Instituto politécnico nacionali

Instituto politécnico nacionali

Escuela nacional de ciencias biológicas

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN EN

ALIMENTOS

ESTUDIO DE LA ENCAPSULACIÓN DE

Bifidobacterium animalis subsp. lactis

Y SU USO COMO PROBIÓTICO

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

DOCTOR EN CIENCIAS CON

ESPECIALIDAD EN ALIMENTOS

P R E S E N T A:

GONZÁLEZ SÁNCHEZ JOSÉ FERNANDO

Director de tesis: Dr. Humberto Hernández Sánchez

Director de tesis: Dr. Gustavo Fidel Gutiérrez López

México D.F. JUNIO 2009

iii

―La sabiduría consiste en saber que se sabe lo que se sabe y saber que no se

sabe lo que no se sabe‖

―Las buenas fuentes se conocen en las grandes sequías; los buenos amigos, en

las épocas desgraciadas.‖

―Si un problema tiene solución, no hace falta preocuparse. Si no tiene solución,

preocuparse no sirve de nada‖

―Si haces planes para un año, siembra arroz. Si los haces para dos lustros, planta

árboles. Si los haces para toda la vida, educa a una persona‖

iv

DEDICATORIA

A mi madre y mis hermanos,

por dedicarme un poco de su tiempo,

tiempo para demostrar su preocupación por mí,

tiempo para escuchar mis problemas

y ayudarme a buscarles solución.

A todos mis amigos que conoci

personas maravillosas.

Gracias a ustedes

me conoci un poco más

e incluso a apreciar lo que soy.

A los profesores del doctorado,

Por lo enseñado, en cada clase y

hacer nacer en mi el deseo de aprender.

A Nora, por todos los momentos

que hemos compartido

momentos llenos de sentimientos

y pensamientos compartidos,

sueños y anhelos,

secretos, risas y lágrimas,

y sobre todo, amistad.

v

AGRADECIMIENTOS

A LETY, QUE SIMPRE ESTA ATENTA A TODOS NOSOTROS, YA FUERA PARA

QUE ENTREGARAMOS DOCUMENTACIÓN Ó NO SE NOS OLVIDARAN

CIERTOS DETALLES.

A ALEX Y PATO, POR SU AYUDA EN LA PARTE EXPERIMENTAL EN SU

LABORATORIO Y POR SU APOYO INCONDICIONAL.

AL CONACYT POR LA BECA OTORGADA, QUE ME HIZO MAS FACIL LA

PERMANECNIA EN EL DOCTORADO.

vi

CONTENIDO

Página

ÍNDICE DE CUADROS…………………………………………………………... viii

ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………. ix

RESUMEN………………………………………………………………………… xi

ABSTRACT………………………………………………………………………... xiii

I. Introducción…………………………………………………………… 1

II. Antecedentes…………………………………………………………. 4

II.1. Ecología microbiana del tracto digestivo humano………………… 4

II.2. Interacción entre la bacteria comensal del intestino y el sistema

inmune………………………………………………………………….

7

II.3. Probióticos y prebióticos…………………………………………….. 8

II.4. Características de las bifidobacterias………..…………………….. 11

II.4.1 Taxonomía del Género Bifidobacterium…………………………… 12

II.4.2 Uso seguro de las Bifidobacterias…………………………………. 16

II.5. Propiedades antimicrobianas………………………………………. 20

II.5.1. Bacteriocinas…………………………………………………………. 21

II.5.2. Compuestos con función de bacteriocinas………………………… 24

II.5.3. Compuestos que inhiben la adherencia de patógenos………….. 25

II.5.4. Sideróforos……………………………………………………………. 25

II.6. Efectos fisiológicos y clínicos de las bifidobacterias……………… 26

II.6.1. Tiempo de tránsito colónico..………………………………………... 26

II.6.2 Fermentación colónica………………………………………………. 28

vii

II.6.3. Estimulación de la inmunidad………………………………………. 28

II.6.4 Efectos en el sistema inmune del colon…………………………... 29

II.6.5 Efecto de las bifidobacterias en las enfermedades

gastrointestinales……………………………………………………..

30

II.6.6. Efecto de las bifidobacterias sobre la carcinogénesis del colon… 32

II.7 Aplicaciones…………………………………………………………… 33

II.8. Encapsulación de ingredientes bioactivos………………………… 34

III Justificación…………………………………………………………… 40

IV Hipótesis……………………………………………………………..... 41

V Objetivos………………………………………………………………. 41

V.1. Objetivo General……………………………………………………… 41

V.2. Objetivos Específicos………………………………………………… 41

VI Materiales y métodos………………………………………………… 42

VI.1. Materiales……………………………………………………………… 42

VI.2. Desarrollo experimental……………………………………………… 43

VI.3. Metodología…………………………………………………………… 44

VII Resultados y discusión……………………………………………… 53

VIII Conclusiones………………………………………………………… 80

IX Referencias…………………………………………………………… 82

viii

ÍNDICE DE CUADROS

Página

Cuadro 1 Lista de especies del género Bifidobacterium………………... 12

Cuadro 2 Resumen del nombre de las bacteriocinas purificadas de

bifidobacterias…………………………………………………….

21

Cuadro 3 Espectro de la actividad antimicrobiana de los compuestos

proteínicos inhibitorios obtenidos de las bifidobacterias……..

23

Cuadro 4 Algunas cepas de bifidobacterias empleadas en

aplicaciones comerciales………………………………………..

33

Cuadro 5 Efectos favorables de la encapsulación de probióticos…….. 39

Cuadro 6 Peso y diámetro de las cápsulas de alginato…………………. 56

Cuadro 7 Células atrapadas por gramo de cápsulas……………………. 58

Cuadro 8 Comparación de las características de las cápsulas

hidratadas y deshidratadas……………………………………...

61

Cuadro 9 Indicadores morfométricos de cápsulas tratadas en

condiciones de simulación gástrica……………………………

65

Cuadro 10 Viabilidad de las bifidobacterias libres y encapsuladas por

tamaño y concentración de alginato después de la

simulación gástrica……………………………………………….

67

Cuadro 11 Cambios de pH del kéfir con bifidobacterias durante el

almacenamiento…………………………………………………..

77

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Cambios en la microbiota intestinal en bebes desde recién nacido

hasta los 7 días de edad…………………………………………………

5

Figura 2 Cambios de la microbiota intestinal con la edad…………………….. 6

Figura 3 Defensa inmune contra la bacteria comensal del intestino…………. 8

Figura 4 Formación de acetato y lactato de glucosa por el ciclo bifidum…….. 13

Figura 5 Árbol filogenético de las bifidobacterias……………………………….. 15

Figura 6 Criterios de selección para probioticos….…………………………….. 16

Figura 7 Estructura química de los ácidos biliares……………………………… 19

Figura 8 Esquema hipotético que muestra los efectos antimicrobianos de

los componentes proteínicos obtenidos de las bifidobacterias……..

20

Figura 9 Métodos de cubierta por aspersión para encapsular probióticos….. 37

Figura 10 Tecnologías de gelificación de partícula para la

microencapsulación de probióticos…………………………………….

38

Figura 11 Morfología de las bifidobacterias………………………………………. 54

Figura 12 Cinética de la fermentación de Bb 12…………………………………. 54

Figura 13 Curva tipo bacterias vs absorbancia a 660 nm……………………….. 55

Figura 14 Curvas de secado de las esferas de alginato………………………… 59

Figura 15 Efecto de la temperatura de secado del aire sobre la rapidez de

secado …………………………………………………………………...

59

Figura 16 Cápsulas de alginato……………………………………………………. 60

Figura 17 Imágenes de microscopia de barrido de las cápsulas deshidratadas

a temperatura de 20ºC (A), de 40ºC x 15 minutos (B) y de 40ºC

(C) y correspondientes imágenes binarizadas del área

proyectada.………………………………………………………………..

60

Figura 18 Viabilidad de las capsulas hidratadas y deshidratadas……………… 62

Figura 19 Efecto de las sales biliares en cápsulas de 1.44 mm y 3% de

alginato…………………………………………………………………….

65

Figura 20 Difusión en agar………………………………………………………….. 70

Figura 21 Modelo general para la formación de poros………………………….. 71

x

Figura 22 Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas y no encapsuladas

durante el periodo de almacenamiento del Kefir de 0 a 28 días en

refrigeración……………………………………………………………..

74

Figura 23 Viabilidad de Bifidobacterium animalis subsp. lactis encapsulada y

sin encapsular durante el almacenamiento por 28 días del kéfir en

refrigeración antes y después de someterse a la simulación

gástrica a pH2……

75

Figura 24 Cambios en la acidez titulable del kéfir…………………………… 78

xi

RESUMEN

La viabilidad y actividad de los probióticos (lactobacilos y bifidobacterias) en los

productos es un pre-requisito para obtener los beneficios en la salud. Sin embargo

la viabilidad de las bifidobacterias en leches fermentadas, depende de la cepa

seleccionada, interacción entre las especies microbianas presentes, producción de

peróxido de hidrógeno del metabolismo bacteriano, actividad acuosa y la acidez

del producto final. Adicionalmente la viabilidad puede ser afectada por la

disponibilidad de nutrientes, inhibidores de crecimiento, concentración de

azucares, potencial redox (presencia de oxígeno) debido a la permeabilidad del

empaque al oxígeno, cantidad de inoculo y tiempo de fermentación. Por esta razón

las técnicas de encapsulación y microencapsulación son un método prometedor

para mejorar la supervivencia y liberación de bifidobacterias fisiológicamente

activas al sitio donde deben ejercer su acción benéfica. El objetivo de este trabajo

fue estudiar el proceso de encapsulación de Bifidobacterium animalis subsp. lactis

para emplearse como probiótico en Kéfir. Se empleo la bifidobacteria, cepa BB12

(Chr. Hansen), se activo la bacteria, se cultivo en medio TPYG y se conservo en

congelación con glicerol. La encapsulación se realizo con alginato de calcio al 1, 2

y 3% en tres tamaños diferentes (1.4, 1.8 y 2.4 mm); las bifidobacterias libres y

encapsuladas se sometieron a la simulación gástrica a pH 2, por tres horas y

posteriormente se pasaron a la solución de sales biliares por dos horas. Al Kéfir

previamente elaborado, se le adicionaron bifidobacterias encapsuladas y

bifidobacterias libres; se determinó el pH y acidez titulable en muestras de kéfir por

un periodo de 4 semanas; se sometió a una simulación gástrica a pH2 después

del almacenamiento y se realizo la enumeración de bifidobacterias viables. Así

mismo las cápsulas se secaron por lecho fluidizado. Se evaluó el efecto de la

nisina en el crecimiento de las bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular, así

mismo se evaluó la susceptibilidad de las bifidobacterias a antimicrobianos. El

número de células libres disminuyo 36% después de estar en contacto con la

solución gástrica, en cambio las células encapsuladas disminuyeron entre 0.4 a

9.9%. Al pasar a las sales biliares las cápsulas de tamaño de 1.4 y 1.8 mm, se

xii

desintegran o se rompen y la viabilidad de las células encapsuladas disminuye

1% y las libres su viabilidad disminuye 3% durante este periodo. En el kéfir se tuvo

una disminución del 35% de la población de bacterias encapsuladas y del 56% de

bifidobacterias no encapsuladas; el pH del kéfir varió de 4.7 a 4.3 a partir de su

elaboración hasta el final del tiempo de almacenamiento, el valor más bajo de pH

se encontró en el control y fue mayor en el kéfir con células encapsuladas; la

acidez titulable fue similar en el kéfir con células libres y el control, fue mayor la

acidez en estos que en el kéfir con cápsulas. Las cápsulas secadas por lecho

fluidizado tuvieron un peso de 1 mg con un contenido de humedad de 2% (b.h.)

al final del secado; el mejor método de deshidratación fue el de 40ºC x 15 minutos

y el resto a 20ºC, estas cápsulas tuvieron una cuenta viable de 1.7 x 106 UFC/g

después de tres meses de almacenamiento. La encapsulación ayuda a que las

bifidobacterias resistan la acción de la nisina. Las bifidobacterias fueron

susceptibles a 10 antimicrobianos. El tamaño y concentración de gel influye en la

viabilidad durante toda la digestión gástrica. La encapsulación en alginato mejoro

la supervivencia de las bifidobacterias después de la exposición a 3 horas en

ácido clorhídrico a pH2, antes y después del periodo de almacenamiento del kéfir.

xiii

ABSTRACT

The viability and activity of probiotics in products is a prerequisite for obtaining

health benefits. However viability of bifidobacteria in fermented milk products

depends on the selected strain, interactions between microbial species, production

of hydrogen peroxide from bacterial metabolism, water activity and final product

acidity. Additionally, viability may be affected by nutrients availability, growth

inhibitors, sugars concentration, redox potential (presence of oxygen) and oxygen

permeability of packaging, inoculum amount and fermentation time. Hence,

encapsulation or microencapsulation techniques are a promising approach to

improve viability of bifidobacteria and their release in physiologically active sites

where they exert their beneficial action. The aim of this work was to study the

process of encapsulation of Bifidobacterium animalis subsp. lactis as a probiotic for

use in Kefir. Bifidobacteria strain BB12 (Chr Hansen) was cultured in TPYG broth

and freezed in glycerol solution. Encapsulation was carried out with calcium

alginate 1, 2 and 3% and three different beads sizes (1.4, 1.8 and 2.4 mm), free

and entrapped cells were tested in gastric simulation at pH 2; for three hours and

then passed to a bile salts solution for two hours. Encapsulated and free cells were

added to previously developed Kéfir and pH, titratable acidity and cell viability were

measured weekly for a month in the product. Both types of cells were subjected to

a simulated gastric digestion at pH 2 after the storage period. Capsules were dried

in a fluid bed dryer. The effect of nisin and different antibiotics on the growth of free

and encapsulated bifidobacteria was evaluated. Free cell number decreases 36%

after contact with the gastric solution; however encapsulated cells decreased only

to a range of 0.4 to 9.9%. In the case of the bile salts, the beads of sizes 1.4 and

1.8 mm were disintegrated and the viability of encapsulated cells decreased 1%,

compared with free cells which viability decreased 3% during this experiment. In

the case of Kefir, a decline of 35% in the population of encapsulated bacteria and

56% in free bifidobacteria could be observed. The pH of kefir ranged from 4.8 to

4.34 after its development and until the end of storage. The lowest pH was found in

the control sample and the highest in kefir with encapsulated cells. Titratable

xiv

acidity was similar in the control kefir and in the kefir with free cells and in both

cases higher than the acidity in kefir with beads. Dried beads had a mass of 1 mg

with a moisture content of 2% (w.b.) at the end of the drying process. The best

method of dehydration was 40 º C x 15 minutes and the rest at 20 ° C, where the

beads had a count of 1.7 x 106 viable UFC after three months of storage.

Encapsulated bifidobacteria resisted the action of nisin. Bifidobacteria were

susceptible to 10 antimicrobials. The size and concentration of gel affected the

viability during gastric digestion. Encapsulation in alginate improves the

bifidobacteria survival after 3 hours at pH2, before and after the storage period of

kefir.

1

I. INTRODUCCIÓN

El incremento del costo en el cuidado de la salud, el constante aumento de la

esperanza de vida y el deseo de las personas mayores por mejorar su calidad de

vida son factores que han conducido a la investigación y desarrollo en el área de

alimentos funcionales. Aunque el concepto de alimentos funcionales fue

introducido muchos años atrás con Hipócrates y su lema ―Que vuestros alimentos

sean vuestras medicinas, y que vuestras medicinas sean vuestros alimentos‖,

recientemente las pruebas en organismos vivos han comenzado a apoyar la

hipótesis de que el alimento juega un papel importante en la modulación de las

funciones fisiológicas del cuerpo humano. Entre los muchos compuestos

funcionales reconocidos hasta la fecha, los componentes bioactivos de los

alimentos probióticos y fermentados han sido el centro de atención debido a su

larga tradición de alimento seguro y sus efectos benéficos (Valsiljevic and Shah,

2008).

Los probióticos son microorganismos vivos (bacterias o levaduras) los cuales

benefician la salud del consumidor por el mejoramiento del balance de su

microbiota intestinal (Fuller, 1989); cuando estos se adicionan a un producto

alimenticio, adecuado de tal forma que se mantengan vivos y en suficiente

cantidad, a éste producto se le denomina alimento probiótico y después del

consumo del mismo, se espera obtener los efectos deseados en salud, más allá

de usarse solo como alimento (Marteu y col., 2001);

Los principales probióticos son bacterias de los géneros Lactobacillus y

Bifidobacterium, nativas del tracto gastrointestinal humano y han sido

tradicionalmente utilizadas en diversas fermentaciones alimentarías. Las

bifidobacterias ayudan a estimular el sistema inmune, producir vitaminas del grupo

B, inhibir el crecimiento de patógenos, reducir los niveles de colesterol en la

sangre y ayudar a restablecer la microbiota normal después de una terapia con

antibióticos. Los lactobacilos pueden ayudar a la digestión de la lactosa en

2

personas intolerantes a la misma, reducir el estreñimiento y la diarrea infantil,

ayudan a resistir infecciones como salmonella y ayuda a aliviar el síndrome del

intestino irritable (Gibson y Roberfroi, 1995; Manning y Gibson, 2004).

Las bifidobacterias han sido objeto de gran interés debido a su contribución en el

mantenimiento de la salud gastrointestinal (Lievin y col., 2000). Por esta razón

diversas cepas de este género se consideran como probióticos, y entre ellas la

más uasada es Bifidobacterium animalis subsp. lactis (Bb12). A menudo se

adiciona como bacterias viables a los productos lácteos (por ejemplo el yogurt) o

se suministran en alimentos infantiles.

Con el fin de ejercer sus propiedades funcionales, los probióticos necesitan llegar

viables al sitio activo. La viabilidad y actividad de los probióticos en los productos

es un pre-requisito para obtener los beneficios en la salud. Sin embargo, algunos

cultivos no viables pueden ejercer ciertas propiedades funcionales como la

inmunomodulación (Ouwehand y col., 1999). Además, en general no se ha

alcanzado un acuerdo sobre los niveles recomendados y se sugieren niveles

desde 106 ufc/mL (Kurman y Rasic, 1991) hasta 107 y 108 ufc/mL (Lourens-

Hattingh y Viljoen, 2001). Estas sugerencias se han realizado por la posible

disminución en la concentración de células viables durante el procesamiento,

congelación, descongelación y almacenamiento del producto probiótico, así como

el paso por la parte superior del tracto gastrointestinal. En Japón, la Asociación de

Leches Fermentadas y Bebidas de Bacterias Ácido Lácticas, ha implementado un

estándar y ha promovido que al menos se debe tener una concentración de 107

unidades formadoras de colonias (ufc) de bifidobacterias por gramo de producto

para que se considere un alimento probiótico para humanos (Ishibashi y

Shimamura, 1993). Sin embargo varios estudios han demostrado que las cepas

probióticas crecen poco en leche, lo que resulta en bajas concentraciones en el

yogurt terminado e incluso la perdida de la viabilidad durante el tiempo de

almacenamiento en frío (Vasiljevik y Shah, 2008).

3

El número de bacterias probióticas en los productos lácteos fermentados, se ve

reducido significativamente por la acidez, la concentración de azúcar en el

producto y la toxicidad del oxígeno. Por esta razón, las tecnologías tales como la

cubierta entérica y microencapsulación se han estudiado como métodos

prometedores para la protección eficaz y liberación efectiva de las cepas

probióticas fisiológicamente activas. La microencapsulación es un proceso en el

que las células se mantienen dentro de una película envolvente con el fin de

reducir el daño celular o pérdida de la célula. Se han empleado materiales

envolventes como la gelatina o gomas vegetales para brindar protección a

organismos probióticos sensibles a la acidez. El alginato es otro excipiente que ha

mostrado un gran potencial debido a los requerimientos sencillos del proceso y los

costos generales. Además el alginato no es toxico por lo cual puede usarse de

manera segura en los alimentos. El gel de alginato puede solubilizarse por el

secuestro de los iones de calcio dando como resultado la liberación de las células

atrapadas. Los organismos probióticos encapsulados muestran una mejor

viabilidad en comparación con los organismos no encapsulados cuando son

adicionados en postres fermentados congelados y yogurt (Ravula y Shah, 2000;

Capela y col., 2006).

4

II. ANTECEDENTES

II.1. Ecología microbiana del tracto digestivo humano

La microbiota del tracto gastrointestinal (TGI) es una comunidad muy compleja,

que incluye microorganismos anaerobios y anaerobios facultativos. La microbiota

predominante del estómago es anaerobia Gram-positiva, con concentraciones de

<103 ufc/mL. La concentración más alta de estos microorganismos se encuentra

en el intestino delgado (Naidu, 1999). Se reconocen diferentes hábitats

pertenecientes al tracto digestivo, por ejemplo, la boca, el estómago, el intestino

delgado (duodeno, yeyuno e íleon), intestino grueso (ciego y colon) y recto.

Normalmente existe una estabilidad en estos hábitats. El equilibrio se ve

influenciado individualmente por el hospedero. Esto significa que existen

variaciones interpersonales (individuales). Cada persona tiene una microbiota fija

en cuanto a lo que concierne a la cantidad de lactobacilos y bifidobacterias

(Reuter, 2001). Este hecho es de gran interés, pues se pueden identificar más de

400 especies de bacterias pertenecientes a la microbiota intestinal y pueden

alcanzar niveles de células bacterianas en el colon de aproximadamente de 1014 lo

cual es 10 veces más del total de células del cuerpo humano que es de 1013

(Mitsuoka, 1982). Entre estas, solo de 30 a 40 especies constituyen casi el 99% de

la masa de la microbiota intestinal. Los factores ambientales, interacciones

fisiológicas y la dieta rigen la distribución de la microbiota en diferentes regiones

del tracto. De estos factores, la dieta es el principal factor que regula la frecuencia

y concentración de especies individuales y grupos de microorganismos que

colonizan el tubo digestivo (Naidu y col., 1999).

La población bacteriana en el TGI puede dividirse en bacterias autóctonas y

alóctonas. Las bacterias autóctonas forman parte de la microbiota estable y se

define como las bacterias que habitan un lugar o región por primera vez, es decir

las que son encontradas donde se formaron, mientras las bacterias alóctonas se

encuentran en un sitio diferente de aquel en el que crecieron. La cuenta relativa de

5

esta última puede variar con el tiempo dependiendo de los cambios del medio

ambiente o por el consumo de bacterias vivas encontradas en los alimentos

(Tannock, 1999). Las bifidobacterias pueden encontrase en el TGI como

residentes autóctonas y alóctonas.

Los niños recién nacidos tienen un TGI estéril y la colonización bacteriana inicia

inmediatamente después de nacidos. Durante los primeros días de vida, la

microbiota detectada en heces es relativamente simple, compuesta principalmente

por enterobacterias y estreptococos y se vuelve más diversa con el tiempo

(Figura1). La composición fecal de los niños se ve influenciada por el tipo de parto

al nacer, el medio ambiente, la dieta (Fanaro y col., 2003) y posiblemente la

genética como revelan estudios en gemelos monocigotos (Zoetendal y col., 2001).

Varios estudios han mostrado que las heces de los bebes tienen grandes

cantidades de bifidobacterias, cuando estos son alimentados con leche materna,

comparados con bebes alimentados con fórmula láctea, en donde sus heces

contienen una microbiota más diversa (Favier y col., 2002). Aunque otros estudios

reportan que no existe diferencia de la microbiota entre los dos regímenes de

alimentación (Penders y col., 2005). Las diferencias pueden deberse a las

variaciones individuales entre infantes y/o a la diferente composición de las

fórmulas usadas para los estudios, la cual puede en algunos casos estimular la

población endógena de bifidobacterias (Klijn y col., 2005).

Figura 1. Cambios en la microbiota intestinal en bebes desde recién nacido hasta los 7 días de edad (Tomado de Arunachalam, 1999)

6

En adultos sanos la composición de la microbiota varía entre individuos y se

mantiene estable a través de una gran parte de nuestra vida (Figura 2). Las

especies más dominantes son del género Bacteroides y Clostridium (Matsuki y

col., 2004). Anteriormente utilizando métodos de cultivo dependientes se estimó

que las bifidobacterias comprenden el 10% de la microbiota intestinal en adultos,

pero las últimas evaluaciones basadas en métodos de cultivos independientes

sugieren que las bifidobacterias constituyen hasta el 3% de la microbiota total.

Esta menor estimación es el reflejo probable a un aumento en el número total de

especies detectadas, las cuales incluyen especies no cultivables, en lugar de una

disminución de bifidobacterias totales (Klijn y col., 2005).

Figura 2. Cambios de la microbiota intestinal con la edad (Lourens-Hatlingh y Viljoen, 2001).

Se observo en pacientes ancianos que la composición fecal cambia con el

incremento de la edad y disminuye el número total de bifidobacterias junto con la

disminución de otra diversidad de especies (Woodmansey y col., 2004). La

presencia de bifidobacterias en heces humanas está asociada con el buen estado

de salud y se ha encontrado que existen diferencias al comparar la composición

microbiana entre individuos sanos y enfermos. Por ejemplo la microbiota de los

pacientes con la enfermedad de Crohn difiere de la de las personas sanas por el

contenido mayor de enterobacterias y aparentemente menos bifidobacterias

(Seksik y col., 2003). Al comparar niños lactantes sanos y alérgicos se observo

diferencias en la cantidad de Bifidobacterium spp. (Ouwehand y col., 2001).

Log u

fc /

g h

eces

7

II.2. Interacción entre la bacteria comensal del intestino y el sistema inmune

La barrera física que separa a la gran cantidad de bacterias comensales del

intestino de los tejidos subyacentes es solo una simple capa epitelial (célula

simple); aunque es reforzada por la secreción por parte del epitelio de una capa de

moco, inmunoglobulina A (IgA) y la producción de moléculas antibacterianas

(como defensinas) (Figura 3). Teniendo en cuenta esto, no es sorprendente que

tanto en humanos como en animales de experimentación algunas bacterias

puedan penetrar esta barrera para llegar a tejidos más profundos (Ganz, 2003;

Berg, 1996). Algunos estudios mostraron que aunque las bacterias comensales

son eliminadas en cuestión de horas por los macrófagos, estas pueden sobrevivir

por varios días dentro de las células dendríticas (CDs). Sin embargo las CDs que

han atrapado a bacterias comensales en la placa de Peyer no penetran más allá

de los nodulos linfáticos mesentéricos, de modo que las CDs cebadas por

bacterias vivas son generalmente restringidas al sistema inmune de las mucosas.

Es importante señalar que este efecto in vivo se pierde si se mata a las bacterias

por un tratamiento térmico, porque este efecto no es mediado por polisacáridos y/o

moléculas inmunoestimuladoras derivadas de otras bacterias. (Aunque las CDs

pueden concentrar estos componentes al atrapar a bacterias vivas). Así la

producción de IgA y probablemente la respuesta intestinal a células T, puede ser

selectivamente inducida por las CDs cargadas con bacterias comensales y este

incrementa la secreción de IgA local limitando la penetración de bacterias

comensales (Macpherson y Uhr, 2004). Durante mucho tiempo se ha establecido

que las células B y las células T se activan en las placas de Peyer, después de lo

cual estas recirculan a través de los vasos linfáticos intestinales, entran en el

torrente sanguíneo a nivel del conducto torácico y regresan a la lámina propia

intestinal. Debido a que las CDs contienen bacterias comensales vivas estas son

confinadas al sistema inmune mucoso, la inducción de células T y B se enfoca en

la mucosa donde es requerida una respuesta. (Macpherson y Harris, 2004).

8

Figura 3. Defensa inmune contra la bacteria comensal del intestino. Las bacterias comensales están presentes a altas densidades en el lumen intestinal (más de 10

12 bacterias por gramo de

contenido luminal). La mayoría de las bacterias comensales reside fuera de la placa de moco que cubre las células epiteliales del intestino. Algunas bacterias pueden ser eliminadas por moléculas antibacteriales, como las defensinas, las cuales son producidas por las células epiteliales. Las bacterias que penetran la placa epitelial de enterocitos son rápidamente eliminadas por los macrófagos de la lámina propia. Las bacterias comensales pueden también penetrar por medio de folículos especializados asociados al epitelio, las células M, las cuales están sobre las placas de Peyer. Estas bacterias son rápidamente eliminadas por macrófagos, pero pequeñas cantidades pueden sobrevivir por algunos días dentro de las células dendríticas (CDs). Esto permite la interacción entre las CDs con las células T y B de las placas de Peyer y/o la migración de CDs por drenado a los nódulos linfoides mesentéricos.

II.3. Probióticos y prebióticos

Definición de probióticos. La palabra probiótico fue inicialmente usada como un

antónimo de la palabra ―antibiótico‖. Esta deriva de las palabras griegas προ y

βιοτοσ traducido como ―por la vida‖ (Hamilton-Miller y col., 2003).

Vasiljevic (2008) refiere la historia del concepto, enunciado que el primero en

utilizar esta palabra fue Kollan en 1952, para describir la recuperación de la salud

de pacientes malnutridos empleando suplementos orgánicos e inorgánicos y que

un año después Vergin propuso, que el desbalance en el cuerpo debido al

9

tratamiento con antibióticos, puede ser restablecido con una dieta rica en

probióticos. Posteriormente en 1955 Kolb reconoció los efectos detrimentales de la

terapia con antibióticos y propuso utilizar a los probióticos como preventivo.

Tiempo después Lilly y Stillwell (1965) definieron los probióticos como substancias

producidas por un microorganismo que promueve el crecimiento de otros

organismos. Similar a esta propuesta, Sperti en 1971 y posteriormente en 1973

Fujji y Cook, describieron a los probióticos como componentes que pueden

estimular el crecimiento microbiano o mejorar la respuesta inmune del hospedero

sin inhibir el crecimiento de un cultivo in vitro. Otra definición fue ofrecida por

Parker en 1974 definiéndolos como organismos y substancias las cuales

contribuyen al balance microbiano del intestino. Esta definición fue criticada por

muchos autores debido a que al decir ―sustancias‖, pueden quedar incluidos los

antibióticos (Vasiljevic, 2008).

La definición más frecuentemente citada es la de Fuller (1992), quien los definió

como ―Suplemento alimenticio de microorganismos vivos, los cuales afectan

benéficamente al animal hospedero por el mejoramiento de su balance microbiano

intestinal‖. Aunque su definición fue más aplicable a animales que a humanos.

Otros autores siguiendo esta línea ofrecieron sus versiones, estando de acuerdo

que probióticos incluye microorganismos vivos. En 1999 Salminem y

colaboradores ofrecieron su definición incorporando bacterias no viables en la

misma. Siguiendo las recomendaciones del grupo de trabajo para la evaluación de

los probióticos de la FAO/OMS (Food and Agricultural Organization/Organización

Mundial de la Salud) en el 2002, sugirieron describir a los probióticos como

microorganismos vivos, los cuales cuando son administrados en cantidad

adecuada confieren un beneficio a la salud del hospedero. Por consecuencia una

gran variedad de especies y géneros pueden ser considerados probióticos

potenciales (Holzapfel y col., 1998); aunque las cepas más importantes

comercialmente pertenecen a las bacterias ácido lácticas (BAL) y bifidobacterias.

10

Prebióticos. Los prebióticos, como la inulina y los oligosacaridos, se definen

como ingredientes no digeribles que tienen un efecto benéfico en la salud por el

estímulo selectivo en el crecimiento y/o actividad de una o varias bacterias del

colon (Gibson y Roberfroid, 1995). Esta definición fue actualizada en el 2004,

ahora prebióticos se define como ―Ingredientes fermentables selectos que

permiten cambios concretos, tanto en la composición y/o en la actividad de la

microbiota gastrointestinal que brinda al hospedero un bienestar en su salud‖

(Gibson y col., 2004).

Sin embargo, el efecto de un prebiótico es en esencia indirecto, por que sirve de

fuente de carbono selectivo para el crecimiento de una o un número limitado de

microorganismos, causando así una modificación selectiva de la microbiota

intestinal del huésped (especialmente en el colon). No es el prebiótico en sí

mismo, sino más bien los cambios inducidos en la composición de la microbiota,

que es la responsable de los efectos. De hecho las bacterias más importantes,

objeto de la estimulación selectiva, son del género Bifidobacterium y Lactobacillus

(Teitelbaum y Walker, 2002).

Dentro de estos ingredientes fermentables los que más se emplean son la

lactulosa, fructooligosacaridos y diversos polisacáridos. Estos azúcares son de

origen natural, algunos como la inulina son considerados como parte de la fibra

dietética. La lactulosa ha sido empleada clínicamente para el alivio sintomático en

algunas enfermedades hepáticas. En concreto, reduce las concentraciones de

amoniaco en la sangre e impide el desarrollo de enfermedades hepáticas y

encefalopatías (Bezkorovainy, 2001).

Un estudio demostró la modificación de la microbiota intestinal por medio de

prebióticos, al incluir germinados de cebada en la alimentación, los cuales

sirvieron como complemento en el tratamiento de colitis ulcerosa (Fukuda y col.,

2002). Sin embargo, a pesar de que el tratamiento más recomendado para

pacientes con el síndrome del intestino inflamado, es un aumento en la ingesta de

11

fibra dietética, actualmente pruebas clínicas no apoyan el empleo de prebióticos

en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (Sartor, 2004).

Los mecanismos de acción deben ser definidos adecuadamente, debido a que la

modificación de la microbiota por la ingestión de los prebióticos puede interactuar

con el sistema inmunológico y tener efectos no solo de protección gastrointestinal,

sino un efecto sistémico, dada la naturaleza de la respuesta inmune asociada a

tejido linfoide de los intestinos, que a su vez puede tener importancia en otras

mucosas, como la piel y las vías respiratorias, proporcionando de esta forma un

beneficio sistémico más amplio (Saavedra y Tschernia, 2002).

II.4. Características de las bifidobacterias

Las bifidobacterias son habitantes normales del tracto gastrointestinal humano y

están presentes durante toda nuestra vida, apareciendo a los pocos días después

del nacimiento. Las especies nativas de bifidobacterias son dependientes de la

edad del individuo. Bifidobacterium infantis y B. breve son predominantes en

infantes mientras B. adolescentis es predominante en adultos y B. longum está

presente a lo largo de la vida del individuo (Gomes y Malcata, 1999). Constituyen

una de las diversas especies predominantes de la microflora del colon, junto con

Peptostreptococcus, Eubacterias, Clostridia y Bacteroides; las bifidobacterias se

encuentran presentes en niveles que van de 108-1011 bacterias/g de material del

colon (Perdigón y col., 2003).

Las bifidobacterias difieren de las bacterias ácido lácticas en que no solamente

producen ácido láctico sino también ácido acético, como uno de sus principales

productos de fermentación (Klein y col., 1998). La clasificación de las

bifidobacterias ha cambiado muchas veces, desde que fueron aisladas por Tissier

en 1899, de heces de bebés alimentados con leche materna. Para el año de 1994,

se habían incluido en la lista a tres especies adicionales, B. inopinatum,

B.denticolens (Crociani y col, 1996) y B. psychraerophilum (Simpson y col., 2004),

12

con un total de 33 especies; pero Masco y col. (2004), así como Ventura y Zink

(2002) dan evidencia de que B. animalis y B. lactis pertenecen a una misma

especie (B. animalis).

II.4.1. Taxonomía, Género Bifidobacterium

En 1899-1900 Tissier fue el primero en aislar y describir a las bifidobacterias

como microorganismos anaerobios con morfología de bífido, en forma de

bastones, no productoras de gases, las cuales están presentes en las heces de

bebes, y les asignó el término de Bacillus bifidos. Las bifidobacterias son

generalmente caracterizadas como gram positivas, no formadores de esporas, no

móviles, anaerobias y catalasa negativa. Hay varios tipos incluyendo bastones

pequeños, curvos, circulares y bifurcados en forma de Y. Existen 33 especies

incluidas en el género Bifidobacterium, 14 de las cuales son de origen humano

(dental, heces y vaginal), 17 de tractos intestinales o del rumen de animales, dos

de aguas de desecho y una de leches fermentadas (ver Cuadro 1). Las

bifidobacterias están filogenéticamente agrupadas en la rama de los actinomicetos

de bacterias gram positivas (Velásquez y Feirtag, 1997), se caracterizan por un

alto contenido de guanina más citosina (G+C), el cual varia de 54 a 67% mol.

Cuadro 1. Lista de especies del género Bifidobacterium

B. adolescentis a B. choerinum B. infantisa B. pollorum

B. angulatanum a B. coryneforme B.animalis subsp.

Lactis

B. ruminantium

B. animalis B. cuniculi B. longuma B. saeculare

B. asteróides B. dentiuma B. magnum B. subtile

B. bifidum a B. gallicum B. merycicum B. suis

B. boum B. gallinarum B. minimum B. termophilum

B breva.a B. globosuma B. pseudocatenulatum a

B. catenulatuma B. indicum B. psudolongum

B. denticoles a B. inopinatuma B. psychraerophilum

a Especies aisladas de fuentes humanas. Fuente: Gomes y Malcata, 1999.

13

Son organismos sacarolíticos que producen ácido acético y ácido láctico sin la

generación de CO2, excepto durante la degradación de gluconato (Figura 4).

Figura 4. Formación de acetato y lactato de glucosa por el ciclo bifidum. 1- Hexoquinasa y fructosa 6 fosfato isomerasa, 2- fructosa 6-fosfato fosfocetoloasa, 3-transaldolasa, 4-transcetolasa, 5- Ribosa-5fosfato isomerasa, 6- ribulosa 5-fosfato-3 pimerasa, 7- xylulosa 5 fosfocetolasa, 8- acetato cinasa, 9- enzimas del ciclo homofermentativo (adaptado de Rasic y Kurmann, 1983).

La heterofermentación es iniciada por el rompimiento de la fructosa 6 fosfato entre

la parte de un C2 y un C4. La conversión de la porción de C2 a acetato es paralela

a la formación de heptosa 7 fosfato de la parte concomitante del C4 con la

formación de una parte de triosa derivada de la adición molecular de fructosa 6

fosfato. La heptosa 7 fosfato es dividida subsecuentemente en dos moléculas de

14

acetato y una molécula de piruvato. La segunda triosa de la parte izquierda de la

fructosa 6 fosfato es convertida a lactato. Por lo cual la fermentación de dos moles

de hexosa da como resultado tres moles de acetato y dos moles de lactato. La

enzima clave en la fermentación tipo glicolítica es la fructosa 6 fosfato

fosfocetolasa, la cual puede ser usada como una carácter taxonómico en la

identificación del género, pero ésta no hace posible la diferenciación ínter especie

(Masco y col., 2004).

El pH óptimo para el crecimiento es entre 6 –7, y prácticamente no crecen a pH de

4.5 - 5.0 o por encima de pH de 8.0-8.5. La temperatura óptima de crecimiento es

de 37 a 41°C, con crecimiento a una temperatura máxima de 43 a 45°C y sin

crecimiento por debajo de los 25-28°C (Gomes y Malcata, 1999).

En lo que respecta a Bifidobacterium animalis subsp. lactis subsp. nov., la

temperatura óptima de crecimiento es de 39-42°C. No ocurre crecimiento en agar

en caja expuestos al aire, pero es tolerante a un 10% de oxígeno en la atmósfera

sobre un medio líquido. Ocurre crecimiento en leche o en medios a base de leche.

La relación molar de acetato a lactato del metabolismo de la glucosa es cercano a

10 a 1 bajo condiciones anaeróbicas, por ejemplo, la producción de lactato es

remplazada por la producción de formiato. Las cepas han sido aisladas de

muestras de leches fermentadas, heces de infantes, conejos, pollos y aguas

negras. El contenido de DNA G+C es de 61.0 0.5%mol. Cepa tipo:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis UR1 T(LMG19314T=DSM10140

T=JCM10602 T) ( Masco y col, 2004).

Respecto a la taxonomía, las técnicas moleculares modernas incluida la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) y otros métodos moleculares para determinar el

de genotipo, han sido importantes para la identificación de las especies y de

diferenciación de cepas de bifidobacterias.

15

El análisis de la secuenciación de la cadena del rRNA 16s (normalmente utilizado

para producir árboles filigeneticos) no es apropiado para distinguir las diferentes

especies del género Bifidobacterium (Miyake y col., 1998). Por lo cual se utiliza

preferentemente la secuencia de la proteína de 60kDa de choque térmico (HSP

60); además, se encuentra en una sola copia en casi todas las especies

bacterianas. El árbol filogenético es realizado comparando un fragemento de DNA

de 0.6kb de la HSP60 de cada especie de bifidobacteria estudiada (Picard y col.,

2005). En la figura 5 se presenta en detalle la filogenia de B. animalis subsp. lactis.

Figura 5. Árbol filogenético de las bifidobacterias basado en la secuencia parcial de DNA de la

HSP60. Barra 5% de divergencia de la secuencia (Picard y col., 2005).

16

II.4.2. Uso seguro de las Bifidobacterias

El uso seguro de las bifidobacterias es apoyado históricamente por el consumo de

leches fermentadas y por el conocimiento cada vez mayor sobre la taxonomía y

fisiología de las bifiodobacterias (Ishibashi y Yamazaki, 2001). Las bacterias ácido

lácticas de los alimentos son consideradas microorganismos comensales con

poco o ningún potencial patógeno (Makclainen, 2003). Borrielo y col. (2003)

llegaron a la conclusión de que los lactobacilos y bifidobacterias empleados como

probióticos no representan un riesgo para la salud del consumidor.

Se han hecho tres propuestas para asegurar la seguridad de las cepas probióticas

(a) estudios de las propiedades intrínsecas de la cepa probiótica. (b) estudios de la

farmacocinética de las bifidobacterias (sobrevivencia, actividad en el intestino,

interrelacion dosis-respuesta y recuperación de las mismas en heces y mucosa) y

(c) estudios de la interacción entre el hospedero y las bifidobacterias (Saarela y

col., 2000). Los criterios para seleccionar a las cepas probioticas se ilustran en la

Figura 6.

Figura 6. Criterios de selección para probióticos (Salminen y col., 1998)

Caracterización/origen/ definición

Género y cepa. Propiedades de seguridad

Aspectos generales

Actividad y viabilidad en el producto.

Resistencia a pH bajo, jugo gástrico, sales biliares, jugo del pancreas, colonización/sobrevivencia in vivo

Efectos clínicos en pacientes voluntarios

Adherecia al epitelio intestinal/ tejido

Estimulación del sistema inmune

Seguridad y estabilidad

Actividad antimicrobiana antagonismo a patogenos

Aspectos funcionales y fisilogicos

17

La valoración del riesgo por el consumo de probióticos puede ser muy costosa y

exigir demasiado tiempo. Un riesgo muy bajo puede ser aceptado cuando se

recomienda a individuos inmunocomprometidos, pero la relación riesgo beneficio

debe ser claramente establecida en cada caso (Saarela y col., 2000).

Debido al indiscriminado uso de antibióticos en humanos, en medicina veterinaria

y en animales, como promotores de crecimiento, la resistencia a los antibióticos ha

llegado a existir como una característica común en los microorganismos, esto

causa graves problemas en el tratamiento de infecciones microbianas. La

resistencia a los antibióticos en las bacterias puede ser intrínseca o adquirida. La

resistencia intrínseca es una característica natural y puede ser considerada como

una característica de una especie, mientras la resistencia adquirida deriva ya sea

de una mutación genética o de la adquisición de un DNA ajeno de otra bacteria. La

mayoría de las bifidobacterias son intrínsecamente resistentes al ácido nalidixico,

polimixina B, kanamicina, gentamicina, estreptomicina y metronidazol (Chateris y

col., 1998).

La farmacocinética de los probióticos ha sido estudiada en vivo usando técnicas

de entubación, perfusión y de biopsia. Algunas propiedades enzimáticas como la

excesiva desconjugación de las sales biliares o degradación del mucus pueden

ser potencialmente perjudicial (Marteau y col., 1993, 1995 y 1997).

Resistencia de las bifidobacterias en el tracto gastrointestinal. El

conocimiento de la sobrevivencia de las bifidobacterias dentro del TGI, sus

propiedades de translocación, colonización y el destino de los componentes

activos derivados de las bifidobacterias es importante para la evaluación de los

efectos positivos o negativos del consumo de las bifidobacterias (Salminen y col.,

1998).

La supervivencia de diferentes cepas probióticas en diferentes partes del TGI es

importante, puesto que estas deben de realizar varios efectos físiologicos en

18

diferentes partes del mismo, hasta llegar a implantarse en el intestino; pero esta

supervivencia varía: algunas cepas se mueren rápidamente en el estómago,

debido al jugo gástrico del estómago contiene ácido clorhídrico, pepsina y renina;

mientras otras pueden pasar en alto número al intestino delgado y posteriormente

al intestino grueso. En el intestino delgado, principalmente en el duodeno algunas

cepas también pueden ser objeto de elimación debido a que en esta parte se lleva

a cabo otra hidrolis producida por líquido pancreático, líquido intestinal y sale

biliares; la sobrevivencia de las bifidobacterias en esta parte es de suma

importancia puesto que la actividad metabólica que exhiben casi todas las

bifidobacterias es la desconjugación de las sales biliares, que se produce

naturalmente en los seres humanos. Las sales biliares desconjugadas pueden

disminuir los niveles de colesterol sérico en los seres humanos

hipercolesterolémicos o prevenir la hipercolesterolemia en individuos con niveles

normales de colesterol (Tanaka y col., 2000).

Para tratar de comprender como se da este fenómeno anterior es importante

conocer como se da el ciclo de producción de las sales biliares. Begley y col

(2005) describen a la bilis como una solución acuosa verde-amarillenta cuyos

principales componentes son los ácidos biliares, colesterol, fosfolipidos y el

pigmento biliverdina. Es sintetizada en los hepatocitos pericentrales del hígado, se

almacena y se concentra en la vesícula biliar y se libera en el duodeno después de

la ingesta de alimentos. La bilis funciona como un detergente biológico que

emulsiona y solubiliza lípidos, desempeñando de esta forma un papel esencial en

la digestión de las grasas. Esta propiedad detergente de la bilis confiere también

potente actividad antimicrobiana, principalmente a través de la disolución de

membranas bacterianas.

Begley y col. (2006) describen que los ácidos biliares primarios, ácido cólico y

quenodesoxicólico, son sintetizados de novo en el hígado a partir del colesterol. La

solubilidad de los esteroides de núcleo hidrofobico se ve incrementado por su

conjugación de una N-acil amida con alguna glicina (glicoconjugado) o la taurina

19

(tauroconjugado) antes de la secreción (Figura 7 A). El resultado son moléculas

anfipáticas que pueden solubilizar lípidos para formar micelas mixtas.

Figura 7. (A) Estructura química de los ácidos biliares. Primero los ácidos biliares son sintetizados en el hígado a partir del colesterol y se conjugan ya sea con glicina o taurina antes de la secreción. El grupo carboxilo de los ácidos biliares y el grupo amino de los aminoácidos están unidos por un enlace peptídico. (B) Reacción catalizada por las enzimas hidrolasas de sales biliares (BSH). La BSH rompe el péptido que une a los ácidos biliares, lo que se traduce en la eliminación del aminoácido del grupo esteroide. Resultando en la precipitación de los ácidos biliares desconjugados.

Además, Carey y Duane (1994) detallan que los ácidos biliares son conservados

de manera eficiente, en condiciones normales por un proceso denominado

recirculación entero-hepática. Los ácidos biliares conjugados y descongujados

son absorbidos por difusión pasiva a lo largo de todo el intestino y por transporte

activo en el íleon terminal. Los ácidos biliares reabsorbidos entran al torrente

sanguíneo portal y son llevados a los hepatocitos los cuales los re-conjugan y

secretan en bilis. Aproximadamente el 5% del total de ácidos biliares mezclados

(0.3 a 0.6g) por día eluden la absorción epitelial y pueden ser modificados por las

bacterias autóctonas del intestino (Bortolini y col., 1997). Una transformación

importante es la desconjugación, una reacción que tiende a producirse antes que

otras modificaciones sean posibles. La desconjugación es catalizada por las

enzimas hidrolasas de sales biliares (BSH por sus siglas en ingles), EC 3.5.1.24,

las cuales hidrolizan el enlace peptidico y libera la glicina/taurina de la fracción

básica del esteroide (Figura 7 B). Los ácidos resultantes se denominan ácidos

biliares no conjugados o desconjugados.

20

II.5. Propiedades antimicrobianas

Ibrahim y Salameh (2001), refieren que la actividad antimicrobiana de las

bifidobacterias fue descrita por primera vez por Tissier en 1990, quien detalló

diversos efectos antagonicos de B. bifidum contra E. coli. Las bifidobacterias

tienen la capacidad de producir ácidos orgánicos y otros compuestos

antimicrobianos de tipo proteínico llamados bacteriocinas. Algunos estudios

atribuían la capacidad antimicrobiana de las bifidobacterias únicamente al efecto

de la reducción del pH como resultado de la producción de ácido láctico y ácido

acético, mientras otros autores lo han atribuido a compuestos proteínicos y al

efecto de la reducción del pH (Meghrous y col., 1990; Ibrahim y Bezkorovainy,

1993). Un esquema hipotético de los efectos antimicrobianos de los compuestos

proteínicos obtenidos de las bifidobacterias se muestra en la Figura 8

(Cheikhyoussef y col., 2008).

Figura 8. Esquema hipotético que muestra los efectos antimicrobianos de los componentes

proteínicos obtenidos de las bifidobacterias (Cheikhyoussef y col., 2008)

Inhibición de la replicación de

patógenos por la privación de

hierro

Inhiben el crecimiento de

bacterias patógenas

sideróforos Compuestos con función

de bacteriocinas

Componentes proteínicos

antimicrobianos de las

bifidobacterias

Proteínas de la capa S

Adhesinas y lectinas

Lectinas con función de

Bacteriocinas

Bacteriocinas (bifidina,

bifilog y bifidocina B)

Componentes inhibidores de

adhesión de patogenos

Organización del dominio y espacial

de los factores de

adhesión

Complexation con

biopolimeros y bioefectores

Formación de

biofilms microbianos

y colonización del TGI

Antagonista de patógenos y co-funcionamiento con otras

citoquinas (pro y anti inflamatorias), regulación de las

propiedades de las células blanco

Competición con patógenos por los sitios de unión en las

células epiteliales

21

11.5.1. Bacteriocinas

Las bacteriocinas son definidas como proteínas biológicamente activas contra

miembros de la misma especie o especies muy relacionadas a la cepa productora

(Klaenhammer, 1988).

Los primeros reportes sobre la producción de bacteriocinas de bifidobacterias los

realizaron Anand y colaboradores (1984, 1985) y Kang y colaboradores (1989)

quienes mencionaron que B. bifidum puede producir bifidin y B. longum produce

biflong. La cepa B. bifidum 1452 exhibe mayor zona de inhibición cuando crece en

leche descremada en comparación que cuando crece en caldo MRS (Man,

Rugosa y Sharp). Se observo inhibición después de 30 h y la máxima inhibición

después de 48h.

La bifidina se ha aislado de B. bifidum por el proceso de extracción metanol –

acetona y purificado parcialmente mediante cromatografía con Sephadex G-15

(Anand y col., 1984 y 1985).

En el cuadro 2 se resumen las bacteriocinas y compuestos parecidos a

bacteriocinas (Bacteriocin-like compounds) que han sido aisladas y purificadas de

bifidobacterias (Cheikhyoussef y col., 2008).

Cuadro 2. Resumen del nombre de las bacteriocinas purificadas de bifidobacterias

Especie Peptido Referencia

B. bifidum Bifidina Anand y col., (1984, 1985)

B. Longum Biflong Kang y col., 1989

B. bifidum NCFB 1454 Bifidocina B Yildirim y Johnson 1998.

B.Lactis Bifilact Bb12 Abd El-Salam y col., 2004

B. longum Bb-46 Bofilong Bb-46 Abd El-Salam y col., 2004

22

La bifidina es de consistencia aceitosa, de color amarillo pálido y nihidrina positiva.

Tiene un pH óptimo de 4.8 y su rango de inhibición máximo se encuentra entre pH

de 4.8 a 5.5. La bifidina es estable al calor y no tiende a perder su actividad

cuando se calienta a 100°C durante 30 minutos. El extracto obtenido por metanol

– acetona puede ser almacenado entre 5 y 8°C por más de tres meses sin pérdida

de su actividad antimicrobiana. La fracción purificada de bifidina tiene dos

aminoácidos principalmente en cantidades considerables, fenilalanina y ácido

glutamico y solo tiene trazas de aminoácidos como el ácido aspártico, treonina,

serina, prolina, glicina, isoleucina y leucina (Anand y col., 1985).

El extracto crudo de bifidocina B inhibe el crecimiento de cepas selectas de los

géneros Listeria, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y

Pediococcus pero no es activa contra otras bacterias Gram-positivas y Gram-

negativas. La bifidocina B es sensible a las enzimas proteolíticas, pero resistente

al pH (2-10), al calor y a disolventes orgánicos su peso molecular es de 3300 Da

(Yildirim y Johnson, 1998). B. lactis Bb-12 y B. longum Bb-46 al cultivarse en caldo

MRS con 0.05% L-cisteína HCl, producen bacteriocinas designadas como bifilact

Bb12 y Bifilong Bb-46 respectivamente. Bifilact y Bifilong inhiben la actividad de

Staphylococus aureus, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus y E. coli.

El efecto de inhibición es dependiente de las especies. La concentración mínima

inhibitoria (CMI) de bifilact Bb12 y bifilong Bb46 contra E. coli fue de 20 y 16

mg/mL, respectivamente, mientras la CMI contra S. aureus fue de 40 y 20mg/mL,

respectivamente (Abd El-Salam y col., 2004).

En el cuadro 3 se sintetizan las cepas de bifidobacterias y su espectro de

inhibición hacia las bacterias patógenas (Cheikhyoussef y col., 2008).

23

Cuadro 3. Espectro de la actividad antimicrobiana de los compuestos proteínicos inhibitorios obtenidos de las bifidobacterias

Especie Espectro inhibitorio*

Bifidobacterium (Aisladas de

productos lacteos)

Algunas especies de Bifidobacterium,

Lactococcus, Clostridium y Lactobacillus.

B. breve 4, B. infantis1 E. coli enteropatogena; Yersinia

pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium

B. infantis Escherichi coli y Clostridium

B. bifidum Perfringes, Salmonella ssp.

B. adolescentes Campylobacter ssp.

B. bifidum Shigella dysenteriae

B. infantis Yesrsenia enterolitica y Clostridium difficile

ATCC 9689

B. longum SBT 2829 E. coli enterotoxigenica Pb176(ETEC)

B. animalis Salmonella enteritidis

B. bifidum NCFB 1454 (extracto crudo

de Bifidocina B)

Listeria, Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus,

Leuconostoc y Pediococcus

Bifidobacterium CA1 and F9 (aisladas

de heces de infantes)

Salmonella typhimurium SL 1344

B. animalis subsp. lactis DR10 E. coli entero-hemorrágica (O157:H7)

B. animalis subsp. lactis LKM512 Clostridium perfringens

B. adolescentes, B. bifidum and B.

longum

E. fecalis, S.typhimurium, C. sporogenes, B.

cereus y Listeria monocytogenes.

B. adolescentis (RBL85), B.

longum(RBL67), B. Bifidum (RBL

68,69,70 y 86)

Listeria monocytogenes

B. thermacidophilum RBL71 E. coli entero-hemorrágica (O157:H7)

B. longum y B. infantis B. cereus y E. coli.

B. thermophilum subsp. infantis RBL

67

Listeria monocytogenes

BIR-032 y BIR-0307 (aislado de heces

humanas)

Listeria innocua ATCC 33090, Escherichia coli

NCTC 8603 y Salmonella typhimurium

ATCC29631

BIR-0307, BIR-0312 y BIR-0324 Helicobacter pylori

B. longum CIDCA 5320, 5323 Clostridium dificile ATCC 9689 y ATCC 43593

* El espectro de inhibición se refiere a la zona de inhibición más alta reportada de la especie indicada

24

II.5.2. Compuestos con función de bacteriocina (Bacteriocin-like compounds

o BLC)

El término compuestos con función de bacteriocina se ha acuñado para referirse a

sustancias antagónicas que no se ajustan a la definición típica o no cumplen con

los criterios de las bacteriocinas y tienden a tener un espectro de actividad más

amplio (Boris y Barbés, 2000). Algunos investigadores, han identificado estos

compuestos sobre la base de que el efecto inhibitorio dirigido hacia una cepa no

depende únicamente de la producción de ácido o el peróxido de hidrógeno sino de

otros compuestos presentes en el medio de producción.

Meghrous y col. (1990) reportaron la producción de BLC en cepas de

Bifidobacterias las cuales tenían actividad frente a cepas de Lactococcus lactis y

contra otras especies de bifidobacterias, Clostridium y Lactobacillus, pero no

mostraron actividad frente a bacterias Gram-negativas. Las bacteriocinas

producidas fueron de de un tipo de proteína estable al calor y actividad a pH del

rango de 2 a 10.

Se demostró que cinco cepas de bifidobacterias (RBL 70, RBL 85, RBL 69, RBL

68 y RBL67) y una de referencia (B. infantis ATCC 15697) producían cierto

compuesto proteínico estable al calor con actividad antimicrobiana contra L.

monocytogenes. Los compuestos antimicrobianos de RBL 70, RBL 69, RBL 68 y

RBL67 pueden ser extraídos con acetona pero los de RBL 85 fueron extraídos con

metanol. Los compuestos de RBL85 exhibieron una característica altamente

hidrofílica. Las diferencias en las características de los compuestos

antimicrobianos, extraídos de las cepas de bifidobacterias aislados con el mismo

método revelaron la existencia de varios tipos de moléculas inhibitorias y

posteriormente esto llevó a determinar diversos mecanismos por los cuales las

bifidobacterias son capaces de inhibir a bacterias patógenas (Touré y col., 2003).

25

II.5.3. Compuestos que inhiben la adherencia de patógenos

La adhesión a las células epiteliales es un prerrequisito importante para la

colonización de los microorganismos probióticos y para las bacterias patógenas

esto es un paso fundamental para la virulencia (Servin, 2004).

Bernet-Camard y col., (1993) reportaron, que la adhesión de las bifidobacterias a

las células Caco-2 es mediada por un factor proteínico promotor de la adhesión

(componente proteínico lábil asociado a la superficie) presente en la superficie de

la célula bacteriana y en el sobrenadante del cultivo de Bifidobacterium. Este

factor parece ser especie-especifico. Los factores promotores de la adhesión de

los lactobacilos son también especie específicos, pero el mecanismo de

adherencia parece ser diferente del obtenido para las bifidobacterias (Coconnier y

col., 1997).

Los componentes proteínicos denominados BIF, producidos por B. longum

BL2928 es el único compuesto activo hacia las bacterias Gram-negativas,

caracterizado hasta ahora, el BIF inhibe la unión de E. coli a las células epiteliales

humanas. (Cheikhyoussef y col., 2008).

El BIF tiene un peso molecular de 100 000 Da, con un punto isoeléctrico neutral e

inhibe la adhesión de E. coli enterotoxigenica cepa Pb176 in vitro, expresando la

colonización del factor de adhesión II a la molécula gangliotetrasilceramida GA4

(Fujiwara y col., 2001).

II.5.4. Sideróforos

El término ―sideróforo‖ se refiere a un compuesto, que pueden ser un polipéptido o

de algún otro material orgánico que es secretado por un organismo e inhibe el

crecimiento de otros microorganismos al privarlos de hierro. El sideróforo actúa

como un agente bacteriostático por la reducción en la cantidad de hierro libre

26

disponible para los microorganismos y por lo tanto impide su crecimiento.

(O´Sullivan, 2004). O´Sullivan aislo del tracto de gastrointestinal de animales

cepas de Bifidobacterium que secretan un sideróforo que inhibe el crecimiento de

microorganismos como L. lactis, C. difficile y C. perfirngens.

II.6. Efecto fisiológico y clínico de las bifidobacterias

Los productos del metabolismo de los probióticos van desde ácidos grasos de

cadena corta, hasta ácidos orgánicos esenciales como el ácido fólico y el ácido

orótico. Estos compuestos crean un medio ambiente ácido en el intestino por la

disminución del pH y modulan una serie de eventos fisiológicos y benéficos en el

hospedero. La liberación de varias enzimas dentro del lumen intestinal por las

bacterias probióticas, ejerce efectos sinérgicos en la digestión y alivio de síntomas

por la mala absorción intestinal (Naidu y col., 1999).

II.6.1 Tiempo de tránsito colónico

Se ha definido el tiempo de tránsito colónico (TTC) como la medición objetiva del

tiempo en el que transcurre el contenido intestinal a través de colon (Pacheco y

col., 2005). Las alteraciones en el tiempo de tránsito colónico, asociado con

diarrea y estreñimiento, son frecuentes y constituyen un objetivo importante para

los alimentos funcionales, incluidos los probióticos. Varias cepas bacterianas han

demostrado actividad contra la diarrea de varias etiologías (Marteau, 2002).

Sin embargo; varios estudios han evidenciado que los probióticos aceleran el

tiempo de tránsito colónico. En un estudio en el que se incluyeron 70 voluntarios

sanos, se les dieron 375g/día (125 g, tres veces al día) de leche fermentada con la

cepa B. animalis subsp lactis durante 11 días, se tuvo como resultado el

acortamiento en el tiempo de tránsito colónico en un 20% en comparación al grupo

de referencia y el grupo placebo. El efecto fue más pronunciado en mujeres, en

particular en aquellas con un tiempo de tránsito colónico largo. Estos efectos no se

27

encontraron en productos probióticos con un tratamiento térmico, lo que sugiere

que es necesario la supervivencia y actividad metabólica del probiótico (Bouvier y

col., 2001).

Otro estudio controlado demostró que mujeres, a las que se les dio 375g de yogurt

con bifidobacterias por 10 días, tuvieron menor tiempo de tránsito colónico y

sigmoideo (p<0.05) en comparación con el tiempo del producto testigo que no

tenia bifidobacterias (Marteau y col., 2002). La ingestión de 375g de yogurt

corresponde a una ingestión de 3.6 x 1010 ufc de Bifidobacterium animalis que es

del mismo orden de magnitud en escala logarítmica que la dada por 125 o 250g

del producto (1.2 x1010 y 1.4x1010 ufc respectivamente).

En otros dos estudios se investigó la eficiencia de diferentes dosis de B. animalis

contenidas en leches fermentadas en el tiempo de tránsito, enfocándose en

personas mayores. La primera demostró que el consumo regular de 250 o

375g/día de leche fermentada con bifidobacterias, acorta el tiempo de tránsito

intestinal. El efecto fue más evidente con 375g/día que con los 250g/día. En el

segundo estudio se evaluaron dosis más bajas y la duración del efecto benéfico

del consumo después de que el producto fue retirado. El estudio incluyó 200

voluntarios con edades entre 50 a 75 años, divididos en dos, un grupo de 100

individuos con un tiempo de tránsito normal (40-50 h) y otro de 100 individuos con

tiempo de tránsito bajo (>50h) asignados al azar para recibir 125 o 250g de leche

fermentada con bifidobacterias al día durante 2 semanas. Los autores

concluyeron que: (i) los voluntarios que recibieron 125 y 250 g/día de leche

fermentada con bifidobacterias, ambas dosis reducen significativamente el tiempo

de tránsito oral-fecal. (ii) El efecto en el tiempo de tránsito oral-fecal duró de 2 a 4

semanas, después de que se dejo de dar la leche fermentada (Meance y col.,

2001 y 2003).

28

Los datos demuestran que las leches fermentadas con bifidobacterias reducen el

tiempo de tránsito intestinal con un efecto dosis respuesta, especialmente en

sujetos con lentitud en el tiempo de tránsito.

II.6.2. Fermentación colónica.

A través de la fermentación, se estimula el crecimiento bacteriano (biomasa) y

ácidos orgánicos (ácido láctico y ácidos grasos de cadena corta - AGCC), estos

son producidos junto con gases: H2, CO2 y CH4. EL ácido láctico es producido por

varias especies bacterianas, principalmente por bifidobacterias y lactobacilos. Los

AGCC (principalmente acetato, propionato y butirato) son los principales

productos finales de las reacciones fermentativas de las bacterias y los principales

aniones en el intestino grueso del humano (Mortensen, 1996). Todos los AGCC se

absorben rápidamente en el intestino grueso y estimulan la absorción de agua y

sal. Estos se metabolizan principalmente en el epitelio intestinal, hígado y

músculo. Una de sus principales características es su efecto trófico sobre el

epitelio intestinal. Además, el butirato es importante como fuente de energía para

el epitelio colónico y regula la diferenciación y crecimiento celular (Bugaut y

Bentejac, 1993). Aun cuando las bifidobacterias no producen directamente

butirato, producen lactato el cual puede ser transformado a butirato (Duncan y col.,

2004). Además de los productos de fermentación, las bacterias del intestino

incluyendo las bifidobacterias, son capaces de sintetizar vitaminas, especialmente

vitaminas del complejo B (Crittenden y col., 2003).

II.6.3. Estimulación de la inmunidad

En un estudio aleatorio, se les dio a 30 adultos, que no consumían habitualmente

alimentos fermentados, una leche fermentada que contenía B. animalis BB-12

durante tres semanas y se les infectó con una cepa atenuada de Salmonella

enteropatogenica para simular una infección y se midió el efecto sobre la flora

intestinal y se evaluó la respuesta inmune. Se concluyó que B. animalis puede

29

persistir en el tracto gastrointestinal y puede actuar como coadyuvante a la

respuesta inmune humoral (Link-Amster, 1994).

El efecto barrera generado por algunos probióticos puede derivar de una

modulación positiva de la capa mucosa que separa el lumen intestinal de los

colonocitos. De hecho, los probióticos pueden cambiar la barrera de la mucosa

intestinal por estabilización de la mucosa intestinal, la regulación de la

permeabilidad intestinal y mejorando la inmunidad del TGI, permitiendo la

prevención del sobrecrecimiento de bacterias y virus patógenos (Brandtzaeg y

col., 1989).

II.6.4. Efectos sobre el sistema inmune del colon.

El primer contacto que tienen las bacterias ingeridas con el sistema inmune es el

tejido linfoide relacionado con mucosas (TLRM). El intestino humano es la mayor

masa de tejido linfático en el cuerpo, contiene más de 106 linfocitos/g de tejido.

Diferentes componentes del sistema inmune de la mucosa actúan enfocando una

respuesta específica contra antígenos exógenos. La primera línea de defensa del

sistema es la secreción de IgA, la cual produce abundantes anticuerpos de la

mucosa. La principal función es la secreción de anticuerpos, en cooperación con

mecanismos de defensa no inmunológicos, esto es mediante la exclusión de

antígenos extraños por prevención de la adherencia al epitelio y penetración de

microorganismos patógenos invasivos. Los anticuerpos son también responsables

para la neutralización de toxinas y multiplicación viral.

Las bacterias (patógenas y no patógenas) constituyen antígenos que sirven para

obtener un sistema de respuesta específica inmune local. Además que ejercen

una considerable influencia en el número y distribución de las poblaciones de

células del TLRM y juegan un importante papel en la regulación de la respuesta

inmune (Brantzaeg, 1995).

30

Se ha reportado que algunos probióticos estimulan el sistema inmune a través de

modos de acción no específicos, resultando en un incremento en la respuesta

inmune a una amplia variedad de antígenos. En un estudio no controlado se

suministro BB12 (1x1010 ufc/día) y Lactobacillus johnsonii LA1 (7x1010 ufc/día), a

14 voluntarios durante 3 semanas, encontrando que se duplico el número de

linfocitos con actividad fagocitaria en la sangre periférica, desde el inicio hasta el

final del tratamiento (Shiffrin, 1995).

II.6.5. Efecto de las bifidobacterias contra las enfermedades

gastrointestinales

La diarrea infecciosa es una infección aguda del intestino, es usualmente auto-

limitante y se caracteriza por diarrea y algunas veces vómitos. Los principales

agentes patógenos son virus y bacterias (Brown y Valiere, 2004).

La infección por rotavirus es la causa más común de diarrea en niños. Muchos

estudios clínicos han evaluado el efecto de los próbioticos sobre la diarrea aguda

asociada con el rotavirus. Haschke y col. (1998) concluyeron que las

bifidobacterias sobreviven a través del TGI y están presentes en las heces, al

suministrar fórmulas lácteas con BB-12 a niños, además estos experimentaron

menor diarrea por infección por rotavirus. El uso de fórmulas con BB-12 es seguro

y puede prevenir enfermedades y molestias, a menudo visto en países

industrializados y en desarrollo.

En otro estudio realizado por Saavedra y col. (1994) mencionan que la

administración de una fórmula infantil con bifidobacterias redujo significativamente

la incidencia de diarrea y la insidencia de infección por rotavirus fue menor. La

fórmula complementada fue bien tolerada por los niños, muchos de los cuales

estaban desnutridos o inmunocomprometidos. El uso de las preparaciones con

probióticos puede ser un método práctico para la prevención de la diarrea.

31

La diarrea causada por el crecimiento de bacterias patógenas es la más común

debido al uso indiscriminado de antibióticos. Los probióticos pueden inhibir este

crecimiento por la liberación de sustancias inhibidoras o bacteriocinas, como se ha

demostrado con algunas cepas in vitro (de Ross y Katan, 2000).

Wang y col. (2004) concluyeron que la ingesta regular de yogurt al que le

adicionaron BB12 y LA5, efectivamente suprime la infección por Helycobacter

pylori en humanos.

En otro estudio, los sujetos que recibieron una mezcla de prebiótiocos

(fructooligosacaridos) y probióticos (incluyendo B. longum) durante la

administración oral de cefpodoxima proxetil dos veces al día fueron menos

susceptible a la colonización de Clostridium difficile que los sujetos placebo o que

recibieron solo prebióticos (Orrhage y col., 2000).

Otros problemas gastrointestinales son la enfermedad inflamatoria intestinal de los

humanos y la pouchitis. La inflamación aguda o crónica ocurre hasta en el 50% de

pacientes con colitis ulcerativa (CU) después de una proctocolectomía y asociado

con la reconstrucción de la bolsa con la anastomosis ileoanal (Kruis, 2004).

La mayoría de las investigaciones en este ámbito se han hecho con probióticos,

pero al mismo tiempo hay un creciente interés en la capacidad de los prebióticos y

simbióticos para controlar los síntomas de la enfermedad inflamatoria intestinal,

son muy pocos los ensayos aleatorios controlados reportados. Aunque los

resultados han sido variables, los estudios en humanos y animales han

demostrado que en muchas circunstancias, los alimentos con probióticos pueden

alterar la composición de la microbiota del colon, reducir los procesos inflamatorios

en la mucosa intestinal y tienen el potencial de inducir la remisión de la

enfermedad (Brown y Valiere, 2004; Steed y col., 2008).

32

II.6.6. Efecto de las bifidobacterias sobre la carcinogénesis del colon

Existen pruebas de que la flora intestinal normal puede influir en la carcinogénesis

por la producción de enzimas que transforman procarcinógenos en activos

cancerígenos. Estas enzimas son β-glucoronidasa, azoreductasa y nitroreductasa

(McGarr y col., 2005, Marteau y col., 1990).

Myllyluoma y col. (2007), evaluaron una combinación de probióticos que incluye a

Lactobacillus rhamnosus GG es útil como tratamiento adyuvante durante la

erradicación de H. pylori. La infección por H. pylori está asociada con aumentos de

la secreción basal de gastrina y de la secreción de ácido clorhídrico. La gastrina-

17 está aumentada en la atrofia gástrica y el cáncer gástrico. Por si misma, la

atrofia produce hipergastrinemia. Los probióticos ensayados en este estudio hacen

descender la gastrina-17 pero los mecanismos exactos de este proceso no son

conocidos. La capacidad de los probióticos de adherirse a la mucosa gástrica es

desconocida. Los niveles de los pepsinógenos y su proporción no sufrieron

alteraciones. Si bien disminuye la densidad de la población de H. pylori en la

mucosa gástrica, ninguno de los probióticos fue capaz de erradicarlo.

En otros estudios realizados por Roller y col. (2007) y Rafter y col. (2007), se

evaluaron el efecto de sinbióticos en el proceso de desarrollo de pólipos colónicos

teniendo como base evidencia obtenida de estudios en animales de laboratorio.

Los estudios fueron efectuados en pacientes colectomizados o en quienes se

habían practicado polipectomías. En ambos estudios se les administró inulina

enriquecida con oligofructosa y una mezcla de Bifidobacterium lactis Bb12 y

Lactobacillus rhamnosus GG. Se estudiaron marcadores de cáncer del colon y de

procesos inflamatorios en ambos estudios durante un período de 12 semanas. En

ambos estudios se produjeron alteraciones favorables de varios de los

biomarcadores de cáncer del colon y asimismo en los enfermos con pólipos. Estos

resultados sugieren que el sinbiótico puede producir una menor exposición del

33

epitelio a productos citotóxicos y genotóxicos, disminuye la proliferación de los

colonocitos y mejora la estructura de la mucosa.

II.7. Aplicaciones

Los cultivos de bifidobacterias han sido ampliamente explotados en la industria

láctea como herramienta para el desarrollo de nuevos productos funcionales. Shah

(2004), reporto que existía un estimado de 70 productos que contenían probióticos

comercializándose en el mundo, éste número ha aumentado desde entonces.

Tradicionalmente, las bifidobacterias han sido incorporados en el yogurt, sin

embargo, se han examinado otro tipo de productos para incorporarlas, se han

incluido en mayonesa (Khalil y monsour, 1998), alimentos para untar (Charteris y

col., 2002), en carne (Arihara, 1998), además de otros productos de origen lácteo,

como queso Cheddar (Ong y col., 2006) y salsas a base de queso (Tharmaraj y

Shah, 2004). Las bifidobacterias están disponibles en leches comerciales, leches

fermentadas, jugos de fruta, helados y productos de avena (Valsijevic y Shah,

2008). Los cultivos comerciales utilizados en estas aplicaciones se listan en el

cuadro 4. Las cepas probióticas se utilizan principalmente como complemento de

los cultivos iniciadores debido a su escaso crecimiento en la leche.

Cuadro 4. Algunas cepas de bifidobacterias empleadas en aplicaciones comerciales.

Cepa Fuente

B. animalis ssp.lactis Bb12 Chr. Hansen

B. lactis HOWARUTM/B1 Danisco

B. lactis LAFTI® B94 DSM Food Specialties

B. longum SBT-29281 Snow Brand Milk Products Co. Ltd

B. breve strain Yakult Yakult

B. lactis HN019(DR10) Fonetarra

B. animalis DN173010(Bioactivia) Danone

B. longum BB536 Morinaga milk industry Co.Ltd.

34

II.8. Encapsulación de ingredientes Bioactivos

La adición de ingredientes bioactivos presentes en alimentos funcionales provoca

muchos cambios, particularmente en la estabilidad del componente bioactivo

durante el procesamiento y almacenamiento, además es necesario prevenir

interacciones indeseables del ingrediente bioactivo con la matriz del alimento. En

este aspecto la microencapsulación de ingredientes bioactivos puede ayudar a

disminuir algunos de estos problemas. Obviamente, la obtención de los beneficios

en la salud requiere acciones para asegurar la estabilidad de los componentes en

el sistema gastrointestinal y facilitar la liberación apropiada en el sitio activo

(Champagne y Fustier, 2007).

La encapsulación se define como la tecnología de empacado de materiales

sólidos, líquidos y gaseosos en pequeñas cápsulas que controlen la tasa de

liberación de su contenido en periodos de tiempo prolongados. La cápsula o

envoltura, puede ser de muchas formas diferentes, de membrana simple,

membrana esférica o irregular, estructura multimembrana con paredes de la

misma composición o de otra. En general son tres los pasos involucrados en la

encapsulación: Formación de la pared alrededor del material, aseguramiento de

que no exista fugas y asegurase de que no existan materiales extraños (Gibbs,

1999).

Los tipos de tecnologías empleadas para encapsular, son de interés significante

para el sector farmacéutico (ej. liberación de vacunas y drogas), pero también es

relevante para la industria alimentaria, ya que algunas veces se requiere la adición

de ingredientes funcionales, los cuales son típicamente utilizados para controlar

las propiedades de sabor, color, textura y preservación. Pero también se está

incrementando la inclusión de ingredientes con potencial benéfico a la salud como

son los probióticos. Se han propuesto e investigado varios métodos de protección

para los probióticos en diferentes productos lácteos, como es la encapsulación

(las perlas esféricas de polímero tienen un diámetro entre 0.3 y 3.0 mm) y la

35

microencapsulación (tamaño menor a 100 m) para mejorar la viabilidad de los

microorganismos tanto en productos alimenticios como en el tracto intestinal

(Champagne y col., 1994).

Los probióticos presentan dos tipos de problemas cuando se considera la

microencapsulación: el tamaño, normalmente entre 1 y 5 µm de diámetro el cual

inmediatamente excluye a la nanotecnología, y el hecho de que se tienen que

mantener vivas a las células. Este último aspecto ha sido crucial en la selección de

la tecnología apropiada para encapsular. Asimismo, los diferentes tipos de

materiales utilizados para encapsular dependen de las propiedades funcionales de

la microcápsula y el proceso de encapsulación empleado (Champage y Fustier,

2007).

Los materiales de la cápsula puede ser goma arábiga, la cual es muy utilizada por

sus características de viscosidad, solubilidad y emulsión; también se usan

almidones derivados de papas, maíz, trigo, arroz, y otros, aunque la desventaja de

estos es que son muy viscosos cuando se mezclan con agua y su concentración

es limitada a 3%. En el caso de las maltodextrinas, su viscosidad es menor que la

de la goma arábiga y no tiene grupos lipofilicos, por lo que sus propiedades

emulsionantes son pobres, sus ventajas incluyen poco sabor y se puede usar en

altas concentraciones. Otro ejemplo son los alginatos, los cuales pueden

reaccionar con iones de calcio y formar un gel estable. También hay materiales a

base de proteínas como la polipeptona, proteínas de soya, derivados de leche y

derivados de gelatinas, pero su principal desventaja es su alto costo, su

solubilidad en agua fría y el potencial de reaccionar con grupos carbonilo. También

se pueden emplear componentes lipídicos (liposomas) y ciclodextrinas (Gibbs,

1999). De todos estos materiales el más utilizado es el alginato, el cual es un

heteropolisacárido lineal de ácido L- gulorónico y ácido D-manurónico extraído de

varias especies de algas. Las propiedades funcionales del alginato como un

material de soporte está fuertemente asociada con la composición y secuencia de

los ácidos L- gulorónico y D-manurónico. Los cationes divalentes como el Ca2+ se

36

enlazan preferentemente al polímero del ácido L-gulorónico (Krasaekoopt y col.,

2003).

Las células encapsuladas pueden tener mayores ventajas sobre las células libres

dentro de las cuales se incluye el mantenimiento de una biocatálisis estable y

activa, productividad alta, brinda protección a la célula contra daños y reduce la

susceptibilidad de contaminación. Muchos factores pueden afectar la eficiencia de

las cápsulas en la protección de la bacteria encapsulada. En general, la viabilidad

de la célula en la microcápsula incrementa con el aumento en tamaño de la

cápsula de alginato y la concentración del gel (Chen y col., 2006). La

supervivencia de bifidobacterias encapsuladas es fuertemente dependiente de la

concentración de alginato, número inicial de células y especie (Lee y Heo, 2000).

Se han empleado por lo menos cinco métodos para encapsular probióticos:

cubierta por aspersión, secado por aspersión y tecnologías de gelación de

partícula: extrusión, emulsión y enfriado por aspersión (spray chilling or spray

cooling)[Gibbs, 1999]. Como el componente bioactivo o a encapsular puede estar

en forma líquida, algunas técnicas están basadas en la aspersión. En enfriado por

aspersión una matriz fundida con bajo punto de fusión (32-42°C) que contiene el

componente bioactivo es atomizado a través de una boquilla dentro del

contenedor. Este proceso es similar al de secado por aspersión con respecto a la

producción de gotas finas; aunque éste se basa en la inyección de aire frío dentro

del secador para permitir la solidificación de la partícula de gel, en lugar del aire

caliente el cual seca las gotas produciendo finas partículas de polvo. En la técnica

de cubierta por aspersión el material bioactivo necesita estar en forma sólida y es

mantenido en movimiento en recipientes especialmente diseñados, ya sea por

inyección de aire en la parte baja o por acción rotatoria (Figura 8). El material

líquido, de envoltura, es asperjado sobre el material bioactivo y solidifica para

formar una capa sobre la superficie. El material de envoltura puede ser inyectado

de varios ángulos (Figura 9) y esto influye en las propiedades de la cubierta

(Ubbink y col., 2003).

37

Figura 9. Métodos de cubierta por aspersión para encapsular probióticos. Las tres técnicas ilustradas difieren principalmente en el tipo de aire fluidizado empleado y el sitio en el recipiente donde el material de envoltura es asperjado. Las bacterias probióticas son puestas como partículas de polvo fino, estas son preparadas por los métodos tradicionales (fermentación, concentración, liofilización y granulación), este polvo es mantenido en movimiento en el envase. Se puede emplear como material de envoltura gluten, caseína, derivados de celulosa, carragenina y alginato.

Otras de las tecnologías más empleadas para encapsular probióticos es la de

gelación de partícula (Doleyres y Lacroix, 2004), Dentro de las anteriores

tecnologías, la de enfriado por aspersión es considerada la más económica

(Gouin, 2004). En la encapsulación por gelación, la formación del gel es inducida

por cambios de temperatura, en el caso de agar, agarosa, -carragenina y goma

gelana y por gelación ionotropica realizada por entrecruzamiento de cadenas

polionicas con iones multivalentes opuestos, como ocurre con alginato, quitosana,

carboximetil celulosa y goma guar.

Las cápsulas se forman en un proceso de dos pasos que involucran dispersión y

endurecimiento. La dispersión puede ser formada ya sea por extrusión o por

emulsión. En el método de extrusión la suspensión de células-polímero se hace

salir a través de una aguja, generando gotas esféricas las cuales caen dentro de la

solución de endurecimiento. La técnica de emulsión involucra la dispersión de la

38

fase acuosa la cual consiste en la suspensión de células en el polímero dentro de

una fase orgánica, resultando en una emulsión agua en aceite. Las gotas acuosas

dispersas son endurecidas por enfriamiento o adición de un agente gelante.

También se puede llevar a cabo una co-encapsulación externa por la adición de

un segundo agente activo en la suspensión de alginato células. Así mismo se

puede aplicar una segunda cubierta a la capsula previamente formada (Figura 10).

Por la técnica de emulsión las cápsulas son de diámetros más pequeños en

comparación al método de goteo y es más propicio para aplicaciones de

escalamiento (Grobiollot y col., 1994).

La encapsulación de probióticos para su adición dentro de los alimentos y bebidas

ofrece varios beneficios tecnológicos (Cuadro 5). Esto puede ser argumentado

por que la encapsulación sirve como ―liberador‖ de células viables dentro del

alimento, aunque algunas veces este no sea liberado en el producto.

Figura 10. Tecnologías de gelación de partícula para la microencapsulación de probióticos. Proceso de extrusión (izquierda), el tamaño de la partícula puede ser ajustado por el empleo de vibración de la aguja o efectos piezo eléctricos. Proceso de emulsión (centro y derecha) el tamaño de la cápsula se puede ajustar por medio de la velocidad de agitación o tipo de mezclador. La emulsión es llevada a cabo por la adición de la suspensión células-alginato o carragenina en una fase aceitosa. La solidificación ocurre por la adición de una solución de CaCl2 o una solución ácida.

39

Cuadro 5. Efectos favorables de la encapsulación de probióticos.

EFECTO FAVORABLE PRODUCTO

Facilita la producción de cultivos sensibles al oxígeno Cultivo probiótico seco

Facilita la recuperación de cultivos sensibles a la

centrifugación

Cultivo probiótico seco

Disminuye los problemas de contaminación Cultivo probiótico seco

Los cultivos pueden ser secados con aire Cultivo probiótico seco

Mejora la supervivencia a exposiciones de soluciones

gástricas

Nutraceuticos

Mejora la supervivencia a exposiciones de soluciones

biliares

Nutraceuticos

Mejora la estabilidad durante el almacenamiento en

forma seca

Nutraceuticos

Mejora la tasa de acidificación Embutidos secos

Mejora la supervivencia al calor Panificación

Mejora la supervivencia en frío Helados, jugos y medios a base

de leche

Mejora la retención en el producto final Queso

Protección contra bacteriófagos Leches fermentadas

Protección contra levaduras contaminantes Leches fermentadas

Mejora la sobre vivencia durante el almacenamiento Yogurt, mayonesa, leche

Fuente Champagne y Fustier, 2007.

Independientemente de los problemas tecnológicos para la producción de

probióticos, los cultivos que son encapsulados en esferas de alginato mejoran la

resistencia a la acidez del medio ambiente gástrico y a las soluciones biliares

(Chandramouli, 2004). Con las partículas de gel las células no son liberadas

dentro de los productos alimenticios cuando son adicionadas; estudios in Vitro y ex

vivo han mostrado que las cápsulas mantienen su integridad en condiciones

gástricas simuladas, pero subsecuentemente son liberadas en el tracto intestinal

(Iyer, 2004).

40

III JUSTIFICACIÓN

Las bifidobacterias y otros cultivos iniciadores son empleados generalmente en

forma congelada o seca (congelados o liofilizados) para su inoculación directa en

lotes de leche. La viabilidad de estos cultivos a lo largo de su proceso de

obtención y almacenamiento depende de muchos factores como son; la

concentración inicial, condiciones de crecimiento, medio de crecimiento y

rehidratación. Las desventajas que presentan la congelación o liofilización son

principalmente en el manejo, debido al alto costo de almacenamiento y transporte,

además de los efectos perjudiciales en la viabilidad por el ciclo de congelación-

deshielo, por lo cual se han empleado otras tecnologías para su manejo como es

el secado por aspersión. Independientemente del método aplicado para su

conservación, los cultivos de bifidobacterias están expuestos a condiciones

ambientales desfavorables, debido a la mayor concentración de soluto, la

formación de hielo intracelular (en el caso de la congelación), la exposición a

temperaturas elevadas durante el secado por aspersión y en general, a la

deshidratación. Además, la viabilidad de las bifidobacterias en el sistema de

liberación (i.e. alimento) depende de la cepa seleccionada, interacción entre las

especies microbianas presentes, producción de peróxido de hidrógeno del

metabolismo bacteriano, actividad acuosa y la acidez del producto final.

Adicionalmente la viabilidad puede ser afectada por la disponibilidad de nutrientes,

promotores de crecimiento e inhibidores, concentración de azúcares, potencial

redox (presencia de oxígeno) y permeabilidad del empaque al oxígeno, cantidad

de inóculo y tiempo de fermentación. Por esta razón, las técnicas de

encapsulación y microencapsulación son un método prometedor para mejorar la

eficiencia y liberación de bifidobacterias fisiológicamente activas al sitio donde

deben ejercer su acción benéfica.

41

IV HIPÓTESIS

El proceso de encapsulación incrementa la viabilidad de las bifidobacterias en el

kéfir durante el almacenamiento y la digestión gástrica.

V. OBJETIVOS

V.1 Objetivo general

Estudiar el proceso de encapsulación de Bifidobacterium animalis subsp. lactis

para emplearse como probiótico en Kéfir.

V.2 Objetivo específicos

Seleccionar el proceso adecuado empleando alginato para encapsular a

Bifidobacterium animalis subsp. lactis de tal manera que resista la acción

de ácidos gástricos y sales biliares.

Caracterizar el proceso de conservación por secado de encapsulados de

bifidobacterias, así como la morfología de las capsulas humedas y

deshidratadas por análisis de imágenes.

Evaluar la sensibilidad de Bifidobacterium animalis subsp. lactis a la nisina y

antibióticos.

Utilizar las bifidobacterias encapsuladas para incorporarlas en el kéfir y

estimar la viabilidad de las mismas durante el almacenamiento refrigerado

42

VI. MATERIALES Y METODOS

VI.1. Materiales

Microorganismo: Cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis (F-DVS BB-12)

donada por Chr Hansen México.

Reactivos

Alginato de sodio (Fluka)

Extracto de bilis bovina (Sigma B-8391. Lot. 99H0733 )

Pepsina de mucosa de estomago de cerdo (Sigma Lot.70H0437)

Nisina (Nisaplin, OXD. Danisco)

Reactivos de grado analítico

Clorhidrato de L- Cisteína monohidratada (MP lot. R20392)

Medio TPYG el cual consiste en (gL-1) peptona de soya 5, peptona de caseína

10, extracto de levadura 2.5, glucosa 10, MgCl26H2O 0.5, K2HPO4 2.0, ZnSO47

H2O 0.25, CaCl2 0.125, FeCl3 0.003, Cisteína 0.5 y Tween 80 un mL.

Agar MRS al cual se le adiciono (gL-1) cisteína 0.5, Na2CO3 0.2 y CaCl2 0.1

Leche en polvo Difco

Equipo

Cámara de anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición de aire de 5% H2,

10% CO2 y 85% N2.

Centrífuga.

Material de vidrio propio del laboratorio

Espectrofotómetro.

Estufa de cultivo

Microscopio óptico compuesto Carl Zeiss

Potenciómetro. Marca Orion. Modelo 920, pH 0-14

Agitador tipo vortex

Esterilizador.

43

VI.2. Desarrollo experimental

Activación de la bacteria

Bifidobacterium animalis subsp. lactis

Prueba de

confirmación de

género

Conservación de la cepa

Encapsulado en polímeros

Curva tipo

Simulación

gástrica

Susceptibilidad

a la Nisina

Incorporación a

un producto

Susceptibilidad

a

antimicrobianos

Análisis de

imágenes

44

VI.3. Metodología

Activación de la bacteria.

Se pesó 1 g de la cepa liofilizada (BB12, Chr. Hansen) y se resuspendió en 9 mL

de caldo MRS modificado el cual consiste de caldo MRS 52 gL-1, cisteína 0.5 gL-1,

Na2CO3 0.2 gL-1 y CaCl2 0.1 gL-1. Se homogeneizó y se tomaron alícuotas de 1ml

y se inocularon 5 tubos que contenian 9 mL de caldo MRS modificado (González

y col., 2004), finalmente se incubaron por 12 horas a 39°C en una cámara de

anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición de aire de 5% H2, 10% CO2 y

85% N.

Acondicionamiento de la bacteria.

Se tomaron alícuotas de los tubos anteriores y se inocularon al 10% v/v frascos

viales con medio TPYG para un volumen final de 80mL; a los que previamente se

les gaseó CO2 puro y se sellaron herméticamente (Azaola y col., 1999). Los

frascos se incubaron a 37°C y 180 r.p.m. por 8 horas.

Conservación de la cepa.

Se tomaron alícuotas de los frascos anteriores y se inocularon al 10% v/v 10

frascos viales con medio TPYG para un volumen final de 80mL. Previamente los

viales se gasearon con CO2, para producir la anaerobiosis, se sellaron

herméticamente y se esterilizaron a 121°C por 15minutos. Los frascos se

incubaron a 37°C por 12 horas y 180r.p.m. Posteriormente el contenido de los

viales se centrifugó a 3000 x g por 15min a 4°C, el sobrenadante se descarto y el

paquete celular se lavó con agua peptonada dos veces, se concentró y se

resuspendió con 30 mL de leche descremada con 20% de glicerol y se mezcló de

manera homogénea. Se transfirió el contenido a viales Eppendorf 1.5 mL, y se

sembró por vaciado en placa por diluciones 101 hasta 1010, para determinar las ufc

45

contenidas en un mililitro. Los viales se guardaron en congelación hasta su

posterior utilización.

Confirmación del género.

La enzima clave en la fermentación tipo glicolítica es la fructosa 6 fosfato

fosfocetolasa (F6PPK), la cual puede ser usada como un carácter taxonómico en

la identificación del género, aunque ésta no hace posible la diferenciación ínter

especie (Masco y col., 2004).

Las células se cultivaron por 24 horas en caldo TPYG a 38°C, se tomaron 20 mL

del caldo y se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos. El paquete celular se

resuspendió en 15 mL de solución salina por agitación en vortex; este

procedimiento se realizó por duplicado, se centrifugó nuevamente a las mismas

condiciones y el paquete celular se resuspendió con 2 mL de amortiguador de

fosfatos 0.05M adicionando cisteína; se colocó en un baño de hielo y se aplicó

sonicación 3 veces con pulsos de 5 s y períodos de descanso de 5 s. El producto

de la sonicación se mezcló con 250 µL de solución 1(6mg NaF y 10mg Na yodo

acetato en 1 mL de agua) y 250 µL de solución 2 (fructosa -6-P 80mg/L); se agitó

por 30 minutos a 37°C, la reacción se paró por adición de 1.5 mL de solución 3

(hidroxilamina – HCl, 13.9 g/100mL, recién neutralizada con NaOH a pH 6.5). La

mezcla se dejó reposar 10 minutos a temperatura ambiente y después se

adicionaron 1mL de solución 4 (TCA 15% p/v en agua) y 1 mL de solución 5 (HCl

4M), se agitó y dejó reposar por 5 minutos. Finalmente se adicionó 1 mL de

solución reveladora 6 (FeCl3.6H2O 5% p/v) en HCl 0.1M. El desarrollo de un color

rojizo-violeta inmediatamente después de agitar el tubo indicó la presencia de

F6PPK. Esta enzima es única para bifidobacterias. El resultado es negativo si el

color formado hubiera sido amarillo claro (Scardovi, 1986).

46

Elaboración de la curva estándar de crecimiento.

Las células se cultivaron en caldo TPYG por 12 horas, a 38°C, cada 2 horas se

tomó una alícuota de 2 mL y se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos. El

sobrenadante se descartó y el paquete celular se lavó con solución salina al

0.85% estéril, se realizó el conteo de ufc por siembra en placa con agar MRS,

haciendo diluciones de 10-1 hasta 10-9 con solución salina, por duplicado, y se leyó

a 660 nm. Las placas se incubaron por 48 horas a 38°C, en la cámara de

anaerobiosis. Se realizó una gráfica del tiempo contra la absorbancia y unidades

formadoras de colonias (Saarela y col., 2005).

Preparación del cultivo a encapsular.

Se utilizaron 2 g de cultivo de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB12, Chr.

Hansen) liofilizado y se resuspendió en 18 mL de caldo MRS estéril, se mezcló de

manera homogénea y posteriormente se tomaron alícuotas para inocular al 1% v/v

5 tubos con medio MRS estéril (González y col., 2004) y se incubaron por 12

horas a 39°C en cámara de anaerobiosis (Forma Scientific) con una composición

de 5% H2, 10% CO2 y 85% N2. Posteriormente se tomaron alícuotas de los tubos

anteriores y se inocularon al 10% v/v frascos viales que contenían medio TPYG

para un volumen final de 80mL; a los que previamente se les gaseó CO2 puro, y

se sellaron herméticamente (Azaola y col., 1999). Los frascos se incubaron a 37°C

y 180 r.p.m. por 8 horas. Las células se cosecharon por centrifugación a 3000 x g

por 15 minutos, el paquete celular se resuspendió con solución salina al 0.9% y se

ajustó por densidad óptica a una concentración aproximada de 1 x109 ufc/mL, por

último se almacenaron a 3°C para su posterior utilización.

47

Encapsulación de las bifidobacterias.

Se prepararon soluciones de alginato de sodio al 1,2 y 3%; se esterilizaron a

121°C por 15 minutos y después individualmente se mezclaron con 1% de células

resuspendidas con una concentración aproximada de 1x109 ufc. Las cápsulas se

obtuvieron por goteo de la mezcla del polímero- células, a través de una aguja

20G, 22G y 27G en caída libre a 10 cm por arriba de una solución de CaCl2, (0.2

M), las cápsulas se dejaron en la solución por 20 minutos para permitir el

endurecimiento (Lee y Heo, 2000). Posteriormente se cocecharon y se

almacenaron a 3°C con solución de agua peptonada al 0.03%.

Viabilidad de las células encapsuladas.

Las cápsulas se lavaron con solución salina al 0.85% p/v y se disuelvieron por 20

minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and Heo, 2000). Se

realizaron diluciones de 10-1 hasta 10-7 y se sembró por la técnica de vaciado en

placa con agar MRS bajo condiciones anaeróbicas a 37°C por 2 días. Lo anterior

se realizó para un periodo de 4 semanas.

Secado de las cápsulas

Las cápsulas preparadas con 3% de alginato y aguja 20, se almacenaron en

solución de agua peptonada al 0.1% a 4ºC. Posteriormente las cápsulas se

sometieron a un secado por lecho fluidizado con una velocidad del aire de

3.25m/s y tres esquemas de temperatura de deshidratación: (A) 20ºC durante todo

el proceso, (B) 40ºC por 15 minutos y 20ºC hasta terminar el proceso de

deshidratación y (C) 40ºC durante todo el proceso, las cápsulas deshidratadas se

almacenaron en frascos de polipropileno a temperatura ambiente (20-25°C). Para

determinar el tamaño y geometría de las cápsulas deshidratadas se utilizó la

técnica de procesamiento de imágenes (Du and Sun, 2004), la adquisición de la

48

imagen se realizó por medio de un microscopio de barrido (Scanning microscope

JSM-5800LU), posteriormente la segmentación de la imagen se efectuó con la

técnica de thresholding. Se tomaron los parámetros morfométricos de circularidad

o factor de forma circular, así como el diámetro de Feret; estos parámetros los

proporciona directamente el programa Image J v1.41 (Wayne Rasband, National

Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Para medir la viabilidad de las cápsulas deshidratadas, estas se disolvieron por

20 minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and Heo, 2000) y

se sembró por la técnica de vaciado en placa con agar MRS modificado bajo

condiciones anaeróbicas a 37°C por 2 días. Lo anterior se realizó por un periodo

de 3 meses.

Prueba de susceptibilidad a la nisina.

Se disolvió 1 mg de nisina liofilizada en 1 mL de HCl 0.02 M (pH2) y se almacenó

en refrigeración. La solución de nisina se diluyó en factores de 2 para obtener las

siguientes concentraciones 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.62, 7.8, 3.9, 1.9, 0.96,

0.48 y .24 μg/mL

Se utilizó el método de difusión en placa, a 14 cajas de petri de 90mm de diámetro

se le adicionó 1 mL de células sin encapsular a una concentración aproximada de

1x107ufc por vaciado en 10mL de medio MRS modificado. Se dejó secar hasta

solidificar y se realizaron 4 perforaciones de 10mm. A los pozos se les adicionaron

80μL de Nisina con concentraciones preparadas anteriormente, al control sólo se

le adicionan 80 μL de HCl 0.02M. Se metieron a refrigerar x 3h para permitir la

difusión de la nisina, posteriormente se sacaron y se incubaron a 40°C x 24h en

anaerobiosis. La CMI se identificó como la dilución más baja de nisina que

presentó un halo de inhibición (Rada y Dlabal, 1998).

49

El efecto de protección de las cápsulas se detectó por crecimiento en viales con

medio TPYG, se emplearon 14 viales a los cuales se les adicionó nisina para

obtener concentraciones de 500, 250, 125, 62.5, 31.2,15.62, 7.8, 3.9, 1.9 ug de

nisina/mL y se les adicionaron 1 g de bifidobacterias encapsuladas ó 1mL de

bifidobacterias sin encapsular con una concentración de 1x107 ufc/g, se incubaron

durante 12 horas a 37°C en anaerobiosis y se midió la D.O. a 650 nm (Kheadr y

col., 2004).

Susceptibilidad a los antimicrobianos.

Se utilizó como inóculo una suspensión de 108 células mL-1 y se realizó una

prueba de sensibilidad por medio de la técnica de difusión en disco. Se sembró 1

mL de inóculo por el método de vaciado en placa utilizando medio MRS

modificado. Cuando el agar se enfrió se procedió a colocar el disco estándar con

12 agentes antimicrobianos (Moubareck, y col., 2004). El disco se tomó con una

pinza esteril y se colocó en el medio en un tiempo menor de 15 minutos después

de haber inoculado la placa, se incubó a 37°C por 48 horas en anaerobiosis. La

zona de inhibición se midió y el resultado se reportó como positivo o negativo.

Digestión in vitro, simulación de jugos gástricos

La solución gástrica se preparó suspendiendo 3g/L de pepsina en solución salina

al 0.5% v/v y se ajustó el pH a 2 adicionando HCl 12N (Lian ycol., 2003). Se

adicionaron 10mL de la solución gastrica y 1g de cápsulas ó 1mL de células sin

encapsular con concentración de 6.8 ufc/mL, a viales; estos se incubarón a 37°C

por 3h y 180 r.p.m. Se tomaron viales cada hora y se evaluó la viabilidad.

Viabilidad de cápsulas en presencia de sales biliares.

La solución biliar se preparó adicionando 6g de bilis (oxgall) a 100 mL de solución

salina al 0.85% p/v.

50

Las cápsulas puestas en HCl se enjuagaron con solución salina, se les adiciono

10 mL de solución biliar y se incubaron a 37°C durante 3 horas. Al terminar se

cosecharon las cápsulas, por medio de un tamiz 40 (0.425mm), se lavaron con

solución salina al 0.85% y se disuelvieron por 20 minutos en 30 mL de solución de

citrato de sodio 0.1M en agitación a 200 rpm a 25°C. Las células se cultivan en

diluciones de 10-1 a 10-6 en placa con agar MRS modificado bajo condiciones

anaeróbicas a 37°C por 48 horas (Hou y col., 2003).

Las células sin encapsular, provenientes del HCl, se centrifugaron para separar las

células del líquido y posteriormente se les adicono 10 mL de solución de bilis,

cada hora se tomo un vial y se cultivaron las células en agar MRS modificado bajo

condiciones anaeróbicas a 37°C por 48 horas, para obtener la viabilidad.

Análisis de imágenes

Se capturaron imágenes de las cápsulas testigo y tratadas en condiciones de

simulación gástrica cada hora por 6 h utilizando un estereomicroscopio Nikon,

SMZ 1500, Japan, a una amplificación de 2X. Las imágenes se trataron con el

programa Image J v1.41 NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Se analizó, tanto la circularidad como el diámetro de Feret de las imágenes

capturadas.

Preparación del kéfir

Se empleó leche entera pasteurizada, se inoculó con 2% de cultivo liofilizado de

kéfir (Swedish Dairies Association, Malmo, Sweden). Se dejó fermentar a

temperatura de 26°C por 24 horas. El coagulo formado se rompió; se dividió en

tres porciones y se agregaron en recipientes sellados de 100mL. Una porción fue

el control (sin Bifidobacterias), a las otras dos partes se les adicionaron

bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular por separado para tener una

51

concentración inicial de 2 a 3 x 107 CFU/ g y 2 x108 CFU/mL respectivamente.

Después se dejó madurar de 12-14°C por 24 horas (Otles and Cagindi, 2003) y

por último se almacenaron a 3°C para su posterior análisis. Esto se realizó por

triplicado.

Digestión in vitro, simulación de jugos gástricos de las bifidobacterias

encapsualdas y libres adicionadas al Kéfir.

La solución gástrica se preparó suspendiendo 3g/L de pepsina en solución salina

al 0.5% v/v y se ajustó el pH a 2 adicionando HCl 12N (Lian ycol., 2003). Cada

semana, se tomó un gramo de cápsulas contenidas en el kéfir almacenado, las

cuales se separaron por medio de un tamiz 40 (0.425mm), ó se tomó una alícuota

de 1.0 mL de kéfir con células libres. Las muestras se pusieron en viales y se les

adicionó 10.0 mL de solución gástrica y se incubó a 37°C por 3 h con agitación a

180rpm. La simulación gástrica se realizó semanalmente por un periodo de 28

días.

Viabilidad de las células encapsuladas y sin encapsular adicionadas al Kéfir.

Después de la digestió, las cápsulas se lavaron con solución salina al 0.85% y se

disolvieron por 20 minutos en 10 mL de solución de citrato de sodio 0.1M (Lee and

Heo, 2000). Se realizaron diluciones 10-1 hasta 10-7 y se sembró por la técnica de

vaciado en placa con agar MRS modificado bajo condiciones anaeróbicas a 37°C

por 2 días. Lo anterior se realizó para un periodo de 4 semanas.

Para las células libres después de la simulación gástrica se centrifugaron, se

enjuagaron con solución salina al 0.85% dos veces, se realizaron diluciones y se

sembró en placa con agar Columbia modificado (Beerens, 1991), al cual se le

adicionó 5g/L de rafinosa, 0.5g Cisteína, 3 mL/L de ácido propiónico y 2g/L de

cloruro de litio.

52

Características físico químicas del kéfir después del almacenamiento

pH. El pH se determinó para todas las muestras con un medidor de pH, marca

Orion modelo 920, pH 0-14, semanalmente.

Acidez Titulable. La acidez titulable se midió como porcentaje de ácido láctico, se

realizó para todas las muestras a los 0, 7, 14, 21 y 28d utilizando NaOH (0.1 N) y

solución fenolftaleína al 1% como indicador (Marshall, 1992)

Grasa total y lactosa se determinó por medio de espectroscopia infrarroja, con el

espectro fotómetro de luz infrarroja Miko-Skan 133B

Determinación de alcohol del kéfir Se determinó por un método colorimétrico

utilizando el kit BioVision (Ethanol Assay kit Catalogo #K620-100). Primero se

realizó una curva estándar: se adicionó 11.7μL de etanol (9.2 mg) y se mezcló con

988.3 μL de amortiguador para etanol. A continuación se tomaron 10 μL del

diluyente y se mezcló con 990μL de amortiguador. Se agregaron 0, 4, 8, 12, 16 y

20μL del etanol diluido en las celdas y se ajustó el volumen a 50μL con

amortiguador para etanol. A cada celda se le adicionó 50 μL de la mezcla de

reactivos (46 μL de regulador para etanol, 2 μL de etanol con dimetilsulfoxido y 2

μL de enzima alcohol oxidasa previamente preparada) y se leyo la densidad óptica

de cada celda a 570nm, con estos datos se realizó la curva tipo.

La muestra se preparó tomando 1 ml de kéfir y se diluyó con 1 mL de regulador y

se realizaron diluciones con el amortiguador. Se tomaron 50 μL de muestra diluida

y se adicionaron en una celda, junto 50 μL de la mezcla de reactivos y se leyó a

570nm. La concentración de etanol se obtuvó, por cálculo directo en la curva tipo

y multiplicado por el factor de dilución.

53

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Conservación de la cepa y confirmación del género

La cepa conservada en glicerol y leche descremada, tuvó una concentración de

inicial de 2 ± 0.33 x109 ufc/mL, depsues de cinco meses en congelación la

viabilidad fue de 1.88 ± 0.11 x 109 ufc/mL. La congelación no afecto la viabilidad

debido a que tanto la leche como el glicerol son considerados crioprotectores. El

glicerol es un crioprotector penetrante, el cual penetra en la célula e incrementa el

volumen de la solución intracelular y aumenta la permeabilidad de la membrana

citoplasmática contribuyendo a la deshidratación; adicionalmente a los

crioprotectores penetrantes, se les atribuye la acción de disminuir el punto de

fusión de la solución intracelular, factor decisivo para evitar la formación de

cristales de hielo en el medio intracelular. Así mismo, la leche se considera un

crioprotector no penetrante, actuando fundamentalmente como agente osmótico

desde el medio externo y contribuyendo a reducir la cantidad de agua intracelular

que puede congelarse (Mazur, 1984). Por lo cual, la mezcla de ambos

crioprotectores dio mayor estabilidad a las células a bajas temperaturas.

Las células, mostraron la morfología típica de las bifidobacterias al ser observadas

al microscopio a 1000X (Figura 11). La prueba enzimática mostró actividad de la

enzima fructosa 6 fosfato fosfocetolasa, la cual es usada como un carácter

taxonómico en la identificación del género (Masco y col., 2004), esta enzima

cataliza la reacción Fructosa 6-P acetil-P + eritrosa-4-P, con lo cual se aseguró

que la célula sigue la vía metabólica de las bifidobacterias, en cuanto a la

determinación de la especie se necesitaría hacer un análisis genético de la misma.

54

Figura 11. Morfología de las bifidobacterias a 1000X

Curva estándar de ufc vs Absorbancia.

El máximo crecimiento célular se obtuvó a las 10 horas de fermentación (Figura

12), inoculando al inicio de la fermentación con 3 x10 6 ufc/mL (6.7 log ufc/mL) de

bifidobacterias, a las seis horas se llegó a tener concentración de 6.7 x 107

ufc/mL (7.8 log ufc/mL) y a las 10 horas se tuvó una concentración de 1.3 x 108

ufc/mL (8.1 log ufc/mL) e inició la fase estacionaria; a las 24 horas las

concentración disminuyó a 7x107 ufc/mL (7.8 log ufc/mL). Esto difiere con lo

reportado por Saarela y col. (2005), quienes mencionaron que después de 15 h de

fermentación B. animalis subsp. lactis, alcanza la fase final logarítmica y después

de 22h están en la fase estacionaria y el número de células alcanzado en este

momento fue de 9.7 log ufc/mL.

Figura 12. Cinética de la fermentación de Bb 12

55

La diferencia en los resultados, se debe principalmente al tipo de fermentación

que se empleó en éste trabajo, comparada con el de Saarela y col., los cuales

emplearon un fermentador New Brunswick-IF40 (Edison, NJ, USA) y diferente

medio de cultivo (glucosa, peptona soya, extracto de levadura y sulfato de

magnesio). Con lo cual se demuestra la importancia de la realización de la gráfica

de cinetica de crecimiento para cada fermentación. Conjuntamente, la gráfica es

útil para determinar el momento en el cual hay que cosechar las células para

encapsular, se considera generalmente que los cultivos jóvenes son más

sensibles al manejo como puede ser centrifugación y concentración, que los

cultivos en fase logarítmica tardía o que están en la fase estacionaria (Heckly,

1985).

Con los datos de la gráfica anterior, se realizó una curva tipo (Figura 13),

utilizando sólo los datos de crecimiento exponencial, la cual sirvió para calcular

indirectamente la cantidad de células por mililitro, que estaban presentes cuando

estas eran suspendidas en solución salina y de esta forma, ajustar a la cantidad

de células que se desean encapsular.

Figura 13. Curva tipo bacterias vs absorbancia a 660 nm para Bb12

56

Encapsulación

El tamaño de las cápsulas estuvó relacionado con el grosor de la aguja. Las

formadas con aguja 27 tuvieron un diámetro entre 1.19 y 1.65mm, para las

formadas con aguja 22 y 20 su diámetro estuvo entre1.29 y 2.1mm y entre 1.4 y

2.68 mm respectivamente (Cuadro 6), la concentración de alginato interfiere con el

tamaño y el peso, independientemente del grosor de la aguja, a menor

concentración las cápsulas son más pequeñas, existe una mayor adherencia entre

ellas y son más suaves.

Cuadro 6. Peso y diámetro de las cápsulas de alginato

Grosor de la aguja

en mm (cal.)

Peso (mg) Diámetro (mm)

Alginato de calcio Alginato de calcio

3% 2% 1% 3% 2% 1%

0.42 (27G) 6.7±0.9 5.2±1.1 2.2 ±0.3 1.65±0.14 1.48±0.17 1.19±0.2

0.72 (22G) 10.9±0.8 5.6±0.4 2.8±0.3 2.1±0.15 1.92±0.14 1.29±0.19

0.91 (20G) 12.9±1.4 7.5±1.0 5.5±0.6 2.68±0.20 2.52±0.08 1.4±0.25

Smidron y Skjak-Braek (1990), utilizaron agujas de 0.27mm para la formación de

las esferas y obtuvieron diámetros de 2-3 mm; mayores a las obtenidas en este

trabajo. Anal y Stevens (2005) indican que el tamaño de las esferas es

generalmente dependiente de la viscosidad de la solución y el diámetro del orificio

de la aguja, por otro lado según Krasaekoopt y col (2003), la forma está

relacionada con la distancia de la caída libre entre la salida y la solución de

coagulación. Martinsen y col. (1989) concluyeron que las propiedades físicas de

las esferas, también depende en gran medida de la composición, el peso

molecular y la secuencia de los ácidos L-gulorónico y D-manurónico del alginato

empleado para su formación, esferas pequeñas resultan de alginatos con bajo

ácido gulorónico.

La reducción de tamaño aun empleando el mismo diámetro de la aguja puede

deberse a la facilidad de extrusión del gel al pasar a través de la aguja, lo cual

provoca que salgan rápidamente un tras otra y disminuye su tamaño antes de

57

gelificarse, pues Kim (1990) menciona, que una vez formada la gota después de

la extrusión esta mantiene la misma forma cuando entra en contacto con los iones

de la solución de calcio e instantáneamente se forma la esfera. Inicialmente el

centro del alginato de calcio no reacciona, pero transcurrido un tiempo el ion de

calcio puede difundir hacia el centro y formar un estructura calcio - alginato.

Durante el proceso de gelificación el gel se va formando sobre la superficie hacia

el centro, mientras los iones de calcio van penetrando por la capa porosa

gelificada. Así mismo, la concentración de alginato es importante para tener

cápsulas esféricas, así a mayor concentración se tiene una mejor forma esférica y

homogeneidad.

Smirdsrod y Draget (1996) mencionan, que durante la formación de los geles de

alginato hay una contracción lo cual provoca una pérdida de agua (sinéresis) y un

aumento en la concentración del polímero. Las cápsulas con mayor concentración

de alginato son más grandes y duras, lo que refleja una mayor sinéresis del gel a

altas concentraciones de alginato. Las cápsulas más fuertes tenían mayores

concentraciones de alginato y al ser expuestas a los cationes divalentes del CaCl2

por el mismo periodo de tiempo que las demás, formaron una densa red de gel

firme con una mayor contracción y sinéresis.

Champagne y col. (1994) señalan que el diámetro de las esferas es un importante

parámetro para la actividad de los biocatalizadores. Diámetros pequeños pueden

mejorar la productividad volumétrica de un reactor con células inmovilizadas por

que incrementa la biomasa atrapada con el mismo volumen en el bioreactor. El

diámetro optimo para una alta productividad puede estar entre 0.5 y 0.8 mm.

La cantidad de células atrapadas por gramo de cápsulas varió de 5.9x106 ufc a 3.2

x107 ufc (Cuadro 7), siendo el menor valor para las células atrapadas en alginato

de calcio al 1% y formadas con la aguja calibre 27.

El tamaño de las cápsulas no afecto significativamente el número de ufc por

gramo de material. Aunque Chandramouli y col. (2004), así como Sheu y col.

58

(1993) concluyeron, que existen varios factores que afectan la eficacia de la

capsula en la protección de las bacterias como es la concentración de alginato, de

CaCl2, el tiempo de endurecimiento y concentración de células.

Cuadro 7. Células atrapadas por gramo de cápsulas Concentración de

Alginato (%)

Log ufc (Calibre de la aguja)

20G (0.91mm) 22G(0.77mm) 27G(0.42mm)

1 7.4 ± 0.63 7.2 ± 0.09 6.7 ± 0.34

2 7.3 ± 0.04 7.3± 0.17 7.2 ± 0.43

3 7.4 ± 0.05 7.2 ± 0.07 7.5 ± 0.23

Cinética de secado y características de las cápsulas

Al iniciar el secado, se partió de una humedad de 93.3% (b.h) y el proceso finalizó

con una humedad del 2% (b.h). En la Figura 14, se presentan las curvas de

secado (X/Xo) vs tiempo de secado y en la Figura 15, presenta las gráficas de

velocidad de secado (-LsdX/Adt), observándose que existe una tendencia a

presentar un período constante de secado que representa la mayor parte del

proceso, seguido por uno de velocidad decreciente. De las figuras se observa que

la temperatura de secado tuvó el efecto esperado en el tiempo total del proceso; a

mayor temperatura, menos tiempo de secado. A 40ºC, se obtuvo el menor tiempo

(30min) para alcanzar la humedad de equilibrio; al deshidratar a 40°C por 15

minutos y posteriormente a 20°C hasta alcanzar la humedad de equilibrio, el

proceso tomó 38 minutos y cuando se deshidrató a 20ºC durante todo el proceso,

éste tomó 70 minutos. La humedad final en todos los casos fue prácticamente la

de equilibrio (2% b.h).

59

Figura 14. Curvas de secado de las esferas de alginato al 4% con 2% de células, por lecho fluidizado a () 20ºC durante todo el proceso, (X) 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.

Figura 15. Efecto de la temperatura de secado del aire sobre la rapidez de secado a () 20ºC durante todo el proceso, (X) 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.

60

En las Figuras 16 y 17(A, B y C), se observa el tamaño relativo y geometría de las

esferas antes y después de la deshidratación por diferentes procesos. La

temperatura del proceso de secado tuvó una incidencia directa tanto en la

geometría como en el tamaño de la cápsula, en el Cuadro 8 se hace la

comparación entre las cápsulas no deshidratadas y deshidratadas por los tres

procesos descritos anteriormente.

Figura 16. Cápsulas hidratadas de alginato al 3% conteniendo bifidobacterias y su imagen binarizada.

Figura 17. Imágenes de microscopia de barrido de las cápsulas deshidratadas a temperatura de

20ºC (A), de 40ºC x 15 minutos (B) y de 40ºC (C) y correspondientes imágenes binarizadas del

área proyectada.

A C B

61

Cuadro 8. Comparación de las características de las cápsulas hidratadas y deshidratadas

Peso (mg) Diámetro Feret (mm) Circularidad

Hidratadas 18.78±0.78

3.19±0.15 0.89±0.02

Deshidratadas proceso (A) 1±0.02 1.9 0.50

Deshidratadas proceso (B) 1±0.02 1.23 0.84

Deshidratadas proceso (C) 1± 0.02 0.74 0.81

(A) T=20°C todo el proceso, (B) T=40°C x 15min y el resto del proceso a 20°C (C) 40°C todo el proceso.

La deshidratación, causó una disminución de la circularidad de las esferas, Según

Pertusa (2003), la circularidad o factor de forma circular, cuando el valor se aleja

más de la unidad el perímetro del objeto es más irregular, esto se aprecia

perfectamente para las capsulas secas en el proceso A. La cual era de esperarse

por la eliminación de agua y tratamiento térmico. Asimismo, el secado causó un

encogimiento de los materiales (Cuadro 8), determinado por el diámetro de Feret

mismo que fue menor a mayores temperaturas y menores tiempos de proceso.

Pertusa (2003), decribe el diámetro de Feret como: el valor de la distancia entre 2

paralelas tangentes a la silueta proyectada de la partícula y que son

perpendiculares a una dirección fija. Éste resultado es congruente con procesos

de endurecimiento superficial que es más pronunciado a mayores temperaturas

(Aguilera y Stanley, 1999), protegiendo, así el interior de las cápsulas. En estas

condiciones, también se obtuvo una mayor protección de la viabilidad de las

bacterias.

Para percibir el efecto de la deshidratación, se efectuó el conteo de células viables

por gramo de cápsulas húmedas o deshidratadas. En 1g de capsulas humedas la

viabilidad fue de 1.3 x 108 ufc (8.1± 0.01 log ufc); posteriormente se tomó un

gramo de capsulas humedas, se deshidartaron y estas tuvieron una viabilidad de

6.3 ± 1.3 x 107 ufc (7.83±0.06 log ufc). Después de tres meses de

almacenamiento, la viabilidad disminuyó 0.59 log en las cápsulas húmedas, 1.3

log para las cápsulas del proceso (A), 0.23 y 0.5 log para las cápsulas de los

62

procesos (B) y (C), respectivamente, el proceso de secado influyó en la viabilidad

(Figura 18), como se puede observar las cápsulas deshidratadas a 20ºC la

supervivencia es menor, después de 90 días de almacenamiento, esto pudiera

explicarse por qué las cápsulas de alginato de calcio tienden a ser muy porosas

(Anal y Singh, 2007), lo cual permite el paso del oxígeno y provocar que las

bifidobacterias mueran; en cuanto al proceso B y C, la viabilidad se mantiene

después de deshidratadas las cápsulas, pero la hidratación de las mismas es más

tardada en la cápsulas deshidratadas por el proceso (C) en comparación con las

otras dos, esto se debe a que la cápsula es más compacta y con menos porosidad

(ver Figura 17), a demás de que las cápsulas de alginato restringen la difusión del

oxígeno a través del gel, creando regiones anoxicas (Talwalkar y Kailasapathy,

2003).

Figura 18. Viabilidad de las células encapsuladas (X) hidratadas y deshidratadas, durante el almacenamiento por 90 días. () 20ºC durante todo el proceso, () 40ºC x 15 min + 20ºC resto del proceso y () 40ºCdurante todo el proceso.

La deshidatacion de las esferas por el método realizado, de acuerdo a la viabilidad

encontrada, es una buena alternativa de conservación y preservación de la

bifidobacterias; comparando esto con la deshidratación por liofilización, en donde

es neserario utilizar crioprotectores para mejorar la viabilidad de las bifidobacterias

(Saxelin, 1999) y el costo es mayor, debido tanto al proceso, como al

almacenamiento del producto deshidratado. Por ejemplo Saarela y col. (2005)

63

utilizaron sacarosa como crioprotector y encontraron que la viabilidad de

Bifidobacterium animalis ssp. lactis disminuía en 1.2 logaritmos después de dos

meses a 5ºC, mayor a lo obtenido en este trabajo que fue de 0.7 logaritmos de

disminución de la viabilidad a los dos meses para en el proceso A, que fue el de

mayor disminución en la viabilidad a los tres meses.

Otro método utilizado, es el secado por aspersión en donde el inconveniente es

que la mayoría de los probióticos no sobreviven bien durante el proceso, debido a

la temperatura y extremos a los cuales son sometidos durante el secado (Selmer y

col., 1999). Picot y Lacroix (2004), reportaron tasas de supervivencia de

probioticos de solo 26% a las pocas semanas después de secar por aspercion

cepas probioticas. Esto es asociado con el estrés producido por los cambios de

temperatura, cambios de fase y deshidratación, combinación que tiende a dañar la

membrana celular y las proteínas asociadas a ella (Anal y Singh, 2007). En

general son dos los principales mecanismos responsables del deterioro en el

secado de cultivos bacterianos: la inactivación por deshidratación (efecto

osmótico) y la inactivación por calor, estos mecanismos afectan un gran número

de componentes celulares como ADN, ARN, proteínas, membrana, pared celular

entre otros (Masters, 1985).

Shin y col. (2004), deshidrataron capsulas de alginato que contenían células

mediante frío utilizando un congelador a temperatura de -15ºC, el tiempo para

deshidratar las cápsulas fue de 24 horas, manteniendo estable la actividad de las

células; pero no reportan la humedad final de la cápsula, ni viabilidad de las

células.

El encapsular en alginato y deshidratarlas por lecho fluidizado, es un alternativa

para conservar y almacenar a temperatura de 20°C a las bifidobacterias,

manteniéndolas viables.

64

Efecto de la simulación gástrica en el tamaño de las cápsulas

Las bifidobacterias encapsuladas al ser sometidas al ácido clorhídrico pH2, no se

observo ningún cambio en la conformación de la capsulas. Aunque despues de

analizar las imagenes tomadas durante su estancia en el ácido, se tuvó como

resultado que todas las capsulas se achicaron, es decir disminuyeron su diámetro

entre 20.6% y 29.79%, dependiendo el tamaño. Las esferas pequeñas se

achicaron menos que las grandes (Cuadro 9). Según Rayment y col. (2009), esto

se debe a un contenido mayor de agua en las esferas grandes; estos autores

concluyeron que el encogimiento de las cápsulas se debe a la reducción de cargas

de repulsión electrostáticas al bajar el pH. Asimismo, Norton y col. (2006) aluden

que existe una disociación de los iones de calcio a bajo pH, lo cual forma un gel

ácido donde los grupos carboxilo están protonados, permitiendo que las cadenas

de alginato esten más unidas y formen enlaces de hidrógeno.

Las cápsulas al pasar de la solución ácida a las sales biliares, empiezan a

hincharse llegando en algunos casos a desintegrarse, después de una hora en la

solución de sales biliares (capsulas al 1% de alginato de los tres tamaños

diferentes y capsulas de 1.48 mm al 2%) y en otros a fraccionarse después de

dos horas en la solución de bilis (cápsulas al 3% de 1.65mm, Figura 19). Este

fenómeno se da principalmente en las cápsulas de tamaño pequeño, las cápsulas

de mayor tamaño solo se hinchan pero no se desintegran. Esto concuerda con lo

reportado con Rayment y col. (2009), quienes indican que las cápsulas de alginato

una vez en la solución intestinal (sales biliares), comienzan a hincharse en

diversos grados, debido a un aumento en la fuerza de repulsión electrostática a un

pH por encima de los valores de pKa de los grupos de ácido urónico del alginato y

que la desintegración presumiblemente es consecuencia de la mayor

concentración de iones monovalentes.

65

Figura 19. Efecto de las sales biliares en cápsulas de 1.65 mm y 3% de alginato.

En el Cuadro 9, se muestran indicadores morfométricos de las diferentes cápsulas

que se trataron en las condiciones de simulación del tracto gastro intestinal. Es

importante resaltar, que las partículas, en general, no cambian marcadamente su

apariencia. Sin embargo, el tamaño tiende a regularizarse hacia la forma esférica

(ver valores de la circularidad) y a aumentar su tamaño (ver valores del los

diámetros de Feret).

Cuadro 9. Indicadores morfométricos de cápsulas tratadas en condiciones de simulación gástrica.

Tiempo

(min)

1% alginato 2% alginato 3% Alginato

D.

Feret

(mm)

Circ.

%

dism.

D.

Feret

(mm)

Circ.

%

dism.

D.

Feret

(mm)

Circ

%

dism.

D.

Feret

(mm)

Circ

%

dism.

D.

Feret

(mm)

Circ

%

dism.

0 1.19 0.80 0 1.48 0.77 0 2.5 0.89 0 1.65 0.89 0 2.68 0.83 O

60 * 0.88 0.84 26 1.10 0.89 25.64 1.89 0.89 24.2 1.31 0.88 20.60 2.12 0.89 20.73

120* 0.85 0.87 28 1.07 0.88 27.81 1.83 0.89 26.89 1.25 0.88 24.52 2.07 0.90 22.61

180* 0.84 0.90 29.4 1.07 0.90 27.81 1.76 0.89 29.79 1.19 0.90 27.95 2.07 0.90 22.67

240** 3.43 0.78 2.67 0.90 2.69 0.90

300** 3.42 0.89 2.72 0.90

360** 3.42 0.88 2.90 0.90

420** 3.50 0.88 3.36 0.90

* Cápsulas en solución acida. ** Cápsulas en solución de sales biliares

D. Feret= Diámetro de Feret; Circ.= circularidad ó factor de forma circular; % dism. = % que disminuyó la esfera de tamaño.

Hoad y col. (2009), evaluaron cápsulas de alginato a través del tracto gastro

intestinal, en un modelo in vivo. Obteniendo como resultado, que el tiempo en que

3h 1h 2h

66

las cápsulas llegan al inicio del ciego fue de 120 minutos en promedio. Así mismo,

las cápsulas son visibles después de 4 horas, tiempo que duró el experimento,

demostrando que las cápsulas no se desintegran en el intestino y concluyen que

las esferas de alginato tanto fuertes como débiles, son claramente visibles en el

estómago y en el intestino delgado, estas se observaron en las imágenes de

resonancia magnética (RM). Las cápsulas son más visibles en el íleon el cual

tenía una apariencia más distendida en las imágenes de RM, comparado con el

duodeno y yeyuno. Además, estos autores, no encontraron diferencias

significativas en la morfología de las diferentes capsulas durante su paso por el

tracto gastro intestinal. Lo anterior difiere con lo encontrado en este trabajo, en

donde algunas cápsulas se desintegran después de una hora en la solución de

sales biliares y con los datos proporcionados por Rayment y col. (2009), los cuales

en experimentos in vitro encontraron que algunas cápsulas se desintegraron una

vez colocadas en la solución intestinal.

Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas durante la simulación

gástrica.

La viabilidad de las bifidobacterias libres disminuye de 6.8 x 108 ufc a 4.68 x 105

ufc/mL, después de tres horas en ácido clorhídrico pH 2 (Cuadro 10), Ding y Sha

(2007), encontraron que la viabilidad de las células de B. lactis tipo BI04 y 07

después de dos horas en ácido (pH2) disminuyo 63%.

Favaro-Trindade y Grosso (2002), reportaron que B. lactis (Bb12) es eliminada

después de solo 1 hora en condiciones acidas (pH1 y 2), en contra parte,

Vernazza y col (2006) mencionan que de 5 cepas de bifodobacterias sometidas a

pH2, solo Bb-12 mostró incremento en la supervivencia.

Las bifidobacterias encapsuladas, después de ser sometidas durante tres horas a

HCl, pH2, mantuvieron su viabilidad en general en más del 90%, la viabilidad se

vio afectada por el tamaño de la cápsula y la concentración de alginato, las

67

esferas chicas de 1.19 mm y 1% de alginato tuvieron una pérdida de viabilidad de

10%, comparado con el original. Las cápsulas que tuvieron la mejor viabilidad

fueron las obtenidas con aguja 20 al 2% y 3% (diámetro de 2.52 mm y 2.68 mm

respectivamente), donde la viabilidad se mantuvo (Cuadro 10). Estos resultados

concuerdan con Lee y Heo (2000), quienes concluyeron que en general la

viabilidad de las células en las cápsulas se incrementa con el aumento de la

concentración de alginato y el tamaño de la cápsula. Por otro lado Annan y col.

(2008), mencionan que una cubierta con gelatina a las esferas de alginato ayuda a

mejorar la viabilidad de las bifidobacterias después de someterse a la simulación

gástrica.

Cuadro 10. Viabilidad de las bifidobacterias libres y encapsuladas por tamaño y concentración de alginato después de la simulación gástrica.

Tamaño

cápsula

(mm)

Concentración

alginato %

Tiempo (horas)

Log ufc /g de cápsulas

0 1 2 3

1.4±0.25 1 7.4±0.06 7.33±0.06 7.23±0.06 6.92±0.098

2.52±0.08 2 7.29±0.04 7.27±0.04 7.25±0.05 7.2±0.1

2.68±0.20 3 7.41±0.05 7.39±0.06 7.38±0.08 7.35±0.12

1.29±0.19 1 7.2±0.09 7.1±0.06 7.1±0.006 7.1±0.011

1.92±0.14 2 7.3±0.17 7.3±0.14 7.28±0.10 7.23±0.01

2.1±0.15 3 7.2±0.07 7.2±0.07 7.2±0.07 7.23±0.01

1.19±0.20 1 6.7±0.34 6.6±0.31 6.5±0.26 6.0±0.09

1.48±0.17 2 7.2±0.43 7.1±0.38 7.0±0.31 6.6±0.05

1.65±0.14 3 7.5±0.23 7.3±0.65 7.14±0.48 6.9±0.43

Células sin encapsular 8.8±0.11 6.6±0.04 6.4±0.04 5.7±0.01

68

Chen y col. (2005) concluyeron, que para tener una alta viabilidad de las células

probióticas, la cubierta de la cápsula debe estar compuesta por 1% de alginato de

sodio adicionando 1% de péptidos y 3% de fructooligosacaridos, aunque

posteriormente, los mismos autores argumentan que esta combinación no provee

la suficiente protección para los probióticos durante el almacenamiento y

simulación gástrica, por lo cual en un trabajo posterior recomiendan emplear para

la formulación de la esferas 3% de alginato de sodio con 1% de péptidos y 3% de

fructooligosacaridos (Chen y col., 2006), se puede ver que el componente que le

da mayor resistencia a la cápsula es el alginato, a mayor concentración mejor

viabilidad, semejante a lo obtenido en este trabajo. En otra propuesta para mejorar

la ecapsulación con alginato, Sultana (2000) sugiere para encapsular

bifidobacterias utilizar 2% almidón (Hi-Maize) y 2% de alginato, el almidón ayuda a

mejorar la viabilidad de las células, debido a que el alginato y el almidón tienden a

ser sinérgicos y como resultado se obtiene una mejor protección y sugieren que es

necesario evaluar con diferentes concentraciones de alginato y tamaños de

cápsulas para ver la efectividad de las mismas. En contraparte Simpson y col.

(2005) aluden que el efecto en la viabilidad durante la simulación ácida no es solo

atribuible al material de envoltura sino también de la tolerancia intrínseca de las

diferentes especies de bifidobacterias que se utilicen, como puede ser tolerancia al

calor, oxígeno y acidez.

Más aun Matsumoto y col. (2004) argumentaron que generalmente, cuando las

bacterias son expuestas a condiciones ácidas, estas mantienen la homeostasis del

pH por la descarga de iones H+ de la célula. Este proceso depende de la actividad

de la H+-ATPasa. Las cepas no ácido tolerantes se dañan en condiciones acidas,

ya que la actividad de su H+-ATPasa no puede ser aumentada, mientras que

cepas ácido tolerantes se ven menos afectadas y son capaces de sobrevivir a

causa de su rápido aumento de la actividad de su H+-ATPasa.

69

No obstante de que Bifidobacterium animalis subsp lactis, cuando no esta

encapsulada, es considerada como cepa ácido tolerante, en este trabajo su

viabilidad se ve afectada al someterse a la simulación de gástrica.

Tolerancia de las bifidobacterias encapsuladas a las sales biliares

La viabilidad después de someter a las bifidobacterias sin encapsular a la

simulación gástrica y posteriormente a las sales biliares, disminuye 3% después

de tres horas en las sales biliares. La cuenta inicial de 8.8 Log ufc/mL disminuyo a

5.2 Log ufc/mL después de 6 horas de simulación gastrointestinal (ácida más

sales biliares). Ding y Shah (2007) describen que la viabilidad de Bifidobacterium

animalis después de someterse a 4 horas a sales biliares se ve disminuida de 10.5

a 6.35 ufc/ml, (39.6 %). En cuanto a las bifidobacterias encapsuladas estas

pierden un 1% de viabilidad en general, después de 3 horas en la solución de

sales biliares, se observó que ciertas cápsulas después de una hora se

desintegraban y por lo cual no se pudo cuantificar la viabilidad en las esferas; lo

obtenido en este trabajo difiere con lo reportado por Favaro-Trindade y Grosso

(2002), los cuales reportan que Bb12 encapsulado fue resistente a 12 horas en

solución de sales biliares. La desintegración de las capsulas se debe a que ciertas

sustancias como citrato, presente en las sales biliares, tiene una alta afinidad por

los iones Ca+2 , secuestra los iones calcio de enlace, con la consecuente

desestabilización del gel. Ademas debido a que el ion Ca+2 puede ser

intercambiado con otro catión, el gel también va a ser desestabilizado por altas

concentraciones de iones no inductores de gel, como el Na+ (SmidsrØd y Skajak,

1990).

La trascendencia de determinar la resistencia a las sales biliares por las

bifidobacterias radica en que estas las deben desconjugar, pues según Tanaka y

col (2000) las sales biliares desconjugadas pueden disminuir los niveles de

colesterol sérico en los seres humanos hipercolesterolémicos o prevenir la

hipercolesterolemia en individuos con niveles normales de colesterol. Asimismo

70

una importante actividad metabólica que exhiben casi todas las bifidobacterias es

la desconjugación de las sales biliares, que se produce naturalmente en los seres

humanos, por lo cual es necesario mantener viables a las bifidobacterias en altas

concentraciones cuando están en contacto con las sales biliares y sobrevivan para

su implantación en el intestino grueso por lo cual la encapsulación en alginato es

una buena alternativa.

Susceptibilidad a la nisina

Usando el método de difusión en agar (Figura 20), la bifidobacteria estudiada fue

sensible a concentraciones de 62.5 a 250 μg /mL de nisina, produciendo zonas de

inibición del rango de 1- 4 mm. La concentración mínima inhibitoria fue por lo tanto

62.5 μg/mL para la bifidobacteria libre. Este resultado, es diferente a lo reportado

por Rada y Dlabal (1998) los cuales examinaron 13 cepas de bifidobacterias las

cuales fueron sensibles a concentraciones de 1mg /mL con zonas de inhibición de

3 a 18mm.

En cuanto al medio TPY se determinó que la CMI para las células libres fue de 1.9

μg/mL, lo cual es mayor en comparación a lo reportado por Kheadr y col. (2004)

en donde la CMI de nisina para Bb12 es de 0.24μg/mL.

Figura 20. Difusión en agar, se muestra el efecto inhibitorio de la nisina a concentración de

62.5μg/mL. T es el pozo testigo.

71

El modo en que la nisina lisa a las bifidobacterias es por formación de poros en la

membrana de las bacterias, lo que resulta en una salida rápida de los compuestos

citoplasmáticos, por ejemplo aminoácidos, potasio, fostafo inorgánico, rubidio

preacumulado, glutamato y ATP. En la formación del poro la nisina primero une su

extremo carboxilo terminal a los lípidos aniónicos de la membrana por medio de

interacciones electrostáticas (Figura 21). Enseguida su extremo amino terminal se

inserta en la membrana lipídica, mientras que el péptido adopta una orientación en

paralelo con respecto a la superficie de la membrana y por tanto distorsiona la

bicapa de lípidos para formar un poro, la nisina seguirá un modelo de cuña para

formar el poro. La formación del poro es transitoria, de modo que los péptidos

pueden rápidamente regresar a la orientación original en paralelo en el exterior de

la cubierta (Bauer y Dicks, 2005).

Figura 21. Modelo general para la formación de poros. Paso 1: Unión de la nisina por medio de su carbón terminal. Paso 2: inserción de la nisina en la membrana. La profundidad de la inserción depende del porcentaje de lípidos aniónicos y concentración de nisina. Paso 3: Cuña / formación de poro. Paso 4: translocación de los péptidos en el interior de la membrana.

Las bifidobacterias encapsuladas no se ven afectadas por las concentraciones de

nisina utilizadas en este experimento, 0.5 mg de nisina por mililitro equivalente a

40,000 UI/mL. Esto puede deberse a que la nisina no entra en contacto inmediato

con las bacterias lo cual puede provocar que estas se reproduzcan dentro de la

cápsula y salgan de la misma, en estas nuevas células la nisina se une y las

72

destruye hasta el momento en que la concentración de nisina no es suficiente para

unirse a más bacterias.

Esta evaluación es importante para comprender el comportamiento de las

bifidobacterias en medios que contengan nisina como inhibidor. Puesto que la

nisina ha demostrado ser un eficaz biopreservador natural en alimentos, inocuo,

sensible a las proteasas digestivas (puede ser hidrolizado a aminoácidos en el

intestino por la quimotripsina) y no produce cambios en las propiedades

sensoriales de los alimentos (Guerra y col. 2007). Por ejemplo, la nisina se puede

agregar a los quesos (a los cuales se les pueden adicionar bifodobacterias) y en

alimentos enlatados, sin límite en el Reino Unido, Australia, Francia y Perú,

mientras que en México, Italia, Brasil y Argentina se permiten concentraciones

máximas de 500UI/g (Juncioni de Arauz y col., 2009). Asimismo, a escala

industrial se puede afectar la viabilidad de la propagación de bifidobacterias, al ser

adicionados en leches fermentadas, por ejemplo, Quiao y col. (1997) determinaron

que en fermentaciones con condiciones optimas para L. lactis los títulos máximos

de nisina obtenidos van de 1,000 – 5,000 U.I. /mL. Además Murina y Kanach

(1995) encontraron concentraciones de nisina en productos lácteos comerciales

de un rango de 10 a 500 U.I./mL. También pudiera haber incompatibilidad si se

incorpora al Bb12 a productos lácteos fermentados que contengan cepas de

lactociccus lactis productoras de nisina.

Por lo tanto las bifidobacterias encapsuladas en alginato puede resitir

perfectamente la concentración más alta de nisina que se adicona como

conservador en un producto.

Susceptibilidad a antimicrobianos

Bifidobacterium animalis subsp. lactis fue sensible a los β-lactamicos, como

ampicilina, cetotaxina cefalotina, cefuroxina, penicilina G, carbenicilina y

ceftriaxona. Los antibioticos β-lactamicos son bactericidas, actúan inhibiendo la

73

síntesis de la barrera de peptidoglicanos de la pared celular bacteriana. Se

determinó que es también sensible a la amikacina, que es un bactericida del grupo

de los aminoglucosidos, estos inhiben la síntesis proteica actuando sobre la

unidad 30S de los ribosomas; así como a nitrofurantoina, tetraciclina y

eritromicina. La cepa fue resistente a pefloxacina, gantamicina, dicloxacilina y

trimetropim-sulfametoxazol. Estos resultados son semejantes a lo reportado por

Khear y col. (2004), quienes discuten que la evaluación de la sensibilidad de las

bifidobacterias a los antibióticos tiene varios propósitos como son:

1) La identificación selectiva de antibióticos para el recuento de bifidobacterias

en los productos fermentados.

2) Predecir alteraciones en los rasgos de las bifidobacterias que puedan

ocurrir debido al tratamiento con antibióticos y

3) Determinar el papel de las bifidobacterias en la transferencia de genes

resistentes a los antibióticos a otros grupos de bacterias intestinales.

Supervivencia de las bifidobacterias encapsuladas y no encapsuladas en

kéfir durante el almacenamiento

Los resultados muestraron una disminución del 31% de la población de bacterias

encapsuladas y del 76% de bifidobacterias no encapsuladas (Figura 22), durante

el periodo de almacenamiento del kéfir en refrigeración. Adhikariy col. (2000)

adicionaron Bifidobacterium longum en yogurt, reportaron una disminución del

78% de las bacterias no encapsuladas, pero no tuvieron diferencias en las

muestras con bacterias encapsuladas después de 30 días de almacenamiento.

Por otro lado Sultana y col. (2000), realizaron un monitoreo por 8 semanas

encontrando que las células inmovilizadas disminuyeron 0.5 log en la cuenta

viable, mientras que en las células libres disminuyó 1 log cuando fueron

incorporadas al yogurt.

74

Figura 22. Viabilidad de las bifidobacterias encapsuladas (●) y no encapsuladas ( ) durante el periodo de almacenamiento del Kéfir de 0 a 28 días en refrigeración.

El kéfir difiere con el yogurt en la preparación, en el kéfir se distinguen dos fases la

fermentación y la maduración. La fermentación es generalmente hecha entre 18 y

22°C durante 18 a 20 horas, mientras las bajas temperaturas favorece a las

levaduras y las altas a las bacterias lácticas y por lo tanto el proceso de

acidificación. Después de la etapa de maduración a temperatura entre 8 a 10°C

por 1 a 3 días, se incrementa la concentración de etanol, debido a la actividad de

la levaduras y otros componentes que le dan aroma y sabor (Koroleva, 1991);

después de estos pasos se refrigera el producto, durante el almacenamiento la

cuenta viable de bacterias ácido acéticas y levaduras permanece constante

mientras que las bacterias ácido lácticas disminuye después de 7 y 14 días

(Irigoyen y col., 2005), lo cual puede indicar la disminución de las bifidobacterias

tanto encapsuladas como libres.

Sumado a lo anterior, el oxígeno puede entrar al producto a través del material de

empaque durante el almacenamiento, el oxígeno afecta a las bifidobacterias de

dos formas. Primero es toxico para las células tal vez expresado directamente por

el propio cultivo sensible al oxígeno. Esto resulta en la acumulación intracelular de

peróxido de hidrógeno y como consecuencia la muerte celular (Dave y Shah,

1997). Segundo, L. delbrueckii ssp. bulgaricus es conocido por producir peróxido

de hidrógeno en presencia de oxígeno, el cual puede afectar a las bifidobacterias

indirectamente (Villegas y Gilliland, 1998), así mismo Lankaputhra and Shah

75

(1996) describen un efecto sinérgico de la acidez y el peróxido de oxígeno en la

inhibición de las bifidobacterias.

Supervivencia de las bifidobacterias en la simulación gástrica después del

almacenamiento del kéfir

La encapsulación, mejoró la supervivencia de las bifidobacterias después de la

exposición a 3 horas en ácido clorhídrico a pH2, antes y después del periodo de

almacenamiento del kéfir y posterior digestión (Figura 23).

Figura 23. Viabilidad de Bifidobacterium lactis encapsulada (▲, ) y sin encapsular (●, o) durante el

almacenamiento del Kéfir por 28 días en refrigeración antes (▲, ●) y después ( , o) de someterse

a la simulación gástrica a pH2.

En comparación las células libres después de la digestión su vibilidad disminuyo

11.54% en kéfir al primer día, 30.28 y 11.92% para la primera y segunda semana

respectivamente después de someterse a la digestión gástrica (comparando la

disminución, con el conteo de ufc que se tuvo antes de iniciar la digestión);

después de los 21 días de almacenar el kéfir y someterlo a digestión gástrica no

se observo viabilidad de las bifidobacterias. Lo anterior difiere con Charteris y col.

(1998) los cuales reportaron que la viabilidad de Bifidobacterium bifidum, B.

0123456789

0 7 14 21 28

Log 10 UFC/mL

tiempo (días)

76

infantis, B. breve y B. adolescentis disminuyo en 3.0 log ufc/mL después de ser

expuestas a la simulación en ácido gástrico; sumado a esto Lee and Heo (2000)

encapsularon B. longum y encontraron que la viabilidad de las bifidobacterias

encapsuladas disminuía proporcionalmente con el tiempo de exposición a la

simulación a ácidos gástricos y que en las bifidobacterias sin encapsular disminuía

su viabilidad después de 30 minutos de exposición al ácido de 1.28 x 109 a 1 x103

ufc/ml.

Por otro lado Favaro-Trindade and Grosso (2002), encapsularon Bb12 en acetato

ftalato celulosa por la técnica de secado por aspersión y encontraron que las

encapsulación favorece a la supervivencia de la bifidobacteria, en comparación

con las libres las cuales se morían después de estar sólo una hora en condiciones

ácidas a pH2. Así mismo, Lian y col. (2003), no encontraron diferencias

significativas en la viabilidad de B. longum B6, encapsuladas por aspersión con

goma arábiga, gelatina y almidón soluble después de ser expuestas por 4 h en la

simulación de ácidos gástricos a pH2. Por otro lado Jung y col. (2007) realizo una

doble encapsulación de B. breve CBG-C2, como capa interna empleo aceite y

posteriormente la recubrieron con almidón y gelatina, las adicionaron a yogurt y la

sometieron a la simulación gástrica, demostrando que la doble encapsulación

favorece la viabilidad de la bifidobacterias. Nuestros resultados demuestran la

efectividad de la encapsulación en alginato aun después de estar el producto en

almacenamiento.

Cambios de pH y acidez titulable durante el almacenamiento

Los cambios de pH en el kéfir tanto del control como los experimentales durante el

almacenamiento a 4°C por un periodo de 28 días se muestra en el cuadro 11. El

control mostró el pH más bajo. El pH final del kéfir (después de los 28 días de

almacenamiento) con bacterias sin encapsular fue menor que el del kéfir con

bifidobacterias encapsuladas. El pH del kéfir preparado con granos de kéfir por lo

general debe estar entre 4.3 y 4.6 (Wider, 2001). Iroyen y col. (2005) no

77

encontraron diferencia en el pH del kéfir durante el almacenamiento, atribuyendo

esto a que la población de bacterias ácido lácticas disminuye con el transcurso del

tiempo. En este caso, el pH del kéfir con bifidobacterias encapsuladas no

disminuyó significativamente (p>0.05).

Cuadro 11. Cambios de pH del kéfir con bifidobacterias durante el almacenamiento

Tiempo almacenamiento

(Semanas)

Control

Kéfir con bifidobacterias libres

Kéfir con bifidobacterias encapsuladas

0 4.7 4.7 4.7 1 4.7 4.7 4.7 2 4.7 4.7 4.7 3 4.6 4.6 4.6 4 4.3 4.4 4.6

En otras leches fermentadas como el yogurt el pH decrece con el tiempo de

almacenamiento hasta 3.95 (Kailasapathy, 2006) debido a que los cultivos

iniciadores del yogurt incluyen a L. delbrueikii subsp bulgaricus and S.

thermophilus los cuales son activos aun a temperatura de refrigeración y pueden

producir pequeñas cantidades de ácido láctico lo que resulta en disminución del

pH (Shah y col., 1995).

La acidez titulable aumentó ligeramente con el tiempo de almacenamiento, siendo

mayor para el testigo y menor para el kéfir con bifidobacterias encapsuladas

(Figura 24); esto concuerda con lo dicho por Litopoulou-Tzanetaki and Tzanetakis

(2004), los cuales mencionan que la acidez titulable en el kéfir es de 1%; así

mismo Beshkova y col. (2002), encontró ligeras variaciones en la acidez titulable

entre el kéfir recién elaborado y el almacenado después de 7 días. En yogurt esta

puede ser de 1.2 % después de 30 días de almacenamiento en refrigeración y de

1.1 en yogurt con bifidobacterias encapsuladas y sin encapsular (Adhikari y col.,

2000), Collar (1996) menciona que las bacterias ácido lácticas producen más

ácido láctico y ácido acético en cultivos puros que en cultivos mezclados con

levaduras.

78

Figura 24. Cambios en la acidez titulable del kéfir (▲) testigo y del kéfir conteniendo Bifidobacterium lactis encapsuladas (●) y sin encapsular (■) durante el almacenamiento en refrigeración por 28 días.

Grasa total y lactosa

Después del almacenamiento por 28 días, el contenido de grasa disminuyó de

3.18% que tenía la leche a 2.53 % en el kéfir. En el kéfir con bifidobacterias tanto

libres como encapsuladas la grasa fue de 2.37%; esto concuerda con lo hallado

por Chin-Yun y Ching-Wen (1999), en donde el contenido de grasa del kéfir

elaborado es menor que el de la leche que se utilizo, esta diferencia puede ser

atribuible a la producción de lipasas por los granos de kéfir durante la

fermentación de la leche (Vujicic y col., 1992). En contraste Irigoyen y col. (2005)

no encontraron diferencias en el contenido de grasa del kéfir y la leche utilizada en

el procesamiento del mismo.

El contenido de lactosa en los tres kéfires fue el mismo 2.53%, el nivel disminuyó

en 16.55% con respecto al nivel de lactosa presente en la leche. La cantidad de

lactosa se mantuvo prácticamente constante durante el periodo de

almacenamiento, esto concuerda con lo descrito por García y col. (2006), donde el

contenido de lactosa disminuyó un 18% en el kéfir con respecto a la leche

79

empleada; así mismo Irigoyen col. (2005) reportaron que el nivel de lactosa se

mantiene constante después de 16 días de almacenamiento.

Determinación de alcohol

El contenido de etanol fue de 4.41± 0.38 μg/mL de producto, Garcia y col., (2006)

reportaron una cantidad de alcohol de 0.018 % (p/p) en contra parte Wszolek y col.

(2001) reportaron una cantidad de alcohol entre 4.22 y 5.51 ug/g y concluyeron

que la diferencia en alcohol se debe principalmente a las diferencias en el balance

de microorganismos de los diferentes cultivos con los que se prepara el kéfir.

80

VIII CONCLUSIONES

A mayor concentración de alginato se obtiene una mejor viabilidad de las

bifidobacterias encapsuladas.

Las esferas de mayor tamaño soportan mejor la digestión ácida y de sales biliares

y contiene la misma cantidad de ufc por gramo de cápsulas.

La encapsulación ejerce un efecto protector de las bifidobacterias contra el pH

ácido, con respecto a los microorganismos no encapsulados.

La concentración de alginato no tiene efecto en la resistencia de las esferas a la

digestión gástrica.

El mejor método de conservación, por deshidratación en lecho fluidizado es de

40°C por 15 minutos y el resto del proceso a 20°C (Proceso B), en el que la

supervivencia de las bifidobacterias solo disminuyó 3% después de tres meses de

almacenamiento a temperatura ambiente.

La deformación de las cápsulas deshidratadas bajo las condiciones del

procesamiento B (ver anterior), fue menor que las alcanzadas por medio de los

procesos A y C.

La concentración mínima de nisina para que Bb12 sin encapsular no cresca en

medio líquido es de 1.9 μg de nisina/mL, mientras que las células encapsuladas

resistieron hasta 500 μg de nisina/mL.

La cepa BB12 resultó ser sensible a los antibioticos reportados en la literatura para

B. animalis subsp lactis.

81

Durante la refrigeración del Kéfir, las bifidobacterias encapsuladas mantienen

mejor su viabilidad, en comparación con las no encapsuladas; sin embargo ambas

presentan una disminución en su población.

Las células encapsuladas en el Kéfir almacenado, presentan una viabilidad mayor

que las células no encapuladas después de someterse a la digestión gástrica.

La adición de bifidobacterias no encapsuladas y encapsuladas no afecta a las

propiedades del kéfir como el pH, cantidad de grasa, lactosa y etanol.

Ampliacio futura del trabajo Seria conveniente evaluar la viabilidad con el tiempo de almacenamiento para

diferentes tipos y concentraciones de alginato y células.

Probar una secuencia experimental que incluya encapsular, inocular en el

producto y posteriormente realizar la simulación de la digestión gástrica.

Evaluar el proceso de encapsulación de las bifidobacterias para ver si proteje de la

actividad de los antibioticos.

Realizar un estudio más amplio del fenómeno de transferencia de agua durante la

deshidratación que incluya intervalos más amplios de temperaturas, velocidad del

aire y relación de tiempo de deshidratación a altas y bajas temperaturas.

Realizar pruebas de deshidratación, asociadas a estudios morfométricos de los

que se obtengan parámetros tales como tamaño de poro y coarteaduras, perdida

de esfericidad y evaluación de las dimensiones fractales de contorno y de textura.

82

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