Instrucciones de Uso GenDx SBT excellerator® · Mecanografía (SBT). SBTexcellerator® pueden ser...

Octavo Edición Julio de 2011

Tecnologías de Muestra y Ensayo

Instrucciones de Uso

GenDx SBTexcellerator®

Para Tipificación Basada en Secuenciación de HLA de alta

resolución

Genome Diagnostics B.V.

Teléfono: +31 302 523 799

Correo electrónico: [email protected]

Sitio web: www.gendx.com

Dirección: Yalelaan 48

3584 CM Utrecht

Países Bajos

0344

Distruibuido por

Marcado CE

Número de catálogo Marcado CE

SBTexcellerator® HLA-A 4100084, 4100184 CE 0344

SBTexcellerator® HLA-B 4101084, 4101184 CE 0344

SBTexcellerator® HLA-C 4102084, 4102184 CE

SBTexcellerator® HLA-DRB1 4105084, 4105184 CE 0344

SBTexcellerator® HLA-DRB3/4/5 4105384 CE 0344

SBTexcellerator® HLA-DQA1 4106084, 4106184 n.a.

SBTexcellerator® HLA-DQB1 4104084, 4104184 CE

SBTexcellerator® HLA-DPB1 4103084, 4103184 CE

Derechos de Autor Esta publicación, incluyendo todas las fotografías e ilustraciones, está protegida por las leyes internacionales sobre derechos de autor, con todos los derechos reservados. Ni este manual ni ninguna parte del material contenido en él se pueden reproducir sin el consentimiento por escrito del autor. © Copyright 2011 Descargo de Responsabilidad Genome Diagnostics B.V. ha hecho todo lo posible para garantizar que este modo de empleo es preciso. Genome Diagnostics B.V. rehúsa toda responsabilidad por cualquier imprecisión u omisión que pueda existir. La información contenida en estas Instrucciones de Uso está sujeta a cambios sin previo aviso. Genome Diagnostics B.V. no asume ninguna responsabilidad por cualquier inexactitud que pueda estar contenida en estas instrucciones de uso. Genome Diagnostics B.V. se reserva el derecho de hacer mejoras a este Instrucciones de uso y / o los productos descritos en estas instrucciones de uso, en cualquier momento sin previo aviso. Si usted encuentra información en este manual que es incorrecta, engañosa o incompleta, le agradecemos sus comentarios y sugerencias. Envíelas a [email protected].


Página 3

Contenido

Marcado CE 2

Contenido 3

Clave de los Símbolos 4

Contenido de los Kits 5

Para HLA de Clase I 5

Para HLA de Clase II 7

Envío y Almacenamiento 9

Advertencias y Precauciones 9

Limitaciones de Uso del Producto 9

Información de Seguridad 10

Uso 10

Asistencia Técnica 10

Principio y Procedimiento 10

Notas importantes antes de empezar 11

Preparación de la muestra 11

Preparación del cebador de SBTexcellerator® 11

Configuración del ensayo 11

Equipos y Reactivos para ser suministrados por el Usuario 12

Protocolo 1A: Amplificación de Loci HLA de Clase I 14

Protocolo 1B Amplificación de Loci HLA-DRB 17

Protocolo 1C: Amplificación de Locus HLA-DQA1 21

Protocolo 1D: Amplificación de Locus HLA-DQB1 24

Protocolo 1E: Amplificación de Locus HLA-DPB1 27

Protocolo 2: Limpieza de producto de PCR 30

Protocolo 3: Secuenciación de Loci HLA 31

Protocolo 4: Limpieza y Análisis de los Productos de Secuenciación de HLA 33

Guía de resolución de problemas 35

Apéndice A: Control de la Contaminación 39

Notes 41

Clave de los Símbolos

Número de Material

Componentes

Número

Dispositivo Médico de Diagnóstico In Vitro

Código de Lote / Número de Lote

Número de Catálogo

Consulte las Instrucciones de Uso

Contiene reactivos para pruebas N

Store at -20 ºC Almacenar a -20 ºC

Fabricante Legal

Agregue el líquido


Página 5

Contenido de los Kits

Para HLA de Clase I

Kits HLA-A SBTexcellerator® Kit de Base (50)

Kit Ampl. (50)

Nº de catálogo 4100084 4100184

Número de reacciones 50 50

Cebadores de Amplificación HLA-A (tapa roja) 1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-A (tapa amarilla)

Múltiples tubos* –

Cebadores HLA-A GSSP (tapa verde) – Múltiples tubos*

H2O sin Nucleasa (tapa transparente) 1 tubo 1 tubo

Hoja de Protocolo HLA-A 3000101 –

Instrucciones de Uso 3840000 –

Kits HLA-B SBTexcellerator® Kit de Base (50)

Kit Ampl. (50)



Cebadores de Amplificación HLA-B (tapa roja) 1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-B (tapa amarilla)

Múltiples tubos* Múltiples tubos*

Cebadores HLA-B GSSP (tapa verde) – Múltiples tubos*


Hoja de Protocolo HLA-B 3000201 –


* Consulte la hoja de protocolo para los detalles de los cebadores.

Kits HLA-C SBTexcellerator® Kit de Base (50)

Kit Ampl. (50)



Cebadores de Amplificación HLA-C (tapa roja) 1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-C (tapa amarilla)


Cebadores HLA-C GSSP (tapa verde) – Múltiples tubos*


Hoja de Protocolo HLA-C 3000301 –




Página 7

Para HLA de Clase II

Kits HLA-DRB SBTexcellerator®

HLA-DRB1 de Base (50)

HLA-DRB1 Ampl. (50)

HLA-DRB3/4/5 (50)

Nº de catálogo 4105084 4105184 4105384

Número de reacciones 50 50 50

Cebadores de Amplificación HLA-DRB1 (tapa roja)

1 tubo – –


– – 1 tubo


– – 1 tubo


– – 1 tubo

Cebadores de Secuenciación HLA-DRB1 (tapa amarilla)

Múltiples tubos*

1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-DRB3/4/5 (tapa amarilla)

– – Múltiples tubos*

Cebadores HLA-DRB1 GSSP (tapa verde)

1 tubo Múltiples tubos*

–

Cebadores HLA-DRB3/4/5 GSSP (tapa verde)

– – 1 tubo

H2O sin Nucleasa

(tapa transparente) 1 tubo 1 tubo 1 tubo

Hoja de Protocolo HLA-DRB 3000601 – 3000701

Instrucciones de Uso 3840000 – 3840000


Kits HLA-DQA1 SBTexcellerator® Kit de Base (50)

Kit Ampl. (50)



Cebadores de Amplificación HLA-DQA1 (tapa roja)

2 tubos –

Cebadores de Secuenciación HLA-DQA1 (tapa amarilla)



Hoja de Protocolo HLA-DQA1 3000801 –


Kits HLA-DQB1 SBTexcellerator® Kit de Base (50) Kit Ampl. (50)



Cebadores de Amplificación HLA-DQB1 (tapa roja)

1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-DQB1 (tapa amarilla)


Cebadores HLA-DQB1 GSSP (tapa verde) – Múltiples tubos*


Hoja de Protocolo HLA-DQB1 3000501 –




Página 9

Kits HLA-DPB1 SBTexcellerator® Kit de Base (50)

Kit Ampl. (50)



Cebadores de Amplificación HLA-DPB1 (tapa roja)

1 tubo –

Cebadores de Secuenciación HLA-DPB1 (tapa amarilla)


Cebadores HLA-DPB1 GSSP (tapa verde) – Múltiples tubos*


Hoja de Protocolo HLA-DPB1 3000401 –



Envío y Almacenamiento Los Kits HLA SBTexcellerator® son:

- enviados a temperatura ambiente y se deben almacenar a -20°C a la llegada

- estables hasta la fecha de caducidad del kit cuando se almacenan a -20°C

- estables durante 5 meses después de la disolución de los cebadores en H2O libre de nucleasa cuando se almacenan a -20°C

Advertencias y Precauciones

Limitaciones de Uso del Producto

Para asegurarse del mejor rendimiento, utilice los Kits HLA SBTexcellerator® con los materiales, reactivos y equipamientos recomendados en "Equipamiento y Reactivos que el Usuario debe Proporcionar", página 12. ¡El usuario deberá aprobar el uso de materiales distintos de los especificados!

¡La reconstitución o dilución de los cebadores en otros volúmenes distintos de los descritos en estas Instrucciones de Uso no se recomienda en absoluto!

Tenga especial consideración del Apéndice A: Control de la Contaminación, en la página 39.

Información de Seguridad

Cuando se trabaja con productos químicos, se ha de utilizar siempre una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección.

Uso SBTexcellerator® están destinados para la identificación de alta resolución de los alelos de los antígenos de leucocitos humanos (HLA) mediante secuenciación base Mecanografía (SBT). SBTexcellerator® pueden ser utilizados para la tipificación de los donantes de registro y diagnóstico de trasplante. El material de muestra es el ADN genómico humano.

Los productos SBTexcellerator® están destinados a uso diagnóstico in vitro por personal profesional de atención sanitaria, como técnicos de laboratorio y médicos, formados en la tipificación de los HLA y la secuenciación de ADN en laboratorios de diagnóstico con acreditación EFI o ASHI o en condiciones de trabajo de acuerdo a las especificaciones de EFI o ASHI.

Asistencia Técnica Para obtener asistencia técnica y más información, consulte el Centro de Soporte Técnico en www.qiagen.com/Support o llame a uno de los Departamentos de Servicio Técnico de QIAGEN o distribuidores locales.

Principio y Procedimiento Los kits HLA SBTexcellerator® son juegos de cebador/oligonucleótidos dedicados a la tipificación basada en secuenciación de HLA de alta resolución (SBT). Para la tipificación de alta resolución de HLA de Clase I y Clase II, la secuenciación de los exones 2, 3 y 4 del locus HLA se puede realizar (secuenciación del exón 4 no disponible para todos los loci) utilizando los cebadores de secuenciación de los Kits de Base HLA SBTexcellerator®. La secuenciación de los otros exones o el uso de cebadores de secuenciación específicos de grupo (GSSP), incluidos en los Kits Ampliados HLA SBTexcellerator®, sólo es necesario cuando quedan ambigüedades por resolver. 1. La amplificación específica de locus HLA se lleva a cabo en un termociclador con

la mezcla de cebadores de amplificación, la plantilla de ADN, y el Kit PCR QIAGEN LongRange.

2. Antes de la secuenciación, los productos de PCR se limpian utilizando Exonucleasa I y Fosfatasa Alcalina de Camarón (o métodos alternativos) para eliminar los cebadores y nucleótidos no incorporados.

3. La secuenciación se realiza utilizando la química de secuenciación BigDye® Terminator.

4. Los productos de secuenciación se purifican con Sephadex G-50 Superfine (o métodos alternativos) para quitar los cebadores de secuenciación no incorporados y los nucleótidos residuales.

5. Las muestras desnaturalizadas se cargan en un analizador genético automatizado.


Página 11

Notas importantes antes de empezar

Preparación de la muestra

� El DNA purificado debe tener una relación A260/A280 entre 1,7 y 1,9. Si es necesario, el ADN debe diluirse en H2O sin Nucleasa antes de su uso.

� Las muestras de sangre se deben recoger en tubos con ACD o EDTA como anticoagulante. NO utilice muestras con heparina.

Preparación del cebador de SBTexcellerator®

� Centrifugar brevemente los tubos que contienen los cebadores de amplificación Centrifugar brevemente los tubos que contienen los cebadores de amplificación Centrifugar brevemente los tubos que contienen los cebadores de amplificación Centrifugar brevemente los tubos que contienen los cebadores de amplificación (tapas rojas) y los cebadores de secuenciación (tapas de color amarillo y verde) (tapas rojas) y los cebadores de secuenciación (tapas de color amarillo y verde) (tapas rojas) y los cebadores de secuenciación (tapas de color amarillo y verde) (tapas rojas) y los cebadores de secuenciación (tapas de color amarillo y verde) antes de abrir por primera vez. Resuspender cada cebador en Hantes de abrir por primera vez. Resuspender cada cebador en Hantes de abrir por primera vez. Resuspender cada cebador en Hantes de abrir por primera vez. Resuspender cada cebador en H2222O sin O sin O sin O sin Nucleasa Nucleasa Nucleasa Nucleasa (proporcionada), con los volúmenes de resuspensión listados en la Tabla 1.(proporcionada), con los volúmenes de resuspensión listados en la Tabla 1.(proporcionada), con los volúmenes de resuspensión listados en la Tabla 1.(proporcionada), con los volúmenes de resuspensión listados en la Tabla 1.

Configuración del ensayo

� Lea el Manual de PCR QIAGEN LongRange, prestando especial atención a la “Información de Seguridad” y “Notas Importantes” antes de comenzar el procedimiento.

� Configure todas las reacciones en el hielo.

Tabla 1. Volúmenes de resuspensión de cebadores de amplificación y cebadores de secuenciación (resuspender cada cebador en la H2O sin Nucleasa proporcionada)

Loci

Cebadores de amplificación (tapas

rojas)

Cebadores de secuenciación (tapas amarillas y verdes)

HLA-A 55 µl 55 µl

HLA-B 55 µl 55 µl

HLA-C 55 µl 55 µl

HLA-DRB1 55 µl 55 µl

HLA-DRB3/4/5 55 µl 110 µl

HLA-DQA1 55 µl 110 µl

HLA-DQB1 55 µl 55 µl

HLA-DPB1 55 µl 55 µl

Equipos y Reactivos para ser suministrados por el Usuario Cuando se trabaja con productos químicos, se ha de utilizar siempre una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección. Para obtener más información, consulte la correspondiente hoja de seguridad (MSDS), disponible en el proveedor de productos.

Para la amplificación del locus HLA

� Kit PCR QIAGEN LongRange

� Hielo

� Pipetas y boquillas de pipeta (el uso de boquillas de pipeta con filtros hidrofóbicos es muy recomendable)

� Termociclador

� Microcentrifugadora

� Agitador

� Tubos PCR (use tubos PCR de paredes delgadas de 0,2 ml, recomendados por el fabricante del termociclador)

� Sistema de electroforesis en gel de agarosa

Para la secuenciación de los loci HLA

� Exonucleasa I y Fosfatasa Alcalina de Camarón; alternativos métodos de limpieza se pueden utilizar

� Pipetas y boquillas de pipeta

� Termociclador

� Microcentrifugadora

� Uubos de microcentrifugadora de 1,5 o 2 ml

� Kit de Secuenciación de Ciclo BigDye Terminator v1.1 o Kit de Secuenciación de Ciclo BigDye Terminator v3.1*

* Esta no es una lista completa de los proveedores y no incluye muchos proveedores importantes de productos biológicos.


Página 13

Para la limpieza y el análisis de productos de secuenciación de HLA

Nota: Nota: Nota: Nota: Como alternativa, otros métodos de exclusión por tamaño o la precipitación del etanol de los productos de secuenciación se puede utilizar.

� Sephadex G-50 Superfine

� Cargador de Columna 45 ul Multipantalla

� Espátula para Cargador de Columna Multipantalla

� Multipantalla-HV

� Centrifugadora Multipantalla Alinear Marco Azul

� Placas de Pared Fina 96 x 0,2 ml con Borde Lateral Congeladas EU

� Pipetas y boquillas de pipeta

� Pipeta multicanal (recomendada para facilitar la manipulación)

� Centrifugadora, el rotor y los adaptadores deben ser capaces de centrifugar las placas de microtitulación de 96 pocillos

� Agua desionizada

� Secuenciador capilar (por ejemplo, Analizadores Genéticos ABI PRISM® 3100 o de Applied Biosystems 3130, o Analizadores de ADN ABI PRISM 3700 o Applied Biosystems 3730, Applied Biosystems) §†

� Software SBTengine® u otro software adecuado de tipificación de HLA para analizar los archivos de secuenciación y crear informes de tipificación de HLA

§ Esta no es una lista completa de los proveedores y no incluye muchos proveedores importantes de productos biológicos.

† Los Kits HLA SBTexcellerator® se han probado con varios polímeros y químicas de secuenciación.

Protocolo 1A: Amplificación de Loci HLA de Clase I

Este protocolo es para la amplificación de genes HLAHLAHLAHLA----A, HLAA, HLAA, HLAA, HLA----B o HLAB o HLAB o HLAB o HLA----CCCC por medio del Kit PCR QIAGEN LongRange y el respectivo Kit HLA SBTexcellerator®.

Procedimiento

Importante: Configure todas las reacciones en el hielo.

Nota: Prepare una mezcla de reacción aparte para cada locus (HLA-A, HLA-B y HLA-C).

1. Descongele el Buffer PCR 10x LongRange, la mezcla dNTP, la H2O sin Nucleasa y las soluciones del cebador. Mezcle las soluciones totalmente y centrifugue brevemente antes de su uso.

2. Prepare una mezcla de reacción, como se muestra en la Tabla 2.

La mezcla de reacción típicamente contiene todos los componentes necesarios para la PCR excepto la plantilla de ADN. Prepare un volumen de mezcla de reacción por lo menos 10% mayor que el requerido para el número total de ensayos de PCR a realizar.

La cantidad óptima de ADN de la plantilla a usar en la reacción es de 100 ng. Sin embargo, la plantilla de ADN en el rango de 50-200 ng (en 1-5 l) se puede utilizar sin afectar a los resultados. Para agilizar el proceso, valide el procedimiento de purificación de ADN, para que pueda utilizar un volumen que corresponda a 50-200 ng de ADN.


Página 15

Tabla 2. Composición de la mezcla de reacción para la amplificación de HLA-A, HLA-B, y la amplificación de los loci HLA-C (prepare una mezcla de reacción aparte para cada locus)

Componente Volumen en cada reacción Concentración final

Buffer PCR LongRange con Mg2+, 10x

2,5 µl 1x; 2,5 mM Mg2+

mezcla de dNTP (10 mM cada uno)

1,25 µl 500 µM de cada dNTP

Cebadores de Amplificación HLA Clase I

(tapa roja)

1 µl –

Mezcla de Enzimas PCR LongRange

0,4 µl 2 unidades por reacción

H2O sin Nucleasa Variable (14,85–18,85 µl)

–

Plantilla de ADN

Añadida en el paso 5

Variable (1-5 µl)

50 a 200 ng por reacción (óptimo 100 ng)

Volumen total 25 µl

3. Mezcle la mezcla de reacción a fondo, y centrifugue brevemente.

4. Sirva la mezcla de reacción en cada tubo de PCR.

El volumen apropiado es de 25 µl menos la cantidad de ADN añadido en el próximo paso.

5. Añada 1-5 µl plantilla de ADN (50-200 ng) a cada tubo que contiene la mezcla de reacción.

El volumen final debe ser de 25 µl.

La cantidad óptima de plantilla de ADN a usar en la reacción es de 100 ng. Sin embargo, la plantilla de ADN en el rango de 50-200 ng (en 1-5 l) se puede utilizar sin afectar a los resultados.

6. Programe el termociclador de acuerdo a las instrucciones del fabricante, usando las condiciones descritas en la Tabla 3.

Tabla 3. Protocolo cíclico para la amplificación de HLA de Clase I

Comentarios

Paso de activación inicial:

3 min 95 °C Desnaturalización inicial de la plantilla de ADN.

Ciclo en 3 pasos:

Desnaturalización 15 s 95 °C No exceda esta temperatura.

Recocido 30 s 65 °C

Extensión 3 min 68 °C Tamaños de producto PCR

3,1 kb a 3,4 kb

Número de ciclos 35

Extensión final: 10 min 68 °C

Fin del ciclo de PCR: Indefinido 4 °C

7. Importante: Para un inicio en caliente simplificado, coloque los tubos de inmediato en un termociclador que se calienta a 95 °C e inicie el programa de ciclos como se indica en la Tabla 3.

Utilice el inicio simplificado caliente para garantizar la especificidad de PCR.

Después de la amplificación, las muestras pueden ser almacenadas durante la noche a 2-8 º C. La limpieza de los productos de PCR (página 33) debe llevarse a cabo dentro de las 24 h.

8. Confirme los productos de PCR utilizando un sistema de detección adecuado, tal como electroforesis en gel de agarosa. Prepare un 1% w / v en gel de agarosa de acuerdo a su protocolo de laboratorio, y analice 3 µl de cada ensayo de PCR.

Véase la Tabla 3 para el tamaño aproximado de los productos de PCR.

9. Proceda con el “Protocolo 2:”, página 30.


Página 17

Protocolo 1B Amplificación de Loci HLA-DRB

Este protocolo es para la amplificación de una parte de los genes HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, y / o HLA-DRB5 utilizando el Kit PCR QIAGEN LongRange y el Kit HLA-DRB1 SBTexcellerator® y / o el Kit DRB3/4/5 SBTexcellerator®.

Procedimiento


Nota: Prepare una mezcla de reacción aparte para cada locus (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, y HLA-DRB5).




La cantidad óptima de plantilla de ADN a usar en la reacción es de 100 ng. Sin embargo, la plantilla de ADN en el rango de 50-200 ng (en 1-5 l) se puede utilizar sin afectar a los resultados. Para agilizar el proceso, valide el procedimiento de purificación de ADN, para que pueda utilizar un volumen que corresponda a 50-200 ng de ADN.

Tabla 4. Composición de la mezcla de reacción para la amplificación de los loci HLA-DRB (prepare una mezcla de reacción aparte para cada locus)



2,5 µl 1x; 2,5 mM Mg2+



Cebadores de Amplificación HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 o HLA-DRB5

(tapón rojo)

1 µl –




–

Plantilla de ADN


Variable (1–5 µl)











Página 19

Tabla 5. Protocolo cíclico para la amplificación de loci HLA-DRB

Comentarios



Ciclo en 3 pasos:



Extensión 5 min 68 °C Tamaños de producto PCR:

3,7 a 4,8 kb para HLA-DRB1

3,8 kb para HLA-DRB3

0,4 kb exón 2 y 1,3 kb exón 3 para HLA-DRB4

4,0 kb para HLA-DRB5

(véase la figura 1, página 20)







17. Confirme los productos de PCR utilizando un sistema de detección adecuado, tal como electroforesis en gel de agarosa. Prepare un 1% w / v en gel de agarosa de acuerdo a su protocolo de laboratorio, y analice 3 µl de cada ensayo de PCR.

Véase la Tabla 5 para los tamaños aproximados de los productos de PCR. Véase la Figura 1 para un ejemplo de análisis en gel de agarosa de los loci HLA-DRB3, HLA-DRB4, y HLA-DRB5.

Figura 1. Amplificación específica de locus para HLA-DRB3, HLA-DRB4, y HLA-DRB5. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa. M: GelPilot® 200 pb Ladder.

18. Proceda con “Protocolo 2:”, página 30.


Página 21

Protocolo 1C: Amplificación de Locus HLA-DQA1 Este protocolo es para la amplificación de una parte del gen HLAHLAHLAHLA----DQB1DQB1DQB1DQB1 utilizando el Kit PCR QIAGEN LongRange y el Kit HLA-DQA1 SBTexcellerator®.

Se proporcionan juegos de cebadores de amplificación QA1*01/3 y QA1*02/4/5/6 para tipificar los grupos de alelos HLA-DQA1*01/03 y HLA-DQA*02/04/05/06, respectivamente. Se deben realizar ambas reacciones de amplificación.

Procedimiento


Nota: Prepare una mezcla de reacción aparte para la amplificación de QA1*01/3 and QA1*02/4/5/6.

19. Descongele el Buffer PCR 10x LongRange, la mezcla dNTP, la H2O sin Nucleasa y las soluciones del cebador QA1*01/3 y QA1*02/4/5/6. Mezcle las soluciones totalmente y centrifugue brevemente antes de su uso.

20. Preparar una mezcla de reacción, como se muestra en la Tabla 6. Prepare una solución para QA1*01/3 y QA1*02/4/5/6.



Tabla 6. Composición de la mezcla de reacción para la amplificación del locus HLA-DQA1 (prepare una mezcla de reacción aparte para la amplificación de QA1*01/3 y QA1*02/4/5/6)



2,5 µl 1x, 2,5 mM Mg2+



Cebadores de amplificación QA1*01/3

QA1*02/4/5/6

(tapa roja)

1 µl



H2O sin Nucleasa Variable (14,85-18,85 µl)

–

Plantilla de ADN


Variable (1-5 µl)

50 a 200 ng por reacción (óptima de 100 ng)










Página 23

Tabla 7. Protocolo cíclico para la amplificación del locus HLA-DQA1

Comentarios



Ciclo en 3 pasos:




5,4 kb a 5,8 kb







26. Confirme los productos de PCR utilizando un sistema de detección adecuado, tal como electroforesis en gel de agarosa. Prepare un 1% w / v en gel de agarosa de acuerdo a su protocolo de laboratorio, y analice 3 µl de cada ensayo de PCR. Véase la Tabla 7 para el tamaño aproximado de los productos de PCR.


Protocolo 1D: Amplificación de Locus HLA-DQB1

Este protocolo es para la amplificación de una parte del gen HLAHLAHLAHLA----DQB1DQB1DQB1DQB1 utilizando el Kit PCR QIAGEN LongRange y el Kit HLA-DQB1 SBTexcellerator®.

Procedimiento


Nota: Nota: Nota: Nota: ¡se requiere añadir la Solución Q!


29. Prepare una mezcla de reacción, como se muestra en la Tabla 6. ¡Tenga en cuenta que la adición de solución Q es necesaria!




Página 25

Tabla 6. Composición de la mezcla de reacción para la amplificación del locus HLA-DQB1



2,5 µl 1x; 2,5 mM Mg2+

Mezcla de dNTP (10 mM cada uno)


Cebadores de Amplificación HLA-DQB1 (tapa roja)

1 l –



Solución Q, 5xSolución Q, 5xSolución Q, 5xSolución Q, 5x 5 µl5 µl5 µl5 µl 1x1x1x1x

H2O sin Nucleasa Variable (9,85-13,85 µl)

–

Plantilla de ADN


Variable (1-5 µl)










Tabla 7. Protocolo cíclico para la amplificación del locus HLA-DQB1

Comentarios


3 min 95°C Desnaturalización inicial de la plantilla de ADN.

Ciclo en 3 pasos:

Desnaturalización 15 s 95°C No exceda esta temperatura.

Recocido 30 s 65°C

Extensión 4 min 68°C Tamaños de producto PCR

3,7 kb a 4.1 kb


Extensión final: 10 min 68°C






36. Proceda con “Protocolo2:”, página 30.


Página 27

Protocolo 1E: Amplificación de Locus HLA-DPB1 Este protocolo es para la amplificación de una parte del gen HLA-DPB1 utilizando el Kit PCR QIAGEN LongRange y el Kit HLA-DPB1 SBTexcellerator®.

Procedimiento






Tabla 8. Composición de la mezcla de reacción para la amplificación del locus HLA-DPB1



2,5 µl 1x; 2,5 mM Mg2+

Mezcla de dNTP (10 mM cada uno)


Cebadores de Amplificación HLA-DPB1 (tapa roja)

1 µl –




–

Plantilla de ADN


Variable (1–5 µl)

50–200 ng por reacción (óptimo 100 ng)










Página 29

Tabla 9. Protocolo cíclico para la amplificación del locus HLA-DPB1

Comentarios



Ciclo en 3 pasos:




2,9 kb exón 1 y exones 5.7 kb exones 2-5









Protocolo 2: Limpieza de producto de PCR Los productos de PCR se tratan con Exonucleasa I y Fosfatasa Alcalina del Camarón (ExoI / SAP) antes de la secuenciación para degradar los cebadores no incorporados y para desfosforil losar nucleótidos residuales. Como alternativa a la limpieza del producto de PCR con el ExoI / SAP, el Kit de Purificación de PCR QIAquick también se puede utilizar.

Nota importante antes de empezar

� Configurar las reacciones en el hielo.

Procedimiento

1. Prepare una mezcla maestra ExoI / SAP en un tubo de microcentrifugadora estéril según la tabla 10.

Tabla 10. Composición de la mezcla de reacción para la limpieza de amplicón

N=1 N=10 N=25

Exo I 0,5 µl 5 µl 12,5 µl

SAP 1 µl 10 µl 25 µl

Total 1,5 µl 15 µl 37,5 µl

2. Añada 1,5 µl de Mezcla Maestra de ExoI / SAP a cada uno de los productos de PCR.

3. Suavemente agite la mezcla para producir una reacción homogénea y gire hacia abajo brevemente.


Tabla 11. Protocolo de ciclo para la limpieza ExoI / SAP de amplicón

Tiempo Temperatura

Paso de activación: 30 min 37 °C

Paso de inactivación:

20 min 80 °C

Enfriamiento: Indefinido 4 °C

5. Proceda con “Protocolo 3: Secuenciación de Loci HLA”, página 31.


Página 31

Protocolo 3: Secuenciación de Loci HLA Este protocolo es para la secuenciación de Loci HLA de Clase I y Clase II. Este procedimiento está optimizado para química BigDye Terminator, con su posterior análisis en los Analizadores Genéticos ABI PRISM 3100 o Applied Biosystems 3130 o Analizadores de ADN ABI PRISM 3700 o Applied Biosystems 3730.


� Configure las reacciones en el hielo.

� Centrifugue brevemente los tubos que contienen los cebadores de secuenciación (tapas de color amarillo y verde) antes de abrir.

� Lea el manual protocolo de BigDye Terminator, prestando especial atención a la “Información de seguridad” y “Notas Importantes” antes de comenzar el procedimiento.

Procedimiento

1. Prepare una mezcla maestra de secuenciación de acuerdo a la Tabla 12.

La mezcla maestra de secuenciación debe contener todos los componentes necesarios para todas las pruebas de secuenciaciación. Prepare un volumen de mezcla maestra de secuenciación por lo menos 10% mayor que el requerido para el número total de ensayos de secuenciación a realizar.

Nota: Prepare una mezcla de secuenciación aparte para cada cebador de secuenciación.

Tabla 12. Composición de la mezcla maestra de secuenciación de los loci HLA (prepare una mezcla maestra aparte para cada cebador de secuenciación)

Componente Volumen en cada reacción

Premezcla de Reacción BDT Ready, 2,5x 1 µl

Búfer BDT, 5x 1,5 µl

H2O sin Nucleasa 5,5 µl

Cebador de secuenciación (tapa amarilla o verde)

1 µl

Total 9 µl

2. Mezcle suavemente la mezcla maestra de secuenciación y centrifugue brevemente.

3. Dispensar 9 µl de la mezcla maestra de secuenciación en cada tubo de PCR.

4. Añada 1 µl de producto de PCR purificado a cada tubo que contiene la mezcla maestra de secuenciación.

El volumen final es de 10 µl.


Tabla 13. Protocolo cíclico para la secuenciación de los loci HLA

Comentarios

Desnaturalización inicial:

10 s 96 °C Desnaturalización inicial de la plantilla de ADN.

Ciclo en 3 pasos:

Desnaturalización 10 s 96 °C


Extensión 2 min 60 °C



6. Coloque los tubos de inmediato en un termociclador e inicie el programa de ciclos como se indica en la Tabla 13.

7. Una vez que la reacción de secuenciación haya finalizado, proceda con “Protocolo 4: Limpieza y Análisis de los Productos de Secuenciación HLA”, página 33.


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Protocolo 4: Limpieza y Análisis de los Productos de Secuenciación de HLA Este procedimiento utiliza el método de exclusión por tamaño Sephadex para la limpieza de productos de secuenciación HLA. Los productos de secuenciación se purifican en una columna de Sephadex para eliminar los cebadores de secuenciación no incorporados y los nucleótidos libres.


� Prepare el Sephadex al menos 3 horas antes de su uso.

� Como alternativa a la limpieza utilizando Sephadex, otros métodos equivalentes de exclusión por tamaño (por ejemplo los Kits Qiagen DyeEx) o la precipitación de etanol de los productos de secuenciación se pueden utilizar.

Procedimiento de Preparación (3 horas antes de su uso)

1. Llene los pocillos del Cargador de Columna de 45 µl con Sephadex G-50.

Elimine cualquier exceso de polvo raspando el resto de Sephadex G-50 con la Espátulo del Cargador de Columna Multipantalla.

2. Coloque una placa filtro Multipantalla-HV al revés en la parte superior del Cargador de Columna de 45 µl lleno y colóquelo boca abajo para que la placa del filtro se llene de Sephadex G-50.

3. Añada 300 µl de agua desionizada a cada pocillo con una pipeta multicanal. Asegúrese de evitar burbujas de aire durante la dosificación.

4. Deje reposar el Sephadex G-50 durante al menos 3 horas a temperatura ambiente cubierto por la tapa.

Asegúrese de que el Sephadex no se seca debido al calor excissive y / o flujo de aire. El Sephadex macerado se puede almacenar durante una semana a 4 °C. Limpie el Cargador de la Columna golpeando ligeramente la placa boca abajo y quite el polvo residual con un trapo seco.

Limpieza de los productos de secuenciación:

5. Ponga la placa filtro Multipantalla-HV, que contiene el Sephadex G-50 macerado, en una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos, colocando el Marco de Alineación de la Centrifugadora Multipantalla en el medio.

6. Decante a 750 g durante 5 minutos.

7. Deseche el agua de la microplaca de fondo redondo de 96 pocillos y guarde la placa para su uso futuro.

8. Reemplace la microplaca de fondo redondo de 96 pocillos y el Marco de Alineación de la Centrifugadora Multipantalla por la placa de Pared Fina 96 x 0,2 ml con Borde Lateral Congeladas EU.

9. Añada 10 µl de agua desionizada a cada producto de la reacción de secuenciación utilizando una pipeta multicanal.

10. Mida la muestra de secuenciación (20 µl) en la placa filtro Multipantalla-HV en el centro del pozo.

11. Decante a 750 g durante 5 minutos.

12. Carga de la UE helado Subskirted de pared delgada placa de 96 x 0,2 ml que contiene las muestras en el termociclador, el calor de las muestras durante 2 min a 95°C y, posteriormente, ponerlos en hielo hasta su embarque en el analizador genético.

13. 13. Carga de la UE helado Subskirted de pared delgada placa de 96 x 0,2 ml que contiene las muestras en el analizador genético y ejecutarlo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Nota: las normas de la matriz se debe ejecutar para el uso por primera vez de BigDye reacciones Terminator. Siga las instrucciones proporcionadas en el BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit o por el fabricante.

Los Kits HLA SBTexcellerator® se han probado con varios polímeros y químicas de secuenciación.

Si la secuencia no es posible el mismo día, sellar las placas con un sello adhesivo y el almacén de la placa a -20°C.

14. Proceso de la recogida de datos de secuencia en bruto con el software de análisis de secuenciación SBTengine® u otro software adecuado HLA.


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Guía de resolución de problemas Esta guía puede ser útil en la solución de cualquier problema que pueda surgir. Para obtener más información, véase también la página de Preguntas Frecuentes en el Centro Técnico de Apoyo QIAGEN: www.qiagen.com / Preguntas frecuentes / FAQList.aspx. Los científicos de QIAGEN servicios técnicos están siempre dispuestos a contestar cualquier pregunta que pueda tener sobre cualquiera de la información y los protocolos en este manual de empleo, las tecnologías de la muestra y del ensayo (por www.qiagen.com visita de la información de contacto).

Comentarios y sugerencias

Poco o ningún producto de PCR

a) La mezcla de Enzima PCR LongRange no se agregó a la mezcla de amplificación o no se mezcló adecuadamente cuando se añade

Repita la amplificación y preste atención a la adición y la mezcla de la Mezcla de Enxima PCR LongRange con la mezcla de amplificación.

b) Las condiciones de ciclos no son óptimas

Cuando se utiliza un termociclador rápido, reduzca la tasa de rampa a 1°C / s.

c) La concentración de ADN no es óptima

Recuantifique el ADN y ajuste a 50 ng / l. Si la concentración de la muestra está por debajo del rango recomendado y el producto de amplificación es poco o nada visible, de la muestra, secuencie la muestra. Se puede lograr una secuenciación y tipificación aceptables.

d) El ADN genómico de mala calidad o degradado

Ejecute ADN genómico en un gel de agarosa al 1% para evaluar la calidad.

El DNA purificado debe tener una relación A260/A280 entre 1,7 y 1,9.

e) Amplificación débil del exón 3 de HLA-DRB4

Use la cantidad recomendada de producto de PCR purificado para la secuenciación, aunque la amplificación del exón 3 es débil. Utilice los 63°C de recocido en lugar de 65°C como se describe en la Tabla 5, página 18. Se deben seguir obteniendo datos de secuenciación aceptables.


Productos de PCR inusuales

a) Dos productos de PCR visibles después de la amplificación de locus HLA-DRB1, HLA-DRB4, o HLA-DQB1

En una muestra heterocigota, pueden aparecer dos bandas para el HLA-DRB1 o productos de PCR HLA-DQB1 debido al polimorfismo de longitud en las regiones intrón del HLA-DRB1 o gen HLA-DQB1.

La amplificación de HLA-DRB4 normalmente da lugar a dos productos de la PCR (véase la figura 1, página 20), a excepción de DRB40301N, que no poseen el exón 2.

b) Los amplicones HLA-DRB1 y HLA DQB1 de muestras diferentes tienen tamaños diferentes

Debido a polimorfismos de longitud en las regiones intrón del HLA-DRB1 o gen HLA-DQB1, los amplicones pueden variar en tamaño en diferentes muestras.

Ruido de fondo excesivo

a) Los productos de PCR no se limpian antes de la secuenciación

Limpie los productos de PCR utilizando el ExoI / SAP método de limpieza antes de usarlos en la reacción de secuenciación.

b) Ninguna o mala limpieza de las reacciones de secuenciación

Asegúrese de limpiar las reacciones de secuenciación usando Protocolo 4: Limpieza y Análisis de los Productos de Secuenciación HLA. Vierta la muestra directamente en el centro de la superficie del lecho de gel. No permita que la mezcla de reacción o la punta de la pipeta contacte con los lados del lecho de gel o los lados de los pocillos de las placas.

c) Intensidad de la señal demasiado alta

Consulte “Fuerza de la señal excesiva” a continuación.

d) Matriz pobre o incorrecta Repita la calibración espectral y reinyecte las muestras.

e) Inyección pobre Reinyecte las muestras.

f) El tiempo de inyección demasiado alto

Reduzca el tiempo de inyección y vuelva a inyectar. Niveles de señal de 100-1500 son óptimas. Las muestras de mala calidad puede tener menor intensidad de las señales, pero aún puede ser analizado y escrito. Algunas muestras pueden tener señales que son más de 1500 y no tendrá fondo en exceso.

g) Los picos pasados o en la parte superior de cada uno

Elegido archivo de movilidad incorrecto. Elija el archivo de movilidad correcto.


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h) La mala calidad de secuencia en una de las secuencias de avance de HLA-DRB1 exón 2

Hay dos cebadores de secuenciación a seguir para el exón 2. Ambos deben utilizarse de forma rutinaria. Primer R3 es específico para la secuenciación de alelos en DR1/2/3/5/6/8/10 grupo. Primer R4 es específico para la secuenciación de alelos presentes en DR4/7/9 grupo. Con muestras de homocigotos, las secuencias se obtendrá de sólo uno de los iniciadores. En las muestras de heterocigotos que poseen dos alelos de un mismo conjunto de grupos (por ejemplo, el grupo de DR1 y el grupo DR6), los datos heterocigotos secuencia es que se espera de la cartilla para los grupos pertinentes, y la otra cartilla generará secuencia de malo o no. El software SBTengine® rechazará esta secuencia de datos en la mayoría de los casos, por lo que no interfiere con el análisis de tipificación.

Señal débil

a) El tiempo de inyección es necesario aumentar

Repita las reacciones de secuenciación aumente el tiempo de inyección.

b) La concentración de producto de PCR muy baja

Aumente la cantidad de producto de PCR en la reacción de secuenciación, y reduzca la cantidad de H20 sin Nucleasa proporcionalmente.

Excesivas gotas de tinte

a) Ninguna o mala limpieza de las reacciones de secuenciación

Asegúrese de realizar la limpieza de las reacciones de secuenciación utilizando el Protocolo 4: Limpieza y Análisis de los Productos de Secuenciación HLA. Pipeta de la muestra directamente en el centro de la superficie del gel-cama. No permita que la mezcla de reacción o la punta de la pipeta para contactar con los lados del gel-cama o los lados de los pocillos de las placas.

b) La reacción de secuenciación es pobre debido a un error en el pipeteo o producto de amplificación débil

Asegúrese de que tanto la amplificación limpia-y la mezcla de la secuencia correcta se agregan y combinado. En el caso de la amplificación débil, confirme la intensidad de la amplificación mediante la ejecución de un gel de agarosa.


Intensidad de la señal excesiva

a) Producto PCR demasiado concentrado

Diluya el producto de PCR con la H2O sin Nucleasa antes de la secuenciación.

b) Exceso de Premezcla de Reacción BDT Ready en la reacción de secuenciación

Reduzca la cantidad de la BDT reacción de premezcla y ajustar la cantidad de la BDT búfer de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

c) El tiempo de inyección es demasiado alto

Reduzca el tiempo de inyección y reinyecte. Niveles de señal de 100-1500 son óptimas. Las muestras de mala calidad puede tener menor intensidad de las señales, pero aún puede ser analizado y tipificado. Algunas muestras pueden tener señales que son más de 1500 y no tendrá fondo en exceso.


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Apéndice A: Control de la Contaminación Es muy importante incluir al menos un control negativo en cada instalación de PCR que carece de ácido nucleico para detectar la plantilla de una posible contaminación.

Precauciones físicas generales

� Separe las áreas de trabajo para la creación de la mezcla de amplificación por PCR y la manipulación del ADN, incluyendo la adición de la plantilla de partida, el análisis de los productos PCR, o la preparación del plásmido. Lo ideal es utilizar las salas separadas.

� Utilice un conjunto separado de pipetas para la mezcla de amplificación por PCR. El uso de boquillas de pipeta con filtros hidrofóbicos es muy recomendable.

� Prepare y congele pequeñas alícuotas de las soluciones de imprimación y mezcla de dNTP. El uso de H2O sin Nucleasa y nueva es muy recomendable.

� En caso de contaminación, los bancos de laboratorio, aparatos, y pipetas pueden ser descontaminados limpiándolos con una dilución 1 / 10 de una solución de lejía comercial.*† Posteriormente, los bancos y las pipetas deben enjuagarse con H2O sin Nucleasa.

Precauciones químicas generales

� Las soluciones PCR también pueden ser descontaminadas con luz UV. Este método es laborioso, sin embargo, su eficacia es difícil de controlar y no puede ser garantizada. Se recomienda almacenar las soluciones en pequeñas alícuotas y el uso de nuevas alícuotas para cada PCR.

� Otro método para evitar la amplificación de ADN contaminante es tratar las mezclas de reacción individuales con DNasa I† o enzimas de restricción† que cortan entre los sitios de unión de los cebadores de amplificación utilizados, antes de añadir la muestra de la plantilla de ADN.

* La mayoría de las soluciones de lejía comercial es de aproximadamente 5,25% de hipoclorito de sodio. El hipoclorito de sodio es un irritante y deben ser manejado con precaución.

† Cuando se trabaja con productos químicos, se ha de utilizar siempre una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección. Para obtener más información, consulte la correspondiente hoja de seguridad (MSDS), disponible en el proveedor de productos.

Información para Pedidos

Los productos de tipificación basada en secuenciación (SBT) de QIAGEN gozan del soporte directo de las filiales de QIAGEN, de su distribuidor local o revendedor de QIAGEN. Póngase en contacto con su distribuidor local de HLA o Servicio de Atención al Cliente de QIAGEN al +49 2103-29-12250.

Contrato de Licencia Limitada

El uso de este producto significa el acuerdo de cualquier comprador o usuario de los Kits HLA SBTexcellerator® con los siguientes términos:

1. 1. Los Kits HLA SBTexcellerator® sólo podrán utilizarse de acuerdo con las Instrucciones de Uso de GenDx SBTexcellerator® y para su uso con los componentes contenidos en el kit solamente. Genome Diagnostics B.V. no concede ninguna licencia en cualquiera de su propiedad intelectual para utilizar o incorporar los componentes cerrados de este kit de cualquiera con los componentes no incluidos en este kit, excepto como se describe en las Instrucciones de Uso de SBTexcellerator GenDx® y los protocolos adicionales disponibles en www.GenDx.com.

2. Con excepción de las licencias expresamente declaradas, Genome Diagnostics B.V. no ofrece ninguna garantía de que este kit y / o de su uso (s) no infringen los derechos de terceros.

3. 3. Este Kit y sus componentes tienen licencia para el uso de una sola vez y no pueden ser reutilizados, reformados, o revendidos.

4. Genome Diagnostics B.V. niega específicamente cualquier otra licencia, expresa o implícita que no sean la expresamente declarada.

5. El comprador y usuario del kit se compromete a no tomar o permitir que otra persona tome las medidas que puedan provocar o facilitar cualquier acto prohibido anteriormente. Genome Diagnostics B.V. puede hacer cumplir las prohibiciones de este Acuerdo de Licencia Limitada en cualquier Tribunal de Justicia, y recuperar todos sus costos de investigación y costas procesales, incluyendo honorarios de abogados, en cualquier acción para hacer cumplir este Acuerdo de Licencia Limitada o cualquiera de sus derechos de propiedad intelectual relacionados con el Kit y / o sus componentes.

Para los términos de la licencia actualizados, véase www.GenDx.com.

© 2011 Genome Diagnostics B.V., todos los derechos reservados.

Marcas registradas: QIAGEN®, QIAquick®, DyeEx® (QIAGEN Group); ABI PRISM®, BigDye® (Applera Corporation); SBTengine®®, SBTexcellerator®® (Genome Diagnostics).

Los Kits HLA SBTexcellerator® tienen licencia de Genome Diagnostics BV. QIAGEN actúa como distribuidor exclusivo del software SBTengine®.


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Notes


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3840000ES 07/2011 Tecnologías de Muestra y Ensayo

DE Die Gebrauchsanweisungen und Protokollblätter können in deutscher Sprache von der folgenden Website heruntergeladen werden: www.gendx.com/handbooks. Wenn Sie diese Website nicht erreichen können, senden wir Ihnen gerne die einschlägige Übersetzung per E-Mail, Fax oder Post zu. Kontaktieren Sie bitte Genome Diagnostics B.V. unter der Telefonnummer +31 302 523 799.

EN The english instructions for use and protocol sheets can be downloaded at the following web site: www.gendx.com/handbooks. If you do not have access to this web site, we will gladly send you the relevant translation by e-mail, fax, or post. Please contact Genome Diagnostics B.V. at the telephone number +31 302 523 799.

ES Puede descargarse las instrucciones de uso y las hojas de protocolo en español en la siguiente página web: www.gendx.com/handbooks. Si no tiene acceso a este sitio web, será un placer enviarle la traducción pertinente por correo electrónico, fax, o correo postal. Póngase en contacto con Genome Diagnostics B.V. en el número de teléfono +31 302 523 799.

FR Les guides d'utilisation en français ainsi que les fiches de protocole, peuvent être téléchargés sur le site Web suivant : www.gendx.com/handbooks. Si vous n'avez pas accès à ce site web, nous vous enverrons volontiers la traduction appropriée par e-mail, fax ou courrier. Veuillez contacter Genome Diagnostics BV au numéro de téléphone +31 302 523 799.

IT Le istruzioni di utilizzo e i protocolli in italiano possono essere scaricati dal sito Web: www.gendx.com/handbooks. Se non è possibile accedere al sito, potremo inviare la relativa traduzione per e-mail, fax o posta. Contattare Genome Diagnostics BV al numero di telefono +31 302 523 799.

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