biotecnología Genómica por darme la oportunidad de realizar mis

estudios.

A los compañeros de Laboratorio que siempre estuvieron dispuestos s ayudarme,

Alejandro y Jesús.

A la Doctora Ninfa María Rosas García, por su dirección, apoyo y consejos.

A el Doctor Eleazar Barboza Corona, por el gran apoyo al proyecto.

A el Ing. Martín Santamaría por sus recomendaciones y palabras de aliento.

Al Club Rotario de Reynosa por su gran apoyo.

A todos ellos les doy las gracias por haberme ayudado a concluir este proyecto.


Contenido

RESUMEN ...................................................................................................................... 1

ABSTRACT ..................................................................................................................... 2

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 3

ANTECEDENTES ........................................................................................................... 5

Quitina ........................................................................................................................................................... 5

Quitinasas ...................................................................................................................................................... 6

Las quitinasas en B. thuringiensis ............................................................................................................... 12

Descripción de B. thuringiensis ........................................................................................................... 12

Reportes sobre la actividad sinérgica de las quitinasas y B. thuringiensis ......................................... 13

Caracterización Bioquímica y molecular de algunas quitinasas de B. thuringiensis ........................... 14

JUSTIFICACIóN ............................................................................................................ 18

HIPÓTESIS ................................................................................................................... 21

OBJETIVO GENERAL .................................................................................................. 21

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 21

MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 22

Selección de las cepas mexicanas de B. thuringiensis con actividad quitinolítica ...................................... 22

Determinación preliminar de la actividad quitinolítica .............................................................................. 22

Determinación de la actividad quitinolítica en las cepas seleccionadas .................................................... 24

Determinación de la actividad quitinolítica ........................................................................................ 27

Determinación del tipo de actividad quitinolítica mediante zimogramas .......................................... 28

Obtención de los genes de quitinasa en B. thuringiensis ........................................................................... 29

Extracción del DNA de las cepas seleccionadas .................................................................................. 29

Amplificación de los genes de las quitinasas de las cepas seleccionadas ........................................... 30

Purificación de los amplicones por medio del “QIAquick PCR Purification Kit” ................................. 31

Clonación de los genes de quitinasa al vector pBluescript II KS(+) ..................................................... 32

Digestión del vector pBluescript II KS(+) con SalI y PstI y ligación con los amplicones....................... 33


Transformación de E. coli con el vector recombinante .............................................................................. 35

Obtención de las células electrocompetentes .................................................................................... 35

Electroporación de las células ............................................................................................................. 36

Selección de las cepas recombinantes ................................................................................................ 36

Caracterización bioquímica y molecular de las quitinasas recombinantes obtenidas ............................... 37

Determinación del pH óptimo ............................................................................................................. 38

Determinación de la temperatura óptima .......................................................................................... 39

Análisis estadísticos ............................................................................................................................. 39

Determinación de la secuencia nucleotídica ...................................................................................... 39

RESULTADOS .............................................................................................................. 41

Secuencia de los genes de quitinasa provenientes de las cepas MR10, MR11, MR21, MR33 Y RN52. ...... 67

Secuencia del gen que codifica una endoquitinasa proveniente de la cepa MR10 ............................ 67

Secuencia gen que codifica una endoquitinasa proveniente de la cepa MR11 .................................. 70



Secuencia gen que codifica una endoquitinasa proveniente de la cepa RN52 .................................. 79

DISCUSIÓN .................................................................................................................. 83

CONCLUSIONES ......................................................................................................... 87

RECOMENDACIONES ................................................................................................. 88

LITERATURA citada ..................................................................................................... 89

ANEXOS ....................................................................................................................... 96

Anexo 1 ....................................................................................................................................................... 96

Alineamiento múltiple de las quitinasas recombinante de las cepas MR10 y de MR11, MR21, MR33

y RN52. ................................................................................................................................................ 96

Identidad entre las quitinasas recombinante de las cepas MR10 y de MR11, MR21, MR33 y RN52.102

Anexo 2 ..................................................................................................................................................... 103

Alineamiento de los sitios catalíticos de las endoquitinasas provenientes de las cepas MR10, MR11,

MR21, MR33, RN52 con otras quitinasas .......................................................................................... 103

Anexo 3 ..................................................................................................................................................... 106


1

RESUMEN

Se realizó el análisis bioquímico y molecular de quitinasas en cepas

nativas mexicanas de Bacillus thuringiensis. Se examinaron 98 cepas

provenientes de los estados de Tamaulipas, Nayarit y Michoacán mediante su

crecimiento en placas de agar-quitina. Las cepas MR10, MR11, MR21, MR33 y

RN52 fueron seleccionadas por su producción quitinolítica y sometidas a

ensayos mediante el método fluorogénico para determinar su actividad. Se

realizaron zimogramas utilizando sustratos sintéticos derivados de la quitina:

tetrámero [4-MU (GlcNAc)3] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’,N’’-triacetilquitotriosa;

trímero:[4-MU (GlcNAc)2] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’-diacetilquitobiosa;

dímero:[4-MU GlcNAc ] 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosamina y se

determinó que la actividad presentada por las cepas seleccionadas es de

endoquitinasa. Posteriormente se clonaron los genes de las endoquitinasas en

células de E. coli DH5α. Se corroboró la actividad enzimática de las

endoquitinasas secretadas por las cepas recombinantes. Se realizaron además

análisis de pH de las endoquitinasas recombinantes donde se observó una

actividad óptima entre pH 6.5 y 7.5, el análisis de temperatura óptima indicó

una actividad a 50ºC y a 60ºC. La determinación de la secuencia de las

endoquitinasas de las cepas MR10, MR11, MR21, MR33 Y RN52 reveló una

similitud entre ellas del 97% al 99%; en relación con otras secuencias de

endoquitinasas de Bacillus thuringiensis, el análisis reveló una similitud que

oscila desde el 94% al 99%, .


2

ABSTRACT

Biochemical and molecular analysis were conducted in Mexican native strains

of Bacillus thuringiensis. Ninety-eight strains native to Tamaulipas, Nayarit and

Michoacan states were grown on chitin-agar plates. The strains MR10, MR11,

MR21, MR33, and RN52 were selected and their chitinase activity was assayed

using fluoregenic chitin derivative 4-methylumbelliferyl- -D-N,N’,N’’-

triacetylchititriose (tetramer fluorescent derivative), 4-methylumbelliferyl- -D-

N,N’-diacetylchitobioside (trimeric fluorescent derivative), and 4-

methylumbelliferyl-N-acetyl- -D-glucosaminide (dimeric fluorescent derivative).

The chitinolytic activity was determined as endochitinase in all strains.

Endochitinase genes were cloned in E. coli DH5α cells. Enzymatic activity of

secreted endochitinases was tested again. pH and temperature analysis were

conducted, and the recombinant endochitinases retained enzymatic activity at

pH of 6.5 and 7.5, and demonstrated the highest activity at 50ºC and 60ºC.

Sequence analysis revealed a high similarity (97% and 99%) among

endochitinases from MR10, MR11, MR21, Mr33 and RN52, related to other

chitinases, all the endochitinases have a similarity of 94% to 99%.


3

INTRODUCCIÓN

Las quitinasas son enzimas que degradan a la quitina. En la actualidad

las aplicaciones biotecnológicas de las quitinasas son diversas, ya que son

utilizadas en la industria farmacéutica, alimentaria y en control biológico. La

producción de estas enzimas se realiza en una amplia gama de organismos,

sin embargo, existen reportes que muestran que B. thuringiensis produce

quitinasas con un gran potencial para utilizarlas además del control biológico,

en los rubros biotecnológicos antes mencionados.

B. thuringiensis es una bacteria Gram positiva, la cual es

morfológicamente semejante a B. cereus y B. anthracis. Sin embargo, durante

la fase de esporulación, B. thuringiensis forma cristales o cuerpos parasporales

formados por millones de proteínas denominados Cry, los cuales presentan

actividad contra una gran diversidad de insectos y cuyo efecto tóxico puede ser

incrementado (disminución de la dosis letal media) por la acción sinérgica de

quitinasas bacterianas.

Debido a la importancia que B. thuringiensis tiene como organismo

utilizado en el control biológico y además como un posible productor de

quitinasas con aplicaciones en diversas áreas biotecnológicas, el siguiente

trabajo tratará sobre la caracterización bioquímica y molecular de quitinasas de

cepas mexicanas de B. thuringiensis. Para llevar a cabo lo anterior, en este

trabajo se seleccionaron varias cepas cultivándolas en medio de Castañeda-

quitina coloidal y se detectó su actividad quitinolítica. Diversos genes que

codifican quitinasas en las cepas seleccionadas fueron amplificados, clonados

y secuenciados. Las secuencias deducidas de aminoácidos fueron analizadas


4

in silico y comparadas con las reportadas en el GenBank para otras quitinasas

de B. thuringiensis.


5

ANTECEDENTES

Quitina

La quitina es el compuesto orgánico más abundante en el planeta

después de la celulosa. Podemos encontrarla en organismos marinos como el

camarón, las jaibas, cangrejos y kril, constituyendo la quitina hasta el 75% del

peso de estos organismos, además, está presente en el exoesqueleto e

intestino de los insectos y en las paredes de los hongos (Wang y Chang 1997;

Barboza-Corona et al. 2007).

Debido a hallazgos paleontológicos, se han encontrado trazas de quitina

en los remanentes de la cutícula de fósiles de artrópodos, con una edad

aproximada de 420 millones de años, correspondiente al periodo Silúrico

(Jollès y Muzzarelly 1999, Bierstedt, et al. 1998).

La molécula de quitina se encuentra conformada por polímeros lineales

insolubles de β-1-4 N-acetilglucosamina (GlcNAc). Para su síntesis, necesita

del precursor activado uridina difosfato N-acetil-D-glucosamina, y de la enzima

quitina sintetasa (Lehninger 1995). Los estudios por difracción de rayos X

demuestran que se pueden encontrar tres formas polimórficas de este

polímero, siendo estas α-, β-, γ- quitina, las cuales difieren en el arreglo

molecular de las cadenas.

Las aplicaciones de la quitina en la actualidad abordan diversas áreas,

como la agricultura, medicina, tratamientos de aguas, elaboración de

cosméticos y biosensores (Lárez-Velásquez 2006).


6

Debido a que la quitina ha estado presente en la naturaleza durante miles de

años, diversos organismos han desarrollado un sistema compuesto por varias

enzimas (quitinasas) capaces de hidrolizarla y liberar moléculas de N-

acetilglucosamina que le sirve como fuente de carbono y nitrógeno.

Quitinasas

De acuerdo con la Comisión de Enzimas de la IUPAC (International Union

of Pure and Applied Chemistry), las quitinasas son enzimas que hidrolizan a la

quitina, por lo tanto, se encuentran agrupadas dentro de la clase tres, que

corresponde a las glicosil hidrolasas. Su secuencia aminoacídica permite

clasificar el conjunto de las glicosilhidrolasas en familias y conforme a este

criterio, las quitinasas se agrupan dentro de las familias 18, 19 y 20 (Polaina

2004). La familia 18 es diversa en términos evolutivos, ya que se encuentran

quitinasas de organismos como bacterias, hongos, virus, animales y de algunas

plantas. La familia 19 comprende quitinasas presentes en plantas y en

Streptomyces. Estas dos familias no comparten similitud en la secuencia

aminoacídica; además, su estructura 3D y mecanismos moleculares son

diferentes, lo cual hace pensar que provienen de diferentes ancestros. La

familia 20 incluye a la β-N-acetilhexosaminidasa que se encuentra en

Streptomycetes y en el humano. Las quitinasas se clasifican en dos grandes

categorías de acuerdo al lugar en donde se lleva a cabo la reacción de

hidrólisis en el sustrato:


7

1) Endoquitinasas

2) Exoquitinasas

Las endoquitinasas son enzimas que se unen de manera aleatoria a sitios

internos, lo cual genera multímeros de bajo peso molecular de GlcNAc, tales

como quitotetrosa, quitotriosa y diacetilquitobiosa. Las exoquitinasas a su vez

se dividen en dos subcategorias, las quitobiosidasas y las β-1-4 N-

glucosaminosidasas. Las quitobiosidasas catalizan la liberación de

diacetilquitobiosa comenzando con los extremos terminales no reducidos de las

microfibras de quitina, y las β-1-4 N-glucosaminosidasas se unen a productos

oligoméricos de endoquitinasas y quitobiosidasas, generando monómeros de

GlcNAc. Además, existe una vía que involucra la desacetilación de la quitina a

quitosana, la cual es convertido en residuos de glucosamina por acción de la

quitosanasa. Las quitinasas se clasifican también de acuerdo al grupo de

organismos que las producen, partiendo para ello de las secuencias de los

dominios catalíticos. Así tenemos que en plantas, las quitinasas se clasifican en

cinco clases y se representan con los números romanos I, II, III, IV y V. En los

hongos se clasifican en grupos, siendo estos el A y el B, por último en las

bacterias, las quitinasas están claramente separadas en tres subfamilias que

son la A, B y C (Dahiya et al. 2006).

Las quitinasas son enzimas que poseen un papel importante en diversos

organismos. En los virus, se ha observado que están implicadas en la

patogénesis, en los insectos en la degradación de su exoesqueleto durante la

muda, en hongos tienen un papel importante en procesos de autolisis, nutrición

y morfogénesis. En las plantas estas enzimas están involucradas en procesos

de respuesta a stress y de resistencia contra hongos fitopatógenos. En los


8

vertebrados se encuentran en el tracto digestivo y en las bacterias, están

implicadas en la nutrición y el parasitismo (Taira et. al. 2002; Patil et al. 2000,

Merzendorfer 2006).

Por otro lado, la expresión de los genes de quitinasa en microorganismos es

controlada por medio de un sistema inductor/represor, en el cual, la quitina u

otros productos de la degradación actúan como inductores. En hongos, se ha

observado que la glucosa y otras fuentes de carbono funcionan como

represores del sistema. La expresión de los genes ech42 y chit36 de

Trichoderma harzianum es inducida por medio de paredes celulares, por quitina

coloidal o por la ausencia de carbono, por otro lado, la presencia de altas

concentraciones de glucosa o de glicerol inhibe su expresión. Investigaciones

posteriores demuestran que la transcripción del gene ech42 puede ser inducido

por otros medios como el estrés fisiológico, bajas temperaturas y por una alta

presión osmótica. Además, se han encontrando cuatro copias de un elemento

hipotético de respuesta al estrés (CCCCT) que se ubica en el promotor de este

gen. Un elemento similar de respuesta al estrés se ha reportado en

Saccharomyces cerevisiae (Felse y Panda 1999).

De manera general, las quitinasas presentan una conformación modular,

siendo variables la cantidad de ellos de acuerdo con el organismo en el cual se

encuentren. La familia 18 de las glicosilhidrolasas presenta en hongos una

estructura de cinco multidominios o regiones:

1) La región N-terminal, correspondiente al péptido señal

2) El dominio catalítico

3) Una región rica en serina/treonina


9

4) Un dominio de unión a quitina

5) Una región C-terminal

Sin embargo, se ha observado que no se necesitan todas las regiones de la

enzima para que esta sea activa (Duo-Chan 2006). El mecanismo de acción de

las enzimas se puede presentar de dos formas, por medio de un mecanismo de

retención de doble desplazamiento y el mecanismo de inversión de

desplazamiento sencillo. El mecanismo de retención de doble desplazamiento

fue descrito por primera vez para explicar el funcionamiento catalítico de la

enzima lisozima (Stryer 2001). Este proceso se observa en la figura 1:


10

Fig. 1. Mecanismo de acción por retención de doble desplazamiento.


11

El mecanismo de inversión de desplazamiento sencillo presenta una

inversión de la configuración anomérica, en el cual, una molécula de agua

actua como nucleófilo. Lo anterior se sugiere a partir de estudios de

cristalografía de rayos X, debido a que el segundo carboxilato catalítico esta lo

suficientemente cerca para coordinar a la molécula de agua en un mecanismo

de desplazamiento sencillo (Brameld y Goddard 1998).

Son varios los géneros bacterianos que producen quitinasas, entre ellos,

podemos encontrar algunos representantes del género Serratia. El ejemplo

más distintivo de este género lo tiene Serratia marcescens, la cual es la

especie tipo del género y su estudio ha sido de gran utilidad en su aplicación en

la industria biotecnológica, debido a su alta producción de quitinasas y su

capacidad para degradar a la quitina. Esta enterobacteria es patógena para el

hombre, sin embargo, su estudio se enfoca en la expresión de sus genes chiA

productores de quitinasas aplicados en el área de control biológico y de otros

giros biotecnológicos. Estos genes al ser clonados y producir cepas

recombinantes, producen efectos sinérgicos, potenciandores o de mayor

expresión de la enzima (Ruiz-Sánchez et al. 2005a, Ruiz-Sánchez et al. 2005b;

Grimont y Grimont 2006).


12

Las quitinasas en B. thuringiensis

Descripción de B. thuringiensis

B. thuringiensis es el organismo entomopatógeno mas utilizado en

términos de control biológico. Es una bacteria Gram positiva, es aerobia estricta

y morfológicamente parecida a B. cereus y B. anthracis, sin embargo, al entrar

en su etapa de esporulación produce cristales proteicos denominados Cry, los

cuales son tóxicos para larvas de insectos susceptibles, que son plagas de

cultivos. B. thuringiensis es considerada una bacteria ubicua ya que se ha

aislado de sistemas muy diversos como el agua, el suelo, las hojas de las

plantas y solo ocasionalmente de insectos muertos (Soberón y Bravo 2006). El

mecanismo de acción de las proteínas Cry se lleva a cabo de la manera

siguiente:

Los cristales paraesporales de B. thuringiensis son ingeridos por la larva

del insecto, solubilizándose en el intestino de éste y liberando las proteínas

cristalinas en su forma de protoxina. La solubilización del cristal se lleva a cabo

en un pH alcalino, el cual existe en insectos susceptibles. La proteólisis en el

tracto digestivo del insecto produce la activación del fragmento tóxico. Este

fragmento tóxico que atraviesa la membrana peritrófica, la cual protege el

epitelio intestinal contra daño el mecánico debido al paso del alimento, a la

acción de los radicales libres, y a la invasión por microorganismos, se une a

moléculas específicas de la membrana epitelial creando poros que conducen a

un desequilibrio osmótico y lisis celular. El tejido intestinal en tales condiciones

es incapaz de retener y asimilar los compuestos vitales para la larva del


13

insecto, lo cual provoca su muerte. La unión de estas proteínas tóxicas al

epitelio se explica por una alta afinidad de ellas a moléculas presentes en la

membrana, denominadas receptores. Sin embargo, estas moléculas no son en

un sentido estricto receptores, ya que su función seguramente no es de servir

de unión a un agente que producirá la muerte al organismo (Caballero y Ferré

2001).

Reportes sobre la actividad sinérgica de las quitinasas y B. thuringiensis

Existen diversos reportes que mencionan tras la adición de quitinasas,

un efecto potenciador de la actividad insecticida asociada a B. thuringiensis. En

1974, Smirnoff reportó la adición de quitinasa a una preparación comercial; en

1983, Sneh et al., utilizaron quitinasas producidas por bacterias que se

encontraban en el tracto digestivo de los insectos y en 1996 Wiwat et al.,

emplearon una preparación cruda de quitinasa de B. circulans. Sin embargo,

todas estas preparaciones al ser extractos crudos podían haber llevado

proteasas o algún otro contaminante que potenciara el efecto de B.

thuringiensis.

Para evitar esta posible contaminación, en 1998, clonaron y expresaron

el gen de la quitinasas chiA de Serratia marcescens en una cepa recombinante

de E. coli. La quitinasa obtenida fue combinada con bacterias liofilizadas de B.

thuringiensis cepa HD133 y IPS78, ambas con actividad quitinolítica. Los

organismos blanco seleccionados para la prueba fueron larvas de Cullicoides

nubeculosus y Spodoptera littoralis. Los resultados confirmaron que las

quitinasas producidas por la cepa recombinante potenciaban el efecto tóxico de

B. thuringiensis. La explicación más aceptada para este potenciamiento en la

actividad insecticida es el siguiente: al presentar el insecto una membrana


14

peritrófica cuyo componente principal es la quitina, la quitinasa degrada esta

barrera permitiendo el paso más fácilmente de las proteínas Cry, uniéndose

éstas a las moléculas receptoras, propiciando así la formación de poros en el

epitelio, causando la muerte del insecto con dosis menores de cristales

(Sampson y Gooday 1998).

Caracterización Bioquímica y molecular de algunas quitinasas de B.

thuringiensis

El análisis in silico de la endoquitinasa ChiA-HD73 de B. thuringiensis

sugiere un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 676

aminoácidos con una masa molecular deducida de 74.5 kDa, un promotor

hipotético y una secuencia Shine-Dalgarno rio arriba. El programa Signal

Peptide Prediction sugiere la presencia de un péptido señal hipotético con un

punto de unión localizado entre Leu-23 y Thr-24. Esta enzima posee una

estructura modular compuesta de un dominio catalítico y un dominio hipotético

de unión a quitina (ChBD) (Barboza-Corona et al. 2007). La identidad con otras

quitinasas de acuerdo con su dominio catalítico se muestra en el cuadro 1.

Tabla 1. Identidad de diversas endoquitinasas bacterianas con respecto a la

endoquitinasa ChiA-HD73 de B. thuringiensis


15

Organismo Proteina Identidad

B. circulans Chi41 68.4%

B. subtilis Chi 67.1%

Serratia marcescens ChiA 39.7%

Enterobacter agglomerans ChiA 39.7%

Los residuos Trp-591, Tyr-595 y Trp-626 de la quitinasa ChiA-HD73 son

altamente conservados no solamente en B. thuringiensis, también en otras

bacterias como Serratia marcescens y B. circulans.

Una aplicación potencial sugerida para esta enzima es como agente de

control biológico en contra de hongos fitopatógenos, para ser expresada en

plantas transgénicas y como agente sinérgico en B. thuringiensis potenciando

su toxicidad contra insectos plaga susceptibles. Un uso biotecnológico adicional

posible de esta endoquitinasa es la producción de oligosacáridos empleados en

la industria alimentaria (Barboza-Corona et al. 2007).

El análisis in silico de la endoquitinasa ChiA74 de B. thuringiensis

serovar. kenyae, reveló que es una enzima modular compuesta de tres

dominios: un dominio perteneciente a la familia 18 de quitinasas, dos dominios

para fibronectina (FLDs) y un dominio de unión a quitina (CBD). Las

identidades con otras quitinasas de acuerdo al dominio catalítico de la familia

18 (Gly-147 a Ser-222) se presentan en el cuadro 2. Las pruebas bioquímicas

muestran que el rango de pH de esta enzima se encuentra entre 4 y 9, la


16

temperatura óptima se estimó en 57.2ºC y su peso molecular es de 70 kDa

(Barboza-Corona et al. 2003).

Tabla 2. Identidad de diversas endoquitinasas bacterianas con respecto a la

endoquitinasa ChiA74 de B. thuringiensis serovar kenyae

Organismo Proteína Identidad

B. cereus ChiB 100%

B. thuringiensis serovar.

pakistani

ChiA71 98.7%

B. circulans Chi41 68.4%

B. circulans ChiA 65.8%

B. subtilis Chi 67.1%

Clostidiun paraputrificum ChiA 43.4%

Serratia marcescens ChiA 39.7%

Enterobacter agglomerans ChiA 39.7%

El gene de la quitinasa chi225 presenta un marco de lectura abierto de

2031 nucleótidos que codifican una proteína de 676 aminoácidos con una masa

molecular calculada de 74 kDa. Presenta una secuencia Shine-Dalgarno que

se encuentra 5 pb rio arriba del codón de iniciación. Presenta un promotor

hipotético idéntico a los reportados para el gen chiA71 de B. thuringiensis

subsp. pakistani y para el gen chiA74 de B. thuringiensis subsp. kenyae. Al


17

igual que otros genes de quitinasas reportados para B. thuringiensis, su

expresión se lleva a cabo durante la fase de crecimiento vegetativo (Driss et al.

2005).


18

JUSTIFICACIÓN

Las aplicaciones de las quitinasas en biotecnología son diversas. En la

industria alimentaria son usadas para producir quitooligosacáridos, los cuales

son utilizados como prebióticos. Los prebióticos son ingredientes no digeribles

de la dieta que producen efectos beneficiosos, estimulando selectivamente el

crecimiento y/o actividad de uno o más tipos de bacterias en el colon, las que

tienen a su vez la propiedad de elevar el potencial de salud del hospedero

(Cagigas y Anest, 2002).

Desde hace tiempo es posible clonar los genes de quitinasas de

diversos organismos en E. coli. Uno de los primeros genes de quitinasas

clonados fue de Enterobacter agglomerans, obteniendo buenos resultados

(Chernin et al. 1997)

En el área de control biológico, existen buenas expectativas para

producir plantas transgénicas que expresen el gen de la quitinasa, generando

en ellas de esta manera resistencia a hongos fitopatógenos. Algunos estudios

con el gen de quitinasa chit42 de Trichoderma harzianum, que codifica una

poderosa endoquitinasa, han logrado su expresión en tabaco, manzana y papa

consiguiendo con ello un alto nivel de resistencia (Lorito et al. 1998, Bolar et al.

2000). En plantas trasgénicas de tabaco, que expresan la quitinasa Cts1 de

Saccharomyces cerevisiae, se observó la inhibición de la germinación de

esporas y el crecimiento de las hifas de Botrytis cinerea (Carstens et al. 2003).

Bacillus thuringiensis es una bacteria de gran utilidad desde hace ya

varias décadas, puesto que sus esporas y cristales son los componentes

activos de una gran variedad de bioinsecticidas disponibles en el mercado, y su


19

capacidad para producir quitinasas, ha despertado interés en la búsqueda de

un mayor número de aplicaciones biotecnológicas. En B. thuringiensis, las

quitinasas ofrecen un potenciamiento de su efecto tóxico, incluso, combinando

cepas atóxicas quitinolíticas con cepas tóxicas no quitinolíticas

(Lertcanawanichakul et al. 2004). Liu et al. (2002) reportaron un efecto

potenciador al encontrar que la cepa tóxica DL5789 de B. thuringiensis en

combinación con la cepa quitinolítica atóxica T04A001 de B. thuringiensis,

aumentó su toxicidad en un rango de 2.35 y un valor de LC50 de 0.446 mg g-1

al primer instar larvario de Spodoptera exigua. En contraste, el valor de LC50

solamente de la cepa DL5789 fue de 1.047 mg g-1.

Posteriormente en algunos estudios las quitinasas fueron adicionadas al

principio activo de B. thuringiensis, lo que motivó a que diversos grupos hayan

tratado de sobre expresar las quitinasas en el mismo B. thuringiensis con el

propósito de producir en un mismo biorreactor ambos compuestos (proteínas

Cry y quitinasas) en concentraciones óptimas que permitan lograr algún efecto

sinérgico (Casique-Arroyo et al. 2007).

Las quitinasas producidas por B. thuringiensis también tienen potencial

para el control biológico de hongos fitopatógenos, ampliando de esta manera el

rango de aplicaciones para esta bacteria. Trabajos recientemente reportados

indican que las quitinasas de B. thuringiensis inhiben el crecimiento de los

hongos Sclerotium rolfsii en un 100% y de Aspergillus terreus, A. flavus,

Nigrospora sp., Rhizhopus sp., A. niger, Fusarium sp, A. candidus, Absidia sp.

y Helminthosporium sp., en porcentajes que oscilan entre 55% a 82% (Reyes-

Ramirez et al. 2004; Morales de la Vega et al. 2006).


20

Otros usos que se han sugerido para la utilización de las quitinasas de

B. thuringiensis, además del control biológico, es la producción de

oligosacáridos para la industria alimentaria y farmacéutica (Yong-Seok et al.

2007, Rojas-Avelizapa et al. 1999). En este punto es importante comentar que

recientemente se reportó la producción de quitinasas bacterianas en un

sistema heterólogo y su efectividad en la producción de quitooligosacáridos con

efecto inhibitorio contra bacterias patógenas de importancia en alimentos

(Barboza-Corona et al. 2008).

Debido a lo anteriormente descrito, el empleo de las quitinasas en los

diversos campos de la biotecnología es muy amplio, y especialmente el empleo

de B. thuringiensis como un agente de control biológico así como productor de

estas enzimas. A la fecha, se han reportado 21 secuencias en el GenBank que

corresponden a quitinasas de B. thuringiensis sin embargo, sólo 7 de ellas han

sido caracterizadas bioquímica y molecularmente. El tener una mayor cantidad

de quitinasas caracterizadas de B. thuringiensis, así como el realizar una mayor

búsqueda de ellas, son motivos que ofrecen buenas expectativas de desarrollar

nuevos formulados o de procesos novedosos para la obtención de productos

con valor agregado, ampliando considerablemente las aplicaciones de esta

bacteria.


21

HIPÓTESIS

Las quitinasas producidas por las cepas mexicanas presentan

diferencias en sus actividades enzimáticas debido a las diferencias en las

secuencias nucleotídicas de sus genes.

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar bioquímica y molecularmente las quitinasas que se

encuentren en las cepas nativas mexicanas de B. thuringiensis

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar el perfil de quitinasas en una colección de cepas nativas

mexicanas de B. thuringiensis

2. Caracterizar los genes de quitinasas en las cepas de B. thuringiensis

seleccionadas de acuerdo con su perfil quitinolítico.

3. Caracterizar bioquímicamente las quitinasas producidas por los genes

seleccionados


22

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de las cepas mexicanas de B. thuringiensis con actividad

quitinolítica

Se seleccionaron 96 cepas de B. thuringiensis de la colección del

Laboratorio de Biotecnología Ambiental. Como cepa de referencia se utilizó

Serratia marcescens Nima (proporcionada por el Dr. R. Cruz-Camarillo), debido

a que es una buena productora de quitinasas y está bioquímicamente

caracterizada (Barboza-Corona et al. 2005). Las cepas de estudio fueron

aisladas de suelo de cultivos agrícolas de los estados de Tamaulipas, Nayarit y

Michoacán.

Determinación preliminar de la actividad quitinolítica

Se preparó quitina coloidal de la siguiente manera: a 10 g de quitina

comercial obtenida de caparazones de cangrejos (Sigma) se adicionaron 100

ml de ácido fosfórico concentrado (85% v/v) y se mezcló hasta obtener una

solución homogénea que se almacenó a 4oC durante 24 h. Posteriormente se

añadieron 100 ml de agua destilada a la solución y se almacenó a 4ºC. Esta

operación se repitió a las 48 h. Posteriormente la solución de quitina se

centrifugó y el precipitado se lavó con agua purificada varias veces para

eliminar el ácido fosfórico y obtener un pH de 7.0. Para neutralizar el ácido se

utilizó NaOH 10 M. La quitina húmeda obtenida se secó en una estufa a 80ºC y


23

después se molió primeramente en un molino manual para maíz y/o café y

posteriormente en un mortero. La quitina molida se pasó por un tamiz del

número 60 para homogenizar el tamaño de partícula.

Posteriormente se preparó el medio Castañeda-quitina de la siguiente

manera: en 100 ml de agua se mezclaron 0.06% (p/v) de citrato de amonio,

0.02% de NaCl, 0.04% de KH2PO4, 0.04% de Na2CO3 y 0.01% de MgSO4.7H2O;

(pH 7.0). Esta solución se complementó agregando de un 12-15% de quitina

coloidal y 2.5 g de agar (Castañeda-Agulló 1955).

Los microorganismos incluyendo el testigo, se sembraron en placas con

medio Castañeda-quitina y se incubaron de 3-6 días para observar los halos

de degradación. El criterio de selección para elegir las cepas con mayor

potencial quitinolítico se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Criterios de selección para cepas quitinolíticas de acuerdo al tamaño

del halo de degradación.

Valor Característica

0 No hay crecimiento

1 Se observa crecimiento

2 Degradación del total del sustrato por debajo de la colonia

3 Formación de halos de hidrólisis menores a 1 mm

4 Formación de halos de hidrólisis mayores a 1 mm


24

Determinación de la actividad quitinolítica en las cepas seleccionadas

Para determinar la actividad quitinolítica de las cepas seleccionadas se

tomaron 18 tubos de ensaye de 50 ml estériles, y a nueve de ellos se les

adicionaron 3 ml del medio Castañeda y a los nueve restantes se les

adicionaron 3 ml del medio NB. El medio NB se preparó adicionando 8 g de

caldo nutritivo, 1.5 g de extracto de levadura y 0.05 g de MnCl2 en 50 ml de

NaH2PO4 1 M. Después de esterilizar el medio se adicionaron 1.22 ml de

MgSO4 1 M y 0.68 ml CaCl2 1M (previamente esterilizados).

Los tubos con medio Castañeda y NB se inocularon con las cepas

seleccionadas y se colocaron en agitación a 200 rpm y a 28 ºC durante toda la

noche. Transcurrido este tiempo se midió la absorbancia a 600 nm para

obtener una densidad óptica de 1 en un espectrofotómetro DV 650 marca

Beckman-Coulter USA. Se utilizaron como blancos el medio Castañeda-quitina

y el medio NB para calcular la densidad bacteriana. A continuación se

inocularon 9 matraces de 250 ml con 40 ml de medio Castañeda-quitina y 9

matraces de 250 ml con 40 ml de medio NB, de acuerdo a la cantidad estimada

de cultivo. Los matraces se incubaron en agitación a 200 rpm durante 72 h a 28

ºC.

Al término de este periodo de tiempo, los cultivos de cada uno de los

matraces se transfirieron a tubos de 50 ml y se centrifugaron a 3800 rpm

durante 20 min a 4 ºC. Al sobrenadante se le adicionó sulfato de amonio hasta

lograr una saturación del 80% dicha cantidad se calculó en base a la Tabla 4

de acuerdo a la cantidad de sobrenadante obtenido.


25

Tabla 4. Porcentaje de saturación de soluciones de sulfato de amonio

Adaptado de “Data for Biochemical Research” (R.M. C. Dawson, D.C. Elliott,

W.H. Elliott, and K.M. Jones, eds) 2nd Ed. Oxford Univ. Press, London, 1969.

El contenido de cada matraz fue transferido a tubos de 50 ml y

almacenado a 4ºC durante toda la noche. Posteriormente los sobrenadantes se

centrifugaron a 3800 rpm durante 20 min a 4 ºC. El precipitado obtenido se

colectó y se resuspendió en un buffer de fosfatos 100 mM pH 6. El buffer de

fosfatos se preparó de acuerdo a la metodología de Sambrock y Russell

(2001).


26

Fig. 2. Viales y roscas perforadas utilizadas en las diálisis

Los precipitados se sometieron a una diálisis para lo cual se utilizó una

membrana de celulosa con un tamaño de corte de 15 kDa y viales con tapón de

rosca. Se hizo una perforación a cada una de las tapas de los viales para

acoplar la membrana (Fig. 2). Los precipitados fueron colocadas en los viales y

éstos se colocaron en los contenedores que se sumergieron en un recipiente

que contenía 6 l de buffer de fosfatos 100 mM pH 6 y un agitador magnético

para mantener el buffer en constante circulación. Cada tubo se insertó en un

trozo de poliestireno expandido para que no se hundieran. El recipiente con

agitación se refrigeró por 12 h. A las 6 h se desechó el buffer del recipiente y se

cambió por uno recién preparado. Posteriormente los precipitados dializados

fueron resuspendidos en buffer de fosfatos 100 mM, pH 6.8, en tubos de 20 ml

y se mantuvieron a 4ºC hasta su uso en los ensayos siguientes.


27

Determinación de la actividad quitinolítica

La actividad de la quitinasa se determinó por el método fluorogénico

para lo cual se prepararon 100 ml de una solución patrón de 4-

metilumbeliferona (MU) 5 mM a partir de la cual se prepararon diluciones que

se utilizaron para la calibración del fluorómetro (Turner modelo TD-360). A

partir de esta solución, se prepararon 50 ml de MU 1 M, con Na2CO3 0.2 M.

Para realizar la curva de calibración se hicieron diluciones de 0.1 hasta 0.9 M.

Los derivados sintéticos [4-MU (GlcNAc)3] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’,N’’-

triacetilquitotriosa (tetrámero), [4-MU (GlcNAc)2] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’-

diacetilquitobiosa (trímero) y [4-MU GlcNAc ] 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-

glucosamina (dímero) se prepararon de la siguiente manera: cada derivado

sintético (tetrámero, trímero, dímero) se disolvió en buffer de fosfatos 100 mM

pH 6.8 para obtener una concentración final de 1 mg/ml. Se mantuvieron en

refrigeración por toda noche y al siguiente día se mezclaron en un vortex.

Para determinar la actividad quitinolítica del precipitado se preparó un buffer de

reacción con 120 l del derivado sintético solubilizado en 15 ml de buffer de

fosfatos 100 mM pH 6.8. Se hizo una solución con 10 l del precipitado

dializado, 215 l de H2O destilada estéril y 300 l del buffer de reacción. Esto

se homogenizó con micropipeta lentamente. Se incubó a 37ºC durante 30 min.

Posteriormente, se agregaron 300 l de Na2CO3 0.2 M, se mezcló suavemente

en vortex y se leyó en el fluorómetro previamente calibrado con las diluciones

de MU. La actividad quitinolítica se midió en unidades enzimáticas (U). Esta fue

definida como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1 mol de MU


28

en 1 h (Barboza-Corona et al. 2003). Los datos obtenidos se sometieron a un

ANOVA y prueba de Tukey para comparación de medias con una P = 0.05

utilizando el software SPSS v. 10.0

Determinación del tipo de actividad quitinolítica mediante zimogramas

A 37.5 l de las muestras dializadas y resuspendidas se les adicionaron

7.5 l de 2-mercaptoetanol 2X. A continuación las muestras fueron colocadas

en agua hirviendo durante 5 ó 6 min y se centrifugaron a 14000 rpm durante 4

min. Se tomaron 20 l de cada una de las muestras y se separaron en dos

geles de poliacrilamida al 12%. La electroforesis se corrió durante 1 h a 80 V y

a 120 V durante 2 h. A continuación los geles se procesaron de la siguiente

manera: uno de ellos se tiñó con azul de Coomasie durante 2 h, utilizando un

agitador orbital en movimiento lento. Subsiguientemente se retiró el colorante y

se destiñó durante el tiempo necesario revisando el gel constantemente, hasta

la visualización de las bandas. El otro gel se lavó 4 veces por 15 min con buffer

de caseína/EDTA (10 g /L de caseina, 2 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 9), con

el propósito de remover el SDS. Posteriormente, se equilibró durante 20 min

con buffer de fosfatos 6.8 M, haciendo cambios cada 5 min. Para preparar el

zimograma, los geles de poliacrilamida se cubrieron con un gel de agarosa del

tipo VIII de bajo punto (Sigma) de fusión al 1% en buffer de fosfatos 100 mM y

se adicionaron de 75 l 4-MU-(GlcNAc)3 , 4-MU-(GlcNAc)2 o 4-MU-GlcNAc [1

g/ L] (SIGMA), (Barboza-Corona et al. 2003). El gel se incubó (tapado con

papel Aluminio) a 37 °C por 10min, la actividad de quitinasa se observó bajo la

luz UV y se fotografió en el sistema “Gel Doc” (BioRad). Al tomar la foto se

colocó una regla junto al gel, para luego comparar el peso molecular de la


29

quitinasa con un marcador de peso molecular (Invitrogen life Technologies). Es

importante comentar que para que la agarosa se pueda esparcir de manera

homogénea sobre el gel, se debe de preparar en el microondas mediante

pulsos de 2 segundos, revisando que la mezcla quede transparente antes de

colocarla en el gel.

Obtención de los genes de quitinasa en B. thuringiensis

Extracción del DNA de las cepas seleccionadas

Las cepas seleccionadas se activaron en tubos Falcón con 2 ml de

medio LB y se incubaron durante 12 h con agitación a 180 rpm a 28ºC en el

Environ Shaker de Lab Line (Melrose Park IL). Posteriormente se vertió todo el

contenido de los tubos Falcón para inocular 6 matraces Erlenmeyer de 250 ml

con 75 ml de medio LB y se incubaron con agitación a 180 rpm durante 17 h a

28 °C. Las muestras fueron centrifugadas a 4000 rpm durante 20 min y a 4ºC,

se tiro el sobrenadante y a la pastilla se le adicionó 2 ml de una solución de

TES-sacarosa al 20%, lizosima 2 mg/ml y 1 l/ml de RNAsa a una

concentración de 10 mg/ml, y se incubó a 37ºC durante 90 a 120 min. en la

incubadora Shel Lab mod 1545 (Melrose park, IL). A cada tubo se agregaron 3

ml de una solución de SDS al 8% en TES y se incubaron en baño María

durante 15 min, posteriormente a cada tubo se le agregaron 1.5 ml de acetato

de sodio 3 M pH 4.8, se incubaron por 30 min y se centrifugaron a 13000 rpm

durante 20 min a 4ºC. El sobrenadante se colectó en tubos de 1.5 ml, se les

agregó 1 volumen de alcohol isopropílico y se incubaron durante la noche a -


30

20ºC. Para recuperar el DNA los tubos se centrifugaron a 13000 rpm durante

20 min a 4°C. La pastilla obtenida se lavó 2 veces con 1000 l de etanol al

70%, el sobrenadante se decantó. El DNA concentrado se resuspendió en 100

l de TRIS 10 mM.

Para llevar a cabo la confirmación de la obtención del DNA, se cargaron

5 l del DNA en 3 ml de buffer de carga Blue/Orange 6X en un gel de agarosa

al 0.8% en TAE 1%.

Amplificación de los genes de las quitinasas de las cepas seleccionadas

Para la amplificación del gen de quitinasa, se utilizaron los primers

ChiA74-1 y ChiA74-3 reportados por Barboza-Corona et al. (2007). Su diseño

se basó en regiones conservadas de ChiA74 que incluyen secuencias

reguladoras como el promotor, sitio de unión a ribosoma y el terminador

transcripcional.

Las secuencias de los primers son las siguientes:

ChiA74-1 (5’- ACGCGTCGACCTTTCTACGTCTTTAATAATTGGCTCCATA-3’)

ChiA74-3 (5’- AACTGCAGCGAAAGCCTTTCCCTAACAGGTGACTATC-3’)

Los nucleótidos subrayados corresponden a los sitios SalI y PstI

respectivamente.

Para llevar a cabo la amplificación se utilizó el kit de PCR, PCR

Supermix High Fidelity de Invitrogen.

La mezcla de reacción se indica en la Tabla 5:


31

Tabla 5. Cantidades de la mezcla de reacción para la amplificación de los

genes de quitinasa en cepas de B. thuringiensis

Reactivos Cantidades ( l)

DNA 1.5 L Oligo directo ChiA74-1 2 L Oligo reverso ChiA74-1 2 L PCR MIX 45 L TOTAL 50.5 L

El ciclo utilizado fue el siguiente:

Fig. 3. Ciclo de PCR para la amplificación de los genes de quitinasa

Purificación de los amplicones por medio del “QIAquick PCR Purification Kit”

La purificación de los productos de PCR se realizó de acuerdo al

protocolo descrito a continuación: los productos de PCR se transfirieron a

tubos eppendorf de 1.5 ml. A cada muestra se le adicionaron 5 volúmenes de

buffer PB. Posteriormente se transfirió la mezcla a las columnas QIAquick con

sus respectivos tubos de 2 ml para colecta. Se procedió a centrifugar durante

30 a 60 seg a 14000 rpm en una microcentrifuga Hemle 2160M (Alemania


32

2000). La solución colectada en los tubos se desechó y se reutilizó el mismo

tubo. Se agregaron 0.75 ml de buffer PE a la columna, se centrifugó durante 60

seg y se desechó el sobrenadante. La columna se centrifugó por un período

adicional de 1 min a 14000 rpm para eliminar completamente el etanol del

buffer PE. La columna fue tranferida a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y el

DNA eluido con 30 o 50 μl de TRIS 10 mM pH 8 (buffer EB).

Clonación de los genes de quitinasa al vector pBluescript II KS(+)

Antes de clonar los genes que codifican quitinasas se procedio a la

amplificación del vector pBluescript II KS(+) (Stratagene, La Jolla CA, USA)

(Figura 4). Para realizarlo, se tomaron 100 l de células electrocompetentes de

Escherichia coli DH5 F´ supE44, lacU169 (F80lacZ M15) hsdR17 recA1 end

A1 gyrA96 thi-1 relA1 y se les añadieron 2 l del vector ( 400 ng) en un tubo

eppendorf de 1.5 ml, se mezclaron y transfirieron a una celda para electroporar

de 0.2 cm (Invitrogen). Las muestras fueron electroporadas a 2. 5 kV y despues

transferidas a 1 ml de medio LB donde fueron incubadas a 37ºC durante 1 h.

Finalmente, las células se distribuyeron en cajas de agar LB adicionado con

ampicilina (100 μg/mL), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-2-D-galactopyranoside (X-

GAL, 64μg/mL), y isopropyl-2-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.2 mM) y se

incubaron a 37 ºC durante 12 a 16 h. Se seleccionaron varias colonias azules

y los plásmidos fueron obtenidos mediante minipreparaciones de acuerdo a las

instrucciones del proveedor (Quiagen).


33

Digestión del vector pBluescript II KS(+) con SalI y PstI y ligación con los

amplicones

Tanto el pBluescript II KS(+) como los amplicones fueron digeridos con

las enzimas SalI y PstI de acuerdo con la recomendaciones del proveedor

(Invitrogen). La Fig. 4 esquematiza el procedimiento.


34

Fig.4. Representación esquemática del vector pBluescript II KS(+). En el mapa

se muestran los sitios de corte del vector donde fueron clonados los

amplicones. (Tomado de pBluescript II Phagemid Vectors INSTRUCTION

MANUAL, Catalog #212205, #212206, #212207 and #212208.Revision A.01)


35

Para llevar a cabo la ligación, los productos digerados fueron purificados

mediante un kit de extracción de geles (Quiagen) y su concentración

corroborada en geles de agarosa al 1%. De acuerdo a la concentración de los

productos digeridos se llevó a cabo una ligación a 16ºC durante toda la noche.

El plásmido generado se denominó pBluescript II-gQuit. Se realizó una diálisis

con membranas Millipore® de los productos de ligación obtenidos para eliminar

las sales de la reacción de ligación, disminuyendo así la conductancia y el

riesgo de shock durante el proceso de electroporación en las células de E. coli

DH5α. Para llevar a cabo la diálisis se tomó una caja petri estéril y se le

adicionó agua desionizada estéril. Se cortaron las membranas y se colocan en

la superficie del líquido. Posteriormente se tomaron las muestras del producto

de ligación y se depositaron sobre la membrana, se tapó la caja y se dializó a

temperatura ambiente durante 30 min. El DNA se recolectó y se almacenó en

congelación a -20ºC hasta su introducción en células electrocompetentes.

Transformación de E. coli con el vector recombinante

Obtención de las células electrocompetentes

Las células se prepararon a partir de una célula de E. coli DH5α. Se

cultivaron durante toda la noche en 500 ml de medio LB a 37ºC y en agitación

rotatoria a 180 rpm. Posteriormente, el cultivo bacteriano se centrifugó en tubos

de 50 ml a 3800 rpm durante 20 min y a una temperatura de 4 ºC. Las pastillas

obtenidas fueron concentradas en un solo matraz y se resuspendieron en 100

ml de agua destilada fría. Nuevamente se centrifugó bajo las mismas

condiciones anteriores, se desechó el sobrenadante y la pastilla obtenida se


36

resuspendió en 100 ml de glicerol al 10% estéril. Este paso se repitió tres

veces. La pastilla obtenida en la última centrifugación se resuspendió en

glicerol al 10% estéril en un volumen de 3 ml. Se hicieron alícuotas de 100 l

en tubos de 1.5 ml y se congelaron a -20 ºC.

Electroporación de las células

Se tomaron con una pipeta 50 o 100 l de las bacterias

electrocompetentes y 5 l del producto de ligación y se depositó en cubetas

(Bio-Rad) de 1 ml sumergidas en hielo. El contenido de la cubeta se mezcló

con la pipeta, haciéndolo lentamente y posteriormente se colocó en el

electroporador (Gene pulser de Bio-Rad) y se dio un pulso de 25 F, 200Ω y

2.5 kV. Inmediatament se agregó 1 ml de medio LB, la mezcla se homogenizó y

se pasó a tubos de ensayo desechables estériles con tapa de 10 ml de

capacidad y la muestra fue incubada durante 1 h a 37ºC y a 180 rpm. El cultivo

fue sembrado en cajas de LB que contenian IPTG, Xgal, ampicilina y se

incubaron toda la noche a 37ºC.

Selección de las cepas recombinantes

Las colonias blancas fueron “picadas” con una punta esteril de

micropipeta y transferidas a tubos de ensaye con 3 ml de medio LB/ampicilina.

Se mantuvieron a una temperatura de 37ºC y con agitación rotatoria de 180

rpm durante toda la noche. Posteriormente se realizaron minipreps utilizando el

QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen. El protocolo utilizado fue el sugerido por

el fabricante.


37

Una vez obtenidas las minipreps, se tomaron 5 l de cada muestra y se

corrieron en geles de agarosa al 1% que contenia bromuro de etidio. El

corrimiento del gel se llevó aproximadamente durante 1 h a 80-100 V. Se

seleccionaron aquellas muestras que migraban más lentamente que el vector,

las cuales fueron digeridas con SalI, PstI o ambas. El tamaño del inserto fue

determinado mediante la escalera de 1 kb (Invitrogen®) (Fig. 5).

Fig. 5. Marcador de peso molecular de 1 kb DNA ladder de Invitrogen®

Caracterización bioquímica y molecular de las quitinasas recombinantes

obtenidas

Para determinar la actividad quitinolítica de las cepas recombinantes se

tomaron 7 tubos de ensaye de 50 ml estériles, y se les adicionaron 3 ml del

medio LB. El medio LB se preparó adicionando 8 g en 300 ml de agua

purificada. Los tubos con medio LB se inocularon con las 5 cepas


38

recombinantes, con E. coli y E. coli recombinante, se colocaron en agitación a

180 rpm y a 37ºC durante toda la noche. Transcurrido este tiempo se midió la

absorbancia a 600 nm para obtener una densidad óptica de 1. Se utilizó como

blanco medio LB para calcular la densidad bacteriana. A continuación se

inocularon 7 matraces de 250 ml con 40 ml de medio LB con una alícuota de

bacterias de acuerdo a la cantidad estimada en el cultivo. Los matraces se

incubaron en agitación a 180 rpm durante 72 h a 37ºC.

Al término de este periodo de tiempo, los cultivos de cada uno de los

matraces se transfirieron a tubos de 50 ml y se centrifugaron a 3800 rpm

durante 20 min a 4 ºC en una centrifuga refrigerada Allegra 6R marca Beckman

Coulter USA. Al sobrenadante se le adicionó sulfato de amonio hasta lograr

una saturación del 80%, dicha cantidad se calculó en base a la Tabla 4.

La medición de la actividad quitinolítica de las clonas recombinantes se

efectúo por medio del método fluorogénico descrito anteriormente.

Determinación del pH óptimo

La actividad quitinolítica fue medida en un rango de pH de 3.5 a 9.5,

utilizando los derivados fluorescentes. Para realizar este ensayo se utilizaron 2

buffers: McIlvaine (pH 3.5 a 7.5) y de fosfatos/glicina (pH 7.5 a 9.5). El pH de

los buffers fue ajustado adicionando NaOH 10 M. La temperatura de la reacción

fue de 37ºC y el tiempo de incubación de 1 h. La medición de la actividad se

llevó a cabo mediante el método fluorogénico. La variante con respecto al

método descrito con anterioridad es que se utilizaron los buffers en rangos de


39

pH de 3.5, 4.5, 5.5……. 10.5, a diferencia del buffer de fosfatos utilizado de

manera constante para todas las reacciones a pH 6.8.

Determinación de la temperatura óptima

La temperatura óptima fue determinada en un rango entre los 10 ºC

hasta los 70 ºC mediante la medición de la actividad en contra de los tres

sustratos análogos de quitina de cada una de las quitinasas recombinantes

obtenidas. La temperatura de la reacción fue variable, siendo los rangos

utilizados 10ºC, 20ºC, 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC y 70ºC; el tiempo de incubación

fue 1 h. La medición de la actividad se llevó a cabo mediante el método

fluorogénico descrito anteriormente. Se utilizó un buffer de fosfatos a pH 6 para

realizar la mezcla de reacción.

Análisis estadísticos

Los datos obtenidos de la actividad quitinolítica tanto de las cepas parentales

como de las cepas recombinantes, así como el pH y la temperatura de las

enzimas recombinantes fueron sometidos a un análisis de varianza y

comparación de medias por la prueba de Tukey, P


40

primers universales (M13-forward y M13-reverse) para empezar la

secuenciación sobre el fragmento ya que este sitio se encuentra en el vector de

clonación y flanquea al fragmento de interés. Además, se diseñaron primers de

acuerdo a regiones conservadas de los fragmentos de estudio. Las muestras

fueron preparadas de acuerdo al protocolo de la Unidad de Secuenciación del

Departamento de Biotecnología del Centro de Biotecnología Genómica del IPN.

Para la lectura de los resultados obtenidos en el secuenciador, se utilizó

el software BioEdit v7.0.9.; el diseño de los primers, alineamiento y su

posterior ensamblaje se realizó con la suite bioinformática Lasergene v7.0.0.

Los análisis requeridos para búsqueda de los dominios de las proteínas,

así como el análisis químico in silico de las mismas, se llevaron a cabo

mediante programas disponibles en la red.

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, http://pfam.sanger.ac.uk/,

http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://pfam.sanger.ac.uk/http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html


41

RESULTADOS

Las cepas analizadas provenían de 3 estados (Nayarit, Tamaulipas,

Michoacán) de la República Mexicana. En la Tabla 6 se muestra las diferentes

cepas analizadas en este trabajo así como la forma en que se clasificaron.

Tabla 6. Cepas analizadas de B. thuringiensis para búsqueda de cepas

quitinolíticas.

Cepas

Nayarit Tamaulipas Michoacán

MR2 RN47 RT30 RT21 RT3 MR17 MR27 MR8

RN43 VR9 RT24 RT38 RT20 MR12 MR19 MR10

RN54 RN49 RT32 RT31 RT14 MR31 MR42 MR21

RN53 MR33 RT25 RT33 RT13 MR15 MR14

MR117 RN42 RT41 RT28 RT17 MR25 MR20

MR1 MR5 RT35 RT29 RT10 MR29 MR26

RN44 RN48 RT22 RT39 RT7 MR13 MR18

RN307 RN52 RT34 RT9 RT18 MR9 MR36

MR3 RT23 RT12 RT15 MR22 MR24

RN45 RT26 RT8 MR16 MR37

RN46 RT27 RT11 MR11 MR34

MR6 RT40 RT2 MR30 MR23

MR4 RT36 RT4 MR28 MR35


42

De las 85 cepas estudiadas se seleccionaron 8, de las cuales 4 fueron

de Michoacán y 4 de Nayarit. Estas cepas mostraron la formación de halos de

hidrólisis de quitina mayores a 1 mm (criterio 4) (Tabla 7).

Tabla 7. Cepas seleccionadas de B. thuringiensis con actividad quitinolítica

Clave de cepa Cepa Criterio de selección

1 MR11 4

2 RN52 4

3 MR19 4

4 RN47 4

5 RN48 4

6 MR10 4

7 MR33 4

8 MR21 4

Cuando las cepas fueron cultivadas en medio NB, las proteínas de

secreción presentaron actividad principalmente contra el derivado fluorescente

tetramérico. De manera particular la cepa RN48 presentó una actividad

estadísticamente igual a la de S. marscesens (F= 18.483, gl= 8,18 P≤0.01). Por

otro lado, las cepas MR11, RN47, RN48, MR10 y MR21 presentaron la mayor

actividad hacia el trímero (F= 100.28, gl=8,18, P≤ 0.01). A excepción de la cepa

control, todas la demás presentaron actividades muy pequeñas contra el

derivado dimérico (F=913.162, gl= 8,18, P≤ 0.01), (Tabla 8).


43

Tabla 8. Análisis de la actividad quitinolítica (U/ml) de las cepas cultivadas en

medio NB con los tres sustratos análogos de quitina.

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa

Prueba de Tukey P< 0.05

‡ Tetrámero : [4-MU (GlcNAc)3] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’,N’’-triacetilquitotriosa, Trímero:[4-MU

(GlcNAc)2] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’-diacetilquitobiosa, Dímero:[4-MU GlcNAc ] 4-metilumbeliferil-N-

acetil-β-D-glucosamina

Con respecto a las cepas cultivadas en medio Castañeda-quitina, la

cepa que presentó mayor actividad con el tetrámero fue la RN47 (F=110.256,

gl= 8, 18, P≤). Las cepas MR11, RN47, RN48, MR10 y MR21 fueron las que

presentaron mayor actividad hacia el trímero (F=150.059, gl= 8,18, P≤ 0.01),

Cepa

Tetrámero‡

Valor medio de la

actividad de

quitinasa ( U/ml ) ±

EE*

Trímero‡

Valor medio de la

actividad de


EE*

Dímero‡

Valor medio de la

actividad de


EE*

MR11 0.8033 ± 0.0549ab 0.9167 ± 0.008c 0.030± 0.000a

RN52 0.7500 ± 0.0058a 0.8300± 0.001b 0.016± 0.003ª

MR19 0.7333 ± 0.0088a 0.7967± 0.006b 0.020± 0.000a

RN47 0.8900 ± 0.0173bc 0.9200± 0.020c 0.030± 0.000a

RN48 0.9200 ± 0.0058cd 0.9033± 0.008c 0.026± 0.000a

MR10 0.8900 ± 0.0058bc 0.9200± 0.015c 0.030± 0.000a

MR33 0.8200 ± 0.0115abc 0.6567± 0.012ª 0.020± 0.003ª

MR21 0.9000 ± 0.0115bc 0.9033± 0.003c 0.026± 0.072ª

S. marscesens Nima 1.0200 ± 0.0177d 0.6700± 0.000a 2.213± 0.072b


44

aunque estos valores fueron menores que los producidos por la cepa control.

Con excepción de ésta última, todas las cepas de B. thuringiensis presentaron

una actividad muy pequeña con el derivado dimérico (Tabla 9).

Tabla 9. Análisis de la actividad quitinolítica ( U/ml ) de las cepas cultivadas

en medio Castañeda- quitina con los tres sustratos análogos de quitina

*valores con letras iguales no tienen diferencia significativa

Prueba de Tukey P


45

Una vez determinado la actividad quitinolítica tanto en medio semisólido

como en líquido, se procedió a determinar la actividad de las proteínas de

secreción en geles de poliacrilamida mediante zimogramas. Este ensayo tenía

como propósito determinar el peso molecular de las diferentes quitinasas

producidas por la bacteria, así como dilucidar su tipo de actividad

(endoquitinasa, exoquitinasa). Se determinó la actividad in situ empleando tres

derivados fluorescentes. Bajo las condiciones presentadas en los ensayos

(zimogramas) no se detectó actividad en las cepas MR19, RN47 Y RN48 contra

ninguno de los sustratos usados, por los cual será necesario en futuros

ensayos concentrar más las proteínas de secreción de dichas cepas (Figs. 6 a

11).

Fig. 6 Zimograma mostrando la actividad de las cepas de B. thuringiensis con

el tetrámero


46

Fig. 7. Zimograma mostrando la actividad la actividad de las cepas de B.

thuringiensis con el trímero

Fig. 8. Zimograma mostrando la actividad de las cepas de B. thuringiensis con

el dímero


47


el tetrámero


el trímero


48

Fig. 11. Zimograma mostrando la actividad de las cepas de B. thuringiensis con

el dímero

Tal como se indicó previamente, las cepas MR10, MR11, MR21, MR33 y

RN52 presentaron actividad hacia el tetrámero y/o del trímero o en ambas, sin

embargo no se detectó actividad contra el dímero. Esto indica que dichas

cepas presentan endoquitinasas de aproximadamente 70 kDa. En la Tabla 10

se muestra un resumen de los resultados obtenidos en los zimogramas.


49

Tabla 10. Resumen de las actividades quitinolíticas presentadas por las

proteínas de secreción de diferentes cepas de B. thuringiensis

Tal como se mostró en la Tabla 10, de las 8 cepas seleccionadas, en 4

de ellas (MR10, MR11, MR21, MR33 Y RN52) pudo detectarse (bajo las

condiciones del ensayo) la producción de endoquitinasas. Con el propósito de

clonar los genes que codifican dichas enzimas se procedió a la obtención de

DNA de las 5 cepas, se empleo un método de concentración de plásmidos el

cual no evita que las muestras contengan restos de DNA cromosómico. Las 5

cepas presentan un patrón de plásmidos muy similar (Fig. 12). Empleando

oligonucleótidos específicos diseñados con base a la secuencia nucleotídica de

la endoquitinasa chiA74 (GenBank AF424979) (Barboza-Corona y col. 2007) se

logró amplificar un amplicón de 2.5 Kb en cada una de las cepas (Fig. 13).

Cepa Tetrámero Trímero Dímero Tipo de enzima

MR11 X Endoquitinasa

RN52 X X Endoquitinasa

MR19 X X X No presenta actividad

RN47 X X X No presenta actividad

RN48 X X X No presenta actividad


MR33 X X Endoquitinasa



50

Fig. 12. Patrón de plásmidos de diferentes cepas de B. thuringiensis. Carril 1, MR10;

carril 2, MR11; carril 3, MR21; carril 4, MR33; carril 5, RN52.

Fig. 13. Amplicones obtenidos a partir de diversas cepas de B. thuringiensis

empleando oligonucleotidos específicos endoquitinasas. Carril 1, escalera de 1

Kb (invitrogen); carril 2, MR10; carril 3, MR11; carril 4, MR21; carril 6, MR33;

carril 7, RN52.


51

Los amplicones de cada una de las cepas fueron puestos a ligar con el

vector pBluescript II KS+ e introducidas en Escherichia coli. Se seleccionaron

varias colonias blancas las cuales fueron etiquetadas de acuerdo a la cepa de

la cual procedían agregándoles un número consecutivo, por ejemplo: MR101,

es una transformante obtenida con el amplicón de la cepa MR10.

De las transformantes obtenidas con el amplicón de MR10, se

seleccionaron varias clonas, MR102, MR107, MR1015 y MR1017 (Fig. 14), las

cuelas presentaban igual o migración más lenta que el vector pBluescript.

Fig. 14. Análisis de los plásmidos obtenidos de varias clonas de E. coli

recombinantes transformadas con el pBluescript-amplicón de la cepa MR10 de

B. thuringiensis. Los carriles A15 y B1 del gel corresponden al Vector


52

pBluescript II KS; carril A4, MR102; carril A9, MR107; carril B5, MR1015; carril

B7, MR1017.

Fig. 15. Análisis de los plásmidos obtenidos de varias clonas de E. coli

recombinante transformada con el pBluescript-amplicón de B. thuringiensis

MR21. Carril A1 Y B1 Vector pBluescript II KS; carril A5, MR214; carril B2,

MR2116 carril B8, MR2120.


53

Para la cepa MR11, las clonas que fueron seleccionadas para las

digestiones fueron las MR112, MR117 Y MR1120 (no se muestran fotografías

de estas clonas). Las clonas seleccionadas de la cepa MR21 fueron la

MR2116, MR214 y MR2120. (Fig. 15). Después de transformar E. coli con la

construcción pBluscript-amplicón MR33, se seleccionaron las siguientes clonas:

MR331, MR334 y la MR3320 (Fig. 16).

Fig. 16. Visualización en un gel de agarosa al 0.8% del DNA de las clonas

obtenidas después de transformar E. coli con la construcción pBluscript-

amplicón de B. thuringiensis MR33. Carril A1, Vector pBluescript II KS; carril

A2, MR331; carril A5 MR334; carril B8, MR3320.


54

Con relación a las trasnformantes obtenidas con el pBluescript-amplicón

de B. thuringiensis RN52, las clonas seleccionadas fueron RN528, RN5211 y

RN5215 (Fig. 17)

Fig. 17. Visualización en un gel de agarosa al 0.8% de los plásmidos

recombinantes extraídos de E. coli transformada con el pBluescript-amplicón

RN52 de B. thuringiensis RN52. Carril B4 RN5215; carril A9, RN528; carril A12,

RN5211; carril A14, vector pBluescript II KS.


55

De las transformantes seleccionadas se eligieron cinco clonas (MR1015,

MR112, MR2120, MR334, RN5211) y sus plásmidos recombinantes fueron

digeridos con SalI y PstI (sitios de restricción contenidos en los oligonucleótidos

empleados para la amplificación) con el fin de liberar los amplicones clonados

en el vector (Fig. 18). Una vez demostrado la obtención de transformantes con

los amplicones, se procedió a realizar la detección en la producción de

quitinasas con el propósito de demostrar la síntesis de una quitinasa funcional.

Adicionalmente se determinó la secuencia de los genes clonados.

Fig. 18. Digestión de diversas transformantes seleccionadas con SalI y PstI.

Carril 1, Marcador de DNA de 1 Kb (invitrogen); carriles 2 y 3, MR1015; carril 4,

MR112; carril 5, MR2120; carril 6, MR334; carril 7, RN5211. Obsérvece la

liberación de los genes de quitinasas ( 2.5 Kb).


56

Cuando la actividad de quitinasa de las proteínas de secreción de las

transformantes seleccionadas fue analizada con derivados fluorescentes de

quitina se observó que no hay diferencia significativa entre ellas con relación a

la hidrólisis del tetrámero (F=1255.604, gl= 6,14, P≤ 0.01). Por otro lado, si se

encontraron diferencias significativas con el trímero (F=550.579, gl= 6,14, P≤

0.01) y la mayor actividad fue detectada con la transformante MR2120. No se

encontró actividad contra el dímero, lo cual confirmó que las quitinasas

analizadas poseen una actividad de endoquitinasa (Tabla 11).

Tabla 11. Análisis de la actividad quitinolítica (U/ml) de las cepas

recombinantes con los tres sustratos análogos de quitina.


57

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa. Prueba de Tukey P< 0.05

‡ tetrámero : [4-MU (GlcNAc)3] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’,N’’-triacetilquitotriosa; trímero:[4-MU

(GlcNAc)2] 4-metilumbeliferil-β-D-N,N’-diacetilquitobiosa; dímero:[4-MU GlcNAc ] 4-

metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosamina.

La actividad a diferentes valores de pH fue evaluada empleando el

derivado tetramérico. La endoquitinasa sintetizada por la transformante

Cepa

Tetrámero‡

Valor medio de la

actividad de

quitinasa

(U/ml ) ± EE*

Trímero‡

Valor medio de la

actividad de quitinasa

(U/ml ) ± EE*

Dímero‡

Valor medio de la

actividad de quitinasa

(U/ml) ± EE*

MR1015 0.5467 ± 0.0176b 0.5133 ± 0.0033c 0.0167± 0.0033ab

MR112 0.5233 ± 0.00033b 1.0233± 0.0176d 0.0200± 0.0000ab

MR2120 0.5267 ± 0.0033b 1.1433± 0.0058e 0.0367± 0.0133b

MR334 0.5467± 0.0033b 1.0533± 0.0033d 0.0200± 0.0000ab

RN5211 0.5167 ± 0.0033b 0.3400± 0.0176b 0.0100± 0.0000a

E. coli 0.0200 ± 0.0000a 0.0167± 0.0067a 0.0100± 0.0000a

E. coli + pBs 0.0100 ± 0.0000a 0.0100± 0.0200a 0.0100± 0.0000a


58

MR1015 presentó su mayor actividad entre pH 6.5 y 7.5. Los valores se

presentan en la Tabla 12 (F=814.643, gl= 7,16, P≤ 0.01).

Tabla 12. Actividad a diferentes pHs de la endoquitinasa de la transformante

MR1015.

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P


59

significativa (F=791.083, gl= 7,16, P≤ 0.01). Los resultados se presentan en la

Tabla 13.


MR112

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P


60

presentaron una diferencia significativa (F=206.806, gl= 7,16, P≤ 0.01) (Tabla

14).


MR2120

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P<

0.05.La actividad se evaluó con el derivado tetramérico.

Valores de pH Actividad (U/ml) ± EE*

3.5 0.5833± .0133b

4.5 0.6566 ± .0088bc

5.5 0.7066± .0033c

6.5 0.8133 ± .0033d

7.5 0.8200 ± .0133d

8.5 0.8100 ± .0033d

9.5 0.8333 ± .0120cd

10.5 0.1386 ± .0000a


61

La quitinasa de la clona MR334 presentó un valor máximo entre un pH

de 6.5 y 7.5. Los valores de pH de 6.5 y 7.5 no presentaron una diferencia

significativa (F=275.932, gl= 7,16, P≤ 0.01) (Tabla 15).

Tabla 15. Actividad de la endoquitinasa sintetizada por la transformante

MR334.

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P<

0.05.La actividad se evaluó con el derivado tetramérico.


3.5 0.6300± .0000b

4.5 0.6866 ± .0033bc

5.5 0.7300± .0057c

6.5 0.8433 ± .0066d

7.5 0.9033 ± .0393d

8.5 0.8566 ± .0176d

9.5 0.6966 ± .0066bc

10.5 0.0740 ± .0005a


62

La quitinasa de la cepa recombinante RN5211 presento un valor máximo

a un pH de 6.5 (F=946.000, gl= 7,16, P≤ 0.01) (Tabla 16).

Tabla 16. Actividades de la quitinasa sintetizada por la cepa recombinante

RN5211


3.5 0.4200± .0152c

4.5 0.6266 ± .0088e

5.5 0.7000± .0000f

6.5 0.8033 ± .0033g

7.5 0.7200 ± .0100f

8.5 0.4933 ± .0145d

9.5 0.1833 ± .0033b

10.5 0.0200 ± .0000a

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P< 0.05.

La actividad se evaluó con el derivado tetramérico.

Una vez determinado el pH de mayor actividad ( 6.5) se procedió

determinar la temperatura óptima de actividad de cada una de quitinasas

recombinantes. Todos los ensayos de temperatura fueron realizados a pH 6.5.


63

La quitinasa recombinante expresada en clona MR1015 presentó su

mayor actividad a 60°C, aunque no se encontró diferencia significativa con la

actividad a 40 y 50°C (F=86.287, gl= 6,14, P≤ 0.01). Los resultados se

muestran en la tabla 17.

Tabla 17. Análisis de la actividad quitinolítica de la recombinante MR1015 a

diversas temperaturas

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P< 0.05. La

actividad se evaluó con el derivado tetramérico.

La quitinasa recombinante clonada a partir de la cepa MR11 presentó su

mayor actividad en el rango de temperatura de los 60° C. Entre ellos no se

observó una diferencia significativa (F=143.592, gl= 6,14, P≤ 0.01). Los

resultados se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Análisis de la actividad quitinolílica de la recombinate MR112 a

diferentes temperatura

Temperatura (°C) Actividad (U/ml) ± EE*

40 0.6300± 0.0058b

50 0.6233± 0.0088b

60 0.7067± 0.0145b

70 0.0530± 0.0182a


64

*Valores con letras iguales no tienen diferencia significativa Prueba de Tukey P< 0.05. La

actividad se evaluó con el derivado tetramérico.

La quitinasa de la cepa MR21 expresada en E. coli presentó su mayor

actividad en el rango de temperatura de los 60° C. Entre ellos no se observó

una diferencia significativa (F=149.736, gl= 6,14, P≤ 0.01). Los resultados se

muestran en la Tabla19.

Tabla 19. Análisis de la actividad quitinolítica de recombinante MR2120 a

diferentes temperaturas

Temperatura (°C) Actividad (U/ml) ± EE*

40 0.6100± 0.0000b

50 0.6000± 0.0058b

60 0.6733± 0.0088c

70 0.0390± 0.0010a

“Cara

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