Introducción y

Posibilidades de la

Espectrometría de Masas: LC-GC/MS y LC-GC/MS/MS

Jornada sobre Posibilidades de la

Espectrometría de Masas

en Laboratorios de Investigación.

“El poder” del análisis comparativo de

muestras en Alimentación, Proteómica y

Metabolómica.

Miguel A. Martínez

Inma Alvarez

ICTAN

PCiTAL-UdL

www.ictan.csic.es

Servicios del ICTAN

ESTUDIOS DE VALORIZACION TECNOLÓGICA

ESTUDIOS DE NUTRICION

SERVICIOS ANALITICOS (externos e internos)

• U.S. Técnicas Analíticas, Instrumentales y Microbiológicas (USTA)

• Laboratorio de espectrometría de masas

• Laboratorio de cromatografía general

• Laboratorio de análisis elemental y minerales

• Laboratorio de caracterización y propiedades físicas

• Laboratorio de instrumentación preparativa

• Laboratorio de espectroscopía

• Área de Microbiología

• Área de Cultivos Celulares

• Calidad y Calibraciones

Análisis instrumental en matrices alimentarias y muestras biológicas

Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)

Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)

Servicios del ICTAN

SERVICIOS DE PLANTA PILOTO

• Instalaciones para el procesamiento de distintos tipos de alimentos

• Tratamiento de atmósferas controladas, envasado, microinyección, etc.

• Sistemas de congelación

• Equipo de altas presiones

• -20ºC – 100ºC

• 0 a 900 Mpa

• 1,7 L

• Primer equipo europeo capacidad en rangos amplios de P., T., V.

•Nuevas instalaciones frigoríficas

• 34 cámaras

• 12 Cabinas de atmósferas controladas

• 230 m2 útiles

Miembro de la Red de Laboratorios de Madrid (Nº registro CAM Lab 160)

Planta Piloto

Cámaras

Se pueden visitar las instalaciones después del coctel

Requisitos de las técnicas en un Servicio Análisis

Técnica/método Robusto ( reproducible, fiable, independiente del operador)

Preciso

Baja incertidumbre

Instrumental ( automatizable o poco dedicado.)

Versátil (aplicable a distintas muestras/matrices)

Requiera poca muestra, poca manipulación

Rápido

Interferencias nulas o controlables

Coste razonable

Separa

Identifica

Cuantifica

Información estructural

Masa [cuasi]Molecular

No necesita siempre una separación perfecta

Elección del método de análisis :

¿por qué invertir tantos recursos (€) en MS?

Separación de los analitos

Electroforesis

C E

Ultracentrifugación (polímeros)

E. Vis-UV

Absorción Atómica

Infrarrojo

RMN

Electroanálisis

Métodos Térmicos

Cromatografía

Separativa

Escasamente identificativa

No separativa

Identificativa

Qué puedo hacer con mi extracto?

E. Masas

Extracto

Herramienta mas versátil & eficaz:

ACOPLAMIENTO

CROMATOGRAFIA - E. MASAS

identificación cuantificación

Requisitos Técnicas Análisis en muestras biológicas

de alimentos

Pe

so

Mo

lec

ula

r

Polaridad del analito/

Solubilidad en Agua

LC/MS

API-Electrospray

LC/MS-APCI 1.000

100,000

10,000

no polar muy polar

LC/MS-

APPI

GC/MS

• Requiere técnicas con un muy amplio rango de aplicabilidad.

• Muy elevada selectividad, especificidad y sensibilidad.

• Poder cuantificar trazas de compuestos en complejas matrices.

El acoplamiento Cromatografía / Espectrometría de Masas (LC/MS y GC/MS) es la técnica que:

• Ofrece la mejor sensibilidad y versatilidad para el amplísimo rango de compuestos y matrices a analizar en un laboratorio.

• Permite obtener perfiles masivos de metabolitos y proteínas.

• Combinado con la Bioinformática está “revolucionando” las posibilidades de la investigación multidisciplinar

LC + Nano LC

Solubles

GC + GC x GC

volatilizables

C E + Analitos

iónicos

TOF / q-TOF TRAP QqQ Q-TRAP

sQ

GC

MS

Ejemplos de Instrumentación en MS:

Instrumentos híbridos. Acoplamientos especiales

[lc] Orbi-TRAP

LC-ICP-MS (AGILENT 2007)

Maldi-TOF

Maldi-TOF-TOF

TÉCNICAS MULTIDIMENSIONALES [RP]LC-GC-MS

Acoplamiento directo de cromatografía de

líquidos, cromatografía de gases y espectrometría de masas

Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz

ICTAN

Instrumentos hibridos

GC HORNO

(3) (2)

(1) 1)1)

(1)

Interfaz TOTAD: (1) material absorbente o adsorbente; (2) lana de vidrio; (3) tapón calefactado; (EV1

y EV2) electroválvula 1 y 2; (EPC) controladores de presión electrónicos; (PR) regulador de presión;

(FR) regulador de flujo; (ST1) tubo de acero inoxidable, 0,25 mm d.i., para transferir el eluyente del

LC a la válvula de seis vías; (SCT) capilar de sílice fundida, 0,32 mm d.i.; (WT) tubo del desecho;

(NV) válvula de aguja; (W) desecho. (Villén y col., 1999)

Interfaz “TOTAD”

Minutos

20 40 60 80

1,2 mL

1,5 mL

(R)-limoneno

(S)-carvona

(S)-carvona

(R)-limoneno

Minutos 0 1 2 3 4 5

AU

0

1

2

3

4 0

,92

2,1

2

3,6

3

Transferencia de 0,92

min a 2,12 min

Transferencia de 2,12

min a 3,63 min

Carum carvi

RPLC

GC-MS

Laboratorio grupo Dra. Marta Herraiz

MINIMIZA (O ELIMINA) LA ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA

INTEGRA LA PRE-SEPARACIÓN DE MUESTRA EN EL ANÁLISIS

PERMITE EL USO DE FASE NORMAL (NP) Y FASE INVERSA (RP) EN LC

REDUCE EL USO DE DISOLVENTES

DISMINUYE EL TIEMPO TOTAL DE ANÁLISIS

PROPORCIONA BAJOS LÍMITES DE DETECCIÓN

PERMITE AUTOMATIZAR EL ANÁLISIS COMPLETO

LC-GC-MS

Un espectrómetro de masas consta principalmente de combinación de 3 componentes

Múltiples

diseños

sQ

QqQ

ToF

QToF

MaldiToF

Trap

etc

En

tra

da

Inte

rfa

se

s

ES

I,

AP

CI,

M

AL

DI,

…

ALTO VACíO

INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas

tienen que ser ionizadas.

Los iones son guiados al interior

del MS, sin capilar, mediante

campos electromagnéticos

Gas secante auxiliar aire caliente

TurboV ion Source (ESI)

Qjet ion Guide

La muestra es coprecipitada

en el seno de una matriz que

absorbe la energia del pulso

laser y la transfiere a la

muestra , que se carga con +1

INTERFASES MS: Para poder ser detectadas, las moléculas

tienen que ser ionizadas.

INTERFASES LC API ESI y APCI

SOLO LO QUE SE IONIZA PUEDE SER DETECTADO POR EL

ESPECTRÓMETRO DE MASAS

ESI Jet –Stream Agilent

TIC (Total Ion Chromatogram)

Información cuantitativa: - Área pico (TIC:no selectiva - EIC:selectiva)

Información cualitativa (ID):

-Tiempo Retención - Espectro de Masas

Información Proporcionada por LC-GC-CE /MS. Ejemplo Drogas de Abuso mediante LCMS-TOF Nota aplicación 5989-0667EN

Tr

m/z

Int. EIC ( =Ion extraído)

m/z 300.0-300.2

CROMATOGRAMA SELECTIVO

Utilizados para cuantificación

1

4

Isómeros => igual m/z

exacta

Se requerirá su

separación

cromatográfica

HPLC MS:QTOF

Espectros LC/MS (Ionización a Presión Atmosférica–API )

“versus” GC/MS (Ionización por Impacto Electrónico-EI)

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5 5.4e5

Inte

nsid

ad

TOF MS: 5.672 to 5.833 min from TIC

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

277.087

279.084 [M+H]+=277.0874

m/z

Contribución del Cl(37) de aprox. 2/3 2 átomos Cl

Espectro LC/MS (API-ESI)

Clenbuterol

GC

MS

180 40 60 80 100 120 140 160 200 220 240 260 280 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

m/z-->

Abundance #103730: Clenbuterol (PM = 276Da)

276

86

57 127

41

190 71 243 99 166 154 140 259

Espectro GC/MS (EI)

N H

N H 2

Cl

Cl

O H

C H 3

C H 3 C H 3

86

HPLC MS:QTOF

Espectros LC/MS (API-ESI ) : Iones carga múltiple

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

3.0e5

3.5e5

4.0e5

4.5e5

5.0e5 5.4e5

TOF MS: 5.672 to 5.833 min from TIC

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

277.087

279.084 [M+H]+=277.0874

Clenbuterol

m/z

m/z

Moléculas con varios grupos ionizables (ppdes. acido/base)

Aminoácidos ( lisina)

Péptidos

Proteínas

Adquieren múltiples cargas (ejem. nH+)

Cada molécula con n cargas origina una señal

El espectro muestra todas las posibilidades

Espectro de masa de

proteína ESI-TOF

La determinación de la Masa

Molecular requiere un programa de cálculo o

deconvolución.

M = 16992.8

TOF MS 6.45 to 6.78min from TIC

Mioglobina

El espectro de masas (intensidad de señal “versus” relación masa/carga (m/z)) y el perfil isotópico

son la base de la Bioinformática aplicada a estudios de proteómica y metabolómica

Espectros LC/GC/MS

¿Cómo Lograr Información Estructural en LC/MS?: MSn

SCAN MS2 [579]

579- 433 =146

coincide con perdida hexosa

MS3 [433]

[MH+] -162 -146

[MH+] - 433-162= 271

coincide con perdida 2 hexosas

MS4 [271]

Fragmentación final estructura tipo flavona

Lc-Trap

¿Cómo Obtener Información Estructural en LC/MS de Compuestos No Aislados?: LC/MS/MS

Filtro

Masa

nº 1

SIM

Filtro Masa nº 2

SCAN

MS/MS del ión aislado (m1) en Q1

m1

m2

m1

Celda Colisión

rompe

+

+

+

+ Sistemas LC/MS/MS (QqQ / Q-TOF / TRAP):

se fragmenta en celda de colisión o

en la trampa de iones. Muy útil

cuando existe coelución de

compuestos (p.ej. en matrices complejas)

+TOF 5.688 to 5.849 min

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 1.6e5 1.7e5 1.8e5 1.9e5 132.0624

168.0385 203.0076

205.0046

170.0359 149.0898 133.0675 140.0202

[M+H]+=277 (Clenbuterol

totalmente

fragmentado.

con PERFIL ISOTOPICO)

NH

NH2

Cl

Cl

OH

CH3

CH3CH3

2Cl 1Cl

0Cl

Clenbuterol

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con

iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)

Q1 sólo deja pasar

el ión “precursor”

210 pass

190 210

210

Q3 monitoriza sólo los

fragmentos 158 y 191

característicos del ión

210 para cuantificar y

cualificar con máx.

sensibilidad

160

158

190

191

sin “fondo químico”

Espectro de

una

fenilurea

Celda Colisión

rompe el ión

210 (y sus

productos)

150 170 190 210

210 158

191

Transición: 210 158

QqQ- MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con

Máxima Sensibilidad, Selectividad y Rapidez

QqQ 3m

MS/MS con “masa exacta”: Q-TOF. Ideal para Identificación de picos desconocidos y su confirmación estructural.

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con

iones del

“fondo” (API:

ESI, APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor”

210 pass

190 210

210

Celda Colisión

rompe el ión

210 (y sus

productos)

Tubo de Vuelo monitoriza con “masa exacta” TODOS los

fragmentos característicos del ión 210 para cuantificar

y cualificar con máxima información

y seguridad.

DC Quad

Octopole 2

Ion Pulser

Ion Mirror

Detector

Turbo

Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión

150 170 190 210

210.122

158.123

191.021 Espectro completo

sin “fondo químico” y con “masa exacta”

Tipos Cuantificación por LC-GC/MS: Se cuantifican múltiples compuestos en 1 análisis con

cromatogramas de iones selectivos.

- Relativa: proporcional a la intensidad de señal en otra

muestra. Utilizada en estudios comparativos.

- Absoluta: construcción de curvas de calibrado con

patrones a distinta concentración..

x103

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

Abundance vs. Acquisition Time (min)

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

0.05 ng/µL (LLOQ)

0.25 ng/µL

0.50 ng/µL

2.50 ng/µL

5.00 ng/µL 0.15min

MRM 198.1108

A X mta

C X mta

Ácido Clavulánico 5 Levels, 5 Levels Used, 15 Points, 13 Points Used, 0 QCs

Concentración (Absoluta o Relativa)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

-4 x10

-0.25 0

0.25

0.5

0.75 1

1.25

1.5 1.75

2

2.25 2.5

2.75

3 3.25

3.5

3.75 4

4.25

4.5 4.75

Are

a p

ico

)

y = 4.1936E-005 * x - 2.7931E-007

R2 = 0.99474559

LLOQ: 0.05 ng/µL Clavulanic Acid in Plasma

ULOQ: (not determined)

Range: 0.05 ng/µL 5.0 ng/µL

LINEALIDAD 5 ORDENES

Posibilidades de la Espectrometría de Masas: Detección “Universal” de cualquier Compuesto Ionizado

1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.4e5

+TOF MS: 5.672 to 5.833 min lowhigh03.d Agilent

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290

277.087

279.084

Clenbuterol C12H18Cl2N2O

[M+H]+=277.0874

Con Herramientas de Deconvolución Cromatográfica (MFE) y Análisis

Estadístico Multivariante (MPP) adecuadas:

• Permite obtener un perfil de centenares/miles de compuestos.

• “Caracterizar” los compuestos a comparar por su tiempo retención y:

• LC/MS: por su masa exacta (3-4decimales).

• GC/MS: por su espectro de EI

deconvolucionado (o su masa exacta).

• Correlacionar:

• Variaciones en la concentración de metabolitos/peptidos.

• Con distintas propiedades de 2 o más grupos de

muestras comparadas (organismo, órgano, tejido, célula,

fluido,…).

Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su

Acoplamiento con HPLC o GC en Alimentación

• Identificar y Cuantificar compuestos presentes en un alimento, incluyendo trazas de contaminantes.

• Realizar cribados masivos de centenares/miles de compuestos.

• Correlacionar cambios en la composición de alimentos con sus propiedades:

– Autentificar muestras, detectar fraudes.

– Evaluar el impacto de un tratamiento en la composición / conservación de un alimento.

– Evaluar el impacto de la composición de un alimento (p. ej. alimento funcional) en el metaboloma.

• Evaluar el impacto de una dieta o alimento en las rutas metabólicas de un organismo.

• ....

Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su

Acoplamiento con HPLC en Metabolómica

• Identificar y cuantificar metabolitos a muy bajo nivel.

• Comparar la concentración de los metabolitos presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores.

• Evaluar el impacto en el metaboloma de factores exógenos (dieta/ fármaco/ entorno/…) o endógenos (p.e. enfermedad), a través del descubrimiento de las rutas metabólicas alteradas, o del seguimiento de los metabolitos involucrados en rutas concretas.

• ....

Aportaciones de la Espectrometría de Masas y su

Acoplamiento con HPLC en Proteómica

• Identificar las proteínas presentes en una muestra. Requiere de motores de búsqueda que identifiquen en bases de datos, a que proteínas pertenecen las m/z de los espectros de MS/MS (MS) de los mapas péptidicos.

• Comparar los niveles de expresión de las proteínas presentes en varias muestras, p.e. para localizar potenciales biomarcadores. Requiere motores de búsqueda que admitan esta opción (p.e. SpectrumMill)

• Cuantificar péptidos y proteínas a muy bajo nivel de concentración

• Determinar con gran precisión el peso molecular de un proteína

• Determinar el peso y secuencia de aminoácidos de un péptido

• Detectar PTM’s en proteínas (por búsquedas en modo homología o por secuenciación de péptidos con MS/MS)

• Estudiar interacciones –no covalentes- entre biomoléculas: complejos proteína-proteína, proteína-fármaco, proteínas-metal, enzima-inhibidor,,…..

• ....

DISEÑO EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE

MUESTRAS

Pesada

conservación 3. Si está en concentración muy inferior a interferentes

puede que no lo veamos

El equipo más preciso

no podrá aportar precisión si

no cuidamos la preparación

de la muestra ANÁLISIS = USTA

1. Si no está (perdida en filtrado, extracción)

no podremos analizarlo

2. Si está por debajo del limite de detección,

no podremos detectarlo

4. Si no sabemos lo que buscamos

pueden darse las tres anteriores

La selección adecuada de la muestra:

• Tiempo de exposición al tratamiento

• Recolección y conservación de la muestra etc.

La Muestra

SÓLO LO QUE SE IONIZA ES DETECTADO POR EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS

La Muestra

Alimentos

Fluidos biológicos

Tejidos

Cultivos celulares

• Compatibilizar la matriz con el análisis

• Todos los pasos previos de preparación de muestra sesgan los resultados

• Distintas técnicas aportan información complementaria: LC-MS, GC-MS

• Consideraciones prácticas:

• Utilización de controles: alícuotas de todas y cada una de las muestras analizadas

• Utilización de patrones internos

• En estudio con muestras de orina, corregir la dilución de las muestras

• Utilización de blancos: todos los reactivos de preparación de muestra aplicados sobre una matriz blanca sin muestra

La Muestra

Tipos de Muestra

Muchas

Gracias

Dra. Inma Alvarez

D. Miguel A. Martínez (J.U.)