1

INTRODUCCIÓN

Francisco J. Iruegas Buentello

La importancia de la Parasitología en México

y el Mundo:

El Programa Regional de Enfermedades

Parasitarias y Desatendidas creado por la

Organización Panamericana de la Salud (OPS)

son un grupo de enfermedades parasitarias

(filariosis linfática, oncocercosis, helmintiasis

intestinal, esquistosomiosis y leishmaniosis y

otras infecciosas bacterianas) que

generalmente se caracterizan por la inversión

históricamente baja del sector farmacéutico y

que principalmente afectan a los grupos más

desprivilegiadas de la sociedad (Fig. 1).

Fig. 1. La carga de las enfermedades desatendidas en América Latina y el Caribe en comparación con otras enfermedades trasmisibles en millones de casos (OPS, 2010a).

2

La esquistosomiosis (Schistoma mansoni)

todavía afecta por lo menos a ocho países

de Latinoamérica; Brasil lleva la mayor

carga, donde se estima que al menos 2,5

millones de personas están infectadas y 6

millones están en riesgo (OPS, 2010a). La

filariosis linfática (elefantitis o elefantiasis

filárica) afecta a más de medio millón de

personas en Latinoamérica, donde se estima

que en términos mínimos 6–8 millones de

personas están en riesgo, principalmente en

Haití pero también en Guyana, la República

Dominicana y la parte del nordeste del

Brasil. La oncocercosis pone en riesgo a

cerca de medio millón de personas. Lo más

problemático abarca una región extensa de

comunidades remotas en la zona fronteriza

Venezuela-Brasil. La leishmaniosis

constituye un problema creciente en las

zonas rurales y periurbanas en muchos

países de Latinoamérica, con casi 35,000

casos notificados en el Brasil sólo en 2003;

sin embargo, la notificación insuficiente o la

falta de información es común en las zonas

marginales rurales y periurbanas de la

Región donde estas enfermedades

generalmente se encuentran.

La geohelmintiasis y la esquistosomiosis son

problemas de salud pública serios que

afectan principalmente a la población en

edad escolar y mujeres en edad fecunda,

adolescentes y los jóvenes adultos en edad

de trabajar. Para abordar esta carga de

morbilidad, por lo menos 75% de niños en

edad escolar que viven en las áreas de

riesgo para geohelmintos y

esquistosomiosis van a necesitar acceso a la

quimioterapia regular para 2010, donde se

superponen las dos enfermedades, las

normas de la OMS recomiendan el

tratamiento combinado junto con mejor

agua y saneamiento y educación sanitaria

(OPS, 2010b).

La OPS (2010) reporta para México 1.1 casos

humanos de teniasis por cada 100 mil

habitantes teniasis y 0,7 de cisticercosis El

número de defunciones por cisticercosis fue

de 200. El mayor brote de malaria en los

últimos cuatro años lo padeció Oaxaca con

11.349 casos entre 1994-1998. La

oncocercosis tuvo entre 1997 y el 2000 un

total de 1,424 casos notificados, pero en el

2007 se reporta 001 % en el sur de Chiapas

y 0 % en el Norte del mismo estado y en

Oaxaca (WHO, 2009). La leishmaniosis se

presentó fundamentalmente en los estados

de Quintana Roo, Tabasco, Campeche y

Chiapas, con una morbilidad reportada de

1.700 casos en 1999. En cuanto a la

tripanosomosis americana en el 2000 se

encontró que la incidencia fluctuaba entre 1

y 20 casos por 1,000 habitantes. El tamizaje

serológico para la enfermedad de Chagas

reportado por los bancos de sangre del país

fue del 13%.

3

Los helmintos trasmitidos por suelo (HTS)

conocidos comúnmente como gusanos

intestinales son las infecciones más

comunes en el mundo que afectan a las

comunidades más desprotegidas. Los

agentes causales de HTS son Ascaris

lumbricoides, Trichuris trichiura y las

uncinarias. Reportes recientes indican que

A. lumbricoides afecta a 1 billón de

personas, T. trichiura a 795 millones y las

uncinarias (Ancylostoma duodenale and

Necator americanus) parasita a 740

millones. El mayor número de infecciones

por HTS ocurre en África-Sahariana,

América, China y este de Asia (WHO, 2009).

La OMS calcula que 20–30% de todos los

latinoamericanos están infectados por

helmintos intestinales (parásitos

intestinales), mientras que las cifras en los

barrios pobres alcanzan con frecuencia el

50% y hasta el 95% en algunas tribus

indígenas (OPS, 2010b). La prevalencia de

HTS ha sido analizada por la WHO (2009)

del 2002 al 2006. Los reportes indican

rangos de prevalencia en los siguientes

niveles: Argentina 9.0-38.7%; Belice: 43.6-

52.2%; Brasil: 2-36%, Haití: 15-87%;

Honduras: 12.2-97%, México: 0.01-16.3%,

Nicaragua 27-80% y Venezuela: 3-19%. De

ellos, solo Venezuela y México reportan

prevalencias inferiores al 20%. Para otros

países, los rangos oscilan de la siguiente

forma: Bolivia: 4.5-65.4%, Colombia: 10.7-

49.3%, Cuba: 4.5-47.3%, República

Dominicana: 5.3-55.3%; Ecuador: 28.5-71%,

Guatemala: 12.7-68%, Guyana: 12.3-38%,

Perú: 1.8-80.4%, Santa Lucia: 35-45% y

Surinam: 36-43% (Fig. 2, PAHO, 2011).

Por este motivo, en el curso de Parasitología

Clínica de la carrera de Químico

Bacteriólogo Parasitólogo tiene como

objetivo general capacitar al alumno en el

conocimiento de la morfología, fases de

desarrollo, ciclo biológico, medidas

profilácticas y diagnóstico y de las entidades

parasitarias. Es importante destacar que la

migración de las poblaciones humanas de

zonas rurales hacia zonas urbanas o países

4

Fig. 2. Prevalencia de HTS en América Latina y el Caribe (PAHO, 2011)

desarrollados, en busca de un mejoría en su

calidad de vida, cambian el patrón de la

distribución geográfica de las parasitosis

que antes eran casi exclusivas de las zonas

desprotegidas, como ejemplo, la

tripanosomiosis americana, la cual era una

infección primeramente trasmitida por

vectores hematófagos, es actualmente

trasmitida primeramente por transfusión

sanguínea en las áreas urbanas.

5

Bibliografía

Hotez PJ, ME Bottazzi, CF-Paredes, SK Ault,

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the Caribbean: A Review of Disease

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desatendidas. La carga de las

enfermedades desatendidas en

América Latina y el Caribe en

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parasíticas y desatendidas: El

Programa Regional de la

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transmitted helminthes.

http://www.who.int/intestinal_worms

/en/index.html. Acceso el 18 de

marzo, 2010.

6

PRÁCTICA 1

MICROSCOPÍA

L. Galaviz Silva

Introducción

El microscopio es un instrumento que sirve

en el campo diagnóstico e investigación para

detectar microorganismos que no es posible

ver a simple vista y para el estudio

morfológico de protozoarios y helmintos.

Estos constan de tres sistemas elementales,

que son el sistema mecánico, óptico y de

iluminación. Desde los modelos más

antiguos, hasta los equipos más modernos,

podemos encontrar estos tres sistemas. De

hecho, el conocimiento de las células y

organismos microscópicos es paralelo al

desarrollo del microscopio. El primero en

utilizar la palabra microscopium fue Atanasio

Kircher (1601-1680). No se sabe con certeza

cuando se descubrieron las propiedades de

los cristales curvos para modificar los haces

de luz y formar o amplificar imágenes. Las

evidencias indican que desde el siglo XIII, en

Italia, ya se usaban estas propiedades de los

cristales, pero fue hasta 1665 cuando se

describe su aplicación en el estudio de la

célula, aplicándose inicialmente en una

rebanada de corcho por Robert Hooke.

Siguiendo a estas observaciones, otros

personajes de la misma época, utilizaron el

mismo tipo de instrumentos para describir

protozoarios, células vegetales y tejidos

animales (Gama, 2007).

En 1830, al desarrollar una óptica más

adecuada se constató que todos los tejidos,

animales y vegetales, estaban constituidos

por células y que el embrión de las plantas se

derivaban de una célula única. Esta primera

aplicación, más formal, fue llevada por

Matthias Schleiden en 1838. Un año más

tarde, el investigador Theodore Schwann,

colega de Schleiden, publicó uno de los

trabajos más completos sobre las bases

celulares de la vida. Propuso que todos los

tejidos estaban formados por células y que

estas eran la unidad funcional de los

organismos vivos. Schwann, junto con su

colega establecieron la Teoría Celular (Gama,

2010).

El microscopio, a diferencia del

estereoscopio, nos proyecta una imagen

bidimensional e invertida en un doble plano.

De esta manera, la imagen que es

transportada en el haz de luz, al pasar por la

7

lente del objetivo sufre el primer aumento e

inversión (imagen intermedia), y al pasar por

la lente del ocular se invierte en el segundo

plano, siguiendo las leyes de la propagación

rectilínea de la luz (Gu, 2002; Inoué, 2007).

El poder de resolución del microscopio

significa su capacidad para separar dos

puntos que aparentemente son uno solo y es

función de la apertura numérica del objetivo,

del condensador y de la longitud de onda de

la luz. La apertura numérica es también el

aumento útil de las imágenes y el límite de

resolución de las lentes. El aumento útil

significa la cantidad de veces que puede

ampliarse un objeto distinguiendo en él más

detalles que originalmente han escapado de

nuestra vista (resolución), pero finalmente,

cuando llegamos al límite de resolución de la

lente ya no se observarán más detalles del

objeto por más aumentos que se le apliquen.

A esto se le llama amplificación vacía y se

refiere al límite de resolución. La apertura

numérica de las lentes, se refiere al ángulo

de que se forma por el axis óptico de los

rayos de la luz (A) que inciden en el objetivo,

también llamado ángulo de apertura. La

magnitud de este ángulo no está indicada en

grados, sino en el valor del ángulo seno, que

es un valor numérico. Esto explica el origen

del término que es “apertura numérica”.

Esto es el seno de la mitad del ángulo de

apertura multiplicada por el índice de

refracción (n) del medio que llena el espacio

entre el cubreobjetos y la lente (Inoué,

2007).

Donde n es el índice de refracción del medio

que llena el espacio entre el cubreobjetos y

el objetivo. Este oscila entre 1 en el caso del

aire, hasta 1.51 si es aceite de inmersión.

A partir de esta ecuación, es obvio que

cuando el medio es el aire, (n=1), entonces la

apertura numérica depende solamente del

ángulo , cuyo máximo valor es 90°. El sin

del ángulo por lo mismo, tiene un valor

máximo de 1.0 (sen (90°))= 1, el cual es la

apertura numérica máxima de un lente

operando con aire usando objetivos “secos”

(Davidson, 2010).

Analizando la ecuación de apertura

numérica, aparentemente el índice de

refracción es factor limitante, para lograr

aperturas mayores de 1.0. Por eso, para

obtener mayores aperturas numéricas se

debe incrementar el indice de refracción del

medio que llena el frente de la lente del

objetivo y el cubreobjetos. Ahora se han

desarrollado objetivos que permiten medios

alternativos como el agua (n=1.33), glicerina

(n=1.47) y aceite de inmersio´n, (n=1.51). De

acuerdo a la marca del microscopio, varía la

banda de color que identifica el medio de

inmersión recomendado (Kapitza, 1997;

Juskaitis, 2007).

8

Fig. 3. Esquema de la apertura numérica (u´). IR del aire = 1. IR del aceite= 1.515 U´ y u´: Angulo de apertura de los rayos. No en grados, sino en forma de un valor seno, que es un valor numérico = Apertura numérica

Objetivo general

Mostrar al alumno la aplicación de las

técnicas microscópicas en Parasitología, el

uso correcto y el mantenimiento del

microscopio de luz ó microscopio óptico,

debido a que el diagnóstico de certeza de las

parasitosis, se basa en este importante

instrumento.

Objetivos particulares:

1. Dar a conocer al estudiante las técnicas

microscópicas de campo claro, contraste

de fases, campo oscuro, interferencia y

polarización.

2. El estudiante será capaz de esquematizar

estructuras microscópicas y conducir un

estudio morfométrico de los protozoarios

aplicando las medidas de longitud

correspondientes.

3. El estudiante aplicará las normas para el

mantenimiento y cuidado del

microscopio.

Material

1. Microscopio estándar, foto microscopio o

mini cámara digital para el ocular,

microscopio de contraste de fases,

estereoscopio, microscopio invertido,

cámara lúcida o clara, micrómetro ocular.

1. Método para calcular el poder de

resolución:

Para calcular el poder de resolución, se

requiere conocer la longitud de onda de la

luz visible, la apertura numérica del objetivo

y del condensador.

Una vez que investigue estas tres variables,

aplique la siguiente formula:

Poder de resolución = / AN objetivo + AN

condensador

Poder de resolución = 0.55 μm/1.25 + 0.9 =

0.25 μm

Ejemplo de apertura numérica: Si es el

objetivo de 100 X, este se fabrica con una

apertura numérica de 1.25 (Kapitza, 1997),

entonces, el poder de resolución calculado

será:

Un poder de resolución de 0.25 μm, significa

que este lente de 100 X, tiene la capacidad

u´ u´

Aire Aceite

9

de resolver áreas o distancias entre dos

puntos de 0.25 μm (la cuarta parte de la

milésima de un milímetro).

Actividad. Calcule el poder de resolución del

microscopio que le proporcione el instructor.

2. Método para explicar la formación de la

imagen

Aumento y transporte de la imagen a través

de la propagación rectilínea de la luz.

Imagen en dos dimensiones: largo y ancho.

Imagen invertida

Distancia focal.

Condensador.

Aumento total: Coeficiente de aumento (CA)

del objetivo x CA del ocular x C A del

multiplicador de aumentos (Si lo tiene).

Fig. 4. Formación de la primera y segunda imagen.

Aumento vacío: Aumento que no

proporciona más información sobre el

objeto.

Aumento útil: Es la apertura numérica que

permite conocer el poder de resolución del

microscopio (capacidad de resolver la

distancia entre dos puntos, que parecen ser

uno solo),

Actividad a) Investigue el aumento total y el

aumento útil de los instrumentos que le

proporcione el instructor. b) Anote la letra A

y la B en un acetato. Obsérvelas a través del

microscopio (3X, 10X) y reporte el plano de

observación e inversión observado.

A

B

B´

A´

B´´

A´´

10

3. Método para conocer las partes del

microscopio.

Con el instrumento proporcionado por el

instructor, identifique las siguientes partes

según el modelo y marca:

a) Sistema óptico:

Ocular

Objetivo

Condensador

Espejo

b) Sistema mecánico:

Estativo

Pie

Tornillo de ajuste macrométrico

Tornillo de ajuste micrométrico

Platina

Carro y pinza

Tornillos de desplazamiento, Diafragma

Tornillo del condensador, Revolver

Función de los objetivos: Proporcionarnos un

aumento estándar del objeto, de 3.2 X a 100

X. En los microsdopios Carl Zeiss®, los

objetivos vienen graduados con información

que indica:

a) El aumento alcanzado (3.2 X; 10 X; 40X,

100 X). Permite calcular el aumento total.

b) Apertura numérica: Mide el poder de

resolución del objetivo, permitiendo calcular

el aumento útil.

c) Distancia del ocular al objetivo: Regulada a

160 mm.

PRINCIPALES PARTES DEL MICROSCOPIO

Fig. 5. Principales partes del microscopio (Carl Zeiss©).

Ocular Objetivos Condensador Filtros

•Tubo del ocular

•Estativo

•Carro y pinzas

•Platina

•Piñones de desplazamiento del carro

•Diafragma

•Piñones de enfoque APROXIMADO Y FINO

Sistema óptico Sistema mecánico

11

d) Grosor del cubreobjetos (si requiere): 0.17

mm.

e) Línea superior de color: Aumento del

objetivo. Línea amarilla=10 X; Línea azul =

40X; Línea blanca = 100 X.

f) Línea inferior de color: Indica el líquido de

inmersión. Naranja: Glicerina (IR 1.455;

Negra: Solo aceite de inmersión (IR 1.515),

Blanca: Agua (1.333); Amarillo: Ioduro de

metilo (1.740). (Kapitza, 1997; Petraco &

Kubic, 2004).

Obviamente, esta información no está

estandarizada y varía de acuerdo a la marca.

Actividad. De acuerdo al modelo y marca del

microscopio, identifique las partes y

nomenclatura de los oculares y objetivos.

Fig. 6. Objetivos Marza Zeiss©. Flecha: Banda de color indica el aumento. (Azúl=40X. Verde=20X)

4. Método para usar los principales

accesorios del microscopio:

Existen hoy en día infinidad de accesorios

para efectuar trabajos de investigación y

diagnóstico microscópicos. Entre ellos se

describirán como ejemplo la cámara lúcida y

el micrómetro ocular, aclarando que en la

actualidad se cuentan con micro proyectores

de laminillas, cámaras de circuito cerrado,

foto microscopios, equipos con interface a

equipos computacionales, etc.

a) Cámara lúcida: Diseñada por Wollaston en

1806, esta se emplea para elaborar

esquemas de protozoarios y helmintos

directamente del microscopio con la ventaja

de que se conserva la proporcionalidad del

tamaño y forma de las estructuras. Consta

de un adaptador para el ocular del

microscopio, filtros que regulan la intensidad

de luz emergente y un espejo que proyecta

la mano y lápiz del investigador al interior

del campo del microscopio permitiendo

seguir el contorno de las estructuras

calcándolo sobre papel.

Al utilizar este accesorio, se coloca el espejo

a 45 ° aprox. Ensamblándolo sobre el ocular

del microscopio y sujetándolo con el tornillo

12

correspondiente. Enseguida se enfoca la

preparación y se regula la intensidad de luz

con el diafragma iris, o bien, con uno de los

filtros de la cámara. El tornillo de enfoque

fino y diafragma se mueven repetidamente a

lo largo de la sesión, según los

requerimientos de la iluminación. La luz en el

exterior o ambiental, deberá ser tenue para

que no interfiera con la luz de la bombilla del

microscopio, impidiendo ver con claridad o

nitidez las estructuras a dibujar. Solo en

contorno o detalles gruesos de las

estructuras se dibujan con la cámara. Los

detalles finos se toman directamente del

microscopio, sin la cámara y si se requiere en

el objetivo de inmersión (100 X).

Una vez iniciada la sesión para elaborar el

esquema, es muy recomendable terminarlo

totalmente, pues es difícil volver a colocar el

organismo en la misma ubicación del

bosquejo anterior y que coincida en todos

sus contornos.

Actividad. Dibuje con la cámara lúcida, el

protozoario o helminto proporcionado por el

maestro o instructor.

b) Micrómetro ocular: Se le llama así a un

disco de acrílico o cristal que lleva impresa

una línea con 5 o 10 divisiones mayores,

entre las cuales aparecen 10 subdivisiones. A

cada una de las subdivisiones les

denominamos trazos, y una vez que se

cuenta la cantidad de trazos, estos se

multiplican por el factor de conversión

correspondiente al objetivo (10X, 40X ó 100

X) y al microscopio calibrado para este

efecto.

Material necesario para la calibración del

microscopio. a) Micrómetro ocular, consiste

en un círculo de 18 mm, con escala. b)

Acercamiento a la escala del micrómetro

ocular; consiste en una línea de 1 cm con

100 divisiones, c) Micrómetro objetivo para

calibrar la escala del ocular. Se muestra una

microescala de 2 mm con divisiones de 0.01

mm (10 mm cada una).

1. Proceso de calibración del microscopio:

Posicione la escala del micrómetro ocular

sobre la escala del micrómetro objetivo.

13

Enfocar. Hacer coincidir ambas líneas de los ceros.

Buscar las líneas donde vuelven a coincidir ambas escalas.

Fig. 7. Escala del micrometro ocular con 100 divisiones.

Fig. 8. Portaobjetos con la escala calibradora (micrómetro objetivo), donde cada linea está

separada 0.01mm (10 micrómetros) y sirve para calibrar el micrómetro ocular.

Fig. 9. Calibración del micrómetro ocular. 1) Girar el ocular para hacer coincidir los ceros de ambas escalas. 2) Buscar lineas de coincidencia (flecha)

Ejemplo: 83 divisiones del micrómetro ocular

corresponden a 55 divisiones del micrómetro

objetivo (55 x 10 m, en objetivo 10X =

550 m). La escala de este último es de

1/100 (0.01 mm = 10 m). Dividiendo la

medida del micrómetro objetivo entre el

número de líneas del micrómetro ocular, se

obtiene la calibración correcta del objetivo

de 10 X en micrómetros.

Medida del micrómetro objetivo / Líneas del

micrómetro ocular = 550 m /83 = 6.62 m.

Escala del micrómetro ocular

Escala del portaobjetos con la escala calibradora

14

Realizar varios cálculos con las otras

coincidencias y obtener el promedio.

El valor solo es válido para el objetivo donde

se calibró. Puede variar si el ocular se cambia

a otro tipo de microscopio.

Actividad: Tabule los valores de calibración

en 10X, 40X y 100X. Diseñe una tabla de

calibración siguiendo el ejemplo hipotético

de abajo.

Tabla 1. Ejemplo de la conversión del

número de líneas a micrómetros según el

objetivo.

Número

de

líneas

CONVERSIÓN EN MICROMETROS

( m)

10X 40 X 100X

1 6.62 5 1

2 13.24 10 2

3 19.86 15 3

4 26.48 20 4

5 33.1 25 5

etc. … … …

50 331 500 50

Mida cinco de los organelos u órganos

(según se trate) del parásito y repórtelos en

micrómetros.

c) Método para usar la cámara digital de

microscopio Moticam®.

1. Instale el programa del CD incluido en el

equipo. Siga las instrucciones de acuerdo al

fabricante.

3. Solamente remueva un ocular del

microscopio e inserte la cámara digital

ensamblada como se muestra por el

instructor

4. Conecte el cable USB a la computadora y

examine la imagen en su programa de video

o fotografía favorito. Este es compatible con

software TWAIN (Motic,. 2007)

3. Coloque la laminilla del protozoario o

helminto proporcionado por el instructor

bajo la lente del objetivo, seleccione el área

que desea analizar y enfoque en la pantalla

de la computadora.

Fig. 10. Cámara para microscopio para digitalizar imágenes de parásitos.

4. Grabe la (s) imágenes solicitadas por el

instructor en Microsoft Photo Editor®, Paint

® o Publisher® en JPEG o TIFF con el

nombre que desee en una unidad extraíble

(tarjeta de memoria, disco flexible, etc.)

15

Actividad: Identifique con la ayuda de la

bibliografía, la morfología del parásito e

indique cada uno de sus órganos u

organelos, según se trate. Inclúyalo en el

reporte de la práctica.

Resultados y Discusión

1) Reporte las actividades solicitadas en la

práctica apoyándose con la literatura

consultada.

2) Investigue sobre las aplicaciones de la

microscopía de contraste de fases y la

iluminación Köeler.

Cuidado del microscopio:

El microscopio es un instrumento valioso y

de precisión. Para que pueda funcionar

eficientemente, es necesario darle un

adecuado cuidado. Por ello debemos tener

presentes las siguientes normas:

1. Si la lámpara está encendida no lo sacuda,

pues el filamento incandescente puede

romperse.

2. Si no está ocupando el microscopio,

protéjalo del polvo colocándole su funda.

El polvo es el peor enemigo.

3. Los oculares deben estar siempre

introducidos. Evite transportarlo de lado

para que no se desprendan y se rompan.

4. Elimine el polvo con algodón hidrófilo

humedecido con agua o con vaho

(aliento), sin tallar las lentes para evitar

que se rayen. No use solventes, las

superficies de los cristales también se

limpian con una tela de lino o algodón, no

con gamuza.

5. Inspeccione con frecuencia que los lentes

estén libres de los restos de aceite de

inmersión, huellas, maquillaje y trazas de

grasa.

6. No coloque el microscopio en el borde de

la mesa, un leve empujón o descuido

podrá derribarlo.

7. Trasládelo en posición vertical, sin

inclinarlo.

8. Enrolle el cable de luz apropiadamente.

9. Enfoque primero en panorámico, seco

débil, fuerte y finalmente, en el de

inmersión para evitar rayar o romper los

objetivos.

10. No desarme jamás, el microscopio, o le

quite oculares u objetivos para

intercambiarlos sin no tiene la asesoría o

preparación adecuada.

16

® Zeiss: Marca Registrada por la Compañía

Carl Zeiss, Alemania. ® Microsoft Photo

Editor, Paint, Publisher: Marcas registradas

por Microsoft Corp. 1985-2007. ® Moticam

es Marca registrada de Motic China Group.

Conclusiones

Literatura consultada (por el alumno)

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Sterrenburg, AS. 2005. Microscopy Primer. Micscape Magazine. United Kindom.

18

PRÁCTICA 2

TÉCNICAS HEMATOLÓGICAS Y TISULARES

L Galaviz Silva

Introducción

Las técnicas para el estudio parasitológico de

sangre y tejidos se emplean para el

diagnostico de parásitos como son los

géneros Plasmodium, Leishmania,

Trypanosoma, etc. Cuando los parásitos

invaden y se reproducen en el interior de los

tejidos se les llama histozoicos, mientras

que aquellos que habitan el interior de

órganos huecos o lumen intestinal se les

llama celozóicos. Entre el grupo de los

metazoarios (pluricelulares) existe la

superfamilia Filarioidea (nemátodos) los

cuales habitan linfa y sangre, arrojando sus

embriones (microfilarias) en el torrente

sanguíneo. Estas son de gran importancia en

medicina humana en el Sur de nuestro país,

tal como es Onchocerca volvulus, causante

de la oncocercosis o ceguera de los ríos,

quien habita el tejido subepitelia (Garcia,

2001).

Objetivo general

Reforzar en el estudiante su habilidad para el

manejo de órganos y tejidos en el

diagnóstico de las parasitosis causadas por

protozoarios. Esta práctica corresponde a la

Unidad A (Protozoarios de importancia

médica) y Unidad E (Nemátodos de

importancia médica) de la carta descriptiva

de la materia.

Objetivos particulares:

1. El alumno practicará la realización de

frotis sanguíneos extendidos, gota gruesa

y preparación de improntas para estudio

histológico.

2. Aplicará las técnicas de fijación y tinción

(Giemsa, Wright y combinada)

convencionales para la preservación y

estudio de las muestras.

Material

Para la obtención de la muestra de sangre y

realización de frotis extendidos se necesita

utilizar anticoagulantes, cualquiera de estos

pueden prepararse en el laboratorio (según

los reactivos disponibles) de la siguiente

manera:

A) Anticoagulante de Heller y Paul

Oxalato de potasio 0.8 g

Oxalato de amonio 0.2 g

Agua destilada. Aforar a 100 ml

19

Se emplea 1 ml de la solución por tubo de

ensaye. Se deja evaporar el agua en una

estufa. El residuo cristalino se mezcla con 10

ml de sangre.

B) Heparina en polvo

Utilizar 2 mg por cada ml de sangre. Se

puede disolver en etanol absoluto o agua y

evaporarlo antes de usar.

C) Citrato de sodio

Citrato trisódico 2g

Solución salina 0.85% 100ml

Utilizar 2ml por cada 8 ml de sangre.

D) EDTA. Se emplea 1-2 mg de EDTA en

polvo por cada mililitro de sangre.

Detalles de la preparación y el modo de

acción de cada anticoagulante, se describen

en Todd et al. (2005).

El instructor proporcionará al alumno el

siguiente material:

Microscopio

Jarras de tinción

MetanolCanastillas de tinción

Anticoagulante

Colorante de Wright

Colorantde Giemsa

Amortiguador de Giemsa y Wright

El alumno se responsabilizará de aportar el

material biológico para la práctica y el

siguiente material:

Portaobjetos (limpios y

desengrasados)

Aplicadores

Franela

Etanol 95° (no potable)

Jeringas de 1mL y 3-5mL

Cubreobjetos

Gasa

Algodón

Pipetas Pasteur

Método

1. Técnicas para realización de frotis e

improntas

a) Examen microscópico directo. Esta se

emplea como un procedimiento preliminar

para la detección de parásitos en sangre,

pero de ninguna manera, es definitivo para

un diagnóstico de certeza, siendo de gran

ayuda para los parásitos extracelulares como

tripanosomas o microfilarias.

1. Obtener sangre con jeringa preparada con

anticoagulante (según el procedimiento M21

recomendado por el INDRE, 2010) lancetas o

en el caso de ratones de laboratorio, por el

corte del ápice caudal. Depositar 1-2 gotas

en portaobjetos.

2.. Mezclar con una gota de solución salina

fisiológica si no se usó anticoagulante (en

mamíferos esta tiene una concentración

del 0.85%).

3. Depositar el cubreobjetos.

20

4. Examinar al microscopio. En muestras

recientes, los tripanosomas o microfilarias

se evidencian por su movimiento entre las

células sanguíneas. Es necesario que el

frotis no quede excesivamente grueso,

porque los eritrocitos enmascaran los

parásitos dificultando su diagnóstico.

b) Frotis extendido. Los frotis extendidos

son útiles para el estudio morfológico de los

parásitos intra e intercelulares. Además, con

estos se obtienen registros permanentes de

los parásitos, empleándose en las laminillas

en docencia, investigación ó bien como

preparaciones de referencia. Mayores

detalles de la preparación de los

portaobjetos, técnica del procedimiento se

citan en Todd et al. (2005) e INDRE (2010) en

el Procedimiento M7. La técnica es la

siguiente:

1. Depositar una gota de sangre

(aproximadamente de 2-3 mm de dm)

cerca de un extremo del portaobjetos.

Usar solo portaobjetos nuevos, lavados

con detergente, enjuagados y

desengrasados con etanol 95° o acetona,

sumergiéndolos en esta solución varios

días antes.

Fig. 11. Portaobjetos “extensor” sin Fig. 12. Desplazar con un movimiento uniforme

esquinas cortado con un lápiz de punta hacia el extremo opuesto.

de diamante.

2. Acercar el extremo des esquinado del

portaobjetos extensor a la gota de la

sangre y permitir que se difunda por

capilaridad en toda la orilla.

3. Inclinar el extensor en un ángulo de 45°

aproximadamente y desplazarlo

horizontalmente hacia la orilla opuesta de

la gota con un movimiento uniforme.

4. Secar inmediatamente el frotis agitándolo

como abanico para fijar las células

sanguíneas. El propósito es realizar una

extensión de una sola capa de células

sanguíneas. El secado es importante para

evitar la crenación de las células. El secado

al aire funciona como un fijador físico,

comparable a los fijadores químicos como

45°

21

el metanol o formaldehído que se emplean

para otros tipos de tejidos o células. Una

secadora de pelo o abanico pueden ayudar

a secar rápido la preparación. Si no se van a

teñir inmediatamente, guardar en un sitio

libre de polvo o insectos, o envolviéndolos

en papel absorbente.

c) Frotis de gota gruesa. Esta es una técnica

de “concentración” para parásitos,

considerándose así por la destrucción

selectiva de eritrocitos, quedando en la

preparación solamente las formas parásitas

y los núcleos de las células blancas (Garcia,

2001; Trujillo et al., 2001; Todd et al.,

2005).

1. Si se usa lanceta, se limpia la yema del

dedo o el lóbulo de la oreja con una

torunda de algodón empapada en alcohol

etílico al 70% y se deja secar. Si es por

punción venosa, siga las instrucciones del

maestro. Depositar 1-2 gotas de sangre

obtenidas por lanceta. o punción venosa.

en el centro del portaobjetos, desechando

la primera gota (Procedimiento M9 del

INDRE, 2010).

2. Macerar los eritrocitos girando sobre la

muestra con la esquina de un portaobjetos

por 0.5-1 cm.

3. Secar el frotis protegiéndolo de los

insectos y el polvo.

4. Una vez seca la preparación, sumergir el

frotis en agua destilada. Esperar a que el

agua lave todos los restos de células y

hemoglobina. Interrumpir el procedimiento

cuando la preparación adquiera una

coloración blanca u opaca. Si el

portaobjetos no está libre de grasa, esta

capa blanquecina no se adherirá a la

superficie.

5. Colocar verticalmente sobre un papel filtro

o absorbente y escurrir el exceso de agua.

Teñir con el colorante de Giemsa, sin el paso

de fijación por metanol. La inmersión en

agua destilada, tiene como objeto lisar el

resto de las células sanguíneas que quedaron

intactas y eliminar la hemoglobina, por lo

tanto, solo deben observarse núcleos de las

células blancas y los parásitos si la muestra

es positiva.

d) Técnica para realización de improntas.

Para los tejidos obtenidos por biopsias o por

autopsias de animales, las improntas suelen

ser una técnica económica y sencilla para la

detección de parásitos. El órgano o tejidos a

estudiar, depende del parásito estudiado.

Para Leshmania donovani las improntas se

realizan con muestras de bazo, hígado o

nódulos linfáticos. En el caso de L. tropica se

selecciona el borde indurado de la lesión. En

L. braziliensis el borde indurado de las

úlceras sobre la piel, nódulos o ulceraciones

sobre la membrana mucosa. En estudios de

T. cruzi, los tejidos se estudian por autopsia

seccionando el músculo esquelético,

corazón, bazo, hígado, nódulos linfáticos y

22

de ser posible el chagoma. En Sarcocystis

lindermani los quistes se localizan en

músculo, principalmente esófago, diafragma,

abdomen y tórax. Toxoplasma gondii se

puede detectar en bazo, pulmón, hígado,

nódulos linfáticos, cerebro y otros tejidos en

casos agudos. Pneumocystis carinii es

común en pulmones. Tripanosoma

gambiense y T. rhodesiense se encuentran en

nódulos linfáticos. Las improntas son

principalmente útiles para el estudio de

protozoos en tejidos, porque quedan más

libres en comparación con los cortes

histológicos, donde se obtiene una masa

compacta de organismos embebidos en el

tejido. Las biopsias de piel son útiles para

diagnosticar amebiasis cutánea y las

microfilarias. En biopsias de músculo se

pueden detectar a Trichinella spiralis,

Cysticercus cellulosae y en muestras de colon

y recto se demuestran huevos de

esquistosomas.

En los helmintos también, es conveniente

cuando se estudian estadios larvarios de

microfilarias en piel o nódulos linfáticos.

Detalles especiales sobre improntas de piel

se detallan en el Procedimiento M12 del

INDRE (2010).

1. Lavar la muestra de tejido con agua

destilada, eliminando el exceso de

líquidos tisulares.

2. Cortar un trozo de tejido. Eliminando

nuevamente cualquier exceso de sangre

con agua destilada y secar con papel

absorbente.

3. Envolver en un extremo del portaobjetos,

una tira de aproximadamente 5 cm por 1.

5 cm.

4. Adherir la muestra de tejido a la tira de

papel, de manera que la zona del corte

permanezca expuesta.

5. Acercar el portaobjetos limpio y libre de

grasa, hasta hacer contacto con el tejido.

Retirar una vez que se imprima en el

portaobjetos. Secar a temperatura

ambiente o en incubadora a 37°C.

Fig. 13. Técnica para improntas. Enrollar (3 o 4 vueltas) el extremo del portaobjetos con el papel absorbente y sobre él, adherir el trozo de tejido. Imprimir la “huella” del tejido sobre el otro portaobjetos.

Papel absorbente

Trozo de tejido Portaobjetos

23

6. Teñir con Giemsa, Wright o combinada.

Transparentar en Xilol y montar en resina

sintética. Si lo prefiere en vez de montar,

agregué aceite de inmersión al tejido y

examine al microscopio.

e) Técnica para concentración de

tripanosomas por triple centrifugación. Esta

se recomienda para el examen y

recuperación de parásitos en hospederos

inoculados experimentalmente, o con

infección natural, pero también, evadiendo

el primer paso, se pueden recuperar

tripanosomas de heces de triatominos para

inoculación en ratones, medio de cultivo,

determinación de parasitemias o elaboración

de laminillas, Preparar recientemente citrato

de sodio al 6% en agua destilada.

1. Mezclar 9 ml de sangre y 1ml de citrato de

sodio al 6%.

2. Centrifugar a 300 x g por 10min.

3. Transferir el sobrenadante a otro tubo y

centrifugar a 500 x g por 15min.

4. De nuevo, transferir el sobrenadante a

otro tubo y centrifugar a 900 x g.

5. Decantar el sobrenadante y examinar el

sedimento al microscopio en

preparaciones húmedas o extender el

sedimento en un portaobjetos y teñir con

Giemsa (Garcia, 2001; Cerrada-Bravo,

2004).

2. Técnicas de tinción

La preparación de los colorantes en el

laboratorio se realiza con días o semanas de

anticipación, debido a que estos requieren

de un proceso de “maduración” en frascos

ámbar protegiéndolos de la luz. La

“maduración” permite que las soluciones

adquieran sus propiedades adecuadas para

teñir constituyentes celulares acidófilos y/o

basófilos propias. Los colorantes en polvo,

deberán mostrar una certificación como es la

que extiende la Biological Stain Commision,

University of Rochester, Medical Center,

Rochester, NY y el número correspondiente

de certificación.

a) Técnica de Giemsa.

Solución madre del colorante de Giemsa.

Solución madre:

Colorante de Giemsa en polvo (tipo azure B)

0.60 g

Alcohol metílico absoluto, libre de acetona

50 ml

Glicerina neutra 50 ml

Moler pequeñas alícuotas del colorante y la

glicerina en mortero y colectarlas en un en

matraz de 500 ml. Tapar el envase con una

torunda de algodón y tapón de papel.

Colocar el matraz en baño maría a 55-60°C

por 2 h. Agitar suavemente en intervalos de

30 min. Al terminar de moler el colorante y

la glicerina, enjuague con el alcohol metílico

24

el mortero y después guardarlo en un envase

bien cerrado

Al terminar el baño maría, dejar enfriar a

temperatura ambiente. Agregue el metanol y

agite bien la mezcla. Filtre el colorante en

papel Whatman 1 y almacene dividiéndolo

en varios frascos ámbar de 30 ml para evitar

una posible contaminación de la solución

madre. Es recomendable dejarlo madurar

por 3 semanas, agitándolo periódicamente.

Esta solución, se diluye para preparar la

solución de trabajo en una proporción de

1:10 a 1:50 con amortiguador de fosfatos. La

dilución varía según el tiempo de tinción que

se desea usar. Una regla general para la

dilución contra el tiempo de tinción es la

siguiente: Si la dilución es 1:20, teñir por 20

min. Si la dilución es 1:30, teñir por 30 min.

El tiempo de tinción promedio oscila entre

30 a 40 min. Si este excede una hora, será

recomendable aumentar la proporción de la

solución madre o prolongar el tiempo de

maduración. El núcleo de los leucocitos debe

verse azul violeta; los neutrófilos rojo-

púrpura con granitos violeta en el

citoplasma. En los parásitos de la malaria se

observa la cromatina roja con o sin gránulos

de pigmento y citoplasma azul. La solución

de trabajo de amortiguador de fosfatos se

ajusta de acuerdo al pH requerido.

Amortiguador de fosfato dibásico

Na2HPO4 anhidro 9.5 g

Agua destilada 1,000 ml

1. Fijar la preparación en metanol por 1 min.

Escurrir el exceso de alcohol.

2. Sumergir en la solución de trabajo del

colorante de Giemsa recién preparada

diluida 1:10 a 1:50 en amortiguador de

fosfatos (pH 7.0a 7.2). El tiempo de

tinción óptimo será proporcionado por el

instructor.

3. Eliminar el exceso de colorante

sacudiéndolo sobre la misma cubeta de

tinción.

4. Sumergir por 3 min. en amortiguador de

fosfatos a pH 7.0 (o bien en una cubeta

con agua de la llave con unas gotas de

colorante). Lave con agua destilada o al

chorro de agua para eliminar algunas

partículas precipitadas del colorante y

dejar secar en posición vertical.

5. Examine al microscopio impregnando la

preparación en aceite de inmersión.

Amortiguador de fosfato monobásico

Na2HPO4 9.2 g

Agua destilada 1,000 ml

25

Tabla 2. Preparación de amortiguador según el pH requerido

b) Técnica de Wright

Colorante de Wright.

Colorante de Wright en polvo (certificado)

0.9 g

Metanol absoluto, libre de acetona

500 ml

Se muele en mortero los0.9 g de colorante

con 15 ml de metanol. Se agrega el metanol

gradualmente mientras se muele, agregue

mas metanol, vacié gradualmente en un

frasco ámbar hasta que se termine el

metanol. Almacenar en un frasco bien

cerrado y agite periódicamente por al

menos 5 días. Filtre el papel Whatman N° 1

y distribuir alícuotas en varios envases.

Esta mezcla se deja madurar por transcurso

de una semana. A diferencia del Giemsa,

esta se emplea como solución de trabajo

directamente.

1. Sumergir el frotis en el colorante de

Wright (o cubrirlo en posición

horizontal) por 2-3 min. 2. Eliminar el

colorante sacudiéndolo en el fregadero

o sobre la jarra de tinción.

3. Agregar o transferir el frotis al

amortiguador de fosfatos (pH 7.0) por 4-

8 min. Debe aparecer una película verde

metálica sobre el frotis.

4. Lavar en agua corriente y luego en agua

destilada. Dejar secar y examine con

aceite de inmersión.

c) Técnica combinada

En esta técnica de emplean los colorantes

de Giemsa y Wright, aprovechando al

máximo las propiedades de tinción

pH

Mililitros de:

Na2HPO4 (9.5g/L)

NaH2PO4-H2O

(9.2 g/L)

Agua destilada

6.6 37.5 62.5 900

6.8 49.6 50.4 900

7.0 61.1 38.9 900

7.2 72.0 28.0 900

26

diferencial de ambos. Se aplica en frotis extendidos e improntas, preferentemente.

1. Sumergir la preparación en el colorante

de Wright por 3 a 5 min. Sacudir el

exceso de colorante.

2. Sumergir en el colorante de Giemsa por

30-40 min.

3. Equilibrar la tinción en amortiguador de

fosfatos buffer de Giemsa por 3 min.

Lavar en agua de la llave y dejar secar

antes de examinarlo al microscopio.

27

Resultados y Discusión

1. Esquematice las células y parásito observados en el examen directo (10X, 40X y 100 X).

2. Esquematice las formas parásitas y células y sanguíneas observados en frotis extendido (10X,

40X y 100 X).

3. Esquematice las células y/o parásitos observados en la técnica de gota gruesa.

28

4. Esquematice de las laminillas de colección, cuatro parásitos diferentes que habiten o se

reproduzcan en sangre y tejidos. Consulte la morfología en la literatura correspondiente.

Conclusiones

Literatura consultada (por el alumno)

29

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Marzo 27, 2010.

31

PRÁCTICA 3

PROTOZOARIOS HEMOFLAGELADOS

Z J Molina Garza

Introducción

Los protozoarios se ordenan principalmente

según el tipo de organelos de locomoción

que presentan. Aquellos que poseen

flagelos, se les llama comúnmente

flagelados por ejemplo, y como parasitan

y/o se reproducen el torrente sanguíneo se

les conoce como hemoflagelados,

pertenecen al Filum Euglenozoa, Clase

Kinetoplastea y la familia

Tripanosomatidae. Los tripanosomatidos

que causan enfermedades en el ser humano

y animales domésticos y silvestres son del

género Trypanosoma y Leishmania. Estos

son heteroxenos (con unas excepciones)-

alguno de sus estadios de vida viven en

sangre o y/o tejidos de toda clase de

vertebrados, mientras que otros estadios

habitan el aparato digestivo de

invertebrados hematófagos. Todas las

especies se dividen por fisión binaria

longitudinal (asexual), son alargadas, con un

solo flagelo y membrana ondulante, o

redondas y con un flagelo muy corto que no

sobresale de la membrana celular,

uninucleadas. El flagelo se origina en el

blefaroplasto o cuerpo basal, asociado

íntimamente al cinetoplasto (cuerpo

parabasal) en forma de disco o salchicha.

Los organismos del género Trypanosoma y

Leishmania, pasan por todas o algunas de

las cuatro fases de desarrollo o estadios

(Beaver et al., 2003; Uribarren Berrueta,

2004) que se describen brevemente a

continuación:

A) Amastigote (forma tipo, Leishmania):

Células esféricas, con un núcleo,

aflageladas y cinetoplasto prominente

entre el núcleo y la membrana celular.

Habitan el interior de las células

incluyendo macrófagos.

B) Promastigote (Leptomona): Cuerpo

fusiforme o de hoja, flagelo solitario en

el extremo anterior sin membrana

ondulante, cinetoplasto inmediatamente

en la base del flagelo. Esta forma es la

que se desarrolla en los hospederos

invertebrados del género Leishmania y

Trypanosoma o en los medio de cultivo

artificiales.

C) Epimastigote (Blastocrithidia): Cuerpo

fusiforme o de hoja, el flagelo emerge de

la región medial o medio-anterior de la

célula formando una pequeña

membrana ondulante entre el flagelo y la

membrana celular. Cinetoplasto frente al

margen anterior del núcleo. En el género

32

Trypanosoma, esta fase se desarrolla en

el intestino de los vectores.

D) Tripomastigote (Trypanosoma): Cuerpo

fusiforme o en forma de hoja,

cinetoplasto cerca del extremo posterior

de donde emerge el flagelo formando la

membrana ondulante. Estadio o fase de

desarrollo que se presenta en sangre o

linfa los vertebrados y en intestino de

invertebrados.

Objetivo general

Proporcionar al estudiante la información

práctica sobre la morfología de los

protozoarios hemoflagelados de

importancia médica y veterinaria en México

y el mundo. Lo anterior, mediante el

examen de preparaciones permanentes de

los mismos, capacitándolo para efectuar

diagnósticos parasitológicos de certeza y

aumentar su destreza en el campo de la

investigación clínica o en el campo de la

biología (crecimiento y reproducción) de

este grupo de protozoarios. Esta práctica

concuerda con la teoría de la Unidad B (B1 a

B5, Flagelados de sangre y tejidos) de la

carta descriptiva de la materia.

Objetivos particulares:

1. Examinar preparaciones

permanentes de los agentes

etiológicos de la tripanosomiosis y

leishmaniosis, causantes de la

tripanosomiosis americana,

enfermedad del sueño y

leishmaniosis visceral o kala-azar.

2. El estudiante comprobará además,

los cambios morfológicos que

presentan estos protozoarios al

crecer en medios de cultivo artificial

o bien, al crecer en diferentes

tejidos u hospederos, mediante el

examen al microscopio de laminillas

permanentes.

Material

El instructor le proporcionará preparaciones

permanentes entre portaobjetos y

cubreobjetos de la colección que

corresponden a Trypanosoma cruzi, T.

gambiense, T. rhodesiense, Leishmania

donovani, L. brazilienses, L. tropica y L.

mexicana, estos obtenidos de sangre o

tejido infectado, cortes histológicos así

como de medios de cultivos.

Cada estudiante aportará lápices para

colorear, cuaderno de hojas blancas para

dibujo y lápiz.

Método

Coloque las laminillas de colección que le

proporcione el instructor en el microscopio

y esquematice los protozoarios en los

objetivos de 10X, 40X y 100X, coloreándolos

según las estructuras. Identifique o consulte

33

la morfología característica de cada uno y

señale con una flecha el nombre de cada

organelo.

Resultados y discusiones.

En cada una de los siguientes esquemas,

señale el nombre del estadio o fase de

desarrollo, estructuras subcelulares, tipo

de tejido o células donde se localiza y la

técnica de tinción. Indique las

características diagnósticas de cada

parásito.

1. Trypanosoma cruzi en corazón. 2. T. cruzi en frotis sanguíneo

3. T. rhodesiense en frotis sanguíneo 4. T. gambiense en frotis sanguíneo

34

5. Trypanosoma en cultivo. 6. T. gambiense. Corte histológico de cerebro

7. Leishmania donovani en hígado 8. Leishmaniosis mexicana cutánea.

35

9. L. tropica en cultivo 10. L. donovani en

cultivo.

Literatura consultada (por el alumno)

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