Investigación en arbovirosis en el CISA:

Avances en el reconocimiento y control del virus de la fiebre del

Valle del Rift

Alejandro Brun Centro de Investigación en Sanidad Animal

INIA

II Jornadas sobre zoonosis y enfermedades emergentes: enfermedades virales transmitidas por mosquitos Barcelona. 23-24 de mayo de 2013

CISA. Laboratorio de biocontención Valdeolmos

ñ

11,000 m2 Nivel de seguridad biológica 3 y 3+

Findlay, G.M, 1932

Transmisión transovárica

Transmisión transovárica

Zoonosis

Mosquitos periurbanos

¿Roedores?

mosquitos

mosquitos

Epizootía Periodo interepizoótico

Clínica en el hombre

Madani et al., 2003

Líneas de investigación sobre FVR en el CISA-INIA

• Reconocimiento: Desarrollo de herramientas para la detección del virus, detección de infección (anticuerpos), clínica y patología en animales.

• Control: Desarrollo de estrategias de vacunación en modelos animales y su validación en rumiantes

RVFV (fam. Bunyaviridae): componentes estructurales

Glicoproteinas (Gn y Gc)

Nucleoproteina (N)

S M

L

SN P mock

Gc Gn

N

Polimerasa (L)

Envuelta lipídica

ssRNA(-) L,M, S

80-120nm

RVFV: genoma viral

S M

L

ssRNA(-) L,M, S •RNA tri segmentado, polaridad negativa •Circular 5’-3’ NCRs “panhandle” •Variabilidad del genoma (total: 5%) •Seg M más variable entre aislados

Detección e identificación molecular de aislados del RVFV

CGGACTTGGAGACTTTGCATCA

...G.................. W

.................T.... SA-75

..................G... Zimbabwe 70

S-segment

ACGTTGCACCTCCACCAGCGAAGC

...................A.... SEC

.T.................A.... Wf

G..................A.... KenyaIB8/65

ACAAGGTTCCCCAATCTGAAAGAA

.................A...... SEC

...................G.... ArD38388

.......................G 2269/74

TTCTTTGCTTCTGATACCCTCTG

....................T.. ArD38388

..............C........ SECa

........A.............. SECb

.....C................. SECc

.....C........C........ SECd

AGGGGCCTGTGTGGACTTGTGCAA

......................G. SECe

......................T. ArD38388

CAGATGATGCAAGGAAGTGGAAC

................A...... SA-51

L-segment

Fwd primer FAM-probe (rc) Rev primer (rc)

Rev primer (rc) Cys5-probe Fwd primer

Aed

es-L

Man

sonia

-L

Aed

es-S

Man

sonia

-S

102

103

104

105

106

107

108

109

GE

C/m

l

Mwaengo et al., 2012

Detección de RVFV en mosquitos mediante RT-qPCR

Variabilidad del segmento M

cDNA RVFV-Segmento M

Regiones de > variabilidad de secuencias

cDNA RVFV-Segmento M

Amplificación de la region 3’ del cDNA segmento M

cDNA RVFV-Segmento M (amplicón 480nt)

MRV1(ag) Emfwd(ag) Emrev(g) cDNA primer

1 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 1 1

0.5kb

secuenciación

Amplificación de la region 3’ del cDNA segmento M

Mosquito pooles

0.96

1

1

1

0.99

0.29

1

1

1

0.82

0.28

1

0.96

1

1 1

0.98

1 0.93

0.96

1

0.95

1

0.28

0.36

0.06

1

Mwaengo et al., 2012

Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados

Detección e identificación molecular de aislados del RVFV (resumen)

RVFV: nucleoproteína N

Nucleoproteina (N)

S M

L

ssRNA(-) L,M, S •Altamente conservada entre aislados •Muy abundante e inmunogénica •Anticuerpos anti-N en suero: evidencia de infección en animales

Desarrollo de tests serológicos

Martín Folgar et al., 2010

Empleo de AcMo anti-N en ensayos de competición

El-Harrak et al., 2011

Detección de anticuerpos anti-RVFV en sueros de camellos en el Norte de Africa

PLACA ANTIGENADA

LAVADO

NEGATIVO POSITIVO

LAVADO

Proteína N

ADICIÓN MUESTRA Sueros 1/5 1h 25ºC

IgM

IgG

PROTEÍNA- PEROXIDASA 1h 25ºC

SUBSTRATO 15 MIN

Proteína

N+PO

Utilización de la proteína N recombinante en ELISA anti-FVR DE DOBLE RECONOCIMIENTO DR (Ingezym FVR-DR, Ingenasa)

Expresión y purificación De Trx-N en E.coli

Van der Vaal et al., 2012

Empleo de proteínas N y Gn recombinantes para la detección simultánea de anticuerpos mediante técnica Luminex

5.6um

Gn N

Fluorescencia roja e infrarroja

Fluorescencia verde

Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados

Detección e identificación molecular de aislados del RVFV

Desarrollo de test serológicos (resumen)

Desarrollo de un ELISA de competición mediante AcMo Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Desarrollo de ELISA comercial de “doble reconocimiento” Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Mejora la detección de IgMs o IgAs específicas Desarrollo de ELISA Luminex Detección simultánea de anticuerpos anti Gn y N Discriminación de animales vacunados /infectados

FVR: necesidad de nuevas vacunas

• Mejorar la eficacia y seguridad de las vacunas actuales

• Varias opciones de éxito: vectores virales, genetica reversa, virus atenuados..

• Antígenos diana: glicoproteinas GnGc

• Vacunas animales y humanas necesarias

Desarrollo de vacunas experimentales para RVF

Vacunas de ADN

• Facilidad de producción y conservación y transporte

• Expresión intracelular de antígenos (virus-like)

• Excelentes resultados en modelos de infección en ratón

• Vacunas DNA comerciales para WNV (USA) y IPNV

Vacunas basadas en el vector viral MVA

• Vector muy atenuado (pérdida de factores de virulencia)

• Bajos niveles de replicación en células de mamífero

• Altamente inmunogénico

• Buen inductor de respuestas T

• Aplicación en ensayos clínicos humanos

Mecanismos de presentación de antígenos tras una vacunación ADN/Vector

Muscle/ skin cell

Secreted/Released antigen

APC

B-cell

IMMUNE RESPONSE

T-cell

T cell

Antigen Presenting Cell

Plasmid/Viral vector

21 480 2091 3614 1103 1842

1 1198 691 154 RVFV M segment cDNA

pCMV-M4 Gn Gc

nt

aa

Met4

pCMV-M4 pCMV

Construcción de vectores vacunales pCMV-M4 y MVA-GNGc

tPA leader

VV p7.5

pb9 V5 tag

VV p11 gfp TKL TKR

250 150 100 75

50

37

25

20

15

Mr

anti-Gn anti-Gc

MVA-GnGc Gn Gc

Met4

Esquema de immunización y desafío en ratones Balb/c

Desafío RVFV cepa 56/74

Prime: pCMV-M4

Boost: pCMV-M4 ó MVA GnGc ¿Morbilidad?

¿Mortalidad?

0 15 30 50 Días post inmunización

Días post desafío 0 20

Signos clínicos: 5/7

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100pCMV (control)

pCMV-M4

DIA PI

su

perv

iven

cia

(%

)

contr

ol

pCM

V-M

4

0

1

2

3

4

5

6

vaccine groupslo

g 1

0 T

CID

50

pCM

V-M

4

0

100

200

300

400

500

VN

T 5

0“prime-boost” homólogo: pCMV-M4 + pCMV-M4

supervivencia

neutralización

Viremia 3dpi

(López-Gil et al, 2013)

Mejoría en los signos clínicos tras prime boost

contr

ol

pCM

V-M

4

pCM

V-M

4 +

MVA-G

n/Gc

0

1

2

3

4

5

6

vaccine groups

log

10 T

CID

50

Signos clínicos: pCMV- MVA: 2/7 pCMV-M4: 5/7

pCM

V-M

4+M

VA-G

n/Gc

pCM

V-M

4

0

100

200

300

400

500

VN

T 5

0

supervivencia

neutralización

Viremia (3dpi)

“prime-boost” heterólogo: pCMV-M4 + MVA GnGc

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100pCMV-M4+ MVAGnGc

pCMV+MVA (control)

DIA PI

su

perv

iven

cia

(%

)

(López-Gil et al, 2013)

pCM

V-M

4+M

VA-G

n/Gc

pCM

V-M

4

MVAGnG

c

0

100

200

300

400

500

VN

T 5

0

contr

ol

pCM

V-M

4

pCM

V-M

4 +

MVA-G

n/Gc

MVA-G

n/Gc

0

1

2

3

4

5

6

vaccine groups

log

10 T

CID

50

Signos clínicos a 3dpi: pCMV- MVA: 2/7 pCMV-M4: 5/7 MVA GnGc: 0/7

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100MVA (control)

MVA-GnGc

DIA PI

su

perv

iven

cia

(%

)MVA GnGc 1X (dosis única)

supervivencia

neutralización

Viremia (3dpi)

Sin clínica aparente

(López-Gil et al, 2013)

Identificación de péptidos MHC-I en la secuencia de las glicoproteínas Gn y Gc

peptide GnGc peptides

1 LYRALKAII

2 PPHKKRVGI

3 TYAGACSSF

4 SYAHHRTLL*

5 CSHANGSGI

6 LVLGNPAPI

7 SYASACSEL

8 CGGWGCGCF

9 CFNVNPSCL

10 SCLFVHTYL

11 SGSNSFSFI

12 ESPGKGYAI

13 SYKPMIDQL

14 GGPLKTILL

15 LYVALSIGL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15pb9

pha

0

50

100

150

200

250

GnGc peptide #sfu

/10

6cells

4 SYAHHRTLL

13 SYKPMIDQL

14 GGPLKTILL

IFN-g ELISPOT

(López-Gil et al, 2013)

4 13 14 150.0

0.5

1.0

1.5

2.0

peptide #

% IF

N- g

secre

tin

g C

D8

+

4 13 14 150.0

0.5

1.0

1.5

2.0

peptide #

% IF

N- g

secre

tin

g C

D8

+

4 13 14 150.0

0.5

1.0

1.5

2.0

peptide #

% IF

N- g

secre

tin

g C

D8

+

P=0.0028 MVAGnGc MVAGnGc (2x)

pCMV-M4 + MVA GnGc pCMV-M4

4 13 14 150.0

0.5

1.0

1.5

2.0

peptide #

% IF

N- g

secre

tin

g C

D8

+

P=0.0005

P=0.1713 P=0.0492

**

* * ***

* *

Cuantificación de linfocitos T CD8+ específicos estimulados por péptidos clase I (ICCS)

(López-Gil et al 2013)

• Tanto la vacunación con DNA como MVA inducen protección en ratones tras un desafío letal.

• El prime-boost heterólogo reduce la aparición de signos clínicos con respecto al homólogo

• La protección conferida por una dosis de MVAGnGc se produce en ausencia de signos clínicos y viremia

• En todos los casos se produce una respuesta modesta de anticuerpos neutralizantes

• Se han descrito péptidos restringidos por clase I que podrían ser importantes en la inducción de respuestas CD8+ (citotóxicas y de memoria)

Desarrollo de vacunas experimentales para RVF

0

Inmunización: 400ug de pCMV-M4 ID (oreja) IM (pata trasera)

16 30

1ª inmunización

26 10

Suero

38

Esquema de inmunización de ovejas con plásmido pCMV-M4

días

Boost RVFV MP12 (atenuado)

113

2ª inmunización 3ª inmunización

Suero Suero

Aplicación de las vacunas en modelos de infección ovinos

10 26 38

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200pCMV M4

pCMV (control)

dias post primera inmunización

VN

T 5

0

“DNA prime”

“MP12 boost”

> 2 meses

0 1 2 3 4 5 7 9 11 14 16 18 21 28 381

2

3

4

pCMV M4

pCMV (control)

dias post MP12 boost

log

VN

T5

0

pCMV-M4 en ovejas: anticuerpos neutralizantes

Lorenzo et al , unpublished

Esquema de inmunización de ovejas MVA GnGc

Aplicación de las vacunas en modelos de infección ovinos

rMVA 108 pfu

rMVA-GnGc 108 pfu G1 n=6

RVFV 56/74

105 TCID50

Inoculación s.c Desafío (sc) Necropsia

14

G2 n=6

0 30

Control saline G3 n=7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1338

39

40

41

42

43

rMVAGnGc

MVA control

non-vaccinated

Mean temperatures

days postchallenge

tem

pera

ture

ºC

rMVA-GnGc

14 23 300

1

2

3

4

days post immunization

log

VN

T 5

0

rMVA control

14 23 300

1

2

3

4

days post immunization

log

VN

T 5

0

Non-vaccinated control

14 23 300

1

2

3

4

days post immunization

log

VN

T 5

0

MVA GnGc en ovejas: pirexia, anticuerpos neutralizantes

Hisopo nasal

3 5 70

2

4

6

8MVA GnGc

MVA control

Non-vaccinated

dias post desafío

log

TC

ID50

Sangre

3 5 7 90

2

4

6

8MVAGnGc

MVA (control)

Non vaccinated control

log

TC

ID50

Hisopo bucal

3 50

2

4

6

8MVAGnGc

MVA control

Non-vaccinated

log

TC

ID50

Busquets et al , unpublished

desafío

Agradecimientos • Elena López (CISA, Madrid) • Gema Lorenzo (CISA, Madrid) • Raquel Martin (UNED, Madrid) • Esther Hevia (Ingenasa, Madrid) • Hani Boshra (NCFAD, Winnipeg) • Paco Mateos (CISA, Madrid) • Belén Borrego (CISA, Madrid) • Sarah Gilbert (Jenner Institute, Oxford) • Matt Cottingham (Jenner Institute, Oxford) • George Warimwe (Jenner Institute, Oxford) • Gertrude Gerdes (OVI, Onderstepoort) • Shirley Smith (OVI, Onderstepoort • Clarence J. Peters (UTMB, Galveston) • Bob Tesh (UTMB, Galveston) • Paz Sánchez Seco (ISCIII, Majadahonda) • Ramón Soriguer (EBD, Doñana) • Jeroen Koortekaas (CVI, Lelystad) • Rob Moormann (CVI Lelystad) • Friedemann Weber (Phillipps University, Marburg) • Michele Bouloy (Institut Pasteur) • Martin Eiden (FLI, Insel Reims) • Martin Groschup(FLI, Insel Reims) • Mariano Domingo (CReSA, Barcelona) • Xavier Abad (CReSA, Barcelona)

• Nuria Busquets (CReSA, Barcelona) • Fernando Rodríguez (CReSA, Barcelona) • Raquel Rivas (CReSA, Barcelona) • Albert Bensaid (CReSA, Barcelona) • Nicola G Abrescia (CIS-Biogune, Bilbao) • Richard P. Bishop (ILRI, Nairobi) • Rosemary Sang, KEMRI, Nairobi • Dufton Mwaengo (ILRI, Nairobi) • Antonio López Sebastian (INIA, Madrid) • Pilar Pallarés (INIA, MAdrid) • Mónica Morales (UNED, Madrid) • Jesús Bermejo (Hospital Clínico, Valladolid) • Antonio Sanz (Ingenasa, Madrid) • Gerónimo Fernandez (Fac Quimicas, Alcalá) • Dolores Rodríguez (CNB, Madrid)