¿Que debo saber del Antibiograma?

Interpretación práctica

Principales fenotipos de resistencia

Dr. Freddy Roach Poblete

Médico Microbiólogo y Parasitólogo

clínico

Laboratorio clínico

Hospital Regional de Antofagasta.

En 1929, el médico y bacteriólogo escocés, Alexander Fleming descubre la penicilina.

¿De que vamos a Hablar?

1. Las Bacterias

Cronología de la vida en el planeta

Cuando apareció la resistencia

Genética Bacteriana

2. El Antibiograma

CIM

CBM

Técnicas de estudio de sensibilidad

Métodos fenotípicos

Métodos bioquímicos

Métodos genéticos

3. Lectura interpretada del antibiograma

Resistencia intrínseca

Lectura interpretada para Gram (+)

Lectura interpretada para Gram (-)

Dr. John Rudge de la Universidad de Cambridge en el año 2010

redujo la antigüedad de la tierra a 4.480 millones de años.

Las bacterias aparecieron hace unos 3.800 millones de años.

Homo sapiens, se originó hace alrededor de 150.000 años.

Anton van Leeuwenhoek en 1683, observó la 1ra bacteria.

La capacidad que tienen las bacterias de

generar resistencia a los antibióticos se

remonta a hace más de 30.000 años.

La resistencia a los antibióticos es una

propiedad natural existente en los genes de las

bacterias que precede al uso clínico de los

antibióticos.

El Resistoma:

Las bacterias del suelo y las que causan

enfermedad en los humanos intercambian

rápidamente genes con resistencia a múltiples

medicamentos.

Las Bacterias¿Cuando apareció la resistencia a los antibióticos?

La arsfenamina

Fue el primer fármaco que curó una enfermedad infecciosa.

Comercializado bajo la marca de Salvarsán en 1910 y denominado

la bala mágica.

Sintetizado por el bacteriólogo alemán Paul Ehrlich.

Era antibiótica Un evento reciente de aproximadamente 100 años

La mayoría de mecanismos de resistencia están mediados

por elementos genéticos móviles:

integrones, transposones, plásmidos.

Estos pueden transportar uno o varios genes de resistencia.

¡Hey chico! ¿Quieres ser una superbacteria? Clávate esto a tu genoma.Ni la Vancomicina te hará daño…!!!

Cromosoma bacteriano Toda la información genética de la bacteria

está contenida en una única molécula de ADN de doble cadena y

circular.

Plásmidos ADN extracromosómico, también circular y cerrado.

Se replican de forma autónoma y no se integran al cromosoma

bacteriano.

Genoma bacteriano: conjunto de elementos genéticos autorreplicativos que tiene una bacteria:

1. Cromosoma2. Plásmidos3. Genes "saltarines"

Genes "saltarines" de las bacterias

Los transposones (Tn): son segmentos de ADN capaces de

“saltar” desde una posición a otra en el genoma. Pueden

transponerse desde el cromosoma a un plásmido o viceversa.

Genética bacteriana

¿QUE ES EL ANTIBIOGRAMA?

Es un método fenotípico de estudio microbiológico realizado en el laboratorio.

Consiste en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferentes concentraciones de antibiótico.

La interpretación de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes.

Se traduce como factor predictivo de la eficacia clínica.

Al realizar el antibiograma se pueden obtener :

1. Resultados cualitativos que indican si la bacteria es

sensible o resistente a un antibiótico.

2. Cuantitativos que determinan la concentración mínima de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano en µg/ ml

o en mg/l (CMI) .

¿QUE ES EL ANTIBIOGRAMA? (2)

Es la concentración más baja de un antibiótico capaz de

inhibir el crecimiento del 99,9% de una determinada

población bacteriana.

La CMI es diferente para cada especie bacteriana y cada

antimicrobiano.

Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser

determinadas mediante métodos de microdilución en

caldo o por difusión tiras de Etest.

Utilizando un inóculo estandarizado de una bacteria.

Se prueba un antibiótico mediante concentraciones

decrecientes, generalmente diluciones doble seriadas.

Los agentes antimicrobianos se preparan en

"soluciones madre" concentradas y luego se diluyen

en caldo hasta obtener las concentraciones

apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como

control negativo de crecimiento.

Luego de la incubación adecuada, se observa la turbidez (desarrollo bacteriano).

La CIM corresponde al 1er tubo que

no presenta turbidez.

Si se hace un traspaso a una placa de Agar, todavía habrá desarrollo bacteriano y por lo tanto están inhibidas y no muertas.

CIM

CBM:

Es la mínima concentración del

agente antibacteriano que

permite sobrevivir a < de 0,1 %

de la población bacteriana.

Es el primer inóculo que, al

traspasarlo demuestra que ya no

crecen bacterias.

Habitualmente, las cifras de CIM

y de CBM son muy cercanas,

rara vez más allá del doble. CBM

El estudio de la sensibilidad in vitro de las bacterias a los

antimicrobianos se realiza mediante:

1. Métodos fenotípicos (antibiograma):

Por dilución

- Método por dilución en caldo

- Método por dilución en Agar

Por difusión

- Método de Kirby-Bauer (Disco placa)

- Método Epsilon test

2. Métodos bioquímicos

3. Métodos genéticos.

Las técnicas de dilución

proporcionan resultados

cuantitativos (concentración mínima

inhibitoria)

Las de difusión cualitativos

(sensible, intermedio, resistente).

Ambos métodos son comparables ya

que hay una correlación directa

entre el diámetro del halo de

inhibición y la CMI.SensibleResistente

Son la base de casi todos los métodos utilizados en la

actualidad.

Este método determina la CMI utilizando un medio de dilución

en caldo para las diferentes concentraciones del

antimicrobiano.

Estos novedosos métodos utilizan sistemas de

microdilución en medio líquido sobre microplacas con

pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en

los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador

(mediciones por turbidez o fluorescencia)

Sistema automatizado Vitek 2

En el caso de los sistemas más sencillos, la lectura la

realiza el tecnólogo médico o microbiólogo, a través de

un visor invertido de espejo.

Las técnicas de difusión emplean discos de papel

impregnados con una solución estandarizada para cada

tipo de antibiótico, que se disponen sobre la superficie

de un medio sólido previamente sembrado con una

suspensión bacteriana.

Tras un período de incubación, se observa el diámetro

de halos formados alrededor de los discos.

El tamaño de los halos esta en relación con el grado de

sensibilidad del microorganismo.

Al medir los halos puede establecerse una correlación

con los valores de CMI.

Halos pequeños se relacionan con valores altos de CMI

(resistentes) y halos grandes con CMI bajas (sensibles).

Método fenotípico por difusiónMétodo de Kirby-Bauer

Es una técnica por difusión, permite la

determinación directa del valor de la CMI.

Utiliza tiras de plástico impregnadas con un

antibiótico en concentraciones decrecientes.

Al contacto de la tira con el agar, el

antibiótico difunde e impide el crecimiento

del microorganismo.

Después de la incubación se observa una

zona de inhibición en forma de elipse: el

valor de la CMI es el punto de intersección

de la elipse con la tira y está indicado en la

escala impresa sobre la superficie de la tira.

Consisten en la determinación del mecanismo

bioquímico de resistencia.

.

Detección de b-lactamasa con discos impregnados con una

cefalosporina cromogénica que cambia de color cuando se hidroliza.

Utilizado para la detección rápida de la resistencia a ampicilinaen Haemophilus spp. Neisseria spp. y Moraxella spp.

Técnica de aglutinación con látex

Partículas sensibilizadas con anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la PBP2a responsable de la resistencia a cloxacilina enStaphylococcus aureus.

Los métodos genéticos detectan genes de resistencia, generalmente

mediante técnicas de PCR, como en el caso del gen mecA que

codifica la producción de la PBP2a.

Ya obtenida la CIM o el diámetro de inhibición, se

clasifica al microorganismo frente cada antibiotico

según puntos de corte como S, I o R

Los puntos de corte se establecen basados en

propiedades microbiológicas, farmacocinéticas y de

eficacia clínica,

El factor más importante para definir las categorías es

la concentración que alcanza un antibiótico en el

plasma.

La interpretación de los resultados del antibiograma se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités, como: a. Clinical and Laboratory Standards Institute en Estados

Unidos (CLSI)

b. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testingen Europa (EUCAST)

¿Quien establece los puntos de corte para el antibiograma?

La Lectura del Antibiograma, es un proceso que

consiste en el reconocimiento de los fenotipos

bacterianos y de la interpretación de los

resultados obtenidos del antibiograma para guiar

al clínico en la elección del mejor tratamiento

individual.

NO confundir, categorización clínica (Sensible,

Intermedio o Resistente) o los valores de CIM,

con una lectura interpretada del antibiograma.

Su objetivo es evitar el posible fracaso

terapéutico

De su aplicación se obtienen conclusiones

como:

Favorece la adecuación del tratamiento.

Predicción del éxito terapéutico.

Condiciona la modificación de las categorías

clínicas y la deducción de los valores de

sensibilidad de antimicrobianos no incluidos

en el antibiograma

Vigilancia y detección de nuevos mecanismos

de resistencia.

Definición y control de las políticas de

antimicrobianos.

Sin interpretación

del antibiograma

Adaptado de: Lectura interpretada del antibiograma y su integración en el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. Rafael Cantón Moreno, Hospital Ramón y Cajal. Vol. 20. Núm. 04. abril 2002.

El resultado terapéutico depende de muchas variables, como

enfermedad subyacente, condición clínica del huésped, las

propiedades farmacológicas del agente antimicrobiano, el sitio de la

infección, etc.

Los microbiólogos sólo pueden recomendar agentes terapéuticos

sobre la base de sus actividades in vitro.

El clínico debe tomar la decisión final, teniendo en cuenta su

conocimiento sobre todos los factores pertinentes.

Debiendo elegir entonces el agente apropiado :

El más activo contra el patógeno.

El menos tóxico para el huésped.

Con las características farmacológicas apropiadas.

Más económico.

Un requisito esencial para poder realizar una adecuada

lectura interpretada es conocer la identidad del

microorganismo, tanto el género como la especie.

De esta manera podemos identificcar el fenotipo de

sensibilidad correspondiente.

Hay bacterias que siempre son resistentes a determinados

antibióticos y otras que siempre son sensibles.

La desviación de estos patrones indica un fenotipo raro o

imposible.

Patrón de comportamiento de los microorganismos, individualizado por

género o especie, frente a cada grupo de antibióticos.

Se clasifican en habituales, raros e imposibles.

Fenotipos habituales son los aislamientos con mecanismos de

resistencia epidemiológicamente normales ( Ej. BLEE).

Fenotipo raros: mecanismos de resistencia poco frecuentes ( Ej. KPC ).

Fenotipos imposibles: No responden a

mecanismos de resistencia conocidos

y suelen representar problemas técnicos

del ATB.

¿QUE SON LOS FENOTIPOS DE SENSIBILIDAD O RESISTENCIA?

Es aquella que se desarrolla en forma natural en ausencia

de mecanismo de presión de selección antimicrobiana (no

hay exposición previa a antibióticos).

La resistencia intrínseca es por tanto especie o género

específica y delinea el espectro de actividad del

antibiótico.

ALGUNAS RESITENCIAS INTRINSECAS

Lectura interpretada del antibiogramaCocos grampositivos

Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R

Adquisición de ADN exógeno codificantede una PBP de baja afinidad porbetalactámicos, denominada PBP2a ycodificada por el gen mecA.

Resistencia homogénea (alto nivel) oheterogénea.

R a todos los betalactámicos.

Oxacilina y Cefoxitina se usan comomarcadores de mecA.

Este mismo criterio se aplicará en el casode STACN.

Lectura interpretada del antibiogramaStaphylococcus aureus

resistente a meticilina (SARM, MRSA)

Staphylococcus aureus

resistente a meticilina (SARM, MRSA)

Penicilina R

Ampicilina R

Oxacilina S

Cefoxitina S

Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R

Staphylococcus aureus

Sensible V/S resistente a meticilina

Antibiotico E. faecalis E. faecium

Oxacilina Resistente Resistente

TMT/SMX Resistente Resistente

Cefalosporinas Resistente Resistente

Ertapenem Resistente Resistente

Aminoglucósidos De bajo nivel De bajo nivel

Quinupristina//dalfopristina Resistente Sensible

Clindamicina Resistente Sensible

• Los enterococos adquieren resistencia de alto niveles

de betalactámicos por:

Mecanismo E. faecalis E. faecium Frecuencia

Producción de

Betalactamasa

+++ +/-

Modificación de

la PBP5

+ +++ ++

modificación de la PBP5

Enterococcus spp. resistente a vancomicina

• Resistencia heterogénea que presenta 6 fenotipos: VanA,

VanB, Van D, VanG, VanE y VanL.

• VanA es el más frecuente.

• Clúster de genes en transposón Tn 1546, que posee

genes codificantes de enzimas modificadoras de la afinidad

del péptidoglicano por la vancomicina.

Genotipo vanA

Es el único que presenta alto nivel de resistencia a vancomicina y teicoplanina

E. faecium con fenotipo vanA, se asocia también a resistencia de alto nivel a aminoglucósidos y betalactámicos.

Fenotipo vanA

Teicoplanina R

Vancomicina R

Enterococcus spp. resistente a vancomicina

Genotipo vanA, vanB

Genotipo VanB

Presenta resistencia inducible a vancomicina (CMI 16-64 mg/l) y sensibilidad a teicoplanina.

Enterococcus spp. resistente a vancomicina

Fenotipo vanB

Vancomicina R

Teicoplanina S

E. faecalis,

E. faecium

Fenotipo vanA

Vancomicina R

Teicoplanina R

E. faecalis,

E. faecium

Alto nivel de resistencia.

Cepa control

Vancomicina s

Teicoplanina s

Fenotipo vanC

Vancomicina R

Teicoplanina R

E. gallinarum,

E. casseliflavus.

Bajo nivel de resistencia

Lectura interpretada del antibiogramaBacilos gramnegativos

Proteus: presenta disminución de la sensibilidad a Imipenem debido a alteración de las porinas.

SHV

Fenotipos de resistencia cromosómica Intrínseca

AmpC

Las clasificaciones más utilizadas son las de Ambler y la de Bush-Jacoby-Medeiros.

AmblerCuatro clases de β-lactamasas en función de sus secuenciasaminoacídicas (estructura molecular).

Bush-Jacoby-MedeirosSepara las β-lactamasas en función de su perfil hidrolítico y lainhibición de su actividad (ácido clavulánico, EDTA, aztreonam).

Distingue cuatro categorías y múltiples subgrupos

CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS

CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS

Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.)

Betalactamasas (clase A / 2be)

Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio

espectro (BLEE).

• Enzimas de clase A (Ambler) y grupo

2be (Bush, Jacoby y Medeiros).

• TEM, SHV, CTX-M son las más

habituales.

• 1ª descrita en Alemania (1983) en

Klebsiella ozaenae.

• Los genes que los codifican se

encuentran en Plásmidos facilitando su

diseminación.

• Presentan co-resistencia con

quinolonas, aminoglucósidos,

cotrimoxazol.

• Son capaces de hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y monobactamas.

• No afectan las cefamicinas o carbapenems.

• Son inhibidas por el ácido clavulánico.

• Se informará todas las cefalosporinas resistentes (excepto cefoxitina)

• Fármacos de elección: carbapenems (infecciones graves), asociaciones con

inhibidores de las betalactamasas, si S.

• Para ITU: fosfomicina, amoxicilina/ácido clavulánico.

AMP AMC TIC PRL P-TZ CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN

R

>128

S

8/4

R

>128

R

>128

R

>128

R

>128

R

>128

S

4

0,12

S

(R)

32 I

(R)

8 S

(R)

4 S

(R)

S

0,12

S

0,03

Betalactamasas (clase A / 2be)

Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio espectro (BLEE).

La doble difusión con discos: de cefotaxima y ceftazidima de 30 μg y AM/CL a una distancia de 20-30mm. Se ve la sinergia de sensibilidad y si aumentan los halos más de 5mm con AM/CL es BLEE. Positivo

Prueba confirmatoria para BLEE

BLEE Positivo BLEE negativo

Betalactamasas

(clase C / 1)

Hiperproductor de AmpC.

Resistencia a

amoxicilina/clavulánico

y sensibilidad disminuida a

cefalosporinas:

• Son Serin-Betalactamasa• Pertenecen al grupo 1 de la clasificación de Bush.

• La producción de AmpC puede ser constitutiva o inducible, • Los niveles de producción dependen del grado de expresión del gen

blaAmpC.

• Cuando el gen blaAmpC se expresa de forma constitutiva puede

hacerlo a niveles basales bajos, confiriendo un fenotipo de resistencia salvaje.

• Hiperexpresión de blaAmpC por mutaciones en el atenuador y/o

promotor de blaAmpC,

AMP AMC CAR TIC PRL P-

TZ

CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN

R

>128

R

32/16

R

>128

R

>128

R

>128

I

32/4

R

>128

R

>128

R

64

R

32

I

16S

0,5

R

32

S

0,12

S

0,06

Betalactamasas (clase C)

Hiperproductor de AmpC.Resistencia a amoxicilina/clavulánico y sensibilidad disminuida a cefalosporinas:

• R a amino y acilureidopenicilinas, amoxi-clavulánico,

• R cefas de 1ª , 2ª y 3ra generación, cefoxitina

• R aztreonam.

• Sensible a cefepima y carbapenems.

• Las cefalosporinas de cuarta generación no se ven afectadas.

• P/TZ suele ser Intermedia ya que la piperacilina se hidroliza menos por el

AmpC .

1. AmpC cromosómicas

Enterobacter spp

C. freundii, Serratia spp

Providencia spp

Morganella spp.

2. AmpC plasmídicas :

E. Coli

Klebsiella spp.

Betalactamasas (clase C)

Tipos de AmpC

• Desde punto de vista clínico la alternativa más razonable es usar Cefepima.

• En caso de infecciones grave, podría considerarse el uso de carbapenémicos.

• En el caso de sensibilidad a Cefalosporinas de 3ra G, se aconseja informar la posibilidad de que se produzca un fracaso terapéutico, por la selección de mutantes AmpCdesreprimidos estables, particularmente con Enterobacterspp. y C. freundii.

• Piperacilina/Tazobactam variable, se informará según CMI.

Hiperproductor de AmpC.Tratamiento

AMP

AMC

TIC PRL

P-TZ

CZ CXM

FOX CAZ CTX FEP AZT

IMP MEN

R S R I S I/R S S S S S S S S TEM-1

R R R R R R I S S S s S S S TEM-1

Hiper

R R R R R S S S S S S S S S IRT

R I R R I S S S S S S(R) S S S OXA-1

R R R R I R R R R I

(R)S R S S AmpC

Hiper

R S R R S R R S S (R)

I (R) S(R) S(R)

S S BLEE

Las bacterias presentan múltiples mecanismos de resistencia, los

cuales recién estamos comenzando a conocer y entender.

Muchas de estas resistencias están presentes en los genes de las

bacterias desde antes de la era antibiótica.

No debe validarse el resultado de un antibiograma, sin realizar

previamente una lectura interpretada de este.

Actualmente existen métodos automatizados, que no reemplazan al

tecnólogo o microbiólogo que realiza el la lectura interpretada del

ATB.

Para interpretar correctamente el Antibiograma, debemos conocer

los fenotipos y las resistencias naturales de las bacterias.

BIBLIOGRAFÍA

• Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards forantimicrobial susceptibility testing;. M100-S19. Wayne, PA: CLSI; 2014.

• European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST): Expertrules in antimicrobial susceptibility testing, 2014.

Disponible en: http:// www.srga.org/eucastwt/MICTAB/index.html

• Cantón R. Lectura interpretada del antibiograma: ¿ejercicio intelectual o necesidadclínica? Enferm Infecc Microbiol Clin. 2002;20:176-85.

• ATLAS DEL ANTIBIOGRAMA, Juan Ignacio Alós, Rafael Cantón, Luis Martínez, JordiVila. Biomérieux.

• GUÍA TERAPÉUTICA ANTIMICROBIANA, J. Mensa, J. m. Gatell, J. E. García, E.Letang. E López, F. Marco.

Editorial Antares Barcelona 2013.

• Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.)

• LECTURA INTERPRETADA DEL ANTIBIOGRAMA, capitulo 4, Carmen torres.

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2002:20(7):354-64.