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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TÍTULO DEL TRABAJO: “SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE DISACÁRIDOS LACTONIZADOS COMO POSIBLES AGENTES ANTINEOPLÁSICOS” INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO FARMACÉUTICO PRESENTA: AGUIRRE ALDAI YIDAN BARUCH DIRECTOR INTERNO: Dr. MARCO AUGUSTO BRITO ARIAS EVALUADORES: DR. EFREN V. GARCIA BAEZ M. en C. BENITO RIZO ZUÑIGA México, D.F. Mayo de 2006
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO: “SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE
DISACÁRIDOS LACTONIZADOS COMO POSIBLES AGENTES ANTINEOPLÁSICOS”
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO FARMACÉUTICO
PRESENTA: AGUIRRE ALDAI YIDAN BARUCH
DIRECTOR INTERNO: Dr. MARCO AUGUSTO BRITO ARIAS EVALUADORES: DR. EFREN V. GARCIA BAEZ M. en C. BENITO RIZO ZUÑIGA
México, D.F. Mayo de 2006
ÍNDICE
TEMA Pág.
1. RESUMEN
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Características de la neoplasia
2.2 Antecedentes
2.3 Química de los glicósidos
2.3.1 Grupos protectores
2.3.2 Formación del enlace O-glicosídico
2.3.2.1 Método de Michael
2.3.2.2 Método de Fischer
2.3.2.3 Método de Koenigs-Knorr
2.3.2.4 Métodos diversos
3. JUSTIFICACIÓN
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
4.2 Objetivos específicos
5. METODOLOGÍA
5.1 Materiales y métodos
5.2 Desarrollo experimental
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. CONCLUSIONES
8. RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO
9. BIBLIOGRAFÍA
10. ANEXOS
Anexo 1: Técnica para obtener metanol anhidro
5
6
6
6
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34
3
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18.
FIGURA
Algunas glicoresinas aisladas de plantas del género Ipomoea tricolor
Desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica de la
Tricolorina A
I.- Representación ORTEP de una de las conformaciones de la
tricolorina A en estado sólido; II.-Representación gráfica de la celda
unitaria. Las moléculas de la tricolorina A se indican como Mol1-Mol4 y
las de agua como W1-W18
Método de Michael
Método de Fischer
Método de Koenigs-Knorr
Síntesis de O-glicosil-α-tricloroacetimidato
Estrategia general para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos
Diagrama de la secuencia de la metodología.
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc
(1-6) lactonizado y condiciones de reacción
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc
(1-4) lactonizado y condiciones de reacción
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3) de
1-O-bencil-2,3,4-tri-O-acetil fucopiranosa
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado del intermediario 1
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado del intermediario 3
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado del intermediario 4
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado del intermediario 7
Espectro de RMN de 13C del intermediario 7
Equipo de destilación
Pág.
7
9
10
12
12
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17
17
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30
34
4
1. RESUMEN
Se sintetizan disacáridos lactonizados de potencial efecto citotóxico basándose en la
síntesis de análogos estructuralmente más simples a glicoresinas de origen natural de
conocida actividad farmacológica.
La estrategia se basa en la formación inicial de un disacárido protegido de secuencia
fucosa-glucosa (1→2) a través de la reacción de formación de un enlace O-glicosídico
entre el aceptor de fucosa y el donante de glucosa y su posterior acoplamiento al metil
ester de ácido graso, seguido por el paso crítico de macrolactonización para lo cual se
ensayará una opción enzimática y una química y final remoción de grupos protectores.
En base a esta estrategia se plantea la protección de fucosa con un grupo bencilo a la
posición anomérica, y posterior protección selectiva de las posiciones 2 y 3 dejando la
posición hidroxílica 2 libre que será el punto de unión con el donante de glucosa. El
disacárido resultante se desprotege selectivamente en la posición anomérica de la fucosa
para la posterior reacción de acoplamiento con el ester butílco, lactonización y
desprotección.
5
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Características de la neoplasia.
Neoplasia significa literalmente, "tejido formado de nuevo". Sinónimo de tumor (pero
sólo en el sentido de cualquier proceso que curse con proliferación celular excesiva). Se
aplica generalmente a los tumores malignos o cáncer. Cuando se aplica a los benignos
suele especificarse el calificativo ("neoplasia benigna").
El cáncer es una enfermedad que se caracteriza principalmente por una multiplicación
descontrolada de una célula o grupo de células del organismo, también, se denomina
tumor maligno o neoplasia maligna. La peculiaridad específica de la malignidad consiste
en la capacidad para invadir y destruir tejidos sanos de su entorno y de enviar células a
zonas distantes del organismo, donde pueden anidar o crecer originando nuevos tumores
denominados metástasis.
2.2 Antecedentes.
El aislamiento, purificación y caracterización estructural de productos naturales
constituye una estrategia de gran importancia para la búsqueda de sustancias de
potencial actividad farmacológica. Las glicoresinas son glicósidos constituidos por una
fracción de oligosacárido unido a través de un enlace O-glicosídico con ácidos grasos,
formando en su mayoría una macrolactona entre la posición terminal del ácido graso con
alguno de los hidroxilos de la fracción oligosacárida, mediante el aislamiento, purificación
y caracterización de glicolípidos constitutivos de las resinas glicosídicas de plantas del
género Ipomoea tricolor se ha determinado su actividad fitotóxica por lo que se han
empleado como herbicidas naturales, lo cual se considera un hallazgo trascendente en el
estudio de sustancias bioactivas de origen vegetal.
Estas moléculas han demostrado un poderoso efecto antimicrobiano y citotóxico de
posible interés terapéutico para el desarrollo de nuevos fármacos antineoplásicos1 El
potencial biológico de estos glicolípidos nos permite plantear el diseño y desarrollo de
análogos estructurales de menor complejidad a través de un estudio de relación
estructura-actividad biológica dirigido a la detección de los requerimientos estructurales y
estereoquímicos de la región de la molécula responsable de la actividad farmacológica en
estudio (grupo farmacofórico) y que nos lleve al mejoramiento de su efecto terapéutico.
6
La primera serie de glicolípidos macrocíclicos aislados, a partir de las resinas de
Ipomoea tricolor y posteriormente de Ipomoea orizabensis e Ipomoea batatas, de donde
se han obtenidos tri-, tetra- penta-, hexasacáridos y dímeros macrolactonizados,
corresponde a las tricolorinas A-J2. Gracias a un exhaustivo proceso de purificación
empleando técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución y posteriormente de
caracterización espectroscópica por resonancia magnética nuclear mono y bidimensional,
y espectrometría de masas de alta resolución ha sido posible la elucidación estructural
inequívoca de las glicoresinas aisladas2, en la figura 1 se muestran algunas de las
glicoresinas.
Figura 1. Algunas glicoresinas aisladas de plantas del género Ipomoea tricolor.
7
Los constituyentes individuales de las resinas glicosídicas presentan la particularidad
de ser moléculas anfipáticas debido a la presencia de un núcleo oligosacárido que les
confiere propiedades hidrofílicas y una porción hidrofóbica constituida por la aglicona que
está representada por un ácido graso hidroxilado, el ácido jalapinólico (ácido 11S-
hidroxihexadecanoico). La aglicona establece un éster cíclico intramolecular mediante la
formación de una lactona entre su grupo carboxílico y uno de los grupos hidroxilo del
núcleo oligosacárido.
Se ha podido establecer que la estructura macrocíclica constituye un requisito
fundamental para la actividad biológica ya que le confiere propiedades estereoquímicas
que desempeñan estos glicolípidos en la mediación del amplio espectro de actividades
biológicas demostradas por las resinas glicosídicas, como la actividad antitumoral, las
propiedades moduladoras de la actividad enzimática de la proteína cinasa C y de la (1,3)-
-D-glucan sintasa, esta última de utilidad para el desarrollo de agentes antifúngicos
selectivos3, la fitotoxicidad4, solo por mencionar algunas.
En recientes investigaciones se ha demostrado que las variaciones en la potencia de la
actividad biológica para dos series de glicolípidos, las tricolorinas y las orizabinas5,
dependen de su grado de lipofilicidad y del tamaño del macrociclo lactónico, presentando
una mayor actividad antimicrobiana (Staphyloccocus aureus) y citotóxica (KB) aquellos
oligosacáridos anfipáticos con un menor grado de lipofilicidad1. Esta última propiedad
fisicoquímica se encuentra asociada al número y tipo de ácidos grasos que esterifican al
núcleo oligosacárido (ácidos acético, metilbutírico, nílico, octanoico, decanoico y
dodecaoico, entre otros).
El análisis retrosintético que se puede observar en el figura 2 muestra la primordial
desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica y la subunidad acíclica del
núcleo tetrasacárido de la Tricolorina A. El disacárido D-Fuc-D-Glc (1-3) lactonizado se
ha identificado como uno de los requisitos para la actividad citotóxica de la tricolorina A y
sus congéneres. Por tanto, es importante plantear la síntesis de este posible grupo
farmacofórico y de análogos diastereosioméricos.
8
Figura 2. Desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica de la Tricolorina A.
Se ha contemplado la importancia que desempeña el tipo de agregación de estos
principios para la formación de los poros y explicar su posible potencial inofórico, de esta
forma se inició una línea de investigación para conocer la estructura tridimensional de la
tricolorina A mediante la difracción de rayos-X6. La cristalización de este tetrasacárido
sucedió en la interfase entre PEG200/agua y aceite mineral mediante una modificación a
la técnica de difusión de vapor (“hanging drop”) para la cristalización de proteínas. Los
cristales son monoclinicos con grupo espacial P21 en donde cada celda unitaria está
constituida por cuatro moléculas del glicolípido y dieciocho moléculas de agua, en la
figura 3 podemos observar la representación de la tricolorina A. Se observó un reparto
anisotrópico de las secciones hidrofóbicas e hidrofílicas ya que el agrupamiento de los
grupos hidrofóbicos del primer par de moléculas sucede de cara a las porciones
hidrofóbicas del segundo par de glicolípidos que forman cada celda unitaria. Este arreglo
dirige el empacamiento de tal manera que las caras hidrofílicas generan un canal que
aglutina a las moléculas de agua. Este análisis cristalográfico sugirió que el tamaño de
estos canales hidrofílicos, en conjunto con el arreglo en paralelo de las unidades lipídicas
9
de los oligosacáridos, es compatible con el tamaño de una membrana biológica y permite
racionalizar una explicación para la actividad citotóxica de las resinas glicosídicas basada
en una perturbación del flujo iónico a través de un modelo de inserción membranal de
posibles agregados de alto peso molecular de la tricolorina A que ocasionen alteraciones
en la permeabilidad en las membranas celulares debido a la formación de poros no
selectivos.
El alto contenido de moléculas de agua en la celda cristalina se asemeja al encontrado
en algunos cristales de proteínas. Por lo tanto, en el estado sólido la conformación de la
tricolorina A no se encuentra dominada por fuerza intermoleculares y, por lo tanto,
sugiere que una conformación similar se adopte en solución a manera de agregados o
micelas6. También, se ha propuesto que el posible mecanismo de acción bioquímico para
la toxicidad de las resinas glicosídicas puede ser el resultado de cambios
conformacionales transmembranales o en la organización y la actividad de los
fosfolípidos de éstas, promovidos por la inserción de los agregados glicolipídicos y una
concomitante formación de poros.
Figura 3. I.- Representación ORTEP de una de las conformaciones de la tricolorina A en
estado sólido; II.-Representación gráfica de la celda unitaria. Las moléculas de la
tricolorina A se indican como Mol1-Mol4 y las de agua como W1-W18.
10
Al realizar el estudio cristalográfico de la tricolorina A se estableció la estructura
cristalina de la primera resina glicosídica natural y establece el primer análisis
cristalográfico de un lipotetrasacárido con una estructura oligosacárida relativamente
flexible. Ya que el esqueleto de la tricolorina A y de algunos congéneres ha sido el
objetivo sintético de varios grupos de investigación, el conocimiento de la estructura
tridimensional del grupo farmacofórico (la subunidad macrocíclica) y de los
requerimientos estructurales y esteroquímicos de las resinas glicosídicas para mediar su
acción es fundamental para el diseño y la síntesis de prototipos con una menor
complejidad estructural que permitan potenciar sus actividades biológicas7.
2.3 Química de los glicósidos.
Un glicósido es aquella estructura en la que el carbono anomérico del hemiacetal
cíclico de un carbohidrato está conectado por medio de un heteroátomo a un grupo
alifático o aromático al que se le llama aglicón. El enlace glicosídico se produce
normalmente cuando el agente nucleofílico (alcohol, amina, tiol o carbanion) se sustituye
con el hidroxilo anomérico o un grupo saliente sustituido previamente introducido. Para
que ocurra la reacción de sustitución nucleofílica se requiere que el carbono anomérico
este activado por un grupo saliente, además de halógenos, se pueden utilizar grupos
como sulfonilo, sililo, tricloroacetoimidato y acetatos.
2.3.1 Grupos protectores.
Un requisito adicional para llevar a cabo la síntesis de glicósidos es la protección de los
grupos hidroxilo que no se desea que reaccionen, de tal forma que solo se forme el
enlace glicosídico en el hidroxilo libre. Los grupos protectores utilizados se deben
remover con facilidad, en condiciones que no produzcan la hidrólisis de del enlace recién
formado, ya que en condiciones acidas se puede hidrolizar fácilmente, de esta forma se
preferirán los grupos protectores que se remuevan en condiciones neutras o ligeramente
básicas.
11
2.3.2 Formación del enlace O-glicosídico.
El enlace O-glicosídico se forma cuando un monosacárido se condensa con un grupo
R´OH para generar una unión R´-O-R, donde R es la fracción del carbohidrato y R´ es la
fracción del aglicón. Los principales métodos sintéticos para la formación de enlaces O-
glicósidos son:
• Método de Michael
• Método de Fischer
• Método de Koenigs-Knorr, y
• Método de Helferich
2.3.2.1 Método de Michael.
Este método consiste en condensar el cloruro de 2, 3,4, 6-tetra-O-acetil-α-D-
glucopiranosido, con fenoxido de potasio, para generar el derivado acetilado que en
hidrólisis básica, generará el producto de condensación fenil-β-D-glucopiranosa.
OOAc
OAc
OAc
OAcCL
O-K+
R
OOAc
OAc
OAc
OAcR
O OOH
OH
OH
OHR
O
R=o-OMe, p-MeO
+
Figura 4. Método de Michael.
2.3.2.2 Método de Fischer.
Esta metodología consiste en la condensación catalizada por ácido de D-glucopiranosa
con metanol para producir principalmente metil-α-D-glucopiranosa, como catalizador se
pueden utilizar ácidos de Lewis, resinas de intercambio iónico y mas recientemente el
ácido tríflico.
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
Mei
i) MeOH/0.7 % HCl 20ºC Figura 5. Método de Fischer.
12
2.3.2.3 Método de Koenigs-Knorr.
Este método se basa en la reacción entre un 1, 2-cis-acetilglucolsilhaluro y un alcohol
en presencia de sales de plata. Para que la reacción se realice eficientemente, deberá
hacerse en ausencia de luz y con agitación vigorosa a temperatura ambiente. Esta
técnica posee varias modificaciones, que han demostrado ser efectivas en síntesis de
diferentes índoles.
OOAc
OAc
OAc
OAcBr
OH
i, ii OOH
OH
OH
OH
O
i) AgO2 ii)MeONa/MeOH
+
Figura 6. Método de Koenigs-Knorr.
2.3.2.4 Métodos diversos.
Un método recientemente utilizado es el método del tricloroacetimidato, el cual utiliza a
este grupo como grupo saliente. Este método presenta mejor estabilidad y es más fácil de
purificar que los haloderivados.
O
OBn
OBnOH
BnOBnO
iCCl3C N
O
OBn
OBnO
BnOBnO
NH
CCl3i) Cs2CO3/CH2Cl2 t.a. 5h
+
Figura 7. Síntesis de O-glicosil-α-tricloroacetimidato.
13
3. JUSTIFICACIÓN
En México el desarrollo de nuevos fármacos empleando metodologías que se basan
en la síntesis o semisíntesis de análogos de productos naturales de conocida actividad
farmacológica constituye un área de alta prioridad que se ha desarrollado manera
limitada. Algunos fármacos como la Aspirina, los anticonceptivos y los Antibióticos ß-
lactámicos constituyen ejemplos de fármacos diseñados a partir de productos naturales y
en base a este concepto se propone la síntesis de nuevos glicolipidos estructuralmente
más simples a glicoresinas aisladas de plantas.
En este sentido, el presente protocolo plantea el potencial biológico de estos
glicolípidos para el diseño y desarrollo de análogos estructuralmente mas simples a los
naturales con el fin de realizar un análisis conformacional de los glicolípidos citotóxicos
que permita estudios de los requerimientos estructurales involucrados en sus
mecanismos de acción en un ámbito molecular, asi como estudios posteriores de
evaluación citotóxica para realizar una exploración de la relación entre la estructura
química (lipofilia: logP) y la actividad biológica (citotoxicidad ED50)8 y establecer los
requerimientos estructurales y estereoquímicos para potenciar su actividad biológica.
El conocimiento de la estructura tridimensional del grupo farmacofórico de estos
glicolípidos es fundamental para el diseño de prototipos disacáridos análogos a la
subunidad macrocíclica de la tricolorina A y análogos de la tricolorina F, que permitan
potenciar su actividad citotóxica de aplicación terapéutica (con una posible aplicación
como agentes terapéuticos antineoplásicos) a partir de las estrategias empleadas para
obtener las mencionadas glicoresinas.
14
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general.
La síntesis y caracterización estructural por RMN de 1H y 13C de disacáridos análogos
de las glicoresinas de origen natural Tricolorina A y F9.
4.2 Objetivos específicos.
1. Síntesis de análogos de la tricolorina F como unidades disacáridas D-Fuc-D-Glc
(1 4) y D-Fuc-D-Glu (1 6) a partir de la estrategia empleada para obtener la
glicoresina tricolorina F9
2. Purificación de los intermediarios y productos para caracterizar estructural y
conformacionalmente por medio de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C.
3. En caso de obtener cristales de alta pureza se realizara difracción de rayos X para
determinar su estructura tridimensional.
15
5. METODOLOGÍA
Las estrategias generales para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos
requieren de un intermediario de azúcar conocido como donante glicosídico, que contiene
grupos protectores en las posiciones no involucradas en la formación del enlace, y de un
grupo saliente unido a la posición anomérica. Por otra parte se requiere de una especie
que puede ser de diferente naturaleza química, pero debe contener al menos un grupo
hidroxilo libre para que en presencia de un promotor adecuado se establezca el enlace O-
glicosídico que interesa generar, como se puede ver en la figura 8.
O
OH
PGPG
PGPG
O PG
SGPG
PGPG+ O
O
PGPG
PGPG
OPG
PGPGPG
Promotor
Aceptor glicosidico Donador glicosidico
PG= Grupo protectorSG= Grupo saliente
Figura 8. Estrategia general para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos.
La obtención de sustancias de potencial actividad farmacológica mediante síntesis
química requiere de una serie de pasos que involucran la reacción y tratamiento
posterior, así como la purificación y caracterización estructural de los intermediarios
obtenidos. Los pasos mencionados en esta secuencia se pueden ver representados en la
figura 9.
16
Figura 9. Diagrama de la secuencia de la metodología.
Preparación del aceptor glicosídico purificación y
caracterización estructural
Reacción de condensación usando un promotor
glicosídico. Purificación y caracterización estructural
Preparación del donante glicosídico, purificación y
caracterización estructural
Eliminación de grupos protectores. Purificación y caracterización
estructural
Para la obtención de los disacáridos lactonizados se propone una estrategia basada en
la formación del disacárido de fucosa-glucosa unidos mediante un enlace (1→2)
debidamente protegidos, y posterior condensación al ester butílico del ácido jalapinólico
de acuerdo a la figura 10. El disacárido unido al ácido graso será lactonizado
inespecíficamente a cualquiera de las posiciones disponibles de la glucosa, aunque se
espera que la unión preferencial sea al hidroxilo primario 6. Esta estrategia busca
emplear cantidades menores de ácido graso considerando que será condensado al
disacárido en una etapa avanzada de la síntesis.
17
OO
O
Me
OBnO
OAc
AcOOAc
OAc O
OAcO
AcOAcO
OAc
OC(NH)CCl3OO
O
HO
Me
OBn
i
1
2
3
OO
O
Me
OHO
OAc
AcOOAc
OAc O
ii
4
OO
O
Me
OOAc
AcOOAc
OAc O
5
iiiOC(NH)CCl3
iv
OMe
C5H11
OH
O
OO
O
Me
OOAc
AcOOAc
OAc O
OMe
C5H11
O
O
6
7
OO
O
Me
OOH
HOOH
OH O
OMe
C5H11
O
O
8
OO
O
Me
OHOHO
OH
O O
C5H11
O
9
v
O
OOH
HO
Me
OHOHO
OH
O O
C5H11
O
10
O
vii
i) BF3 Et2O, CH2Cl2 ii) H2Pd(OH)2/Et OH iii) CCl3CN, Cs2CO3 iv) BF3 Et2O, CH2Cl2
v) KOH, MeOH vi) TBz-Cl, Et3N, DMAP, C6H6 vii) H3O+
vi
Figura 10. Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-6)
lactonizado y condiciones de reacción.
18
Para la reacción de lactonización en posiciones distintas a 6, como la posición 4 se
proponen las rutas descritas en la figura 11, que considera la condensación del
intermediario de fucosa 1 con donantes glicosídicos de glucosa que permiten la remoción
selectiva de grupos protectores susceptibles de ser lactonizados.
Figura 11. Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-4)
lactonizado y condiciones de reacción.
19
5.1 Materiales y métodos.
Los reactivos empleados son de grado analítico obtenidos comercialmente (Sigma-
Aldrich Co.) y los disolventes usados fueron destilados previos a su uso. La purificación
de los intermediarios fue llevada a cabo usando como fase estacionaria silica gel 60
(Merck Co.) y el curso de las reacciones fue monitoreada por cromatografía en capa fina
usando cromatofolios de silica gel 60 y como sistema revelador solución de sulfato cerico
amoniacal seguido por calentamiento. Los espectros de resonancia magnética nuclear de
hidrógeno (1H RMN) y carbono (13C RMN) fueron registrados en un espectrómetro Varian
300 Gemini usando cloroformo deuterado como disolvente.
5.2 Desarrollo experimental.
1-O-bencil-2,3,4-tri-O-acetil fucopiranosa.
En un matraz bola de 50 mL se adiciona 1,2,3,4-tetraacetil fucopiranosa (1 g) y se
adiciona una solución de ácido bromhídrico en ácido acético al 30% (10 mL) y la reacción
se mantiene con agitación a temperatura ambiente durante 4 horas. Se diluye con
diclorometano frío (30 mL) y se lava con solución saturada de NaHCO3 (3x30 mL) y
solución salina (20 mL). La fase orgánica se seca sobre Na2SO4, se decanta y evapora
en rotovapor para obtener bromoacetofuranosa (0.84 g, 80%) que sin purificar se diluye
en diclorometano (5 mL) y se le adiciona alcohol bencilico (0.257 g, 2.37 mmol), triflato de
plata (15 mg), drierita (10 mg), yodo (5 mg) y la reacción se agita en ausencia de luz
durante 12 horas. El producto de la reacción se filtra y evapora en rotovapor para realizar
purificación en cromatografía en columna usando silica gel 60 como fase estacionaria y
se eluye con hexano-acetato de etil (4:1) como fase móvil, para obtener (0.63 g, 70%) del
intermediario 2 como un producto cristalino.
1HRMN (CDCl3,δ ppm): 1.31 (d, 3H), 1.9-2.2 (3 S, 9H), 3.8 (m, 1H), 4.5 (d, 1H), 4.6 (d,
1H), 4.9 (d, 1H), 5.0 (dd, 1H), 5.2 (m, 1H), 5.3 (d, 1H), 7.3-7.5 (m, 5H).
OMeOAc
AcO
OAc OAc
OMeOAc
AcO
OAc
OBn
20
1-O-bencil-3,4-O-isopropiliden fucopiranosa (1) En un matraz bola se disuelve 1-O-bencil-2,3,4-tri-O-acetil fucopiranosa (2.1 g, 5.52
mmol) en metanol anhidro (5 mL) y bajo atmósfera inerte se adiciona una solución de
metóxido de sodio (30 mg Na/1 mL metanol) manteniendo la agitación durante 6 horas.
Posteriormente se adiciona resina Dowex 50 hasta llegar a un pH de 7, seguido por
filtración y extracción con diclorometano (3x10 mL). La fase orgánica se seca con
Na2SO4 anhidro y se concentra en rotovapor y se obtiene 1-O-bencil-fucopiranosa (1 g,
3.71 mmol, 70%). El producto oleoso se disuelve en una mezcla de 2,2-
dimetoxipropanona y acetona (6 y 3 mL respectivamente) y una cantidad catalítica de
ácido paratoluensulfónico (30 mg), manteniendo la reacción con agitación por 24 horas.
Se adiciona K2CO3 anhidro (1 g) para neutralizar y se realiza una percolación en columna
pequeña de silica gel eluyendo con una mezcla de hexano–acetato de etilo (1:1) y
concentrando en rotovapor para obtener el intermediario 1 (0.712 g, 2.5 mmol, 61%).
1HRMN(CDCl3,δ ppm): 1.35 (s, 3H), 1.4 (d, 3H), 1.5 (s, 3H), 3.6 (t, 1H), 3.8 (qd, 1H), 4.0
(m, 2H), 4.1 (d, 1H), 4.6 (d, 1H), 5.0 (d, 1H), 7.2-7.4 (m, 5H).
(1)
OMeOAc
AcO
OAc
OBnO
MeO
O
OH
OBn
2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glucopiranosil tricloroacetilimidato (2)
En un matraz de 50 mL se hace reaccionar 5 g de glucosa en diclorometano frío (20
mL) en presencia de 7mL de trietilamina y 5 mL de anhídrido acético a -10 ºC, se agregan
80 mg de DMAP (dimetil amino piridina), y se deja en agitación 24 horas a temperatura
ambiente. La reacción se diluye en 100 mL de diclorometano frío y se lava con solución
1N HCl (3x10 mL), una solución saturada de NaHCO3 (3x10mL), y solución salina (30
mL). El contenido de la fase orgánica recuperada se concentra y se evapora en rotovapor
para generar pentaacetato de glucopiranosa en forma de sólido cristalino.
21
En un matraz de 50 mL se disuelve pentaacetato de glucopiranosa (2g, 5.12 mmol) en
5 mL de tetrahidrofurano (THF), y se adiciona 0.1 mL de bencilamina (BnNH2)
manteniendo la agitación durante 14 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se
adiciona 0.4 mL de solución 1N de HCl y se agita durante una hora a temperatura
ambiente. Se adiciona 10 mL de solución 1 N de HCl y se extrae con diclorometano (3x10
mL). La fase orgánica se lava con solución saturada de NaHCO3 (3x10 mL), solución
salina (50 mL), y se seca sobre Na2SO4 anhidro, se decanta y evapora en rotovapor. El
intermediario resultante desprotegido en la posición anomérica se disuelve en 5 mL de
diclorometano, bajo atmósfera de nitrógeno y se adiciona Cl3CCN (0.5 ml) seguido por
Cs2CO3 (109 mg), manteniendo la agitación durante 7 horas a temperatura ambiente. La
reacción se percola en columna de silica gel y eluye con una mezcla 1:1 de hexano-
acetato de etilo. Las fracciones se concentran en rotovapor en baño menor a 40ºC para
obtener un producto oleoso correspondiente a 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glucopiranosil
tricloroacetilimidato 2, a esta molécula se dificulta realizar su espectroscopia debido a que
se descompone fácilmente.
OAcO
AcOOAc
AcOO
HOHO
OH OH
HO
OCNHCCl3(2)
1-O-bencil-3,4-O-isopropiliden-β-D-fucopiranosil-(1→2)-2,3,4,6-tetra-O-acetil
glucopiranosa (3)
En un matraz seco se disuelve el intermediario 2 (1.04 g, 2.04 mmol) en diclorometano
(3 mL) y se adiciona el producto oleoso 1 (0.60 g, 2.04 mmol) previamente disuelto en
diclorometano (3 ml). La reacción se enfría a -10 °C y se adiciona 5 µl de solución de
BF3.Et2O como promotor glicosídico y la reacción se mantiene durante 40 minutos. La
reacción se diluye en diclorometano frío (20 mL), y se lava con 10 mL de una solución
saturada de NaHCO3 en frio, se seca con Na2SO4 y se evapora para obtener un producto
que es purificado por cromatografía en columna usando silica gel 60 como fase
estacionaria y una mezcla de hexano-acetato de etilo (4:1) como sistema eluyente para
obtener (0.800 g, 1.25 mmol, 61%) del intermediario 3 como sólido cristalino.
22
1HRMN (CDCl3,δ ppm): 1.2 (s, 3H), 1.3 (d, 3H), 1.6 (s, 3H), 1.9-2.1 (4 s, 12H), 3.2-4.6 (m,
6H), 4.6-5.4 (m, 8H), 7.2-7.4 (m, 5H).
OAcO
AcO
OAc
(2)O
MeO
O
OH
OBn
AcO
OCNHCCl3
(1)
OMeO
O
O
OBn
(3)
OAcO
AcO
OAc
AcO
1-O-hidroxi-3,4-O-isopropiliden-β-D-fucopiranosil-(1→2)-2,3,4,6-tetra-O-acetil
glucopiranosa (4)
En un matraz bola de 50 mL se disuelve el intermediario 3 (0.420 g, 0.65 mmol) en
metanol (10 mL) y se adicionan Pd-C al 10% (80 mg) como catalizador manteniendo la
agitación bajo atmósfera de hidrogeno durante 7 horas a temperatura ambiente. La
reacción se percola sobre celita, se eluye con metanol y se evapora en rotovapor para
generar el intermediario 4 (0.110 g, 0.2 mmol, 30%) como mezcla de anómeros.
1HRMN (CDCl3,δ ppm) mezcla de anómeros: 1.2 (s, 6H), 1.3 (d, 6H), 1.6 (s, 6H), 1.9-2.1
(8 s, 24H), 3.2-4.6 (m, 12H), 4.6-5.4 (m, 12H).
OMeO
O
O
OBn
(3)
OAcO
AcO
OAc
AcO
OMeO
O
O
(4)
OAcO
AcO
OAc
AcO OH
23
Metil (11S)-11-[[(2,3,4,6-O-tetraacetil-β-D-glucopiranosil)-(1→2)-3,4-O-isopropiliden-β-D-
fucopiranosil]oxi]hexadecanoato (7)
En un matraz bola de 50 mL se disuelve el intermediario 4 (0.110 g, 0.2 mmol) en
diclorometano (3 mL) en condiciones anhidras y bajo una atmósfera de nitrógeno, se
adiciona con jeringa CCl3CN (0.3 mL) y Cs2CO3 (100 mg) y se deja en agitación durante 7
horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. El producto obtenido se
percola en una columna de gel 60 de sílice de usando como fase móvil una mezcla de
hexano–acetato de etilo (1:1), se concentra y se evapora en rotovapor, obteniendo el
intermediario 5 (0.098 g, 0.14 mmol, 70%), el cual se hace reaccionar en un matraz bola
con el ácido 11S-hidroxihexadecanoico 6 (0.048 g, 0.14 mmol) diluido en diclorometano
(3 mL). La reacción se enfría a -10oC y se inyectan 5 µl de BF3-Et2O, conservando la
agitación por 1 hora bajo atmósfera de nitrógeno. Se diluye con diclorometano (15 mL) y
se lava con solución saturada de NaHCO3 (5 mL). La fase orgánica se seca con Na2SO4
anhidro, se decanta y evapora en rotovapor para obtener el intermediario 7 (0.065g,
0.083 mmol, 49%).
1H RMN (CDCl3, δ ppm): 0.89 (t, 3H), 1.27-1.54 (m, 31H), 1.97-2.06 (4 s, 12H), 2.29 (t,
2H), 3.57-3.77 (m, 6H), 3.96 (dd, 1H), 4.07 (dd, 1H), 4.13 (d,1H), 4.22 (dd, 1H), 4.97 (d,
1H), 5.04 (d, 1H), 5.07 (d, 1H), 5.09 (d, 1H), 5.15 (t, 1H).
13C RMN (CDCl3, δ ppm): 14.3-34.32 (m, 18C), 51.69 (s, 1C), 62.79-79.68 (m, 12C) 99.83-
101.81 (2s, 2C), 109.76-109.99 (3s, 3C), 169.66-171.03 (4s, 4C).
C5H11
OMe
O
OMeO
O
O
O
(5)
OAcO
AcOOAc
AcO
OMeO
O
OOAcO
AcOOAc
AcOOCNHCCl3
C5H11
OMe
O
OH(6)
(7)
24
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de la metodología planteada se preparo 1-O-bencil-2,3,4-tri-O-acetil
fucopiranosa bajo las condiciones descritas, el espectro de resonancia magnética nuclear
de hidrógeno, figura 12, se puede apreciar a 1.3 ppm un doble asignable a tres
hidrógenos de la fucosa, a 2 ppm muestra señales simples sobrepuestas proporcionadas
por tres metilos de los acetatos, a 3.8 ppm se observa una señal doble asignable al
carbono cinco de la fucosa, alrededor de 4.5 y 5.3 ppm se observan las señales
asignables al los hidrógenos cíclicos del azúcar y a 7.4 ppm se observan las señales
típicas de los hidrógenos aromáticos.
Figura 12. Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado de 1-O-bencil-2,3,4-tri-O-
acetil fucopiranosa
25
El espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno de 1-O-bencil-3,4-O-
isopropiliden fucopiranosa 1 en CDCl3 muestra señales a 1.37, 1.45 y 1.53 ppm una señal
doble que integra para 3H asignables al grupo metilo de la fucosa, así como las señales
correspondientes a 2 metilos del acetónido. Entre la región a 3.61-4.95 ppm aparecen las
señales correspondientes a los hidrógenos de la fucosa y al sistema AB del metileno
(3.82, t; 1H; 3.87, dq, 1H; 3.99, m, 2H; 4.29, d; 1H; 4.57, d 1H; 4.95, d 1H) y en campo
bajo las señales correspondientes al benceno monosustituído (7.2-7.5, m, 5H), tal y como
se puede ver en la figura 13, por lo que el espectro si corresponde con la molécula
esperada.
Figura 13. Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3) del intermediario 1.
26
El siguiente paso consistió en la reacción de glicosidación del intermediario 1 con
2,3,4,6-tetraacetyl-α-D glucopiranosil imidato 2 empleando como promotor glicosídico
BF3.Et2O a bajas temperaturas, para generar 1-O-bencil-3,4-O-isopropiliden-β-D-
fucopiranosil-(1→2)-2,3,4,6-tetra-O-acetil glucopiranosa 3 en rendimiento de 61%. Este
disacárido se obtuvo en forma de cristales de alta simetría por lo que se estudia su
estructura mediante difracción de rayos X.
El espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno en cloroformo deuterado
del intermediario 3, figura 14, muestra señales entre 1.1-1.5 ppm correspondientes al
metilo de la fucosa y el acetónido, en δ 2.0 ppm señales simples sobrepuestas
correspondientes a cuatro metilos de los acetatos presentes en la glucosa. La región a
4.0-5.6 ppm muestra un patrón complejo de señales en las que aparecen los picos
correspondientes a los hidrógenos cíclicos de fucosa y glucosa, así como al sistema AB
del metileno del grupo bencílico. Se observan además 2 señales dobles en a 5.6 y 6.4
ppm asignables a los protones anoméricos del disacárido. En la región a 7.2-7.8 ppm se
observan las señales típicas de hidrógenos aromáticos.
Figura 14. Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3) del intermediario 3.
27
El siguiente paso consistió en someter el intermediario 3 a condiciones de
hidrogenación catalítica con la finalidad de remover el grupo bencílico de la posición
anomérica de la fucosa y generar el intermediario 4, para posteriormente instalar el grupo
imidato que permitirá la condensación con el ester del ácido jalapinólico. La reacción de
desprotección se llevo a cabo empleando como catalizador Pd-C al 10% bajo atmósfera
de hidrógeno y etanol como disolvente. El espectro de resonancia magnética nuclear de
hidrógeno muestra un espectro parcialmente puro, como podemos ver en la figura 15,
donde se observan las señales correspondientes al acetónido a 1.7 ppm, acetatos a 2.0
ppm y a 4.0-5.6 ppm asignables a los hidrógenos del disacárido. La ausencia de señales
(a excepción del cloroformo en 7.2) en la región aromática indica la eliminación del grupo
bencílico de la posición anomérica de la fucosa.
Figura 15. Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3) del intermediario 4.
28
Para la obtención del intermediario 7, se hizo reaccionar el intermediario 4 con Cl3CCN
y como catalizador Cs2CO3, para posteriormente adicionar el ácido jalapinólico (ácido
11S-hidroxihexadecanoico), y utilizar BF3.Et2O como promotor glicosídico.
El espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno en cloroformo deuterado
del intermediario 7, como se puede observar en la figura 16, muestra señales a 1.1-1.5
ppm correspondientes al metilo de la fucosa y el acetónido, así como señales
sobrepuestas del acido graso, a 2.0 ppm señales simples sobrepuestas correspondientes
a cuatro metilos del los acetatos presentes en la glucosa. La región a 4.0-5.6 ppm
muestra un patrón complejo de señales en las que aparecen los picos correspondientes a
los hidrógenos cíclicos de fucosa y glucosa. Se observan además 2 señales dobles a 5
ppm y a 5.1 ppm asignables a los protones anoméricos del disacárido.
Figura 16. Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3) del intermediario 7.
29
El intermediario 7 fue caracterizado espectroscópicamente por resonancia magnética
nuclear de carbono, mostrando en la región alifática los carbonos correspondientes al
acido graso y al metilo de la fucosa, en la región vinílica se observan los carbonos
correspondientes a los anillos de la fucosa y glucosa, en aproximadamente 100 y 110
ppm se observan las señales de los carbonos anoméricos de fucosa y glucosa
respectivamente, y entre 170 y 180 ppm se pueden apreciar las señales características
de los carbonilos (figura 17).
Figura 17. Espectro de RMN de 13C del intermediario 7.
30
7. CONCLUSIONES
• Se ha logrado la síntesis y caracterización estructural por RMN de 1H de los
intermediarios 1, 2, 3, 4, 5 y 7 de la figura 10 por las vías propuestas.
• En un espectro de RMN de 1H parcialmente puro se ha logrado caracterizar
estructuralmente los intermediarios 4 y 7.
• Se logro caracterizar estructuralmente por de RMN de 13C el intermediario 7 en un
espectro parcialmente puro.
• Se logro la cristalización del intermediario disacárido 3, el cual se encuentra en
estudio de difracción de rayos X.
• El intermediario 7 se encontraba parcialmente puro, por lo que se encuentra en
purificación por medio de HPLC (en colaboración con la Facultad de Química de
la UNAM)
31
8. RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO
Siguiendo con la tópica de trabajo se realizará un escalamiento para obtener mayor
cantidad de producto, de esta forma, se caracterizara de una mejor forma. La purificación
utilizando HPLC es una herramienta que se esta realizando en colaboración, esta,
aportara compuestos que también serán mas fácil de caracterizar estructuralmente, y en
caso de obtener cristales de alta pureza se realizara difracción de rayos X para conocer
su estructura tridimensional.
Cuando hayan sido sintetizados los disacáridos de fucosa-glucosa lactonizados como
análogos simplificados de menor complejidad, permitirá ampliar el escaso conocimiento
relacionado con la diversidad estructural de metabolitos biodinámicos y permitirá realizar
una exploración de la relación entre la estructura química (lipofilia: logP), la actividad
biológica (citotoxicidad ED50) y establecer los requerimientos estructurales y
estereoquímicos para potenciar su actividad biológica.
En otras líneas de investigación se comprenderá la caracterización de la estructura
química y la determinación de la conformación preferida en disolución de los
oligosacáridos citotóxicos mediante la aplicación de la resonancia magnética nuclear y el
modelado molecular, también se determinará la capacidad de inserción membranal y la
formación de poros de las resinas glicosídicas en modelos membranales selectos.
32
9. BIBLIOGRAFIA
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Tetrasaccharide Glycolipids from the Mexican Scammony Root (Ipomoea
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7. Fürstner, A. (2004) Total syntheses and biological assessment of macrocyclic
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F. J. Org. Chem. 69, 4567- 4570.
33
10. ANEXOS
Anexo 1: Técnica para obtener metanol anhidro.
La destilación separara los componentes de una mezcla líquida calentando la mezcla en
el rango de los puntos de ebullición de los componentes mientras se van condensando el
vapor simultáneamente, para obtener metanol anhidro se coloca metanol grado analítico
obtenido comercialmente (Sigma-Aldrich Co.) en un matraz bola y se adiciona calcio
metálico (1 g/L), se destila a 45 ºC con trampa de humeddad y se recupera el destilado
en un matraz seco.
Figura 18. Equipo de destilación.
34
