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Tincin simple

Los numerosos tipos de colorantes empleados para teirmicroorganismos poseen dos caractersticas en comn

1) Todos poseen grupos cromforos. Grupos con doblesenlaces conjugados que dan color al colorante.Pueden unirse a las clulas mediante enlaces inicos, covalentes oFigura4.1

2) hidrfobo. Por ejemplo un colorante cargado positivamente se une aestructuras cargadas negativamente a la clula. (figura4.1)

Los los colorantes ionizantes se pueden dividir en dos clases generales tomandocomo base la naturaleza de un grupo cargado

1) Los colorantes bsicos - azul de metileno, fucsina bsica, cristalvioleta

verde malaquita, son cationicos o tiene grupos cargados positivamente(normalmente alguna forma de nitrgeno pentavalente) . los colorantebsicos se unen a molculas cargadas negativamente, como cidosnucledos y muchas protenas .como las superficies de las clulasbacterianas estn cargadas negativamente estos colorante se emplean amenudo en la bacteriologa.

2) Colorantes cidos - eosina ,rosa de bengala y fucsina acida --- sonanionicos o posen grupos cargados negativamente ,como carboxilos( -COOH) e hidroxilos fenolicos (-OH) Los colorantes cidos debido a sucarga negativa se unen a estructuras celulares cargadas positivamente.

El pH puede modificar eficaz mente la tincin ,pues la naturaleza y elgrado de la carga de los componentes celulares cambian con el mismo.Poe ello los colorantes anionico tien mejor en condiciones acidas , en quelas protenas y muchas otras molculas poseen una carga positiva .loscolorantes bsicos son ms eficientes a valores de pH ,ms elevados.

Se fijan mediante interacciones inicas estos se unen tambin por mediode enlaces covalentes, su accin se debe a sus caractersticas de

solubilidad por ejemplo: el DNA se puede teir con el mtodo de FeulgenLos microorganismos se pueden teir satisfactoriamente mediante latincin simple.Los colorante s bsicos como cristal violeta , azul de metileno ,carbolfucsinase emplean con frecuencia para determinar la forma el tamao y aorganizacin delas bacterias.

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TINCION DIFERENCIAL

Gram,(1884) descubri que algunos m.o. (Gram +) contienen ciertos

elementos en la pared celular en gran cantidad, dispuestos en forma muydiferente a la de otros (Gram -) y forman con los colorantes derivados de larosanilina (violeta de genciana, cristal violeta) ms el yodo, un compuestoque resiste la accin de decolorantes (alcohol absoluto, alcohol acetona).

tincin de gram

Los mtodos de tincin diferencial clasifican a las bacterias en gruposdiferentes segn sus propiedades de tincin, las bacterias se dividen en dosclases gram negativas y gram positivas.

En el primer paso de la tincin los frotis se tien con colorante bsicocristal violeta , el colorante primario.Acontinuacion se trata con solucin yodada que acta como mordiente , deforma que aquella se tie ams firmemente , luego se decolora el frotislavndolo con alcohol cetona . las bacterias gran positivas retiene el cristalvioleta ,mientras que las gran negativas lo pierden y aparecen incolorasfinalmente se tie con un colorante bsico de diferente color al cristalvioleta. La safranina es el colorante de contraste mas comn y tie las grannegativas de color rosa o rojo y deja las gram positivas violetas.

Fundamento

La tincin de gran requiere cuatro soluciones

1. Primer colorante ; es un colorante bsico crital violeta2. Solucin mordiente : fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el

colorante y la celula ,suelen ser sales metalicas ,acidos o bases porejemplo una solucin diluida d e yodo.

3. Aguente decolorante : es un disolventeorganico por ejemplo alcohol cetona

4. Colorante de contraste : colorante bsico dedistinto color que el primer colorante ejemplola safranina (figura 4.2)

Figura 4.2

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Realizacin(figura 4.3)

1. Preparar el frotis bacteriano

2. Teir con cristal violeta 1 minuto

3. Lavar con abundante agua el exeso de colorante

4. Cubrir con lugol 1 minuto

5. Lavar con abundante agua

6. Decolorar con alcohol cetona 15 seg

7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto del disolvente

8. Teir con safranina 1 minuto

9. Lavar con abundante agua ara eliminar el colorante de contraste

10.Secar la preparcion

11.Observar al microscopio diferenciar la morfologa y el color

Figura 4.3

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Medios de cultivo

Gran parte de los estudios en microbiologa depende de la capacidad decultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, mediante cultivos

adecuados.Un medio de cultivo es un preparacin liquida o solida utilizada para ecrecimiento, trasporte o mantenimiento de microorganismos. Los mediosespeciales son imprescindibles para aislar o identificar los microorganismos,evaluar sensibilidad antibitica analizar agua y alimentos.El conocimiento del habitad del microorganismo es til para elegir el medio de

cultivo apropiado por que sus necesidades de nutrientes reflejan su ambientenatural . un medio se utiliza para seleccionar o cultivar microorganismosespecficos o para facilitar la identificacin de un especie.CO2 como fuente de carbono nitrato o amonio como fuente de nitrgeno, sulfato,fosfato y diversos minerales. Esta clase de medio de la que se conocen todos los

componentes se denominan medio definidos o medio sintticos.Medios complejos: son los que contiene algunos ingredientes cuya composicinqumica se desconoce. Son muy tiles, pues un nico medio puede ser suficientepara satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos . losmedios complejos se necesitan por que a menudo se desconocen lasnecesidades nutricionales de un microorganismo. Estos medio contiene peptonas ,extracto de carne y levadura.

El agar es un polmero sulfatado normal mente extrado de algas rojas,compuesto por D-galactosa, 3,6 anhidro-L-galactosa y acido D-glucoronico.Se funde en agua hirviendo puede enfriarse hasta una temperatura de 40-42

grados centgrados, y no fundir de nuevo hasta que no se alcance unatemperatura de 80 a 90 grados centgrados .

Por su ASPECTO FSICO, los medios de cultivo preparados pueden ser:Lquidos,Semislidos,Slidos.

(figura 4.6)

Figura 4.6

Tipos de medios

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Los medio como el caldo y el agar de triptona y soja se denominan medios porque mantiene elCrecimiento de muchos microorganismos.Se le pueden incorporar a estos medios la sangre y otros nutrientes para

favorecer el crecimiento de los hetertrofos, a estos medios se le denominamedios enriquecidos.

Clasificacin de Medios de Cultivo

Segn su composicin Segn al uso que se destinan

Medio sinttico definidos Medio SelectivoMedios minimos Medios DiferencialesMedios complejos Medios Enriquecimiento

Agar o caldo nutritivo: (AN,CN)Medio econmico para microorganismos que no sean muy exigentes en susrequerimientos, normalmente contiene peptonas, extracto de levaduras o carne yNaCl.

Agar de Enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado tipo demicroorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto .(figura4.7)

Figura 4.7

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Los medio selectivos: Favoresen el crecimiento de microorganismosparticulares.Las sales biliares o colorante como la fucsina bsica y el cristal violetafavoreciendo el crecimiento de los gran positivos. Los mediosAgar endo , eosina azul de metileno y macconkey se emplean para detectar

E.coli y bacterias relacionadas en suministros de agua , contienen colorantes quesuprimen el crecimiento de las gram positivas. Un medio que contenga celulosacomo nicamente fuente de carbono y energa es bastante eficaz para aislarbacterias y digieran celulosa. (figuira 4.8)

Figura 4.8

Medios diferenciales : son mediso que diferencian entre grupos distintos debacterias e incluso permiten una identificacin tentativas de los microorganismos ,segn sus caractersticas biolgicas . (Figura 4.9)

Figura 4.9

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Caractersticas del Cultivo

Una de las caractersticas principales de las bacterias es su apariencia

(caractersticas de desarrollo) seguida del crecimiento en diferentes medios decultivos. Estas caractersticas generales como el color o cromo gnesis,abundancia de crecimiento, olor del cultivo nos pueden servir para la identificacin.

Para determinar caractersticas del un cultivo puro podemos observar lossiguientes aspectos:

1. Tipo de colonia en agar (cultivo en placa)2. Desarrollo en agar inclinado3. Desarrollo en caldo

4. Desarrollo en gelatina

Los cultivos inclinados en agar se preparan haciendo la inoculacin por estriascon asa de siembra de la mitad hacie arriba de la zona inclinada . para los cutivospor picadura se deven usar agujas de siembra rectas introducidas a la gelatina enlnea recta desde la superficie hacie le fondo del tubo y retirarlo del mismo lugar.Los tubos de caldo se siembran con asa o aguja de siembra .

Colonias en placas de agar

Tamao: varan los limites desde muy pequeas punta de alfiler , que midenfracciones de milmetro de dimetro hasta otras muy grandes que miden de 5 10 milmetros de dimetro .

Margen o borde: pueden formar un crculo perfecto como una gota , o mostrarirregularidades como salientes redondos , hendiduras irregulares , proyeccionesfiliformes o proyecciones en forma de raz.

Elevacin: las colonias pueden ser finas ( aplanadas ) o gruesas ( elevadas)Las elevadas muestran diferentes grados de convexidad,

Cromo gnesis o pigmentacin: las colonias pueden estarcoloreadas(pigmentadas) o sin color ( no pigmentadas) algunas especies secaracterizan por matices rojo, amarillo, caf y violeta .

Caractersticas pticas: opacas , trasparentes u opalescentes

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Desarrollo en agar inclinado por estras

1. Cantidad : Escaso , moderado o abundante

2. Margen : uniforme o incluso presentando varias irregularidades3. Consistencia de la masa: mantecosa o de mantequilla , fcilmenteremovible por asa, viscosa o filamentosa, seca y brillante.

4. Cromo gnesis : similar a la descrita para las colonias.

Desarrollo de cultivo nutritivo:

1. Cantidad : escaso , moderado o abundante2. confinado a la superficie del caldo como nata o pelusa o desarrollo que se

desarrolla como sedimento que es granular o viscoso3. Olor : ptrido, a frutas o aromatico o inperseptible

Desarrollo en gelatina por picadura

1. Desarrollo ( sin liquefaccion) alo largo de la lnea de inoculacin2. Liquefaccion de la gelatina : dedde arriba o adquirir aspectos variados

de embudos al licuarla. (figura 5.0)

Figura 5.0

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Morfologa y crecimiento de colonias

Las especies forman a menudo colonias con aspecto y forma caracterstica . enuna poblacin heterogenia de clulas microbianas es posible identificar la coloniadeseada por su aspecto general y utilizarla para obtener un cultivo puro.

El crecimiento celular ms rpido se produce en el extremo de la colonia .El crecimiento es ms lento en las partes centrales, en algunos casos se llega

producir una autolisis celular. Parece que estas diferencias en el crecimiento sedeben a gradientes de oxigeno, nutrientes y productos txicos dentro de lacolonia . en el extremo de esta el oxigeno y los nutrientes son abundantes. Elcentro de la colonia es ms grueso que el extremo. Por ello el oxigeno y losnutrientes no difunden tan fcilmente, los meta bolitos toxico no pueden eliminarsefcilmente y el crecimiento es ms lento o est detenido.

Morfologa colonial en placa

El desarrollo de colonias sobre superficie de agar permite identificar a las bacteriasporque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspectocaracterstico.Colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color

consistencia etc, y pueden ser diferenciadas sobre las bases. Cada colonia aisladaesta constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la decenciade una sola clula y por tanto, un cultivo puro.

Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas , fisiologas, etc. De unabacteria, se necesita que esta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en cajade petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de unaporcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su purezadespus de la incubacin apropiada ,mediante observaciones al microscopio.La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto ydebe familiarizarse al alumno con ella.La terminologa mencionada a continuacin sobre algunas de las caractersticasMas constantes de una colonia bacteriana es muy til.

Forma:Peniforme ,circular ,irregular, alargada ,fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.

Tamao:Estimar el dimetro en mm

Superficie ;

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Lisa, rugosa, cerebriforme , en anillos concntricos.etc

Elevacin:Aplanada, elevada, pulvinada ,convexa, umbonada,umblicada.etc

Estructura interna:Amorfa,o granulosa

Borde :Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso etc.

Color:Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz trasmitida , puede ser decolor blanco , rojo ladrillo , anaranjado etc.

Opacidad:Trasparente, opaca, etc.

Consistencia:Dura, viscosa, membranosa , gelatinosa ,mucosa ,etc.Usar el asa bacteriolgica para determinar la consistencia.(Figura5.1)

Figura 5.1

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Pruebas bioqumicas

Se realizan tras estudios de caractersticas tintoriales , morfolgicas y bioqumicasde los microorganismos . la identificacin bioqumica se basa en la habilidad de la

bacteria de producir enzimas fcilmente detectables. En las caractersticasmetablicas especificas de cada microorganismos. Existen en el mercado enormevariedad de medios de cultivo diseados no solo para permite el crecimiento y lamultiplicacin, si no tambin para inhibir los de otros microorganismos ( medioselectivo) o resaltar determinadas caractersticas metablicas (mediosdiferenciales)

Objetivos

1. Aprender a interpretar algunas de las pruebas bioqumicas de identificacinbacterianas.

2. Aplicar tcnicas de agotamiento por estras para la obtencin de cultivospuros3. Practicar la tcnica de trasferencias de cultivos puros

Material necesario

Medios de cultivo :a) Agar macconkey en placab) Agar sangre en placac) Agar citrato de Simmons en slant

d) Agar dekliger (klinger iron agar KIA ) en slante) Agar fenilalanina en slantf) Agar manitol sal en slantg) Caldo de triptona con NaCl al 0.5% en un tubo}h) Caldo RMVP en tubo

Reactivo

a) Para la prueba de la citocro c oxidasab) Para pa prueba de la catalasac) Para la prueba de la felilalanina desaminasa

d) Eactivo de kovacse) Hidroxodo potacico 0.1 M }f) Alfa naftol

Cepas bacteruanas :

Cultivo mixto de una enterobacteria y un coco gran positivo( estaphylococusstreptococus.)

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Los medios de cultivo en la microbiologa

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales

preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los

microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos

es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

(figura 3.0)

Figura 3.0

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y

presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o

alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores decrecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo

contaminante.

La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en

composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de

muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la

que se aadirn otros ingredientes.

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El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,

son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener,

como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos

casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del

crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para

ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que

tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin deestas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida

de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de

nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen

utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los

aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la

peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a

muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente

pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,

magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,

generalmente de naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de

ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

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Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo

productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en

estado semislido o slido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al

punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est

ampliamente extendido en el laboratorio.(figura 3.2)

Figura 3.2

3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de

oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados

sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn

adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio,

los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas

parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los

anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de

las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en

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los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las

estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as

que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los

microorganismos fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pHneutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe

olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el

crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos

metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y

43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a

temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos

humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C,

y los saproftos tienen rangos ms amplios.

8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar

perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan

alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los

especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los

medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como

agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo

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Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como

ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la

observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a

punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan

dos importantes puntos de inflexin en su evolucin.

La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo

Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos

realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para

las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister

populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en

un medio lquido.

Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de

patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carnelquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio

slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las

colonias microbianas.(figura 3.3)

Figura 3.3

En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en

relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el

agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante.

http://www.danival.org/gente/koch.htmlhttp://www.danival.org/gente/koch.html

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En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal

planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas

bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre

las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo)

tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de

enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial

composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos

que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar

para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando

indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda

observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado fsico:

lquidos

semislidos

Slidos

(Figura 3.4)

Figura 3.4

Atendiendo a su utilidad prctica:

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Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia

variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn

enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX,

FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las

bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se

aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de

bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las

sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac

Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la floracompetitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado

(Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas

especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de

bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).

Medios para identificacin:

Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las

peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo)

especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados

se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria

(Oxidacin-Fermentacin)

Bibliografa

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