Jorge Quintana Aguilar

CITOGENTICA MOLECULAR

El ao 1977 marca el inicio de la era de la citogentica molecular. Los avancesen este campo de la citogentica son impresionantes.

Con este tipo de estudio se puede lograr identificar defectos submicroscpicosdel ADN y disminuir la brecha que existe entre la deteccin de una simple inser-cin o delecin de un nucletido, la insercin o delecin de varios de ellos y laobservacin de estos defectos a nivel de la citogentica convencional.

La importancia extrema de estos avances tcnicos motiv la realizacin de estecaptulo en el que se exponen las caractersticas y fundamentos que combinaninstrumentos moleculares a partir del ADN recombinante y la citogentica.

TCNICAS DE HIBRIDACIN in situ

La tecnologa de "hibridacin in situ" (HIS) combina las tcnicas de citogenticasconvencionales con tcnicas moleculares y est basada en la deteccin de secuenciasespecficas de cidos nucleicos, bien sea en cromosomas aislados o clulas interfsicas.Fue descrita originalmente por Pardue y Gall, John y cols., en 1969 utilizando istoposradiactivos para marcar las sondas, las cuales, combinadas con tcnicas de autoradiografaposibilitaron la deteccin de las secuencias hibridadas.

En 1977, Rudkin y Stollar describieron un mtodo inmunocitoqumico basado en lautilizacin de anticuerpos anti ADN anti ARN marcados con sustancias fluorescentesdetectables microscpicamente. Este procedimiento se conoce como tcnica de"hibiridacin in situ fluorescente" (FISH) o "hibiridacin no isotpica".

Actualmente existen dos mtodos de FISH, llamados directos e indirectos.Los mtodos directos permiten realizar la visualizacin microscpica de la seal inme-

diatamente despus de realizada la HIS. El marcaje directo emplea nucletidos marca-dos con sustancias fluorescentes.

Los mtodos indirectos se basan en la utilizacin de sondas unidas a molculas talescomo la biotina o digoxigenina marcadas con una sustancia fluorescente que permite su

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visualizacin al microscopio con luz ultravioleta. Estos mtodos se pueden combinar contcnicas inmunocitoqumicas basadas en reacciones antgeno - anticuerpo para aumentar

la intensidad de las seales fluorescentes.

La Biotina 11 - dUTP y la digoxigenina 11 - dUTP son dos ejemplos de bases anlogasque pueden ser incorporadas al ADN en lugar de dTTP.

La biotina (vitamina H) tiene la ventaja de poseer una gran afinidad por las protenasavidina y estreptoavidina, dando lugar a uniones casi irreversibles.

La digoxigenina es un derivado de la digitoxina procedente de la Digitalis purprea yD. lanata que resulta altamente eficiente en reacciones antigeno anticuerpo en clulas.

Existe una amplia variedad de sondas disponibles comercialmente. Otra alternativapara la obtencin de sondas se basa en la amplificacin del ADN en vectores y su marcaposterior por medio de la tcnica conocida como "nick translation".

Mediante la FISH pueden detectarse diferentes tipos de secuencias en el genomahumano, de acuerdo con las sondas utilizadas. Algunas de ellas se citan a continuacin.

. Sondas de secuencias nicas o copia simple: se utilizan para la deteccin de se-cuencias especficas en regiones subtelomricas y otros sitios tiles para la identi-ficacin de alteraciones submicroscpicas, como por ejemplo, 15q11-q13.

. Sondas centromricas: se basa en la utilizacin de sondas a satlites que permitenla deteccin de secuencias altamente repetitivas localizadas en regiones pericen-tromricas. Una desventaja de estas sondas es la hibridacin cruzada entre regio-nes homlogas de diferentes cromosomas, por ejemplo entre los cromosomas13/21 y 14/22.

. Sondas de secuencias para regiones especficas: se basa en la deteccin de se-cuencias altamente repetitivas localizadas en determinadas regiones de loscromosomas, como por ejemplo, la regin Yq12.

. Sondas para el pintado de cromosomas completos (WCP): detectan secuencias deeucromatina en determinados brazos o cromosomas completos.

MTODOS DE HIBRIDACIN in situ

La metodologa general utilizada para la FISH sobre ADN descrita por Pinkel y cols.,en 1986, se basa en los principios siguientes.

. Preparacin de lminas y extensiones.

. Pretratamiento del material extendido.76

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. Desnaturalizacin del ADN.

. Hibridacin.

. Lavados post hibridacin.

. Marca de la sonda.

. Observacin al microscopio.

A continuacin se describen los aspectos bsicos esenciales de los protocolos delaboratorio, en relacin con la hibridacin in situ ADN - ADN. Para ello se requiere depreparaciones de clulas, cromosomas, o ambos, de ptima calidad.

Preparacin de lminas y extensiones: se recomienda la limpieza de lminasportaobjetos con alcohol ter (1:1) y realizar fijacin de las extensiones.

Pretratamiento del material extendido: Se utiliza la ARNasa para eliminar el ARNendgeno. El HCl permite la extraccin de protenas e hidrlisis parcial del ADN - blan-co. Las proteasas provocan la digestin de la cubierta protenica del ADN - blanco mejo-rando la accesibilidad de la sonda.

Desnaturalizacin del ADN: en caso de que se utilicen sondas de doble hlice esnecesario realizar la desnaturalizacin del ADN - sonda y el ADN - blanco. Ladesnaturalizacin se realiza mediante pH extremadamente alcalino o por calor.

Hibridacin: mltiples factores influyen sobre la hibridacin. La velocidad de hibri-dacin aumenta proporcionalmente con la concentracin del ADN. Adems, la cantidadde hbridos obtenidos ser mayor cuanto ms largo sea el tiempo de hibridacin. Por otraparte, el dextrn sulfato es importante tambin porque al hidratarse facilita obtener unamayor concentracin relativa de la sonda.

Lavados post hibridacin: los lavados astringentes permiten eliminar el llamado "ruidode fondo" (HIS no especfica) mediante la utilizacin de soluciones salinas poco concen-tradas a altas temperaturas.

Marca: se pueden realizar diferentes tipos de marcas mediante sistemas que utilizanprincipalmente la biotina digoxigenina. Las sondas de ADN marcadas con biotina puedendetectarse por la va de la avidina la cual es una glicoprotena unida a la fluorescena-isotiocianato (FITC) que es la sustancia fluorescente. La avidina tiene 4 sitios de unin conla biotina, lo cual resulta en un complejo muy estable. Para aumentar la seal fluorescentese puede realizar la amplificacin con un anticuerpo anti-avidina (obtenido de cabras) el queposteriormente se pone en contacto nuevamente con avidina marcada con FITC.

Observacin al microscopio: la observacin al microscopio requiere de una fuentede luz ultravioleta y de un sistema de filtros adecuados de acuerdo con las longitudes deonda de las seales fluorescentes. Adems, se utilizan programas automatizados, loscuales permiten realizar el anlisis utilizando diferentes colores simultneamente (FISHmulticolor), as como tambin mediante anlisis de la intensidad de las seales fluorescentes(Figuras 7.1 y 7.2).

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Figura 7.1. FISH sobre clulas en interfase utilizando sonda centromrica para cromosomas X (Oncor).Obsrvese el marcaje de 2 cromosomas X.

Figura 7.2. FISH sobre clulas en interfase y cromosomas utilizando sonda centromrica para cromosomas18 (Oncor) en un caso de trisoma 18.

Otros procedimientos, tales como el cariotipo espectral (SKY), la microdiseccin ypintado reverso de cromosomas, la hibridacin genmica comparativa (CGH) se desa-rrollan actualmente principalmente en el campo de las investigaciones

Las tcnicas de citogentica molecular se han aplicado a los estudios de cartografagentica y de expresin gnica.

RESUMEN79

Ms que sintetizar los aspectos tratados mencionar la utilidad de la tecnologa decitogentica molecular en el diagnstico de las enfermedades genticas:

- Anlisis de clulas interfsicas. Permite realizar marcas fluorescentes en clulasinterfsicas sin necesidad de realizar cultivos para la obtencin de cromosomas locual posibilita realizar diagnsticos prenatales rpidos de las aneuploidas mscomunes.

- Diagnstico de alteraciones submicroscpicas tales como los sndromes demicrodeleciones o por defectos de genes contiguos.

- Anlisis de marcadores cromosmicos de origen desconocido. Los estudiosmoleculares resultan particularmente tiles para precisar el origen y composicindel material gentico en estos casos.

- Reordenamientos complejos en casos de clulas tumorales y hemopatas malig-nas. Cuando se presentan translocaciones complejas que involucran a ms de doscromosomas pueden detectarse con precisin los sitios de roturas e intercambiosdel material gentico.