Caracterización genotípica del gen RHCE

T E S I S

Que como parte de los requisitos para obtener el grado de Maestría en Ciencias Químicobiológicas

Presenta

QFB. Jazmín Ivette Cruz Reyes

Directores de tesis

Dr. Héctor A. Baptista González

Dra. Elba Reyes Maldonado

México, D. F., Enero de 2010.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Secretaría de Investigación y Posgrado

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

Este trabajo fue realizado en el servicio de Hematología Perinatal del Instituto

Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud, en el Banco de Sangre del

Hospital Médica Sur y en el laboratorio de Hematopatología de la Escuela Nacional

de Ciencias Biológicas, bajo la dirección del Dr. Héctor A. Baptista González y la

Dra. Elba Reyes Maldonado.

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgarme una beca

durante 24 meses para la realización de este proyecto con número de de becario

212358. También agradezco al Programa Integral de Fortalecimiento Institucional,

el cual también me apoyó durante 12 meses con una beca bajo el proyecto con

clave 20080640.

Mi agradecimiento especial para:

Dr. Héctor A. Baptista González

Dra. Elba Reyes Maldonado

Dra. Fany Rosenfeld Mann

QBP. Rocío Trueba Gómez

M. en C. Maribel Acosta Tejeda

Dra. Ethel A. García Latorre

Dra. Ruth Lezama Palacios

M. en C. Luisa Bermejo Martínez

M. en C. Carmen Acuña González

Biol. Georgina Coeto Barona

QFB. Carmen Santamaría Hernández

Lic. Carlos Alberto Carrero Sánchez

Por compartirme sus experiencias, enseñanzas y brindarme su apoyo para la realización de

este proyecto.

Al Instituto Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud.

Al Servicio de Medicina Transfusional y Banco de Sangre del

Hospital Médica Sur.

A la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del

Instituto Politécnico Nacional.

i

I N D I C E Página

Abreviaturas ii

Índice de figuras iv

Índice de tablas v

Resumen vi

Abstract vii

I. Introducción 1

Grupos sanguíneos 1

Marco histórico 2

Genes RH 3

Gen RHCE 5

Proteínas Rh 6

Nomenclatura 8

Justificación 10

Planteamiento del problema 11

Pregunta de investigación 11

Hipótesis 12

Objetivo general 12

Objetivos particulares 12

II. Material y métodos 13

Población de estudio. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación 13

Métodos 13

Obtención de muestras 15

Fenotipificación de RhCE 15

Extracción de DNA 20

Genotipificación del gen RHCE 21

Estrategias moleculares 21

Condiciones de PCR 22

Estandarización de las técnicas de PCR 23

PCR en tiempo real 23

Detección de los alelos RHc y RHC 25

Detección del alelo RHE/e 27

Tamaño de muestra y análisis estadístico 29

III. Resultados 32

Determinación de RHc 32

Determinación de RHC 33

Determinación de RHE/e 33

Concordancia 34

No concordancia 40

IV. Discusión 42

V. Conclusiones 46

VI. Perspectivas 47

VII. Referencias bibliográficas 48

ii

Abreviaturas

Abreviatura Descripción

3’-UTR Región 3’ no traducida (del inglés 3’ untranslated region)

5’-UTR Región 5´no traducida (del inglés 5´untranslated region)

Dia /Dib Antígenos Diego a /b de la proteína Diego

EHRN Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido

Fc (γR1) Receptor 1γ de la fracción cristalizable de los anticuerpos

FcRn Receptor neonatal Fc

FRET Transferencia de energía de resonancia fluorescente (del inglés Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Fya/Fyb Antígenos Duffy a/b de la proteína Duffy

GPI Glicosilfosfatidilinositol

ISBT Sociedad internacional de transfusión sanguínea (del inglés Internacional Society of Blood Transfusion)

K/k Antígenos Kell/cellano de la proteína Kell

Kpa/Kpb Antígenos Penny/Rautenberg de la proteína Kell

PCR-RFLP Reacción en cadena de la polimerasa con patrón de la longitud de enzimas de restricción

PCR-SSP PCR alelo específica

RhAG Proteína RhAG

RHAG, RHBG, RHCG

Genes de las glicoproteínas asociadas al Rh, RhAG, RhBG y RhCG

RHCE Gen RHCE

RhCE Antígenos o proteínas C, c, E y e

RHD Gen RHD

RhD Antígeno o proteína D

RHDψ Pseudogen Phi del RHD

SMP1 Proteína pequeña de membrana 1 (del inglés small membrane protein 1).

iii

SNP Polimorfismos de un solo nucleótido (del inglés Single nucleotide polymorphism)

THE-1B Elemento humano tipo transposón

ADNoteca Banco de DNA del Servicio de Hematología Perinatal del INPer

iv

Índice de figuras

No. Figura

Descripción No.

Página

1 Membrana eritrocitaria. 1

2 Orientación opuesta de los genes RHD y RHCE, enfrentados en su posición 3`.

4

3 Organización cromosómica de las cajas Rhesus. 4

4 Proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos identificados por un círculo y los sitios de palmitoilación.

6

5 Estrategia de trabajo. 14

6 Tarjeta DG gel. 16

7 Aspecto de la reacción con diferentes grados de aglutinación en la tarjeta DG gel.

17

8 Procesador Diana Gel. 18

9 Impreso de la fotografía de las reacciones de aglutinación en gel. 19

10 Diagrama de operación del termociclador - fluorómetro 24

11 Capilares de borosilicato, adición de reactivos, colocación de capilares en el carrusel, colocación del carrusel, desarrollo de la reacción.

24

12 Equipo LightCycler. 25

13 Principio de las sondas de hidrólisis TaqMan® 27

14 Principio de las sondas de hibridación HybProbe® 29

15 Curva de Amplificación del alelo RHc. 32

16 Curva de Amplificación del alelo RHC. 33

17 Análisis de las curvas de disociación para RHE/e. 34

v

Índice de tablas

No. Tabla

Descripción No.

Página

1 Nomenclatura del sistema Rh según Fisher/Race y Wiener. 8

2 Fenotipos posibles dentro del sistema Rh. 9

3 Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT) de los antígenos del sistema Rh.

10

4 Estrategias moleculares usadas. 22

5 Condiciones de PCR usadas para todos los ensayos. 22

6 Total de muestras en ADNoteca ordenadas por código de fenotipo. 30

7 Distribución de la muestras por alelos y definición del tamaño de muestra. 31

8 Concordancia entre el fenotipo y el genotipo para el gen RHCE. 35

9 Concordancia por alelo C. 36

10 Concordancia por alelo E. 36

11 Concordancia por fenotipo. 37

12 Concordancia por genotipo. 38

13 Características de los casos que no concordaron. 40

14 Comparación entre la concordancia en la identificación genotípica y fenotípica en el grupo sanguíneo RhCE por otros autores y la obtenida en este estudio.

42

vi

Resumen En el campo de la medicina transfusional, es importante el estudio y la

determinación de los grupos sanguíneos ABO y Rh en los donadores y en los

pacientes que se someten a transfusiones o trasplantes, en el estudio de las anemias

hemolíticas, como la Anemia Hemolítica Autoinmune y la Enfermedad Hemolítica del

Recién Nacido. En el ámbito antropológico son considerados como marcadores de

identidad poblacional o genética. Se han realizado algunos estudios en relación al

fenotipo del sistema Rh en población mexicana, sin embargo, a la fecha no se han

caracterizado los genotipos con el fin de determinar la correlación existente entre

ambos estudios y poder usarlos como herramienta en estudios clínicos y de

poblaciones.

Objetivo: Caracterizar genotípicamente el gen RHCE por PCR en tiempo real,

comparar los resultados con el fenotipo y determinar la concordancia.

Material y métodos: Las muestras de ADN se obtuvieron de donadores del Hospital

Médica Sur y del INPer. De acuerdo a las frecuencias fenotípicas de 1638 muestras

se definió el tamaño muestral que fue de 190. Se usó PCR en tiempo real para

caracterizar los alelos C, c, E y e utilizando el LightCycler®. Se usaron sondas de

hibridación LightCycler FastStart DNA Master HybProbe para los alelos E/e; mientras

que para C y c se usaron sondas LightCycler TaqMan Master. Las 190 muestras se

clasificaron por fenotipos y también por alelos. Se estandarizaron las pruebas con

controles conocidos.

Resultados: Se realizó el análisis estadístico de acuerdo al fenotipo, se observó una

concordancia del 100% en 7 fenotipos de 15 posibles, los otros 8 mostraron una

concordancia no menor al 80%. En cuanto al análisis por alelos, se obtuvo una

concordancia para cc del 95.5%, para Cc de 96.2% y para CC de 95.7%; mientras

que para el alelo ee fue de 96.2%, para Ee de 92.1% y para EE del 100%. En cuanto

al análisis por grupo RhD, se obtuvo un 93.6% de concordancia para el grupo de

negativos y de 96.4% para los positivos. 8 muestras no concordaron, por lo que se

investigó a estos 8 casos que no concordaron entre fenotipo y genotipo para

descartar cualquier elemento externo que interfiriera con el resultado, quedando solo

187. De las 187 muestras, 179 fueron concordantes entre fenotipo y genotipo, es

decir, se obtuvo un 95.7% de concordancia; mientras que en 8 de los casos hay una

franca discordancia, esto significa el 4.3%.

Conclusiones: Una concordancia similar a la hallada en este estudio se ha

encontrado en otras poblaciones del mundo como orientales, caucásicos o negro-

africanos. Las no concordancias pueden tener diversas causas como la presencia de

alelos aberrantes que podrían causar falsos positivos o negativos.

vii

Abstract

In transfusion medicine, it is important the study and determination of ABO and

Rh blood groups in donors and patients who undergo transfusions or transplants, the

study of hemolytic anemias, such as autoimmune hemolytic anemia and Hemolytic

Disease of the Newborn. In the anthropological ambit are considered as markers of

identity or population genetics. Some studies have been developed regarding to the

phenotype of the Rh system in the Mexican population, however, until now genotypes

have not been characterized in order to determine the correlation between these two

studies and use them as a tool in clinical and population studies.

Objective: To characterize phenotypically the RHCE gene by real time PCR,

comparing the results with the phenotype and determine the correlation.

Methods: DNA samples were obtained from donors at Medica Sur Hospital and

INPer. According to the phenotypic frequency of 1638 samples, was defined the

sample size of 190. We used real-time PCR for characterizing the alleles C, c, E and

e, using the LightCycler® equipment. Hybridization probes LightCycler FastStart DNA

Master HybProbe were used for alleles E / e, while for C c were used LightCycler

TaqMan Master probes. The 190 samples were classified by phenotypes and also by

alleles. We standardized the tests using known controls.

Results: Statistical analysis was performed according to the phenotype, we observed

a concordance of 100% in 7 of 15 potential phenotypes, the other 8 showed a

concordance not less than 80%. Concerning the analysis by alleles, we obtained a

concordance of 95.5% for cc, for CC of 96.2% and 95.7% for CC, while for allele ee

was of 96.2%, 92.1% for Ee and 100% for EE. Regarding the RhD group analysis, we

obtained a 93.6% concordance for the negative group and 96.4% for the positive. 8

samples did not agree, so we investigated these 8 cases not agreed between

phenotype and genotype to rule out any external element that interfered with the

result, leaving only 187. Of the 187 samples, 179 were concordant between

phenotype and genotype, ie, we obtained a concordance of 95.7%, while in 8 cases

there is a clear mismatch, this means 4.3%.

Conclusions: A correlation similar has been found in other populations of the world

like Eastern, Caucasian or black African. The non-concordance may have different

causes such as the presence of aberrant alleles that could cause false positives or

negatives.

1

I. Introducción

Grupos sanguíneos

La membrana eritrocitaria (Figura 1) es una estructura dinámica y fluida de

proteínas-lípidos-carbohidratos, consta de una bicapa fosfolipídica donde las colas

de ácidos grasos forman el interior hidrofóbico de la bicapa y las cabezas hidrofílicas

revisten ambas superficies externa o exofacial e interna o citoplásmica, en ella se

distribuyen las diferentes proteínas que componen la membrana(Radillo, 2006).

Los antígenos de los grupos sanguíneos están expuestos en la superficie de

la membrana eritrocitaria, pero además están presentes en otros sitios del organismo

como tejidos o líquidos, algunos antígenos tienen distribución exclusivamente

eritrocitaria, como es el caso del Rh, mientras que otros tienen una distribución

universal como el sistema ABO(Reid y Mohadas, 2004; Daniels y cols., 2009).

Figura 1. Membrana eritrocitaria. Se observa el complejo molecular Rh. Interacción de las proteínas integrales (Rh, banda 3, CD47, RhAG, GPC) con las proteínas del citoesqueleto (anquirina, espectrina, banda 4.2, 4.1, actina). (Delaunay, 2007)

2

Los grupos sanguíneos se clasifican en Sistemas, Series y Colecciones. Un

Sistema consiste en uno o más antígenos que comparten características en común

como su estructura química, la localización en la membrana, controlados por un gen

o genes estrechamente relacionados con escasa o nula recombinación entre ellos.

Las Colecciones contienen a los antígenos que tienen alguna relación bioquímica,

serológica o genética pero sin cumplir cabalmente las condiciones de un sistema.

Las Series corresponden a los antígenos que no reúnen los requisitos anteriores, se

clasifican en series de baja incidencia con <1% (serie 700) y de alta incidencia con

>99% (serie 900). (Escamilla, 2006)

Se han identificado alrededor de 300 determinantes antigénicos de grupos

sanguíneos, la gran mayoría pertenecen a alguno de los 30 sistemas reconocidos y

los restantes (aproximadamente 40 antígenos), forman parte de las series y las

colecciones (Reid y Mohadas, 2004; Daniels y cols, 2009).

Las técnicas de laboratorio utilizadas para la identificación del fenotipo Rh han

sido la hemaglutinación en tubo, que es la prueba más difundida y evaluada, seguida

por otras técnicas aplicables solamente a nivel experimental, como son la

determinación de la densidad del antígeno D mediante citometría de flujo o pruebas

de electroforesis de proteínas (Western Blot). Actualmente también se usa la técnica

de fotoaglutinación en placas de gel. (Vengelen-Tyler V, 2005)

Marco histórico.

El sistema Rh es un sistema sanguíneo muy complejo que se encuentra

constituido por un conjunto de proteínas con afinidad bioquímica y genética, y se le

considera el segundo sistema más polimórfico e inmunogénico en el hombre,

después del sistema ABO (Le Van Kim et al, 2005).

3

El primer sistema sanguíneo descrito por Landsteiner en 1901, fue el ABO

como resultado de la mezcla de eritrocitos y sueros de diferentes sujetos sanos, los

grupos sanguíneos restantes se han identificado a partir de entidades clínicas como

la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), las reacciones hemolíticas a la

transfusión, así como mediante el uso de anticuerpos monoclonales y por las

técnicas de biología molecular, que han permitido la identificación de los

polimorfismos, la caracterización de su expresión en tejidos específicos y la relación

entre la estructura y la función (Denomme, 2004).

En 1940 Landsteiner y Wiener descubrieron el sistema Rh al inyectar

eritrocitos del mono Macacus rhesus en conejos. El suero de conejo aglutinaba a los

hematíes del mono y al 85% de los glóbulos rojos humanos en que fue probado. Por

esta razón se le denominó al nuevo sistema Rh, de Rhesus. Después se

descubrieron los otros 4 antígenos principales: C, c, E y e. (Race y Sanger, 1975)

Genes RH

En 1986, Patricia Tippet propuso la teoría de la existencia de dos genes (RHD

y RHCE) que son responsables de la presencia de los antígenos del sistema Rh,

misma que fue confirmada por la clonación de ambos genes en 1990 por Colin y

cols., y mediante estudios moleculares, se reveló la presencia de ambos genes en

individuos RhD positivo, mientras que en individuos RhD negativo, sólo se observó la

presencia del gen RHCE (Scott, 2004).

El locus para el RH está ubicado en el brazo corto del cromosoma 1, región 3,

banda 4, sub-banda 11 (1p34.11). Estos genes se encuentran constituidos por 10

exones cada uno, con una secuencia genómica de 60,000 y 69,000 pb,

respectivamente, con orientación opuesta; se encuentran enfrentados en su posición

3´ y separados por el gen SMP1 (30,000 pb, sin relación funcional con ambos genes

del sistema). El gen RHCE se considera un gen ancestral, mientras que el RHD es

un duplicado que se encuentra flanqueado en ambos lados por dos segmentos de

4

9,000 pb denominados Cajas Rhesus de alta homología (Le Van Kim et al, 2005; Wagner y Flegel,

2000; Wagner y Flegel 2002, Wiener, 2004,) (Figura 2).

Hay otros tres genes relacionados RHAG, RHBG y RHCG, localizados en el

brazo corto del cromosoma 6 en la región 2, banda 1, sub-banda 1 (6p21.1); el gen

RHAG codifica para la proteína RhAg (Rh50), cuyo papel es esencial en la expresión

de las proteínas RhD y RhCE. Las proteínas RhBg y RhCg no son de distribución

eritroide.

Las cajas RH o Rhesus abrazan exactamente la parte del RHD con homología

a RHCE. La porción central de ambas cajas Rhesus contienen casi completo un

elemento humano tipo transposón (THE-1B). Sin embargo, el marco de lectura

abierto usualmente se encuentra en el elemento THE-1B el cual es eliminado debido

a varios cambios de nucleótidos que ocurren en paralelo en las cajas Rhesus,

incluyendo una mutación sin sentido en el codón 4 (Figura 3). (Wagner y Flegel, 2000)

5´ 3´

Figura 2. Orientación opuesta de los genes RHD y RHCE, enfrentados en su posición 3`. El gen RHD está flanqueado a la derecha y a la izquierda por unas secuencias de nucleótidos llamados cajas Rhesus (b).

Figura 3. Organización cromosómica de las cajas Rhesus. La extensión física de la caja Rhesus inicial (5´RHD) es de 9145pb (barra negra). Cerca del 63% de la secuencia de nucleótidos de las cajas son de DNA repetitivo, los tipos de familias de repetición se indican con el resto de colores. La homología entre las cajas Rhesus inicial y final es del 98.6%, con una región de identidad de 1463 pb (flechas horizontales), hay solo una inserción de 4 pb (al inicio de la región tigger3). Una isla CpG (en L1MC3 MER20) está localizada en la posición 3´ de la caja Rhesus final (3´RHD) adyacente a la

región del promotor del SMP1. (Wagner y Flegel, 2000)

5

Gen RHCE

El gen RHCE codifica principalmente para las proteínas o antígenos C, c, E, e

(Le Van Kim et al, 2005). La condición fenotípica está en parte determinada por la presencia

de los diferentes antígenos codificados en este gen, la cual se detecta, al igual que

en los casos anteriores, por reacciones de aglutinación que se manifiestan al poner

en contacto suspensiones de eritrocitos al 5% en solución salina fisiológica, contra

antisueros específicos (anti-C, anti-c, anti-E, anti-e) que los reconocen. La evidencia

de reactividad identifica al antígeno presente, y la ausencia de la misma, la carencia

de éste.

Las proteínas asociadas al gen pueden expresarse de forma homocigota o

heterocigota para cada una de ellas. Es decir, puede presentarse como Rh CC, Cc y

cc, y EE, Ee y ee.

Los principales polimorfismos para C/c y E/e se asocian a sustituciones de

aminoácidos en la segunda y cuarta asa extracelulares de la proteína RhCE,

respectivamente; el antígeno “C” está determinado por la presencia del aminoácido

serina en posición 103 de la proteína, mientras que el antígeno “c” está determinado

por la presencia de prolina en la posición 103. El antígeno “E” está determinado

también por prolina en la posición 226, mientras que el antígeno “e” está determinado

por la presencia de alanina en la misma posición de la proteína (Le Van Kim et al, 2005; Lomas-

Francis et al., 2000; Wagner et al, 2004).

Las bases moleculares para la expresión de los antígenos “C” y “e” son un

poco más complicadas que la de los otros dos antígenos, ya que los aminoácidos

que determinan la presencia de éstos alelos también están presentes en la proteína

RhD, además de que existen mecanismos determinantes para la expresión de estos

(Le Van Kim et al, 2005).

6

Proteínas Rh

El sistema sanguíneo Rh es el más complejo, a la fecha hay 50 antígenos

reportados, algunos de ellos de muy alta frecuencia hasta otros con presencia en

muy pocos individuos. (Daniels y cols, 2004 y 2009).

Las proteínas en los diferentes grupos sanguíneos se organizan con base a su

integración en la bicapa fosfolipídica del eritrocito. Las proteínas del sistema Rh: RhD

y RhCE, son proteínas de tipo III no glicosiladas y no fosforiladas, que se expresan

exclusivamente en la superficie de los eritrocitos de vertebrados superiores y están

conformadas por 417 aminoácidos, distribuidos en 6 asas extracelulares, 12

transmembranales y 7 segmentos intracelulares. Los sitios carboxilo y amino

terminales se encuentran en el citoplasma (Le Van Kim et al, 2005; Lomas-Francis et al, 2000; Wagner et

al, 2004). Según el alelo considerado, las proteínas Rh (RhD y RhCE) difieren en 34-37

aminoácidos dispersos a lo largo de la secuencia de aminoácidos en ellas (Le Van Kim et

al, 2005; Wagner et al, 2004). Los sitios con actividad antigénica de mayor intensidad son los

seis dominios extracelulares (Lomas-Francis et al, 2000).

La hipótesis más aceptada es que las proteínas de este sistema se

encuentran en la membrana eritrocitaria formando complejos no covalentes con otras

proteínas (RhAG, CD47, LW, GPB), y se estabilizan por palmitoilación (Cartron, 1999; Le

Van Kim et al, 2005; Wagner et al, 2004) en donde los residuos de ácido palmítico acetilado se

unen a cadenas laterales de la cisteína (Figura 4).

Figura 4. Se observan las proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos que están identificados por un círculo y los sitios de palmitoilación. La proteína RhCcEe tiene una cisteína en la posición 330 en vez de tirosina que da lugar al tercer sitio de palmitoilación de la proteína RhCcEe. En la parte derecha se señalan los cambios de aminoácidos en la

proteína C/c y E/e. (Le Van Kim et al, 2005).

7

La expresión de los antígenos del sistema Rh depende de la funcionalidad de

una glicoproteína asociada denominada RhAG (Rh50). La presencia de mutaciones

en esta glicoproteína puede condicionar el fenotipo Rh-nulo, caracterizado por la

ausencia total de los antígenos del sistema Rh (Wagner et al, 2004).

La proteína RhAG está codificada por el gen RHAG, cuya organización es muy

similar a la de los genes RHD y RHCE, se ubica en el brazo corto del cromosoma 6,

región 1 y 2, banda 1 (6p11-p21.1) (Cartron, 1999) y corresponde al sistema sanguíneo

número 30 (Daniels y cols, 2009).

Los genes RHD y RHCE poseen una homología de 40% con el gen RHAG, lo

que sugiere que éstos pertenecen a la misma familia. La diferencia más importante

entre las proteínas codificadas por estos genes, es la presencia de una molécula de

N-glicano en la primera asa extracelular de la proteína RhAG, que acarrea a los

antígenos ABH (Cartron, 1999; Le Van Kim et al, 2005, Daniels y cols, 2009).

Cuando menos existen dos mecanismos moleculares para explicar la

condición de RhD negativo. Uno es la deleción parcial o total de gen RHD. La

deleción del RHD, es el mecanismo dominante en sujetos de origen étnico

caucásico. Es una condición homocigota con la ausencia del gen RHD. El punto de

ruptura se localiza en la región de las cajas del Rh (1463 pb) y se explica por un

entrecruzamiento desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2

repetitivo) (Wagner y Flegel 2000).

El otro mecanismo es la pérdida de expresión del gen RHD. En este segundo

grupo, el gen RHD, al menos en parte, está presente, pero su expresión fenotípica no

ocurre. Un caso ejemplar, es el mecanismo del pseudogen RhDψ mediante el cual

los sujetos de origen negro-africano son RhD negativo como mecanismo principal,

que es una inserción de 37 pb de una secuencia repetida entre el intrón 3 y el exón 4

del gen RHD que recorre el marco de lectura (Singleton et al 2000) y finalmente la formación

de un gen híbrido RHD-CE-D asociado al haplotipo Cde. En otro grupo de sujetos

8

fenotípicamente RhD negativo con la formación del gen híbrido, se tienen diversas

opciones, una de ellas es el gen híbrido RHD-CE-Ds.

Nomenclatura

Después del descubrimiento del grupo sanguíneo Rh se propusieron diversas

nomenclaturas para describirlo, algunas con base en la propuesta genética; el

sistema CDE propuesto por Fisher y Race con tres pares de genes ligados

estrechamente en el mismo cromosoma y, el sistema Rh-Hr de Wiener que proponía

múltiples alelos en un mismo locus genético (Race y Sanger, 1975).

Posteriormente se unificaron estas nomenclaturas y se hicieron equivalencias

(Tabla 1), de esta manera, el haplotipo conocido como “CDe” en el sistema de Fisher

y Race equivale a “R1” en el sistema de Wiener, “cDE” a “R2”, etc., como se muestra

en la tabla 2. La letra mayúscula “R” se utiliza cuando se expresa el antígeno D, y la

letra minúscula “r” cuando el antígeno no se expresa.

Tabla 1. Nomenclatura del sistema Rh según Fisher/Race y Wiener.

Fisher/Race Wiener

CDe R1

cDE R2

CDE RZ

cDe R0

cde r

Cde r´

cdE r´´

CdE ry

9

A partir de los ocho haplotipos se pueden obtener 64 posibles combinaciones,

de las cuales derivan los 18 fenotipos posibles (Tabla 2). En medicina transfusional,

éstas nomenclaturas son muy útiles para comunicar el fenotipo Rh de los pacientes y

donadores.

Tabla 2. Fenotipos posibles dentro del sistema Rh.

RHD(+) RHD(-)

CcDEe CcdEe

CcDee Ccdee

ccDEe ccdEe

ccDee ccdee

CCDee CCdee

CCDEE CCdEE

CcDEE CcdEE

ccDEE ccdEE

CCDEe CCdEe

Rosenfield en 1962 propuso una nomenclatura numérica basada en la

serología, que es la de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT)

y se muestra en la Tabla 3 (Vengelen-Tyler V, 2005).

Durante el desarrollo de este trabajo para fines prácticos en la escritura se

usaron letras minúsculas para señalar la falta del antígeno RhD, y letras mayúsculas

para denotar la presencia de éste. En el caso de los antígenos RhCE las letras ya

sean mayúsculas o minúsculas representan la presencia del alelo correspondiente.

Además se usó con mayúsculas RH para referirnos al gen y Rh para hacer mención

de la proteína.

10

Justificación

En los últimos 10 años, el estudio molecular de los grupos sanguíneos y en

particular del Rh, avanzó vertiginosamente, permitiendo incorporarlos como

herramienta para el estudio clínico en medicina transfusional. También se ha

aplicado en otros terrenos como pruebas de paternidad, migración de poblaciones,

medicina forense o estudios antropológicos (Reid 2003).

En términos generales, se han identificado los diversos eventos moleculares

que dan lugar a la expresión de los diferentes antígenos eritrocitarios, como son:

Conversión o recombinación de genes: MNS, Rh, Chido/Rodgers.

Duplicación de un exón: Gerbich.

Deleción de un gen, exón o nucleótido: ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock,

Gerbich.

Tabla 3. Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT) de los antígenos del sistema Rh.

001 D

002 C

003 E

004 c

005 e

006 f (ce)

007 Ce

008 C

w

009 C

x

010 V

011 E

w

012 G

013 014 015 016 017 Hro

018 Hr

019 hr

s

020 VS

021 C

G

022 CE

023 D

W

024 025 026 C like

027 cE

028 hr

H

029 Rh29

030 Go

a

031 hr

B

032 Rh32

033 Rh33

034 Hr

B

035 Rh35

036 Be

a

037 Evans

038 039 Rh39

040 Tar

041 Rh41

042 Rh42

043 Crawford

044 Nou

045 Riv

046 Sec

047 Dav

048 JAL

049 STEM

050 FPTT

051 MAR

052 BARC

053 JAHK

054 DAK

055 LOCR

056 CENR

057 CEST

Las casillas vacías corresponden a antígenos obsoletos.

11

Inserción de uno o más nucleótidos: Rh, Colton.

Substitución de un nucleótido (SNP): La mayoría de los grupos sanguíneos:

RhC/c, RhEe, Kell/cellano (K/k), Penny/Rautenberg (Kpa/Kpb), Duffya/Duffyb

(Fya/Fyb), Diegoa/Diegob (Dia/Dib) (Reid 2003).

En el año 2002, Legler y cols. pudieron utilizar el plasma materno como

método no invasivo para determinar el genotipo Rh fetal a partir de DNA libre, por

PCR en tiempo real, mismo que ha sido de gran utilidad para diagnosticar de la

enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido.

Planteamiento del problema

El análisis genotípico del sistema Rh, es parte de un conocimiento necesario

que puede ser incorporado como herramienta en el estudio de diferentes condiciones

como es el caso del diagnóstico prenatal del grupo sanguíneo, en la determinación

del grupo sanguíneo propio en pacientes politransfundidos o isoinmunizados, o la

identificación molecular de donadores.

El empleo de la tecnología molecular aplicada a la clínica, como es el caso del

PCR en tiempo real, permite la generación de conocimiento, como es, el establecer

la concordancia entre el fenotipo y el genotipo del grupo sanguíneo en nuestra

población. Esto permitirá mejorar la eficiencia de las herramientas de diagnóstico en

beneficio de los pacientes.

Pregunta de investigación

¿Cuál es la concordancia entre el genotipo y el fenotipo para el gen RHCE en

una muestra de población mexicana?

12

Hipótesis.

La concordancia entre la genotipificación RHCE y el fenotipo RhCE es igual o

mayor a 0.950.

Objetivo general

Establecer la concordancia entre el estudio genotípico del gen RHCE en

relación al fenotipo de las proteínas RhCE.

Objetivos particulares

Determinar el fenotipo del sistema Rh y el genotipo del gen RHCE.

Comparar los resultados del fenotipo y genotipo y establecer la concordancia

entre ambos resultados.

Identificar las diferencias en la concordancia genotipo y fenotipo de acuerdo al

alelo del sujeto.

13

II. Material y métodos

Población de estudio. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación.

La población estudiada fueron donadores de sangre del Hospital Médica Sur y

del Instituto Nacional de Perinatología de la ciudad de México, bajo los siguientes

criterios de selección:

Criterios de Inclusión: Donadores del Hospital Médica Sur y del INPer que

cumplieron con los criterios establecidos para la donación de sangre y que aceptaron

participar en el estudio, a cuyas muestras se les realizó la determinación del fenotipo

Rh y la extracción de DNA.

Criterios de Exclusión: Todas las muestras de los donadores que no

desearon participar en el estudio.

Criterios de Eliminación: Todas aquellas muestras que no estaban en

buenas condiciones, no estaban correctamente identificadas o no eran rastreables.

Métodos

Se desarrolló una estrategia de trabajo, para sistematizar el estudio de los

sujetos. Se recolectaron muestras sanguíneas de los donadores por punción venosa

en tubos de recolección utilizando EDTA como anticoagulante. Se determinó el

fenotipo por el método de fotoaglutinación en placas de gel. Se extrajo DNA de las

muestras a partir de sangre completa. Se determinó el genotipo por PCR en tiempo

real y por último se correlacionaron los resultados para obtener la concordancia.

Dicha estrategia se muestra a continuación en la Figura 5.

14

Figura 5. Estrategia de trabajo. La población estuvo constituida por donadores de sangre del Hospital Médica Sur y del INPer. Se obtuvieron muestras sanguíneas de los donadores. Se determinó el fenotipo por el método de fotoaglutinación en placas de gel. Se extrajo DNA de las muestras a partir de sangre completa. Se realizó el genotipo por PCR en tiempo real y por último, se correlacionaron los resultados para obtener la concordancia.

15

Obtención de muestras

La obtención de las muestras se realizó por punción venosa; se obtuvieron 2

tubos por donador con EDTA como anticoagulante.

Un tubo fue usado para determinar el fenotipo, el resultado se incluyó en la

base de datos de fenotipos del Instituto Nacional de Perinatología; del segundo tubo

se realizó la extracción de DNA utilizando un kit comercial, este DNA fue almacenado

e incluido en el banco de DNA (ADNoteca) del Instituto Nacional de Perinatología

para posteriormente realizar el análisis molecular del gen RHCE.

Fenotipificación de RhCE

Mediante el empleo de la técnica de hemaglutinación en tubo para identificar

el fenotipo de los antígenos más comunes del sistema Rh (D, C, c, E y e), podemos

inferir el genotipo más probable del individuo, pero no establecer con certeza su

condición de heterocigoto u homocigoto de los genes RHCE y RHD. El origen étnico

es importante dado que modifica sustancialmente la probabilidad de la condición de

cigocidad.

La importancia clínica del grupo sanguíneo Rh reside en el hecho de que el

antígeno D es altamente inmunogénico. Los antígenos D, C, c, E y e son los más

importantes del grupo de antígenos que forman este sistema.

La determinación de los fenotipos Rh se define por la presencia o ausencia de

los antígenos D, C, c, E y e en los eritrocitos. Los reactivos anti-C, anti-c, anti-E y

anti-e se utilizan para realizar el tipaje del grupo Rh.

El principio del método se basa en la técnica de aglutinación en gel descrita

por La Pierre para la detección de las reacciones de aglutinación de los eritrocitos. La

16

aglutinación se produce al entrar en contacto los antígenos eritrocitarios con los

anticuerpos correspondientes, presentes en el reactivo o en la muestra de suero o

plasma.

La tarjeta DG gel es un soporte de plástico constituido por 8 microtubos

(Figura 6). Cada microtubo está formado por una columna y una cámara de

dispensación/incubación. Cada placa de gel es suficiente para dos pruebas.

Cada columna contiene microesferas de dextranos polimerizados en medio

amortiguado que actúan como filtro. Los dextranos se encuentran mezclados en un

reactivo que contiene anticuerpos específicos en un amortiguador.

Los microtubos que contienen los anticuerpos específicos incorporados a la

solución de gel actúan como medio de reacción y los eritrocitos aglutinan al contacto

con los anticuerpos.

Durante la centrifugación, los aglutinados de hematíes son atrapados según

su tamaño, en la superficie o a lo largo de la columna de gel (Figura 7). Los hematíes

no aglutinados descienden hasta el fondo del microtubo.

Figura 6. Tarjeta DG gel. Se observan las 8 microtubos conteniendo los antisueros específicos para la fenotipificación del Rh.

17

Cada microtubo de la tarjeta DG Gel Rh contiene dextranos polimerizados en

medio amortiguado, con conservadores y mezclados con distintos reactivos. Los

diferentes microtubos se identifican mediante la etiqueta frontal de la tarjeta.

Microtubos C: anti-C monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon

P3x25513 G8)

Microtubos c: anti-c monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon MS 33)

Microtubos E: anti-E monoclonal (anticuerpos IgM de origen humano, clon 906)

Microtubos e: anti-e monoclonal (mezcla de anticuerpos IgM de origen humano,

clones MS 16 y MS 63)

Las muestras de sangre a analizar deben ser de extracción reciente. No se

deben utilizar muestras hemolizadas, turbias, contaminadas o con presencia de

coágulos. Si es necesario, pueden usarse muestras conservadas entre 2-8°C hasta

por 48 horas después de su extracción.

La determinación del fenotipo del grupo sanguíneo Rh en gel se puede realizar

manualmente en tubos de ensayo, sin embargo, en este estudio se usó el método

semiautomático con el procesador Diana Gel (Figura 8).

Figura 7. Aspecto de la reacción con diferentes grados de aglutinación en la tarjeta DG gel.

18

Inicialmente se dejan atemperar las muestras, el reactivo DG Sol® a 18-25°C.

Se identifican las muestras y tarjetas a utilizar con el lector de código de barras que

incluye el equipo, éstas se van mostrando gráficamente en la pantalla de la

computadora conforme se introduce el código de barras. Las muestras y las tarjetas

ya identificadas se colocan en los pozos y se enciende el equipo. Se elige en la

computadora el análisis de antígenos C, c, E y e y se da inicio al procesamiento de

las muestras, el equipo trabaja de forma automática. Una vez terminado el

procesamiento de las muestras, éstas se centrifugan en la centrífuga para tarjetas

DG Gel, la cual ya está configurada especialmente para este tipo de tarjetas en

tiempo y rpm, solo se activa el botón de inicio.

El lector de placas de gel incluye una cámara que captura las imágenes de la

aglutinación ocurrida durante la reacción antígeno-anticuerpo. Se coloca cada tarjeta

en el lector y se toma la fotografía, está automáticamente se guarda, así se realiza

una fotografía a cada placa de gel. Una vez que se tienen todos los resultados

fotografiados, estos se imprimen y se archivan. Se retiran los tubos de las muestras

del equipo y se conservan hasta que se hayan analizado los resultados, después

Figura 8. Procesador Diana Gel. Equipo semiautomático para el procesamiento y lectura de las tarjetas de gel.

19

pueden desecharse. Se realiza un último lavado al equipo desde el programa en

pantalla y se apaga.

Una ventaja importante del procesador semiautomático DIANA, es que se

puede conservar la evidencia de cada fenotipo y consultar en cualquier momento el

resultado (Figura 9). Un resultado positivo en los microtubos indica la presencia de

los antígenos C, c, E y e del sistema Rh; un resultado negativo en los microtubos,

indica la ausencia de éstos.

Se recomienda realizar la lectura los resultados inmediatamente después de la

centrifugación de las tarjetas. No se deben dejar las tarjetas procesadas en posición

horizontal, ya que si fuera necesario, puede realizarse una lectura retardada hasta 24

horas después de procesadas si se conservan refrigeradas (2-8°C) y selladas con

parafilm o un material similar, para evitar la evaporación del sobrenadante.

Figura 9. Impreso de la fotografía de las reacciones de aglutinación en gel. Las reacciones positivas se observan con una banda en la parte superior mientras que las negativas la tienen en la parte inferior.

20

Los procedimientos técnicos usados para la fenotipificación se llevaron a cabo

bajo la acreditación de la normativa ISO15189 que está implementada en el Banco

de Sangre del Hospital Médica Sur.

Extracción de DNA

La extracción de DNA se realizó a partir de sangre completa, con el kit de

preparación High Pure PCR Template de Roche Applied Science®.

A 200µL de sangre completa se le agregaron 200µL del regulador de unión y

40µL de Proteinasa K, se mezcló inmediatamente y se incubó la mezcla a 70°C por

10 minutos. Después se adicionaron 100µL de isopropanol, se mezcló bien y se

trasvasó la mezcla a un tubo con columna de alta pureza, se centrifugó por 1 minuto

a 8,000 x g, se desechó el líquido resultante y el tubo de recolección. Posteriormente,

se adicionaron 500 µL del regulador inhibidor de eliminación, se centrifugó por 1

minuto a 8,000 x g, se desechó el líquido resultante y el tubo de recolección.

Después se adicionaron 500 µL del regulador de lavado, se centrifugó por 1 minuto a

8,000 x g y se desechó el líquido resultante así como el tubo de recolección

nuevamente. Luego se adicionaron 500 µL del regulador de lavado, se centrifugó por

1 minuto a 8,000 x g y se desechó el líquido resultante. Se centrifugó por 10

segundos a 13, 000 x g y esta vez se desechó el tubo de recolección. Por último, se

adicionó un tubo con tapa nuevo y 200 µL del regulador de elución (70°C) y se

centrifugó por 1 minuto a 8,000 x g, después de todo este proceso se logró obtener el

DNA purificado.

A lo largo de este procedimiento las células fueron lisadas durante la

incubación con Proteinasa K en presencia de una sal caotrópica (guanidina-HCl), la

cual inactiva todas las nucleasas inmediatamente. Los ácidos nucléicos celulares se

unen selectivamente a fibras de vidrio especiales pre-empacadas en el tubo de

purificación con columnas de alta pureza. Los ácidos nucléicos unidos son

21

purificados en una serie de pasos rápidos “lavado-enjuague” para remover

componentes celulares contaminantes. Se incluye un amortiguador especial inhibidor

de eliminación, el cual permite la utilización de muestras heparinizadas hasta con

10U/mL de heparina. Finalmente, la elución baja en sales libera los ácidos nucléicos

de la fibra de vidrio. Este sencillo procedimiento, elimina la necesidad de realizar

extracciones con solventes orgánicos y la precipitación del DNA, permitiendo una

purificación rápida de muchas muestras simultáneamente.

La calidad del DNA extraído se verificó mediante visualización de los ácidos

nucléicos por electroforesis en gel de agarosa al 1%, mientras que la pureza y la

concentración fueron valoradas usando un espectrofotómetro ACTgene, tomando 2

µL de la muestra de DNA y colocándola en la placa de lectura nos da el resultado de

la concentración de DNA en ng/µL, este método es según Sambrook y cols en 1989.

El intervalo de concentración del DNA osciló entre 20-50ng/µL.

Genotipificación del gen RHCE

Estrategias moleculares.

Dada la alta homología que el gen RHCE tiene con el gen RHD, las

estrategias moleculares a usar tienen que ser cuidadosamente definidas.

Legler y cols., 2002, definieron las secuencias para RHc y RHC que se están

utilizando actualmente por PCR en tiempo real. El diseño para RHc se basó en el

cambio T307C en el exón 2 del gen RHCE que es específico para este alelo y que es

diferente en el alelo RHC y en el gen RHD; en el caso del alelo RHC el cambio es

una inserción de 109 pb en el intrón 2 que normalmente solo se encuentra en este

alelo y que tampoco está en el gen RHD.

La estrategia usada para distinguir los alelos RHE/e se basó en la presencia

del polimorfismo C676G en el exón 5 del gen RHCE, éste fue diseñado para PCR en

tiempo real por Araujo y cols en el 2002.

22

En la tabla 4 se resumen las estrategias moleculares que se usaron para la

determinación de los diferentes alelos:

Condiciones de la PCR.

Las condiciones de reacción usadas en los experimentos fueron definidas con

base en las estrategias moleculares con algunas modificaciones menores en la fase

de estandarización, en la tabla No. 5 se muestran las condiciones finales utilizadas:

Tabla 4. Estrategias moleculares usadas.

PCR Tiempo real Amplicón Diseño

RHc (T307C, exón 2, gen RHCE)

Primer sentido 5´ TCGGCCAAGATCTGACCG 3´ Primer antisentido 5´ ATGACCACCTTCCCAGG 3´ Sonda 5´ FAM-CTTCCTGACCTCAAATTTCCGGAGA-TAMRA 3´

175 pb

Legler et al. Transfusion and Apheresis Science 2002;27:217-23.

7

RHC (Inserción de 109 pb, intrón 2, gen RHCE)

Primer sentido 5´ CATTGCTATAGCTTAAGGACTCA 3´ Primer antisentido 5´ ATGATTGTACCACTGGGAAG 3´ Sonda 5´ FAM-CAACACCAAACCAGGGCCACC-TAMRA 3´

105 pb

Legler et al. Transfusion and Apheresis Science 2002;27:217-23.

7

RHE/e (C676G, exón 5, gen RHCE)

Primer sentido 5´ GCAACAGAGCAAGAGTCCATC 3´ Primer antisentido 5´ GAACATGGCATTCTTCCTTTG 3´ Sonda ancla CGCCCTCTTCTTGTGGATGTTCTG Sonda sensor CCAAGTGTCAACTCTGCTCTGCT

392 pb

Araujo F, et al. Immunohematology 2002: 18(3):59-64.

26

Tabla 5. Condiciones de PCR usadas para los ensayos.

Desnaturalización

inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión Ciclos

Curvas de fusión (1 ciclo)

RHc 95°C 10 min 95°C 10 s 61°C 10 s 65°C 20 s 35 No

RHC 95°C 10 min 95°C 10 s 64°C 10 s 60°C 20 s 35 No

RHE/e 95°C 10 min 95°C 0 s 58°C 30 s 56°C 1 min 40 95ºC/0 s, 58 ºC/30 s

y 90 ºC/0 s

23

A partir de estas condiciones de reacción se hicieron las plantillas en el

programa LightCycler® Software versión 4.0.

Estandarización de las técnicas de PCR

Para todos los ensayos se hicieron algunas modificaciones de las condiciones

de reacción a partir de las informadas en los artículos originales, esto permitió

estandarizar las técnicas utilizadas y obtener una mejor visualización de la

amplificación.

Para estandarizar las técnicas se eligieron controles con fenotipo conocido

para RHc, RHC y RHE/e. En los 3 casos se usó un control positivo (homocigoto y

heterocigoto), y uno negativo. El ensayo se repitió 10 veces intraensayo y 10 veces

interensayo en los 3 casos. En todos los sesenta ensayos los controles positivos

amplificaron y los controles negativos y el blanco no amplificaron.

PCR en tiempo real

El PCR en tiempo real se utilizó en los ensayos moleculares para la

determinación de los alelos. El LightCycler® TM (Roche Molecular Systems), es un

sistema que consiste en la integración de un fluorómetro y un termociclador (Figura

10) que combina ciclos rápidos de PCR, con una detección de la fluorescencia en

tiempo real que va aumentando conforme aumenta el número de copias de la

secuencia de DNA amplificado, valorándose gráficamente el producto de

amplificación.

24

La reacción se lleva a cabo en capilares de borosilicato, es calentado por aire,

y distribuido por un ventilador, permitiendo una alta velocidad de reacción y con ello,

la especificidad (Figura 11).

El gráfico (eje x = ciclos; eje y = fluorescencia) que se obtiene, es de tipo

sigmoidal. La fluorescencia (Figura 12) se detecta en diferentes canales ópticos (530,

560, 610, 640, 670 y 705 nm). Los formatos de detección de los fluorocromos son: a)

SyberGreen®, b) Sondas de hibridación (HybProbe®), c) Sondas de hidrólisis

(TaqMan®) y d) sondas sencillas de hibridación en fase de alineación.

Figura 11. Capilares de borosilicato, adición de reactivos, colocación de capilares en el carrusel, colocación del carrusel, desarrollo de la reacción.

Figura 10. Diagrama de operación del termociclador-fluorómetro. Se muestran los componentes del sistema.

25

Detección de los alelos RHc y RHC.

Para la detección de RHc se procesaron 28 muestras por ensayo, en cada uno

se incluyó un Blanco y un control homocigoto positivo con fenotipo ccdee, un control

heterocigoto positivo con fenotipo CcDEe y un control negativo CCDee. El volumen

total por capilar fue de 10 µL, de los cuales 5.7 µL fueron agua grado PCR, cebador

sentido 0.1 µL, cebador antisentido 0.1 µL, sonda Taqman® 0.1 µL, Master Mix® 2.0

µL y 2 µL de DNA. Primero se realizó un cálculo para hacer la mezcla total para las

32 muestras, se adicionan todos los reactivos y se mezclaron con una pipeta durante

30 seg. Una vez mezclados se transfirieron 8 µL de la mezcla a cada uno de los 32

capilares, posteriormente a cada uno se le adicionaron los 2 µL de DNA. Una vez

llenos y tapados todos los capilares, se centrifugaron durante 30 seg a 900 rpm. Se

colocaron los capilares en el equipo LigthCycler® y se dio inicio al ensayo. Después

de aproximadamente 40 minutos, el ensayo concluyó y se pudieron observar las

curvas en la pantalla, en ese momento se guardó el archivo, se retiraron los capilares

del equipo y se desecharon. Este mismo procedimiento se repitió para las 190

muestras.

Figura 12. Equipo LightCycler® donde se observa la fluorescencia en un sistema computarizado.

26

En el caso del alelo RHC se siguieron los mismos pasos que para el alelo RHc,

ya que se utilizaron las mismas cantidades de controles y muestras. La diferencia en

el caso de RHC consistió en que los controles utilizados fueron un homocigoto

positivo con fenotipo CCDee, un control heterocigoto positivo CcDEe y uno negativo

ccdee.

El formato de detección que se usó para identificar molecularmente RHc y

RHC fue el de las sondas de hidrólisis TaqMan®.

Los ensayos de sondas de hidrólisis (Figura 13), también llamados ensayos

TaqMan®, usan una sola sonda que contiene dos marcadores, un reportero

fluorescente y un apagador fluorescente. Mientras la sonda está intacta, el apagador

está próximo al fluorocromo del reportero y suprime la fluorescencia de éste por

FRET. Cuando la sonda hibrida a la secuencia blanco, la polimerasa puede romper la

sonda de hidrólisis, separando al reportero del apagador. Con el aumento de la

cantidad de la secuencia blanco durante el PCR, más sonda puede romperse, lo que

provoca que la señal de la fluorescencia del reportero, que ya se ha liberado del

apagador, incremente. Como el principio de este ensayo es el rompimiento de la

sonda durante el PCR, esta sonda no puede ser usada para llevar a cabo un análisis

de curvas de disociación, también llamadas comúnmente curvas “melting”.

27

Detección del alelo RHE/e.

Para la detección del alelo RHE/e se procesaron 28 muestras por ensayo, en

cada ensayo se incluyó un blanco y un control homocigoto positivo para RHE con

fenotipo ccDEE, un control heterocigoto positivo con fenotipo CcDEe y un control

homocigoto positivo para RHe con fenotipo ccdee. El volumen total por capilar fue de

10 µL, de los cuales 5.4 µL fueron agua grado PCR, Cloruro de Magnesio (MgCl2,

2mM) 0.4 µL, cebador sentido 0.4 µL, cebador antisentido 0.4 µL, sonda ancla 0.2

µL, sonda sensor 0.2 µL, Master Mix®1.0 µL y 2 µL de DNA. Primero se realizó el

cálculo para hacer la mezcla total para 32 muestras, se adicionaron todos los

Figura 13. Principio de las sondas de hidrólisis TaqMan®. Primero se observa la sonda intacta, el apagador (rojo) está próximo al fluorocromo (verde) del reportero y suprime su fluorescencia. Cuando la sonda hibrida a la secuencia blanco, la polimerasa rompe la sonda de hidrólisis, separando al reportero del apagador, lo que provoca que se libere la señal de la fluorescencia del reportero.

Instructivo LighCycler® Taqman® Master, Versión Abril 2009, Roche Applied Science.

Apagador

Reportero

Fluorescencia

28

reactivos y se mezclaron con una pipeta durante 30 seg. Una vez mezclados se

transfirieron 8 µL de esta mezcla a cada uno de los 32 capilares, posteriormente a

cada capilar se le adicionaron los 2 µL de DNA. Una vez llenos todos los capilares se

taparon y centrifugaron durante 30 seg a 900 rpm. Se colocaron los capilares en el

equipo LigthCycler® y se dio inicio al ensayo. Después de aproximadamente 40

minutos se concluyó el ensayo y se pudieron observar las curvas en la pantalla, en

ese momento se guardó el archivo, se retiraron los capilares del equipo y se

desecharon. Este mismo procedimiento se repitió para las 190 muestras.

El formato de detección que se usó para identificar molecularmente RHE/e fue

el de las sondas de hibridación (HybProbe®).

Las sondas HybProbe® (Figura 14) consisten en dos oligonucleótidos

pequeños y diferentes, marcados, que se unen a una secuencia interna del

fragmento amplificado durante la fase de alineación del ciclo de amplificación. Los

pasos básicos de la detección de DNA por sondas de hibridación durante el PCR en

tiempo real en el sistema LightCycler® son: A) La sonda donadora tiene un fluoróforo

en su extremo 3´, la sonda aceptora tiene un marcador rojo (LightCycler® Red 610#,

640, 670#, o 705) en su extremo terminal 5´(ésta también está fosforilada en su

extremo 3´, así que no puede extenderse). No ocurre hibridación durante la fase de

desnaturalización de PCR. Debido a la distancia entre las sondas se previene la

transferencia de energía. No será detectada ninguna fluorescencia del aceptor rojo

durante esta fase. B) Las sondas hibridan el fragmento de DNA amplificado en un

arreglo cabeza-cola, quedando muy próximas las dos sondas fluorescentes. La

fluoresceína se excita por el haz de luz del equipo, lo cual produce la emisión de luz

verde fluorescente. La energía emitida excita al marcador LightCycler® Red por

FRET. La fluorescencia roja emitida por la segunda sonda, se mide al final de cada

alineación, cuando la intensidad de la fluorescencia es mayor. C) Después de la

alineación, un incremento de temperatura permite la elongación y a su vez el

desplazamiento de las sondas. D) Al final de este paso, el producto de PCR es de

29

doble cadena, las sondas HybProbe® que fueron desplazadas están de nuevo en la

solución y suficientemente separadas para evitar que ocurra FRET.

Tamaño de muestra y análisis estadístico

El tamaño de muestra se definió con base en un total de 1638 muestras (Tabla

6) existentes en la ADNoteca. Para esto se consideró realizar la selección por la

frecuencia alélica, por pares y la frecuencia fenotípica, sin embargo, fue la frecuencia

alélica la que se usó al final para determinar el tamaño de muestra adecuado.

Figura 14. Principio de las sondas de hibridación HybProbe®.: A) La sonda donadora tiene un fluoróforo en su extremo 3´, la sonda aceptora tiene un marcador rojo en su extremo 5. No ocurre hibridación durante la fase de desnaturalización de PCR. Debido a la distancia entre las sondas se previene la transferencia de energía. B) Las sondas hibridan el fragmento de DNA amplificado quedando muy próximas las dos sondas fluorescentes. La fluoresceína se excita por el haz de luz del equipo, lo cual produce la emisión de luz verde fluorescente. La energía emitida excita al marcador por FRET. La fluorescencia roja emitida por la segunda sonda, se mide al final de cada alineación. C) Después de la alineación, un incremento de temperatura permite la elongación y a su vez el desplazamiento de las sondas. D) Al final de este paso, el producto de PCR es de doble cadena, las sondas HybProbe® que fueron desplazadas están de nuevo en la solución y suficientemente separadas para evitar que ocurra transferencia de energía.

Instructivo LighCycler® FastStart DNA Master

HybProbe®, Versión Abril 2009, Roche Applied Science.

30

Tabla 6. Total de muestras en ADNoteca ordenadas por código de fenotipo.

Código Fenotipo No. de

muestras TOTAL

1 ccdee 545

2 ccDee 105 650

3 ccdEe 9

4 ccDEe 106 115

5 ccDEE 262 262

6 Ccdee 27 155

7 CcDee 128

8 CcdEe 5 133

9 CcDEe 128

10 CcDEE 70 70

11 CCdEE 1

12 CCDEE 7 8

13 CCDee 128 128

14 CCDEe 117 117

Total 1638

En la tabla 6 se muestran los diferentes fenotipos, a cada uno se le asignó un

código que se muestra en la primera columna; cada fenotipo se separó además por

el antígeno RhD, que aunque no fue el objetivo de estudio en este trabajo, fue útil

para realizar el análisis estadístico. En la tercera columna se desglosan las

cantidades por fenotipo con y sin el antígeno RhD, en la columna TOTAL, solo se

muestran las cantidades totales por fenotipo sin considerar el antígeno RhD.

Como se muestra en la tabla 7, para la selección de las muestras se

separaron las cantidades por alelos, se definió primero un tamaño de muestra del

10% por cada uno y luego se pareó el número de acuerdo al que tenía menor

cantidad, esto para que la muestra final fuera homogénea, sumando el tamaño

31

pareado de las muestras dio un total de 177. La selección de dicha cantidad de

muestras se hizo aleatoriamente utilizando una tabla de números aleatorios en hoja

de cálculo de Excel.

Después de la selección aleatoria, los fenotipos de baja frecuencia (<5) se

seleccionaron por cuotas, que es un procedimiento de ajuste, lo que sumó 13

muestras más a las 177 ya elegidas. El total fue de 190.

Tabla 7. Distribución de la muestras por alelos y definición del tamaño de muestra.

Alelos No. total

de muestras

Tamaño de muestra

(10%)

Tamaño pareado de

muestra

cc 1027 103 25

Cc 358 36 25

CC 253 25 25

Total 1638 164 75

ee 933 93 34

Ee 365 37 34

EE 340 34 34

Total 1638 164 102

n 177

32

III. Resultados

Se realizó la PCR en tiempo real a las 190 muestras elegidas, en total fueron 3

tipos de ensayos, RHc (TaqMan®), RHC (TaqMan®) y RHE/e (HybProbe®) en el

equipo LightCycler®. En cada ensayo se usaron controles conocidos positivos

(homocigoto y heterocigoto) y negativos. En las figuras 15, 16 y 17 se muestra un

ejemplo de cada una de las gráficas obtenidas para cada uno de los diferentes

ensayos realizados.

Determinación de RHc

En la figura 15 se observa la curva de amplificación de las muestras y los

controles positivos Cc y cc que contienen el alelo RHc, mientras que el blanco, el

control negativo CC y las muestras que no contienen el alelo RHc no muestran

amplificación y se observan con fluorescencia de 0.

Figura 15. Curva de amplificación del alelo RHc. Gráfica obtenida después del análisis cualitativo de las muestras para la determinación de RHc. Las muestras que contienen el alelo c amplifican en una curva, mientras que las que no contienen c no amplifican y quedan en estado basal con fluorescencia 0.

Amplificación

33

Determinación de RHC

En la figura 16 se observa claramente las curvas de amplificación de las

muestras con el alelo RHC, entre ellas los controles positivos CC y Cc que también

contienen el alelo C, mientras que las muestras que no contienen este alelo, el

Blanco y el control negativo cc, no amplifican mostrándose en una línea basal con

fluorescencia de 0.

Determinación de RHE/e

En la figura 17, en la parte superior se muestran las curvas de disociación

obtenidas del análisis de los alelos RHE/e. En la parte inferior se observan los picos,

el que se ve del lado izquierdo corresponde a la amplificación de muestras que

contienen solamente el alelo RHe, mientras que los picos tendidos hacia la derecha

indican que las muestras contienen solo el alelo RHE. La curva que muestra dos

Figura 16. Curva de amplificación del alelo RHC. Gráfica obtenida después del análisis cualitativo de las muestras para la determinación de RHC. Las muestras que contienen el alelo C amplifican en una curva, mientras que las que no contienen C no amplifican y quedan en estado basal con fluorescencia 0.

Amplificación

34

picos indica que se trata de muestras con RHE/e, es decir, heterocigotos. En la parte

basal se observa el Blanco.

Concordancia

De las 190 muestras elegidas y analizadas, 3 se eliminaron después de hacer

el análisis de concordancia, ya que no tuvieron rastreabilidad.

Las 187 muestras restantes se analizaron estadísticamente por el coeficiente

de ψ con el programa SPSS versión 11.0 para determinar la concordancia, de éstas,

179 concordaron y 8 no concordaron. En las tablas 8, 9, 10, 11 y 12 se muestran los

diferentes análisis realizados.

Figura 17. Análisis de las curvas de disociación para RHE/e. Gráfica obtenida después del análisis de curvas de disociación de las muestras para la determinación de RHE/e. Del lado derecho se observan las muestras con el alelo RHE mientras que del lado izquierdo, las que tienen el alelo RHe.

RHe RHE

RHE/e

35

Tabla 8. Concordancia entre el fenotipo y el genotipo para el gen RHCE.

36

En la tabla 8 se hace una relación de concordancia entre el fenotipo y

genotipo, se muestra cuál es el porcentaje y la cantidad de casos que concuerdan

entre sí y los que no concuerdan, en la última columna y fila se muestran los totales

en cada caso. Esta tabla es ilustrativa pues se observan claramente los valores

concordantes formando una línea diagonal, mientras que los valores no

concordantes saltan a la vista al quedar fuera de este arreglo.

Alelo Concordancia Total

SI NO

cc 84 4 88

95.5% 4.5% 100.0%

Cc 51 2 53

96.2% 3.8% 100.0%

CC 44 2 46

95.7% 4.3% 100.0%

179 8 187

95.7% 4.3% 100.0%

En la tabla 9 se desglosan los resultados de concordancia por alelos cc, Cc y

CC. En la parte inferior se pueden observar los valores totales de 179 concordancias

y 8 casos que no concuerdan, así como los porcentajes correspondientes por alelo y

concordancia.

Tabla 9. Concordancia por alelo C.

37

Alelo Concordancia Total

SI NO

ee 75 3 78

96.2% 3.8% 100.0%

Ee 58 5 63

92.1% 7.9% 100.0%

EE 46 46

100.0% 100.0%

179 8 187

95.7% 4.3% 100.0%

En la tabla 10 al igual que en la tabla 9 se muestran concordancias y no

concordancias para los alelos ee, Ee y EE, en éste último caso se observa la

peculiaridad de un 100% de casos concordantes de un total de 46 muestras

comparadas.

Tabla 10. Concordancia por alelo E.

38

Fenotipo Concordancia Total

SI NO

ccdee 31

31

100.0%

100.0%

ccDee 9 1 10

90.0% 10.0% 100.0%

ccdEe 5 1 6

83.3% 16.7% 100.0%

ccDEe 10 2 12

83.3% 16.7% 100.0%

ccDEE 29

29

100.0%

100.0%

Ccdee 8 2 10

80.0% 20.0% 100.0%

CcDee 11

11

100.0%

100.0%

CcDEe 19

19

100.0%

100.0%

CcDEE 14

14

100.0%

100.0%

CCDEE 3

3

100.0%

100.0%

CCDee 16

16

100.0%

100.0%

CCDEe 24 2 26

92.3% 7.7% 100.0%

179 8 187

95.7% 4.3% 100.0%

Tabla 11. Concordancia por fenotipo

39

Genotipo Concordancia Total

SI NO

ccdee 31 2 33

93.9% 6.1% 100.0%

ccDee 9 2 11

81.8% 18.2% 100.0%

ccdEe 5

5

100.0%

100.0%

ccDEe 10 1 11

90.9% 9.1% 100.0%

ccDEE 29

29

100.0%

100.0%

Ccdee 8

8

100.0%

100.0%

CcDee 11

11

100.0%

100.0%

CcDEe 19 1 20

95.0% 5.0% 100.0%

CcDEE 14 1 15

93.3% 6.7% 100.0%

CCDEE 3

3

100.0%

100.0%

CCDee 16

16

100.0%

100.0%

CCDEe 24

24

100.0%

100.0%

ccdEE

1 1

100.0% 100.0%

179 8 187

95.7% 4.3% 100.0%

Tabla 12. Concordancia por genotipo.

40

En las tablas 11 y 12 se muestran las concordancias por separado del fenotipo

y genotipo, respectivamente.

Con estas tablas podemos observar de forma individual el comportamiento de

cada fenotipo, genotipo o por separado las combinaciones de los alelos C, c, E y e.

No concordancia

Después de realizar todos los ensayos y encontrar las no concordancias, se

repitieron por triplicado las 8 muestras no concordantes para descartar algún error en

el estudio molecular o fenotípico, además de verificar los datos en los registros del

laboratorio de hematología perinatal del INPer, posteriormente se revisaron las

fotografías y datos del equipo de fotoaglutinación que se encuentran almacenados en

el Banco de datos del Hospital Médica Sur y se descartaron posibles errores de

transcripción en los fenotipos.

Al final de la investigación se definieron los hallazgos que se muestran en la

tabla 13.

41

Caso

No. Fenotipo

Observación

Placa de Gel Genotipo

Observación

PCR

1 ccDEE No se observa RhC CcDEE Amplifica para RHC.

2 CCDEe -No se observa Rhc

-Se observa RhC ccDEe

- Amplifica para RHc

- No amplifica para RHC

- RHE/e diferente T° fusión

3 ccDEe Se observa RhE ccDee No amplifica para RHE

4 ccDEe Se observa RhE ccDee No amplifica para RHE

5 Ccdee Se observa RhC ccdee No amplifica para RHC

6 CCDEe No se observa Rhc CcDEe Amplifica para RHc

7 ccdEe Se observa Rhe ccdEE No amplifica para RHe

8 Ccdee Se observa RhC ccdee No amplifica para RHC

En 7 de los 8 casos se observa una no concordancia para un solo ensayo,

excepto, en el caso No. 2, en el cual no hubo concordancia en ninguno de los

ensayos, además en el estudio para RHE/e de este mismo caso, se observó una

curva con temperaturas de fusión muy diferentes a las esperadas.

Tabla 13. Características de los casos que no concordaron.

42

IV. Discusión

El estudio de los grupos sanguíneos ABO y Rh es de suma importancia en la

medicina transfusional, ya que los antígenos de estos sistemas son altamente

inmunogénicos, por lo que son de considerar en todas las actividades relacionadas

con el empleo terapéutico de la sangre y de sus componentes, por ejemplo, en los

pacientes a ser sometidos a transfusiones y trasplantes, y en particular, en el estudio

de las anemias hemolíticas, como la anemia hemolítica autoinmune y la enfermedad

hemolítica del recién nacido, también en el ámbito antropológico, pues son

considerados como marcadores de identidad poblacional o genética.

La aportación que hace la genotipificación del sistema Rh es muy importante,

dado que forma parte del avance en la medicina transfusional. La precisión de esta

técnica de genotipificación, que evalúa los principales antígenos del sistema Rh,

tiene una estimación muy alta comparándola con la serología como método de

referencia. La imprecisión en términos de falsos positivos y falsos negativos en su

mayor parte tiene como causa la presencia de mutaciones en los genes RHCE y

RHD.

En México, la experiencia reportada se limita a la señalada por el grupo de

estudio de Baptista y Cols. Además no hay informes que incluyan el estudio del gen

RHCE en su concordancia con el fenotipo RhCE, como paso indispensable para la

evaluación y verificación previo a la aplicación en el terreno clínico.

En este estudio, del cual no se ha realizado ninguno en población mexicana,

obtuvimos una concordancia global de 0.957, la cual se asemeja a las concordancias

obtenidas en otros estudios similares en los que se han genotipificado otros tipos de

poblaciones como orientales, caucásicos o negro-africanos como se muestra en la

Tabla 14, donde se observa que la concordancia menor encontrada es de 0.960

hasta la total de 1.0.

43

Las diferencias observadas en los reportes (Tabla 14) dependen de diversas

variables, donde se incluye la metodología empleada, la estrategia molecular

adoptada (región del fragmento para amplificar), la experiencia del grupo de

investigación, las características de los sujetos de estudio evaluados

(politransfundidos, embarazadas, donadores, etc). Sin embargo, una diferencia

sustancial a ser considerada en la verificación de los métodos para ser empleados en

la práctica clínica, son las características étnicas de la población estudiada.

Entre los estudios realizados, destaca el trabajo de Perreault y cols, 2009,

quien en este año genotipificó a 10,555 donadores y encontró una concordancia del

99.6% con el fenotipo, específicamente para el alelo RHC hay 99.9%, RHc 99.9%,

RHE 98.4% y finalmente para el alelo RHe 99.8%.

Tabla 14. Comparación entre la concordancia en la determinación genotípica y fenotípica en el grupo sanguíneo RhCE por otros autores y la obtenida en este estudio.

Autor Alelos

estudiados Concordancia

Faas BHW et al. Netherlands.Blood, 1995. E/e 1.0

Finning K y cols. UK. Transfusion, 2007. C c E

1.0

Zhou HY y cols. Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi. China, 2008.

E/e; C y c

1.0 0.959

Geifman-Holtzman O. y Cols. USA. BJOG,2009. E/e. C/c

0.982 0.963

Perreault J. et al. Vox Sanguinis Canada 2009.

C c E e

0.999 0.999 0.984 0.998

Orzinska A et al.Poland, Prenat Diagnos 2008. C 1.0

Riveiro KR, Brazil, 2009.

C c E e

1.0

Presente estudio

C c E e

0.980 0.960 0.980 0.970

44

Las no concordancias pueden tener diversas causas, sin embargo, éstas aún

no han sido completamente exploradas. Zhou y cols, 2008, mencionan que el hecho

de que el alelo RHC no amplifique, puede deberse a que la inserción de los 109 pb

esté ausente en el gen en estos sujetos de estudio, por tal motivo sería necesario

utilizar otra estrategia para la detección de este alelo y así evitar los falsos negativos

por genotipo. Por otro lado, Hunhousen en el 2002, demuestra la presencia de un

gen híbrido, RHCE-D-CE, el cual podría ser la causa de que el alelo RHe no

amplifique. Esta configuración genética permite el reemplazo unidireccional de

fragmentos entre los genes RHD y RHCE que da paso a la formación de alelos

aberrantes, dada la alta homología entre ambos genes. El principal impacto de la

genotipificación de alelos aberrantes es que pudiera dar resultados falsos positivos o

falsos negativos, sobre todo tomando en cuenta algunas poblaciones específicas

como orientales y negroa-africanos.

Lo que se busca en la actualidad es que la transfusión sea lo más compatible

posible, es decir, que la mayoría de los grupos sanguíneos (entre ellos el sistema

Rh) del donador coincidan con los del receptor, para evitar con ello, la

isoinmunización por un lado, mientras que por otro lado, se pueden resolver

entidades clínicas ya existentes. Esto es posible ahora a través del estudio molecular

de los grupos sanguíneos, que en un futuro podría reemplazar al estudio fenotípico.

Con el adelanto tecnológico se ha podido avanzar en la evaluación de la

genotipificación de diversos grupos sanguíneos, en su concordancia con el fenotipo

en diversas poblaciones. En términos generales la concordancia genotipo-fenotipo

varía desde 0.957 a 1.0, dentro de la cual está comprendida el presente estudio.

La genotipificación podría agregarse al diagnóstico en medicina transfusional

en un futuro, por ejemplo para realizar genotipos de Rh en pacientes

politransfundidos o, los que requieren transfusiones recurrentes, así como en las

discrepancias para la identificación de anticuerpos, o en el estudio del Rh fetal, sin

45

embargo, todavía es necesario mejorar las estrategias moleculares con el fin de

evitar los resultados falsos positivos o negativos.

46

V. Conclusiones

Se encontró una concordancia global de 0.957 (95.7%) entre el fenotipo y

genotipo para el gen RHCE en la población estudiada.

Para el alelo RHC la concordancia entre fenotipo y genotipo fue de 0.96

(96.0%) y para el alelo RHc fue de 0.98 (98.0%)

Para el alelo RHE la concordancia entre fenotipo y genotipo fue de 0.98

(98.0%) y para RHe de 0.97 (97.0%).

Se encontraron 8 muestras no concordantes, de las cuales, para una no hubo

concordancia en ninguno de los alelos, estas representan el 4.2% del total de

187 muestras.

47

VI. Perspectivas

Caracterizar las no concordancias por medio de secuenciación para identificar

la posible existencia de alelos nuevos o ya reportados, que no son reconocidos por

esta estrategia.

48

VII. Referencias bibliográficas

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