Introducción de resistencia genética a Tobamovirus en ... · Introducción de resistencia...

Introducción de resistencia genética a

Tobamovirus en variedades locales de ‘Pimiento

de Gernika’ y ‘Guindilla de Ibarra’.

Avance resultados 2016

Larregla S, Elorrieta J, Abaunza L, Juaristi B,

Aragonés A, Ruiz de Galarreta JI, Ortíz-Barredo A

OBJETIVOS GENERALES. PROYECTO TOBAMOVIRUS. PARTICIPANTES

1. Incidencia de Tobamovirus y determinación de patotipos en las

comarcas vascas de cultivo de la Guindilla de Ibarra y Pimiento de

Gernika.

2. Introducir genes de resistencia mediante sucesivos

retrocruzamientos. Fijar genes de resistencia para obtener dos nuevas

variedades de Guindilla de Ibarra y Pimiento de Gernika.

3. Obtener pimientos resistentes que, a su vez, presenten

características fenotípicas deseadas de la Guindilla de Ibarra y el

Pimiento de Gernika.

4. Elaboración y difusión entre los productores de protocolo de pautas

de manejo que minimicen el riesgo de transmisión y que aumente

durabilidad de la resistencia a largo plazo.

Proyecto a largo plazo (7 generaciones entre parentales y variedad ).

Introducción genes de resistencia

Recuperación características morfológicas

G0: Parentales

G1: PseudoF1

G2: RC1

G3: RC2

G4: RC3

G4: RC4

G5: Autofecundación 1

G6: Autofecundación 2 = Variedad resistente

Ciclo 1

Ciclo 2

Ciclo 3

Ciclo 4

Ciclo 5

Ciclo 6

Ciclo 7

Año 2015

Año 2016

Año 2017

Año 2022*

* 1 ciclo/año

Obtención de híbridos con

genes de resistencia

Recuperación

características

morfológicas

Fijación genes

resistencia

OBJETIVOS -TAREAS 2016.

1. Encontrar marcadores moleculares para seleccionar plantas resistentes

(Genotipado). Objetivo metodológico.

2. Comprobar resistencia mediante inoculación de plantas con el virus

(Fenotipado). Objetivo metodológico.

6. Comprobar si gen L4 en homocigosis puede dar problemas de

androesterilidad y mal cuajado de frutos. Cruzamientos en campo para obtener

PseudoF2 (1ªautofecundación de plantas resistentes de PseudoF1).

Inoculación virus para comprobar resistencia.

3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1).

4. Genotipado con marcadores moleculares para seleccionar plantas

resistentes de 2ª generación (RC1).

5. Comprobar resistencia mediante inoculación del virus en 2ª generación

(RC1).

7. Solicitud proyecto GO liderado por GILBE en el que intervienen GILBE-

BIHOEL-NEIKER y participan SSVV y HAZI.


1. Encontrar marcadores moleculares para gen L3 (resistencia a patotipo

12 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 8 y funcionan 2

País: Korea, Estudio: Tomita et al. (2008) Theor Appl Genet 117:1107-1118

A339(NK)

AFLP → SCAR

A339(YB)

AFLP → SCAR

IH1-04(NK & YB)

RGA, SCAR

189D23M(NB)

BAC-end, SCAR

189D23M(YB)

BAC-end, SCAR

253A1R(YB)

BAC-end, SCAR

YB2A25(NK & YB)

AFLP → SCAR

YB2A19(NK)

AFLP → SCAR



12 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 8 y funcionan 2

YB2A25(NK & YB) Marcador SCAR (Theor Appl Genet (2008) 117:1107-1118)

Derio X VR(L3)

Proporción esperada:50%Resi-50%Sensi

Plantas con marcador=31/69=45%

Ibarroria X VR(L3)

Proporción esperada: 50%Resi-50%Sensi


Controles negativos: Derio, Ibarroria. Controles positivos: VR(L3)



123 del PMMoV). Objetivo metodológico. Se prueban 4 y funciona 1

País: Korea, Estudios: Kim et al. (2008) Mol. Cells 25:205-210

087H3T7HRM

SNP

087H3T7

SNP

158K24HRM

SNP

L4SC340

Yang et al. (2009) Mol. Breeding 24: 433

AFLP → SCAR




L4SC340. Marcador SCAR (Mol. Cells (2008) 25:205-210)

Derio X VR(L4)

Proporción esperada:50%Resi-50%Sensi


Ibarroria X VR(L4)

Proporción esperada: 50%Resi-50%Sensi


Controles negativos: Derio, Ibarroria. Controles positivos: VR(L4)




Marcadores SNP 087H3T7HRM, 087H3T7, 158K24HRM (Mol. Breeding

(2009) 24: 433)

Marcadores SNP 087H3T7HRM, 087H3T7, 158K24HRM codominantes para gen L4.

Cultivares: D=Derio; I=Ibarroria; P=VR(L3); G=VR(L4); K=VR2(L3); M=VR3(L3).


2. Comprobar resistencia mediante inoculación de plantas con el virus

(Fenotipado). Puesta a punto de la técnica. Objetivo metodológico.

A) Preparación inóculo del virus PMMoV

B) Inoculación mecánica virus PMMoV. Invernadero seguridad P2


3. Cruzamientos en campo para obtener 2ª generación (RC1). Obtención

de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Cultivo 2016 para Retrocruzamiento1 (RC1). Plantas seleccionadas (20)

64 7463 72

16 62 7161 IPP2.F2 6660 5159 47

15 58 46 IBARRORIA X PALERMO (L3)57 IPP2.F1 4556 4055 39

14 54 3153 IPP1.F3 3052 1351 12 Transplante 22-03-16

13 50 6 (se desconoce si marcador L3)

49 IPP1.F1 2 (se encuentra presente)

48 7 Transplante 15-04-16

47 5 (se conoce si marcador L3)

12 46 2 (se encuentra presente)

45 DPP5.F1 144 7843 66

11 42 68 DERIO X PALERMO (L3)41 DPP10.F2 6240 4739 46

10 38 4837 IBARRORIA DPP10.F1 4136 3435 25

9 34 2433 DPP9.F4 3332 9131 IBARRORIA DERIO 90

8 30 8729 IGP1.F10 8228 7727 70

7 26 64 IBARRORIA X GIULIO (L4)25 IGP1.F9 6224 5623 49

6 22 42 Transplante 09-02-16

21 IGP1.F8 41 (resistentes con marcador L4)

20 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 3719 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 31

5 18 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 2417 X IGP1.F10 87 X DGP22.F2 94 IGP1.F7 2216 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 9715 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 94

4 14 X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 9113 DERIO X IGP1.F9 70 X DGP22.F2 81 DGP22.F2 8112 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 7611 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 72

3 10 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 66 DERIO X GIULIO (L4)9 X IGP1.F8 42 X DGP19.F9 72 DGP19.F9 658 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 577 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 51

2 6 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 505 X IGP1.F7 31 X DGP19.F7 50 DGP19.F7 424 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 113 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 9

1 2 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 61 X IGP1.F7 22 X DGP16.F6 1 DGP16.F6 1

Planta FILA 1 FILA 2 FILA 3 FILA 4

Saco culivo COMPARTIMENTO 2 MULTI PLACA RÍGIDA ENTRADA PseudoF1 resistentes plantas

nºmax / = = 44 / 5 = 8

nº = 5 por programa (cv-gen) = 5 lineas (cv.-gen)

Consigna calefacción: 12ºC(18-8h) a 18ºC (8-18h)

Consigna ventana: 18ºC (20-8h) a 20ºC (8-20h)

Hidropónico sustrato coco

Riegos 4-5 min (3-4/día)

CE=1.5, pH=5.5



de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Plantas escogidas como polinizadoras para Retrocruzamiento1 2016

PseudoF1_Derio X VR(L4) PseudoF1_Derio X VR(L3)

PseudoF1_Ibarroria X VR(L4) PseudoF1_Ibarroria X VR(L3)



de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4.

PseudoF1_Derio X VR(L4) PseudoF1_Derio X VR(L3)

PseudoF1_Ibarroria X VR(L4) PseudoF1_Ibarroria X VR(L3)

Plantas PseudoF1 escogidas como polinizadoras para Retrocruzamiento1



de 20 líneas: 5 GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4. Semilla de Retrocruzamiento1 (RC1) 2016 (180 frutos-11389 semillas)

CRUCE Planta Fruto Nº SemillasF. PolinizaciónF. Recolección Días polin-recolec

nº plantas

repicadas

nº pl

genotipado

nº pl

inoculación

Derio x Giulio 1 1 112 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20

Derio x Giulio 2 1 228 29/07/2016 26/09/2016 59 40 20 20

Derio x Giulio 3 1 210 10/08/2016 10/10/2016 61 40 20 20

Derio x Giulio 4 1 172 05/08/2016 26/09/2016 52 40 20 20

Derio x Giulio 5 1 224 10/08/2016 10/10/2016 61 40 20 20

Derio x Palermo 1 1 144 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20

Derio x Palermo 2 1 191 28/07/2016 20/09/2016 54 40 20 20

Derio x Palermo 3 1 108 29/07/2016 20/09/2016 53 40 20 20

Derio x Palermo 4 1 136 10/08/2016 10/10/2016 61 33 16 17

Derio x Palermo 5 2 191 09/08/2016 10/10/2016 62 40 20 20

Ibarroria x Giulio 1 1 71 05/08/2016 20/09/2016 46 40 20 20





Ibarroria x Palermo 1 1 74 28/07/2016 20/09/2016 54 40 20 20





Derio x VR(L4)

Derio x VR(L3)

Ibarroria x VR(L4)

Ibarroria x VR(L3)


4.Genotipado con marcadores moleculares para seleccionar plantas

resistentes de 2ª generación (RC1). Mantenimiento de 20 líneas (5

GernikaL3, 5 GuindillaL3, 5 GernikaL4, 5 GuindillaL4).

Semillero plantas de Retrocruzamiento1 (RC1) Noviembre 2016 (20 líneas)

DP1 IG1 DG1 IP1

RC1. 20 LÍNEAS

Gernika (L3): DP1-DP5

Guindilla (L3): IP1-IP5

Gernika (L4): DG1-DG5

Guindilla (L4): IG1-IG5


5. Comprobar resistencia mediante inoculación del virus en 2ª generación

(RC1). 20 líneas x 20 pl/línea: patotipo 1-2 (5 GernikaL3, 5 GuindillaL3) y

patotipo123 (5 GernikaL4, 5 GuindillaL4)

C) Inoculación mecánica virus PMMoV. Valoración síntomas 4-7 semanas

1) Planta sensible 2) Planta resistente 3) Escape inoculación

Mosaico

Deformación

Necrosis

Enanismo

Sin síntomas Sin síntomas

Ho

jas

NO

ino

cu

lda

s

Ho

jas

ino

cu

lda

s

Sín síntomas Puntos necróticos

Necrosis nervios

Abscisión

Sin síntomas

Respuesta Hipersensibilidad Infección sistémica


6. Comprobar si gen L4 en homocigosis dá problemas de androesterilidad

y mal cuajado de frutos. Obtención PseudoF2 (1ªautofecundación de

plantas resistentes de PseudoF1). Inoculación virus para comprobar

resistencia en 10 líneas: (DG1-DG5, IG1-IG5). ¿Se puede obtener variedad

fijada con resistencia a patotipo 123 o hay que obtener híbrido cada año?

1. PseudoF2 Semillero Ago-2016

(10 líneas: DG1-DG5, IG1-IG5) 2. Plantas PseudoF2 Inoculación

Sep-2016 (10 líneas x 40 pl/línea)

3. Plantas PseudoF2 sín síntomas

(10 líneas x 5 pl/línea) Nov-2016 Junio 2017→ Obtener PseudoF3

(2ªautofecundación de plantas

resistentes de PseudoF2).

Máximo 30 líneas a comprobar

resistencia


7. Solicitud proyecto GO liderado por GILBE en el que intervienen GILBE-

BIHOEL-NEIKER y participan SSVV y HAZI. Junio 2016

Denegado en noviembre 2016.

Grupo de trabajo que se planteaba para realizar tareas adicionales como:

Protocolo manejo medidas higiene a consensuar por participantes.

Entrega de semilla del material vegetal de mejora obtenido para

evaluar su resistencia en campo en ensayos en fincas piloto de

agricultores afectados por Tobamovirus.

Desarrollo, validación y transferencia de técnica de análisis simultáneo

a múltiples virus en pimiento (polisonda 15 virus).

SOLICITANTES PARTICIPANTES

Conclusiones

Se han puesto a punto marcadores moleculares para los dos genes de

resistencia a introducir (L3 para patotipo 1-2 y L4 para patotipo 1-2-3).

Esto ha permitido seleccionar plantas resistentes en la primera generación

de híbridos obtenida (PseudoF1) y comenzar en la segunda (RC1).

En la Pseudo F1 se han seleccionado 20 líneas. Por cada uno de los 4

cruzamientos se han obtenido 5 líneas considerando la morfología del

fruto mas parecida a los parentales de interés (cv. Derio y cv. Ibarroria).

Se ha comenzado la puesta a punto metodológica de inoculación de los

dos patotipos de Tobamovirus (1-2 y 1-2-3) para comprobar la

expresión de resistencia en las plantas genotipadas como resistentes.

Se ha comenzado a comprobar si el gen L4 en homocigosis puede causar

problemas de androesterilidad y posterior mal cuajado de frutos en la

PseudoF3 (10 líneas, Gernika: DG1-DG5, Guindilla: IG1-IG5). Esto

permitirá determinar si se podrían obtener variedades fijadas con

resistencia al patotipo 1-2-3 o habría que obtener híbridos cada año.

MILA ESKER ZUEN ARRETAGATIK!

¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!

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