INTRODUCCIONEl gnero Enterococcus pertenece a un grupo de microorganismos conocido como las bacteriascidas lcticas (BAL). Los enterococos son cocos Gram-positivos, no esporulados, catalasa yoxidasa negativos, anaerobios facultativos que se presentan individualmente, en pares, o encadenas. Desde un punto de vista taxonmico, el gneroEnterococcus ha sido revisado varias veces. Ellos pertenecieron, clsicamente, a los Streptococcus grupo D de Lancefield; sin embargo, a mediados de la dcada de 1980 fueron oficialmente clasificados en su propio gnero.Son ubicuos yestn normalmente presentes en el tracto digestivo de humanos y animales. Este grupo seconstituyen como el ms polmico dentro de las BAL. Diversos estudiosmicrobiolgicos han demostrado que ellos juegan un papel importante en la maduracin de algunasvariedades de quesos tradicionales elaborados con leche cruda o pasteurizada y producida enzonas y pases mediterrneos.Los enterococos son causantes de problemas en las industrias de procesamiento de vegetales, fbricas de alcohol y mayormente se investigan en alimentos sometidos a procesamientos trmicos como enlatados, embutidos, alimentos lcteos (leche en polvo) en utensilios industriales y caseros. El estudio de enterococos tambin est orientado a su deteccin en aguas sobre todo a agua de consumo humano o agua de mesa.Adems de su reconocida capacidad para adquirir resistencia a antibiticos. Los enterococos desarrollan, gracias al intercambio de informacin gentica por conjugacin, caractersticas que aumentan su virulencia. Dentro de estas caractersticas se puede mencionar: la adherencia a tejidos del husped, la invasin y formacin de abscesos, la modulacin de la respuesta inflamatoria, la secrecin de productos txicos y la sntesis de enzimas hidrolticas.

OBJETIVOS Aplicar la tcnica correspondiente para el aislamiento de Enterococcus. Identificacin del gnero Enterococcus a partir de leche deshidratada. Realizar la numeracin de Enterococcus de la muestra puesta en prctica.

MARCO TERICOLosEnterococcusson clulas esfricas u ovoides, de tamao 0,6-2,0 0,6-2,5 m. Son cocos grampositivos, no formadores de endosporas. Se presentan en forma de pares o de cadenas cortas. Son no mtiles, con excepcin de las especiesE. gallinarumyE. casseliflavus. Son anaerobios facultativos, quimiorganotrofos, con metabolismo fermentativo. Fermentan un amplio rango de carbohidratos con produccin principalmente de L (+)- cido lctico, pero no de gas, y producen un pH final de 4,2-4,6. Presentan requerimientos nutricionales complejos. Son catalasa negativos o, ms comnmente, dbilmente positivos. Crecen usualmente en un caldo de cultivo a 10 C y 45 C, aunque el crecimiento ptimo es a 37 C. Pueden crecer a pH 9,6, con 6,5 % de NaCl y con 40 % de bilis. Usualmente fermentan la lactosa. Portan el antgeno D del grupo Lancefield y poseen el carbohidrato C. Sobreviven despus del calentamiento a 60 C durante 30 min.Todas las especies deEnterococcusson capaces de crecer en presencia de 40 % de bilis y de hidrolizar la esculina, al igual queStreptococcusdel grupo D, pero se diferencian de estos ltimos porque muestran una respuesta positiva a la prueba de PYR (L-pirrolindonil -naltil-amida).Todas las cepas producen leucino-aminopeptidasa (LAP), por lo que son positivas a esta prueba.Las colonias en los medios agarizados, generalmente, se presentan incoloras a grises, que tienen de 2-3 mm de dimetro a los 2 das de incubacin.Enterococcuspueden presentar hemlisis de tipoa, o pueden ser no hemolticos.Una misma cepa puede variar en sus propiedades hemolticas en dependencia del animal del cual provenga la sangre empleada en el medio de cultivo.La capacidad deEnterococcuspara crecer en un caldo que contenga 6,5 % de cloruro de sodio, su poder de sobrevivencia despus del calentamiento a 60 C durante 30 min y su habilidad para crecer en un caldo de cultivo a 10 C y a 45 C, son pruebas de caracterizacin muy tiles para la diferenciacin deEnterococcusdeStreptococcus.Enterococcuspueden diseminarse por transmisin fecal-oral, por contacto con fluidos de personas infectadas o por contacto con superficies contaminadas.

Enfermedades provocadas por Enterococcus

Las especies del gnero Enterococcus constituyen un serio peligro para la salud, pues se han convertido en un patgeno nosocomial de primer orden y de importancia creciente. Pueden provocar enfermedades muy graves como la bacteriemia y la endocarditis. Tambin son causantes de infecciones de heridas quirrgicas, septicemia, abscesos intraabdominales y plvicos, infecciones de piel, tejidos blandos, neonatales y peditricas. La mayora de las infecciones son originadas de la microbiota endgena, aunque pueden ser transmitida de persona a persona o por consumo de agua o alimentos contaminados.Las infecciones urinarias son la que con ms frecuencia producen estos microorganismos. La naturaleza de su interaccin con el tejido uroepitelial es bastante compleja, involucrando adhesinas de superficie de naturaleza proteica y polisacrida. La tasa de incidencia de estas infecciones aumenta drsticamente, pudiendo llegar a ser responsables del 16 % de estas, y aunque no es habitual, son la fuente ms comn de bacteriemia.La bacteriemia debida a Enterococcus ocurre primariamente en pacientes que han sido hospitalizados por perodos prolongados. Las enfermedades malignas, la cateterizacin uretral, los dispositivos intravasculares, las cirugas recientes, las quemaduras y la terapia antimicrobiana previa, son condiciones asociadas con las bacteriemias. Tambin influyen la hiperalimentacin, la colonizacin previa del tracto gastrointestinal con Enterococcusvancomincina resistentes (EVR), el uso de vancomicina y de antianaerbicos. La incidencia anual de bacteriemias nosocomiales provocadas por Enterococcus es de 1 o 2 episodios por cada 1 000 pacientes hospitalizados.Dentro de los pacientes con un riesgo particular de bacteriemia causada por EVR, estn aquellos que reciben hemodilisis y los receptores de corticoesteroides, de agentes antineoplsicos o con nutricin parenteral. Otros factores de riesgo son la gravedad de la enfermedad, la forma de administracin antibacteriana, la neutropenia y la mucositis. Enterococcus en aguas y alimentosLas aguas y los alimentos contaminados con microorganismos constituyen un vehculo de transmisin de enfermedades infecciosas; por otra parte, el desarrollo microbiano destruye grandes cantidades de alimentos, causando problemas econmicos y una considerable prdida de importantes nutrientes.El control de la calidad sanitaria de los recursos del ambiente se lleva a cabo mediante la enumeracin de bacterias o grupos de ellas indicadoras de contaminacin fecal. La enumeracin de estas bacterias es utilizada para valorar la calidad sanitaria de alimentos, sedimentos y aguas destinadas al consumo humano, la agricultura, la industria y la recreacin. No existe un indicador universal, por lo que se debe seleccionar el ms apropiado para la situacin especfica en estudio. Dentro del rango de los indicadores se encuentra el grupo de bacterias coliformes, E. coli, colifagos, Bifidobacteriumsp., Clostridiumperfringens y el grupo estreptococos fecales. Estos microorganismos se encuentran formando parte de la microbiota del tracto gastrointestinal del hombre y de los animales de sangre caliente; son excretados en sus heces, de ah que su presencia en el ambiente indica contaminacin de origen fecal y el riesgo de aparicin de grmenes patgenos.Enterococcus se encuentran dentro del grupo de microorganismos indicadores de la inocuidad de los alimentos, pues por su amplia distribucin pueden encontrarse en estos productos, especialmente en los de origen animal. Suelen considerarse buenos indicadores porque mueren ms lentamente que los coliformes, debido a que son muy resistentes a condiciones adversas como congelacin, desecacin y como resultado sobreviven ms que stos.La presencia de E. faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar contaminacin de origen fecal. E. faecalisssp. faecalis es considerado como un indicador de contaminacin fecal de fuentes humanas, mientras que E. faecium y otras especies indican contaminacin de otras fuentes.Los productos de consumo pueden contener Enterococcus procedentes de una contaminacin fecal directa o indirecta. En los productos semiconservados, procesados por calor pero no estriles, Enterococcus, junto con microorganismos esporulados, son con frecuencia los nicos microorganismos sobrevivientes. Los productos mantenidos en el rango de temperatura entre 10-45 C pueden contener cifras muy altas de estos microorganismos.El anlisis de Enterococcus es interesante cuando se analizan muestras de aguas, ya que E. bovis y E. equinus, son indicadores de contaminacin por animales de sangre caliente no humana y, adems, son las especies que ms rpidamente mueren en el medio exterior; por eso, cuando se detectan, indican una contaminacin reciente por animales de granja; tambin en alimentos tienen su importancia, especialmente en industrias que procesan carne y productos de granja.El anlisis de Enterococcus se realiza cuando se trata de aguas de bebida de calidad dudosa como son las muestras de pozos, es decir, aguas subterrneas o para aguas de recreacin.La Organizacin Mundial de la Salud discute la ineficacia de coliformes fecales como indicador de polucin fecal y debate los mritos de indicadores alternativos, como Enterococcus o clostridiossulfito reductores.Para su anlisis se emplea la tcnica de nmero ms probable (NMP), usando el medio EVA (etil violeta azida) o mtodos de siembra en placa, empleando el medio KF-Streptococcus. La azida sdica y el cristal violeta, se utilizan frecuentemente para el cultivo de estos microorganismos.Es de vital importancia que el agua para uso recreativo tambin posea una buena calidad. Diversos estudios de aguas marinas y playas indican que las enfermedades de las mucosas, de la piel y digestivas, asociadas con los baistas, estn directamente relacionadas con contaminacin fecal. Enterococcus es considerado el indicador bacteriolgico ms eficiente para evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo, debido a que es altamente resistente a las condiciones salinas de este medio y adems est relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras.La Organizacin Mundial de la Salud defini los criterios de clasificacin de las playas de acuerdo con los niveles de Enterococcus presentes en el agua. Estos son los siguientes:

Tambin es necesario realizar el control sanitario de las piscinas para garantizar la calidad adecuada del agua y prevenir o minimizar riesgos a la salud pblica por enfermedades gastrointestinales, de la piel y otras, ocasionadas por ingestin, contacto e inhalacin de microorganismos patgenos a travs de estas aguas. La vigilancia sanitaria se basa en los parmetros bacteriolgicos y fisicoqumicos que determinan la calidad del agua, as como en sus condiciones sanitarias de operacin y mantenimiento. Estas deben estar ausentes de organismos indicadores de contaminacin fecal y de patgenos como Escherichiacoli o coliformes fecales, Staphylococcusaureus, Enterococcus, Cryptosporidiumsp., Giardialamblia, ameba de vida libre, Vibrio cholerae.Por lo general, los procedimientos empleados en aguas consisten en el enriquecimiento en medio lquido de acuerdo con el mtodo del nmero ms probable y la tcnica de filtracin por membrana. En el primero se ha determinado que los medios que contienen azida de sodio producen los mejores resultados; en cuanto al segundo, ms de 70 medios han sido propuestos para la determinacin de estreptococos fecales por dicha tcnica.Los medios selectivos usualmente estn constituidos por un agente como la azida de sodio, un antibitico, con frecuencia gentamicina o kanamicina, o sales biliares y un indicador que puede ser esculina o tetrazolium. La incubacin a temperaturas elevadas (42-45 C) tiene tambin un efecto selectivo para algunos Enterococcus.El mtodo de tubos mltiples utilizado para la determinacin de Enterococcus en muestras de agua de mar consta de una prueba presuntiva en la cual se utiliza el medio caldo azida dextrosa y de una etapa confirmativa con el medio agar PSE selectivo para Enterococcus. La presencia de turbiedad en el caldo dextrosa azida al transcurrir de 24 a 48 horas de incubacin, indica la presencia de Enterococcus de forma presuntiva. El desarrollo de colonias caf negruzcas con halos color caf en el agar PSE despus de 24 horas de incubacin, confirman la presencia de estreptococos fecales. Estas colonias pueden ser transferidas a tubos con caldo infusin cerebro corazn que contengan 6,5 % de NaCl. La presencia de crecimiento en este medio, despus de incubar a 45 C, confirma que son Enterococcus.La relativa resistencia de Enterococcus a condiciones adversas como temperaturas extremas, pH y salinidad elevados, es ventajosa cuando se determina la historia sanitaria de alimentos moderadamente calentados, congelados, salados u otro alimento o bebida en los cuales los coliformes pueden no haber sobrevivido. Sin embargo, debido a la habilidad de Enterococcus para crecer en ambientes lejanos de la fuente original de contaminacin fecal, se recomienda precaucin y discrecin en atribuirle una significacin al nmero y tipo de Enterococcus y estreptococos fecales presentes en los alimentos.La Organizacin Mundial de la Salud plantea que los estreptococos fecales son considerados de gran valor para medir la eficiencia de los tratamientos del agua potable, para los controles corrientes despus de la insercin de nuevos conductos, o cuando se reparan los sistemas de distribucin.

Se han establecido diferentes parmetros en cuanto a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano. Estos parmetros son los siguientes:

Para las aguas comercializadas en botellas u otros recipientes se aplican los valores siguientes:

MATERIALESMaterial Biolgicos:

Leche deshidratada. Agua de acequia

Materiales De Laboratorio

Medios de cultivo:

Agar Azida Cristal Violeta de Packer en sangre. Agar Enterocococon TrifenilTetrazoliumy acetato de talio 1% Agar triptosatrifeniltetrazolium acetato de talio Caldo EVA Caldo triptosa sorbitol Caldo triptosaNaCl 6.5% Cladotriptosa pH 9.6

Diluyente: agua destilada, agua peptonada 1% o SSFe.

Placas Petri

Pipetas de 1 y 10 ml

Frascos de vidrio

Tubos de dilucin.

Gradillas

Estufa

Mecheros, algodn, alcohol.

PROCEDIMIENTOA. Alimentos ( leche deshidratada)1. Diluciones sucesivas:Pesar 3 gr. de muestra y diluirlos en 27 ml. de SSF esteril (10-1). Realizar las diluciones 10-2 y 10-3.

2. Mtodo presuntivo:-Realizar siembra en profundidad en Agar Azida Cristal Violeta de Packer, dos placas por cada dilucin.

Homogenizar.

Incubar a 35.37C por 48 horas. Observar colonias pequeas de color violeta.

3. Mtodo confirmativo Sembrar en Agar Glucosa TripticasaAzida o Agar TTC.4. IdentificacinRealizar Tincin de Gram y las siguientes pruebas: Catalasa Fermentacin de Sorbitol Crecimiento a 45C Tolerancia a 65C/30B. Agua (agua de mar)-NMP1. Mtodo presuntivo: Sembrar alcuotas de 10 ml, 1 ml y 0.1 ml en una serie de 3 tubos con Caldo Glucosa Azida y Caldo simple.

Incubar a 37C por 24 horas. Observar turbidez.

2. Mtodo confirmativo: Sembrar una azada de los tubos positivos en Agar Enterococcus. Incubar a 37C por 24 horas. Observar sedimento rojo ladrillo y turbidez.3. IdentificacinRealizar Tincin de Gram y las siguientes pruebas: Catalasa Fermentacin de Sorbitol Crecimiento a 45C Tolerancia a 65C/30RESULTADOSMuestra: Leche deshidratada

No creci ningn microorganismo.

Muestra: Agua de la desembocadura del Dren

Serie de tubos positivos: 3-3-3NMP:1 100 UFC/ml

Tincin Gram

Catalasa

NEGATIVO Fermentacin de Sorbitol

POSITIVO Crecimiento a 45CPOSITIVO Tolerancia a 65C/30POSITIVO

I. CONCLUSIONES Se logr determinar la existencia de Enterococcus en la muestra de leche en polvo. De la muestra de agua se pudo aislar Enterococcusfaecalis, y por el mtodo del NMP se determin la presencia de 1100 UFC/ml

II. REFERENCIAS Pascual M. y V. Caldern. 2000. Microbiologa Alimentaria: metodologa analtica para alimentos y bebidas. Editorial Daz de Santos. Segunda edicin. Madrid-Espaa. James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa. Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2001. Lima-Per.