NúcleoRE rugoso

Síntesis Proteínas

Vesícula de transporte

REliso

Complejo de Golgi

Lado CIS

Lado TRANS

Vesícula secreción

Exocitosis (proteínas,mensajeros químicos…)

Endocitosis

Endosoma

Lisosoma

Introducción a las membranas biológicas

Compartimentación celular

Mantenimiento composición específica

Flujo energético celular

Reconocimiento celular

Transducción de señales

Movilidad celular

La correcta funcionalidad de las mbs

depende de la función coordinada del

componente lipídico y proteíco

Funciones Membranas Biológicas

Introducción teórica - Metodología y Experimentación Bioquímicas IV (Curso 2004/2005)

Potencial deMembrana-50/-70 mV

Citosol [K+] = 140 mM[Na+]= 12 mM

Espacio extracelular:[K+] = 4 mM[Na+]= 145 mM

Cadena respiratoria de transporte electrónico mitocondrial

Espaciointermb

NADH + H+succinato

fumarato½ O2 + 2 H+

H2ONAD+

Excitabilidad celular y compartimentación

Modelos de membrana

Movilidad de los lípidos de mb

Movimiento translocación,“flip-flop”

Movimiento dedifusión lateral Flipasas, facilitan la translocación

Son movimientos lentos (poco probable)

Módelo de mosaico fluido,(Singer & Nicholson, 1972)

Oligosacárido deglicoprot

Glicolípido

Cabezas polaresde PLs

Prot integral(1TM)

Proteínas integrales(nTM)

Protperiférica

Zonahidrofóbica

Ch

Prot periféricaunión covalentemente

Ch PLs SFLsProteínas de membrana monotópicas y politópicas

Estructura general de los ≠ lipidos de mb

Asimetría de membrana

Monocapainterna

Monocapaexterna

PEPCSMPSPI

PI 4-PPI 4,5-bP

PA

0100 100

% de distribución en mbplasmática

Com

posi

ción %

to

tal en

mb

Mb plasmática

Mb Mitocondrial interna

Mb Mitocondrial externa

Mb lisosomal

Mb nuclear

Mb RE rugoso

Mb RE liso

Mb Golgi

0 100

Existe además distribución asimétrica composición lipídicaen ≠ mbs celulares

Ch, ↓ % en mbs orgánulosCL, en mb mitoc intPIs, imp en función pero minoritarios

Ca2+

ScramblasaAminofosfolípidotranlocasa

Flipasa

PS, PE

SM, PC

Sistemas enzimáticos implicados en el mantenimiento de asimetría de membrana

Debido a que es energeticamentedesfavorable que se expongan dominios hidrofóbicos de las proteínas a un entorno polar, los lípidos de membrana se adaptan localmente al espesor de estas zonas de interacción Lipido-Proteína

Las MBs Biológicas NO son uniformes:

Existen dominios de membrana. Esta segregación puede venir condicionada por la composición lipídica y también por proteínas de mb. Ej. Muestra los dominios en mbmodelo formada por dilaurilPC (estado fluido, desordenado; en verde) y dipalmitoil PC (estado gelordenado; en rojo)

caveolaraft

Glicoesfingolípido

Esfingomielina

Colesterol

Fosfolípidos

Caveolina

caveolaraft

Glicoesfingolípido

Esfingomielina

Colesterol

Fosfolípidos

Caveolina

Rafts y Caveolas

La monocapa externa de mb rica en SM y Ch, crea una barrera de permeabilidad pero permite difusión lateral

Raft, dominio lipídico de mb rico en SM/Ch monocapa externa y Ch en monocapa internaConcentran proteínas ancladas vía GPI y proteínas de señalización (GTPasas, PKsaciladas…). La existencia de caveolina-1 define las caveolas

Fosfatidilcolina

Zona polar(hidrofílica)

Zona apolar(hidrofóbica)

Los PL son moléculas anfipáticas:

Esfingomielina

Constituyentes y aspectos estructurales

Interioracuoso

Vesícula lipídica(Liposoma)

PL

Micela

LisoPL

Monocapa

∆G’o < 0PL, forma geométrica

cilindrica

Bicapa

∅ 25 nm ∅ 2,5 µm

Lamelaridad: Multilamelares (MLV)Oligolamelares (OLV)Unilamelares (ULV)

Tamaño: pequeñas (SUV) (diámetro <100 nm)grandes (LUV) (diámetro > 100 nm)

AG saturadoej. Palmítico, C16:0

AG insaturadoej. Oléico, C18:1 (∆9)Cabeza polar

GliceroPL:

-O-CH2-CH2-N+(CH3)3

Grupo polar (X) puede ser:

Colina → PC

-O-CH2-CH2-NH3+Etanolamina → PE

-O-CH2-CH-NH3+

C00-

Serina → PS

Fosfatidil-DAG → CL Inositol-4,5-bisP → PI

# Como veremos durante la parte práctica de la asignatura esta estructura confiere a cada PL carga neta específica a pH fisiológico que influyen en su comportamiento.

Estructura de Lípidos

Nomenclatura

LisoPLPL nombre genérico; especificar AG posición 1 y 2 AG 18:n (número de atomos de C: número de insaturaciones)si existen varias estas ocurren normalmente cada 3C debido al mecanismo biosintético

AGsaturados

Mezcla de AG saturadose insaturados

Grupo carboxilo(polar)

Cadena alifática(apolar)

Estructura de los AG

Nomenclatura de los átomos de C de un AG

Por el tipo de ruta biosintética los AGs en general están formados por número par de atomos de C.Estas insaturaciones pueden tener conformación cis o trans

Mayor grado de insaturación menor punto de fusiónMayor longitud mayor punto de fusión (Aceites vs grasas)

Conformaciónej. cis ∆9

# Predicción estructural de una bicapa di(C18:1)PC. Se indica la probabilidad de encontrar los distintos elementos estructurales en la zona hidrofóbica y acuosa.

Estas propiedades son claves en funcionamiento de mbs. La ≠ tendencia a formar un tipo de

estructuras u otras será esencial en procesos de fusión de mbs, transporte vesicular, endo- y

exocitosis etc

Forma del Lípido OrganizaciónEjemplo

CilindroPLs (sin gran repulsión

grupos polares)PC, SM, PS, PI, PG, PA

Bicapa

Conoinvertido

LisoPls,Detergentes

Micela

ConoPLs (↑repulsión grupos polares)

PA-Ca2+,PA y PS pH ácido < 3-4 PE

Fase hexagonalinversa HII

Distintos tipos de estructuras anisotrópicas: A) fase hexagonal normal HI, fase lamelar Lα, fase

hexagonal reversa HII

Interviene de forma activa también el PtdIns(4,5) P2 que atrae las proteína necesarias parael proceso y posteriormente es desfosforilado a PtdIns-4P

La transformación de PA (forma ~ cono) en LPA (forma ~ conoinvertido) por transferencia de AA (C20:4) catalizada por endofilina I (LPA aciltransferasa) – PLA2 favorece la curvatura de membrana y el proceso de endocitosis en vesiculas revestidas de clatrina.

conocono invertido

LPA AA-CoA PA

Por ejemplo:

Procesos de fusión de membranasFactor

desencadenante

Agregación

Semifusión Fusión

Ensayos de mezcla de lípidos y contenidos acuosos

Estructura general deesfingolípido

Descubiertos por J. Thudichum sXIX, lípidos enigmáticos “sphinx”

Ceramida

Esfingomielina

Glucosilcerebrosido

Lactosilceramida

Gangliosido

Fosfocolina

Glucosa

Oligosacárido(di, tri o tetra-)

Oligosacáridocomplejo

Enlace amida

Esfingosina

AG

Protocolo experimental para obtención de liposomas:

““extruder”extruder”

Formación de Formación de liposomasliposomas por extrusiónpor extrusión

No se emplean disolventes orgánicos

Se obtiene una población homogénea de vesículas

Tamaño controlado

Aplicable a una gran variedad de sistemas lipídicos

Temperatura controlada

Altas eficacias de encapsulación

La composición lipídica afecta a las propiedades físicas de las mb:

Longitud y grado de insaturación de AG

Composición en Ch

Composición en SFL

Temperatura de transición de fase

Estudios de calorimetría

Características cabezas polares: impedimentos estéricos, carga …

Fase GelAltamente ordenada, compacta

Gel CristalLíquidoFase Cristal-LíquidoFase menor grado de orden, más fluida, movimientos moleculares, más desordenado

# Efecto del Ch en la transición de fase de bicapas de DPPC

# Efecto de la longitud de los grupos acilo:L, lauril;M, miristoil; P, palmitoil;

S, estearoil; A, araquidonoil

Mezcla de lípidos (sistema NBD-PE/Rh-PE)

Donador: NBD-PEAceptor: Rh-PE

Experimento tipo

nm480 520 560 600 640

IF

0.0

0.4

0.8

NBD-PE NBD/Rh

Ensayos clásicos de interacción en Ensayos clásicos de interacción en liposomasliposomas

1- Agregación de vesículas lipídicas:- Medidas de turbidez (Absorción aparente)- Medidas de Dispersión de luz (light scattering)

2- Mezcla de lípidos:- Medidas de transferencia de energía de resonancia

3- Liberación de contenidos acuosos:- Carboxifluoresceína, ANTS/DPX, etc....

Mezcla de lípidos: otros sistemasMezcla de lípidos: otros sistemas

Sonda fluorescente autoapagada,forma dimérica

Forma monomérica fluorescente

Liberación de contenidos acuosos: ANTS/DPXLiberación de contenidos acuosos: ANTS/DPX

DPX(apagador)

ANTS(fluorescente)

ApagamientoColisional

Fusión

Sondas hidrosolubles

Octadecil-rodamina R-18

Sondas hidrofóbicas

# Existen otros sistemas en los que se emplea una sonda débilmente fluorescente (ej. Tb3+ ) que al encontrarse como consecuencia del proceso de fusión con otro agente (ej. DPA) se produce un

aumento de la emisión de fluorescencia

2-Micelas y detergentes

Vesícula lipídica(Liposoma)

PL

Micela

LisoPL

Monocapa LPL, detergentes:forma cónica

Micela

[Detergente]

[monómero]

[micelas]cmc

Tipos de detergentes y sus aplicaciones

# Con cadena de alquilo y cabeza cargada.En general son fuertemente desnaturalizantes

- Dodecilsulfato (SDS) Aniónico

- Hexadecil trimetilamonio Catiónico

Detergentes iónicos

# Zwiteriónicos o con N-óxido en cabeza polar (detergentes suaves)- CHAPS®

- sulfobetaínas

Detergentes no iónicos

- Serie Triton-X

- Serie Lubrol

- Serie Brij

- Digitonina, interacción con colesterol

- Serie Tween

- Dodecil-β,D-maltósido

- β-D-octilglucósido

Brij 35

Digitonina

Derivados de sales biliares

- Colato (deoxicolato) sódico

Bacteriorrodopsina (1C3W.pdb):resolución 1.55 Å18 cadenas de acilo; 4 esqueletos de glicerol1 escualeno

# Mayor grado de conocimiento de la estructura de proteína de mb si se consigue hacerlo en presencia de los lípidos con los que interaccionan

# Dificultades metodológicas en la purificación de proteínas de mb y en la resolución estructural

Complejo proteína:detergenteComplejo proteína:detergente

# La solubilidad del complejo dependerá del tipo de detergente y la relación [proteína]/[detergente]

Criterios para la elección de detergentes:

Efecto en la actividad/estructura de proteínaCapacidad de solubilización de proteínaCMC

Estructura toroidal en torno a la región hidrofóbica

Dependiendo del tipo de interacción entre prots y mb se pueden separar de ≠ modo:

Prots integrales ⇒ utilización de detergentes

Prots periféricas⇒ ∆pH, fuerza iónica, agentes quelantes o

desnaturalizantes⇒ PLC (prots unidas covalentemente a GPI), esterasas

(prots aciladas)

Los lípidos y la estructura de las proteínas de Los lípidos y la estructura de las proteínas de mbmb

Tipos de estructura 2ª de proteína de mb:

- Héliceshidrofóbicas

248 aa/monómero

zona hidrofóbica

residuos básicos

oligomeriza formando trímeros

7 hélices transmembrana

Ej. Bacteriorrodopsina:

Ct

Nt

Ej. Porina FhuA,canal Fe-ferrocromo de E. coli

- Barril β

Formado por 20 segmentos TMB entorno a un cilindroEstabilizado por fuerzas semejantes a hélice hidrofóbica

Proteínas integrales de mb

Cabeza polar Pls

Grupos fosfato

Ca 2+

Ejemplo de proteína periférica:Unión de Anexina V a mb

Perfiles de hidropatía

- Permite predecir estructura de prots de mbBasados en algoritmos que atribuyen a cada aaen función de su naturaleza un valor indicativo de su probabilidad de estar en entorno hidrofóbico de Mb o en entorno polar- Importante valor parámetro calculado para aaadyacentes- Son necesarios ~7-20 aa para atravesar bicapa(ventana)

Bacteriorrodopsina

Indic

ede

hid

ropat

ía

Hidrofóbico

Hidrofílico

Nº aa

Glicoforina

Indic

ede

hid

ropat

ía

Nº aa

Hidrofóbico

Hidrofílico

3- Modelos Experimentales de

Membrana

A) Interacción Lípido-Proteínaestudios in vitro

1- Preparación de liposomas (MLV

y LUV) y determinación de sus

características

4- Agregación y fusión de

vesículas

2- Influencia parámetros físico-

químicos en la interacción L-P

Introducción a las membranas biológicas

3- Predicción y análisis de la

estructura de proteínas de

membrana

B) Interacción L-P en el contexto celular

1- Regulación de la localización subcelular

de Ras

2- Translocación a dominios preferentes,

influencia de procesos de modificación

covalente y regulación por señales

extracelulares

4- Dominios de interacción Proteína-Lípido

Seminarios sobre trabajos de investigación en el área (alumnos)

Seminarios sobre trabajos de investigación en el área (alumnos)

Papel de los lípidos en señalización celular(mensajeros inter- e intracelulares)