IQ-2005-I-16 Producción de la enzima recombinante alfa-L ...
88
IQ-2005-I-16 Producción de la enzima recombinante alfa-L-arabinofuranosidasa B de Fusarium oxysporum en E.coli y estudio de k L a y P/V como parámetros de escalamiento del sistema Héctor Fabián González Rodríguez Universidad de los Andes Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Química Bogotá, 2005
Transcript of IQ-2005-I-16 Producción de la enzima recombinante alfa-L ...
IQ-2005-I-16
Producción de la enzima recombinante alfa-L-arabinofuranosidasa B de Fusarium oxysporum en E.coli y estudio de kLa y P/V como parámetros
de escalamiento del sistema
Héctor Fabián González Rodríguez
Universidad de los Andes
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química
Bogotá, 2005
IQ-2005-I-16
2
Producción de la enzima recombinante alfa-L-arabinofuranosidasa B de Fusarium oxysporum en E.coli y estudio de kLa y P/V como parámetros
de escalamiento del sistema
Héctor Fabián González Rodríguez
Tesis de grado para optar por el título de
Ingeniero Químico
Director
Patricia Del Portillo
Microbióloga
Director
Diana Marcela Tabima
Ingeniera Química
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
IQ-2005-I-16
3
Nota de Aceptación
Director
Director
Jurado
Jurado
Bogotá, Junio de 2005
IQ-2005-I-16
4
Agradecimientos
A mis padres por su apoyo incondicional.
A Tatiana por alentarme cuando me estaba sacando canas la tesis.
A la familia CorpoGen, en especial a Patty y Mechas por abrirme las puertas
y darme la oportunidad de hacer un proyecto de este tipo. A Carlos por su
colaboración y apoyo. A Rodrigo, Diana, Paola, Vicky, Juanito, Claudia,
Vicman, Sonia, Erwin, Andrés, Juanita, Alejo, Maria T, Luz Ma, Fer, Clarita,
El Doctor por ayudarme y hacerme parte de la familia CorpoGen.
Al Departamento de Bioquímica, en especial a Alfredo Uribe por su
colaboración con el sonicador.
A José Maria Robles.
Al Miñosaurio, por ser mi compañero incondicional, y mi socio.
Y a todas las demás personas que de alguna u otra forma me apoyaron para
poder sacar este proyecto de grado adelante.
IQ-2005-I-16
5
Índice 1. Introducción...............................................................................................................7 2. Resumen ....................................................................................................................9 3. Glosario ...................................................................................................................11 4. Objetivos..................................................................................................................12
4.1. General .............................................................................................................12 4.2. Específicos........................................................................................................12
5. Marco Teórico .........................................................................................................13 5.1. Fusarium oxysporum f. sp. dianthi ...................................................................14 5.2. α-L-ARABINOFURANOSIDASAS (AF) ......................................................15 5.3. Antecedentes de las α-L-ARABINOFURANOSIDASAS .............................15 5.4. Genes clonados de α-L-Arabinofuranosidasas.................................................16 5.5. E. coli................................................................................................................17 5.6. Funcionamiento de la cepa recombinante ........................................................18
5.6.1. Plásmido y cepa de expresión ...................................................................18 5.7. Proceso de fermentación...................................................................................20 5.8. Fases del crecimiento microbiano ....................................................................21 5.9. Biorreactores.....................................................................................................22 5.10. Parámetros de Escalamiento...........................................................................23
5.10.1. Métodos de escalamiento ........................................................................24 5.10.2. Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Oxígeno...........................26 5.10.3. Potencia por unidad de Volumen ............................................................28
6. Materiales y Métodos ..............................................................................................29 6.1. Pruebas previas al biorreactor...........................................................................29
6.1.1. Recuperación y aislamiento de la cepa .....................................................29 6.1.2. Confirmación de la cepa BL21-pET-ABF por PCR ..................................29 6.1.4. Aislamiento y solubilización de los cuerpos de inclusión .........................31 6.1.5. Renaturación de la proteína y determinación de su actividad ..................32
6.2. Pruebas en el biorreactor ..................................................................................33 6.2.1. Preparación del inóculo ............................................................................33 6.2.2. Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno del medio de cultivo (kLa) .........................................................................................................33 6.2.3. Pruebas de kLa con la cepa recombinante ................................................34 6.2.4. Pruebas de P/V ..........................................................................................34
7. Resultados................................................................................................................36 7.1. Aislamiento de la cepa recombinante...............................................................36 7.2. Confirmación de la cepa BL21-pET-ABF por PCR........................................36 7.3. Estandarización de condiciones óptimas in Vitro.............................................37 7.4. Prueba protocolo de sonicación........................................................................37 7.5. Concentración y cuantificación de la proteína recombinante obtenida en la prueba de pH............................................................................................................38 7.6. Pruebas de kLa ..................................................................................................39
IQ-2005-I-16
6
7.7. Pruebas de P/V .................................................................................................40 7.8. Estandarización de un método para la producción de la proteína recombinante en biorreactores........................................................................................................42 7.9. Resultados fermentaciones kLa........................................................................48 7.10. Resultados fermentaciones P/V......................................................................50 7.11. Renaturación de la proteína y prueba de actividad.........................................52
8. Análisis de Resultados.............................................................................................54 8.1. Importancia de la PCR para trabajos con sistemas recombinantes .................54 8.2. Importancia del control de pH..........................................................................55 8.3. Sensibilidad de los sistemas recombinantes a la temperatura ..........................58 8.4. Fases del crecimiento de la cepa recombinante y expresión del producto de interés ......................................................................................................................59 8.5. Concentración y purificación de proteínas .......................................................61 8.6. Actividad de la proteína recombinante.............................................................63 8.7 Efectos de la escala en la producción de la proteína recombinante...................64 8.8 Parámetros de escalamiento...............................................................................66
8.8.1 Ubicación de éste proyecto dentro del proceso de escalamiento...............66 8.8.2. kLa como parámetro de escalamiento .......................................................67 8.8.3. P/V como parámetro de escalamiento.......................................................69
Conclusiones................................................................................................................71 ANEXO 1 ....................................................................................................................73 Conceptos Biológicos ..................................................................................................73
Promotores...............................................................................................................73 Promotor lac ............................................................................................................75
ANEXO 2 ....................................................................................................................77 Métodos Moleculares ..................................................................................................77
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)..........................................................77 Componentes de la Reacción...................................................................................77
DNA Polimerasa..................................................................................................77 Deoxinucleósidos trifosfato (dNTP´s) .................................................................77 Cloruro de Magnesio...........................................................................................77 Iniciadores (Primers) ..........................................................................................78 Buffer de Reacción ..............................................................................................78 DNA Objetivo ......................................................................................................78
Pasos de la PCR.......................................................................................................78 Electroforesis ...........................................................................................................79
SDS-PAGE...........................................................................................................80 Sonicación ...............................................................................................................81 Método Bradford (Prueba para cuantificación de proteínas)...................................82
IQ-2005-I-16
7
1. Introducción
La biotecnología ha logrado despertar el interés conjunto de la microbiología
y la ingeniería para desarrollar productos de interés a escala industrial,
aprovechando los sistemas biológicos para desarrollar productos de uso
común. Después de entender el fundamento de las fermentaciones y la
producción de metabolitos, la tercera era de la biotecnología ha logrado
introducir la manipulación genética como una herramienta para la producción
de sustancias y aceleración de procesos estandarizados en la industria. Sus
alcances se ven desde enzimas de uso común en investigación como la Taq
DNA polimerasa hasta vacunas aprobadas mundialmente como la de la
Hepatitis B (Hepatitis B, 2005). Ahora, el reto para la ingeniería se enfoca en
entender, controlar y optimizar el comportamiento de sistemas biológicos
para poder generar productos de nueva tecnología aprovechando las
técnicas del ADN recombinante [Scragg, 1997].
Es por esto, que aprovechando el apoyo de centros de investigación
colombianos en el área de biología molecular como la Corporación
CorpoGen, se plantea este proyecto con el fin de estudiar más a fondo el
comportamiento de un microorganismo genéticamente modificado para la
expresión de una enzima recombinante, complementado con el estudio de
IQ-2005-I-16
8
los parámetros de escalamiento mas comunes, a partir fermentaciones
realizadas a escala de 2 litros.
IQ-2005-I-16
9
2. Resumen
En la corporación CorpoGen desde hace aproximadamente 8 años se viene
trabajando con el hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum, causante de la
enfermedad conocida como el marchitamiento vascular del clavel. Como
resultado de esta investigación en este momento se cuenta con un
microorganismo (E.coli) genéticamente modificado capaz de producir una
hemicelulasa de este hongo, la cual se ha convertido en un producto
biotecnológico de gran interés debido a sus aplicaciones en áreas como la
enología, compostaje y clarificación de jugos entre otras [Saha, 2000]
Con el fin de continuar esta investigación, este proyecto se plantea desde el
punto de vista de la ingeniería, estudiando algunos parámetros para su
producción en una escala más grande. Para llevar esto a cabo se realizaron
pruebas a nivel de laboratorio para observar el crecimiento del
microorganismo y la expresión de la proteína recombinante, estandarizando
el pH óptimo con el fin de montar el sistema en el biorreactor. La
estandarización de temperatura se tomó de estudios previos realizados con
la cepa recombinante y otros parámetros como el mezclado y la aireación se
tomaron inicialmente de reportes previos con sistemas análogos a éste.
IQ-2005-I-16
10
Tomando estos datos se realizaron pruebas preliminares de fermentación e
inducción de la enzima en el biorreactor con el fin de observar el
funcionamiento de las condiciones estandarizadas, y solucionar problemas
relacionados directamente con la cepa recombinante. Ya teniendo todas las
condiciones del sistema estandarizadas, se evaluaron diversos valores del
coeficiente de transferencia de oxígeno (kLa), y potencia por unidad de
volumen (P/V), con el fin de compararlos con la cantidad de proteína
recombinante obtenida a partir de cada fermentación y observar una
tendencia del sistema hacia alguno de los parámetros estudiados. Como
resultado de este proyecto se observó que en los rangos evaluados no
existía una dependencia clara del sistema con kLa o P/V, abriendo la
posibilidad de estudiar este sistema más a fondo en nuevos proyectos hasta
encontrar el parámetro de escalamiento en el que exista un punto máximo de
producción de la proteína recombinante.
IQ-2005-I-16
11
3. Glosario
Codifica: Término que se refiere al gen que después de ser transcrito y
traducido se convierte en una proteína. Ej. El gen que codifica para la ABF
Constructo: Conjunto de plásmido e inserto.
Deuteromicetes: Subdivisión de los hongos que se caracteriza por no
presentar un estado sexual determinado. (Deuteromicete, 2005).
Expresión: de una enzima; referente a su producción por parte de la célula.
Gen: Región de ADN que después de ser transcrita y traducida se convierte
en una proteína.
Oligonucleótidos: Secuencias de aproximadamente 20 nucleótidos.
Promotor: (Ver anexo 1)
Plásmido: (Ver anexo 1).
Metabolitos: Producto intra o extracelular del metabolismo de la célula.
Sonicación: (Ver anexo 2)
IQ-2005-I-16
12
4. Objetivos
4.1. General Estudiar el comportamiento de una cepa recombinante de E.coli, capaz de
expresar la enzima α-L-arabinofuranosidasa B de Fusarium oxysporum, y
evaluar los parámetros de escalamiento para su producción a escala de 2 L.
4.2. Específicos
• Estandarizar la temperatura y el pH óptimo para el crecimiento de la
cepa recombinante y la expresión de la enzima.
• Comparar el crecimiento de la cepa y la expresión de la enzima en
tubo de ensayo y en el biorreactor.
• Evaluar puntos representativos de kLa y P/V, a partir de
fermentaciones a escala de 2 L.
• Comparar los resultados de los parámetros de escalamiento obtenidos
y proponer un posible parámetro determinante del sistema.
IQ-2005-I-16
13
5. Marco Teórico
La biotecnología ha logrado despertar la necesidad de unir las áreas de la
microbiología y la ingeniería para el estudio de los fenómenos de
transferencia de calor, momento y masa que afectan el buen desempeño de
los sistemas biológicos. Después de comprender y manejar los procesos de
fermentación alcohólica y producción de metabolitos a gran escala, el nuevo
reto para la ingeniería se centra en el estudio de la producción de diversas
sustancias recombinantes de alto interés biotecnológico tales como enzimas,
esteroides, vitaminas, vacunas etc.
A diferencia del estudio de la producción de metabolitos a partir de
microorganismos silvestres, la producción con microorganismos
recombinantes depende de otras variables tales como tipo de
microorganismo (E.coli, S.cereviciae, P.pastoris, entre otros), plásmido
utilizado y el microorganismo del cual se va a tomar el gen a insertar, entre
otros. Estas variables juntas, expresadas como un microorganismo
recombinante, se convierten en la base para el estudio y estandarización de
sistemas a escala piloto en un birreactor de 1 a 10 L, para luego convertirse
en sistemas de producción a escala industrial.
El objetivo de este proyecto, fue hacer una aproximación a la primera parte
del estudio de condiciones a escala piloto para la producción de una enzima
recombinante intracelular, estandarizando algunas de las condiciones de
producción como temperatura y pH, con el fin de montar el sistema en el
biorreactor y observar como los efectos de transferencia de masa y
momento, expresados en los parámetros de escalamiento kLa y P/V
afectaban la producción de la proteína recombinante.
IQ-2005-I-16
14
5.1. Fusarium oxysporum f. sp. dianthi
Fusarium es un hongo Deuteromicete, patógeno, causante del
marchitamiento vascular en vegetales y flores. La mayoría de los casos del
marchitamiento debidos a este género, son producidos por especies de
Fusarium oxysporum o diferentes razas de este hongo [Agrios, 1998].
Específicamente, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) es el agente que
produce la enfermedad conocida como Marchitamiento vascular del clavel
(Dianthus caryophyllus), y por ende grandes pérdidas en el sector floricultor
colombiano [Barrera, et al., 1998].
Una de las herramientas más importantes para la entrada del hongo a la
planta esta dada por enzimas encargadas de degradar los compuestos de la
pared celular tales como lignina, cutina, pectina, celulosa y hemicelulosa
[Agrios, 1998]. La hemicelulosa (compuesto en mayor abundancia en la
pared celular), es un complejo constituido de varios polisacáridos, en el cual,
la composición y frecuencia en que éstos varían depende de la planta, el
tejido y el estado de desarrollo de la misma [Agrios, 1998, Goodman, et al.,
1986].
Las hemicelulasas son producidas por algunos hongos y bacterias
fitopatógenos. Dependiendo del monómero liberado a partir del polímero en
el que actúan se denominan: xilanasas, galactanasas, glucanasas,
arabinasas, mananasas, entre otras.
IQ-2005-I-16
15
5.2. α-L-ARABINOFURANOSIDASAS (AF)
La α-L-Arabinofuranosidasa es una hemicelulasa capaz de hidrolizar xilano,
componente principal de la hemicelulosa, y liberar arabinosa a partir de
compuestos como arabinano, arabinoxilano, arabinogalactano y goma
arábiga [Saha, 2000].
Estas son enzimas que hidrolizan residuos terminales no reductores a partir
de polisacáridos que contienen arabinosa [Saha, 2000]. Se dividen a su vez
en dos grupos: las enzimas del tipo Aspergilus niger, que presentan actividad
sobre substratos sintéticos pequeños y sobre arabino-oligosacáridos, y las
del tipo Streptomyces purpuracens, las cuales solo pueden actuar sobre L-
arabinosidos de bajo peso molecular u oligosacáridos que contengan
arabinosa [Kaji, 1984]
5.3. Antecedentes de las α-L-ARABINOFURANOSIDASAS
En los últimos tiempos ha surgido un gran interés en la utilización de
hemicelulasas en la industria biotecnológica debido a sus diversos usos en
compostaje, panadería, enología, degradación de residuos vegetales,
clarificación de jugos [Saha, 2000] y en alimentos para animales como
suplemento digestivo [Flipphi, et al., 1993b, Kaneko, et al., 1998].
Se ha observado que las xilanasas obtenidas de hongos filamentosos, son
mejores en algunos procesos, comparadas con las de origen bacteriano, ya
que tienen una amplia estabilidad a diferentes pHs que van desde 3 hasta
10, así como una temperatura óptima cercana a los 50ºC.
IQ-2005-I-16
16
Estas enzimas tienen varias aplicaciones en procesos agroindustriales, ya
que pueden convertir eficientemente la hemicelulosa a combustibles (etanol)
y diversos químicos, intervenir en la delignificación de la pulpa del papel,
clarificación de jugos y mejoramiento de la consistencia de la cerveza [Saha,
2000].
Las xilanasas ofrecen grandes ventajas en la sacarificación de residuos
forestales y agrícolas pre-tratados, ya que se producen azúcares
monoméricos, los cuales pueden utilizarse para la producción de etanol y
otros compuestos mediante fermentación. También se han utilizado en
enología para incrementar el aroma de los vinos durante su elaboración, ya
que las α-L-arabinofuranosidasas hidrolizan los monoterpenil-α-L-
arabinofuronosilglucosidos [Saha, 2000].
Recientemente se ha probado que la L-arabinosa inhibe selectivamente la
sacarasa intestinal de manera no competitiva y reduce la respuesta glicémica
después de la ingestión de sacarosa en los animales. Basados en ésto, la L-
arabinosa puede utilizarse como un regulador fisiológico que inhibe la
digestión de sacarosa [Kaneko, et al., 1998]. Por lo tanto, la utilización de las
α-L-arabinofuranosidasas como suplemento digestivo en alimentos para
animales es una buena alternativa para aumentar la digestibilidad de éstos.
5.4. Genes clonados de α-L-Arabinofuranosidasas Varios genes codificantes de las α-L-Arabinofuranosidasas han sido aislados
de bacterias tales como Streptomyces chartreusis [Matsuo, et al., 2000],
Clostridium stercorarium (arf A and arf B) [Schwarz, et al., 1990],
Pseudomonas fluorescens (xyn C) y Bacillus polymyxa (xynD) [Morales, et
al., 1995]. Sin embargo solo cinco genes de origen fúngico, que codifican
IQ-2005-I-16
17
para α-L-Arabinofuranosidas han sido clonados y secuenciados: Aspergillus
niger abf A [Flipphi, et al., 1993b], abf B [Gielkens, et al., 1999, Sánchez-
Torres, et al., 1996] y el gen de la ABF2 [Crous, et al., 1996]; Trichoderma
reesei [Margolles-Clark, et al., 1996, Pentilla, et al., 1987], Aspergillus sojae
[Kimura, et al., 2000] y Aspergillus nidulans [Gielkens, et al., 1999].
En Colombia, la corporación CorpoGen ha logrado detectar, aislar y clonar
en E.Coli el gen de la alfa-L-arabinofuranosidasa de Fusarium oxysporum,
además de reportarlo internacionalmente como el primer gen funcional de
este hongo [Chacón-Martínez, 2003].
5.5. E. coli
Escherichia coli es una bacteria intestinal reconocida como el
microorganismo procariota mejor estudiado. Su amplio uso se da debido a
las facilidades para su manejo en el laboratorio, dentro de las cuales está su
rápido crecimiento, el uso de nutrientes simples, además de una fisiología y
bioquímica interesantes. [Brock, et al., 1984]
A nivel molecular también se ha convertido en una herramienta útil para el
estudio de la genética y la virología, debido a su facilidad para realizar
intercambio genético y expresar proteínas heterólogas aprovechando
aspectos bioquímicos de la célula.
Actualmente, se ha logrado que un rango amplio de microorganismos
procariotes y eucariotes como Saccharomyces cerevisiae y Bacillus subtilis
entre otros, sean capaces de expresar proteínas foráneas, sin embargo la
IQ-2005-I-16
18
mayoría de las proteínas comerciales obtenidas por medio de la tecnología
del ADN recombinante son sintetizadas en E.coli. [Stratagene, 2005]
5.6. Funcionamiento de la cepa recombinante
5.6.1. Plásmido y cepa de expresión
El microorganismo utilizado para la expresión de la proteína fue la E.coli
BL21-Gold de la casa comercial Stratagene (Stratagene, Inc), la cual es una
cepa modificada genéticamente para regular, en conjunto con un plásmido
específico, la expresión de un gen de interés en altas cantidades dentro de la
célula. Para llevar a cabo esta tarea, al microorganismo le fue insertado por
manipulación genética el gen de la RNA polimerasa1 del virus o fago T7 bajo
el control de uno de los promotores inducibles más fuertes de la célula como
es el de la Beta-galactosidasa. Este promotor en E.coli regula la expresión de
la enzima capaz de degradar la lactosa en azúcares simples y así facilitar su
metabolismo, por lo cual se activa en presencia de lactosa o análogos a esta
como el IPTG (isopropiltiogalactopiranósido) [Stratagene, 2005](ver anexo 1.
El plásmido escogido para trabajar en conjunto con la cepa BL21-Gold fue
el pET-23 de la casa comercial Novagen (Novagen Inc.) debido a sus
múltiples ventajas para purificación y los altos índices de proteína obtenidos
con la utilización de este [Novagen, 2005]. La fortaleza de este plásmido
radica en que la regulación de la proteína de interés se lleva a cabo con el
promotor del fago T72, el cual necesita la RNA polimerasa del mismo para
llevar a cabo la transcripción del gen que controla, que en este caso sería el
de la ABF. La afinidad entre el promotor constitutivo y la RNA polimerasa del
1 Enzima esencial para la transcripción y producción de enzimas en todos los organismos 2 Ver figura 1
IQ-2005-I-16
19
fago T7 es muy alta, por lo cual se ha convertido en una de las alternativas
más comunes para la expresión de proteínas heterólogas en E.coli. De esta
forma el sistema constituido por el constructo (pET-23 con el gen de interés)
y la cepa BL21-Gold al ser inducido con IPTG libera el represor lac I3 del
promotor lac generando la producción en altas cantidades de la RNA
polimerasa de T7, la cual a su vez se unirá al promotor T7 del plásmido y
comenzará a transcribir la enzima de interés la cual en este caso específico
es la ABF de Fusarium oxysporum f sp dianthi. Debido a la cepa y el
plásmido utilizados, la nueva cepa recombinante obtenida de la clonación de
este gen se denominó BL21-pET-ABF.
3 Ver anexo1 para observar el funcionamiento del promotor lac
12
4
34
IQ-2005-I-16
20
Figura 1. Mapa del plásmido pET-23. 1 Promotor del fago T7. 2 Sitio múltiple de clonaje. 3 Gen de resistencia a ampicilina. 4 Origen de replicación de E.coli.
La enzima recombinante producida por el microorganismo es acumulada,
generalmente, en unos organelos llamados cuerpos de inclusión, en los
cuales las proteínas se encuentran en una forma inactiva [Lilie, et al., 1998].
Por esta razón para poder evaluar la actividad de la enzima es necesario
renaturar o ayudar a que las enzimas recuperen su estructura para así
poderla enfrentar a un sustrato específico.
5.7. Proceso de fermentación Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y
segregan algunos compuestos bioquímicos de importancia para el hombre.
Estas son las características en que se ha basado la utilización de los
microorganismos como productores de fermentación, lo cual de una manera
esquemática se puede representar así:
MICROORGANISMOS NUTRIENTES CONDICIONES AMBIENTALES
ADECUADAS
Bacterias
C, H, O, N, S, P
pH, temperatura Levaduras + Metales + viscosidad
Hongos Vitaminas oxigeno disuelto Tejido celular etc etc.
etc.
Fermentación Microorganismos + CO2 + Productos (intra o extracelulares)
Figura 2. Esquema de una fermentación típica [Doran, 1998].
IQ-2005-I-16
21
Es decir, que para que una fermentación se realice son necesarios los
siguientes requisitos: tener un microorganismo de características idóneas
para el proceso o producto particular, proveer un medio de cultivo adecuado,
y finalmente establecer y controlar las condiciones fisicoquímicas necesarias
para el desarrollo de la fermentación. Como resultado se obtendrá una
cantidad de microorganismos mayor que la inicial y diversos productos
(antibióticos, esteroides, enzimas, ácidos orgánicos, etc.) [Quintero, 1990].
5.8. Fases del crecimiento microbiano
En la figura 3 se indican las diferentes fases que ocurren en un cultivo
microbiano bajo condiciones típicas de pH, temperatura, concentración de
nutrientes, etc. Éstas, de forma general, son las que reflejan a través del
tiempo los cambios en la biomasa y en el medio ambiente, las cuales están
directamente relacionadas con la fase en la que el microorganismo se
encuentre.
Figura 3 Fases del crecimiento microbiano. (Curva de Crecimiento, 2005)
IQ-2005-I-16
22
Para explicar la curva de una forma general se puede decir que después de
un periodo lag o acoplamiento del microorganismo a las condiciones, el
crecimiento ocurre a la máxima rapidez (fase log), y finalmente cesa ya sea
por carencia de un nutriente, acumulación de un producto inhibitorio o algún
cambio en el ambiente fisicoquímico [Quintero, 1990].
La duración de la fase exponencial del crecimiento depende parcialmente de
la concentración inicial del sustrato limitante, lo cual implica que el cultivo
pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro de carencia
de sustrato. [Quintero, 1990].
5.9. Biorreactores Un biorreactor es un recipiente en el cual se llevan a cabo procesos
biológicos; organismos sustratos y nutrientes son unidos y mantenidos en un
ambiente favorable. Este constituye la parte principal de cualquier proceso
bioquímico en el que se emplean sistemas biológicos para la manufactura de
una amplia variedad de productos útiles. La función principal de un
biorreactor diseñado apropiadamente es la de proveer un medio controlado
para alcanzar el crecimiento y la formación de productos óptimos, o
cualquiera de ambos, en el sistema celular particular empleado [Scragg,
1997]
El funcionamiento de cualquier biorreactor depende de muchas funciones
incluyendo:
1) La concentración de biomasa, la cual debe permanecer alta.
2) El mantenimiento de las condiciones estériles.
IQ-2005-I-16
23
3) Agitación efectiva para que la distribución de los sustratos y
microorganismos en el reactor sea uniforme.
4) Eliminación de calor
5) Creación de las condiciones correctas de corte
Hay tres grupos de biorreactores usados actualmente para producción
industrial:
1) No agitados, sin aireación (76%)
2) No agitados con aireación (11%)
3) Agitados con aireación (13%)
Los recipientes no agitados sin aireación se usan para los productos
tradicionales como el vino, la cerveza y el queso, primariamente como
procesos anaerobios en lote. Puesto que estos procesos se controlan
cinéticamente, los fenómenos de transporte son de menos importancia. Por
otro lado, la síntesis de nuevos productos requiere el crecimiento de
microorganismos en recipientes aireados con agitación, debido a la
dependencia de éstos sistemas por fenómenos de transferencia de oxígeno y
esfuerzos de corte. [Scragg, 1997]
5.10. Parámetros de Escalamiento El escalamiento es el proceso previo para diseñar y construir un sistema a
escala industrial, basado en resultados con experimentos a una escala más
pequeña. De forma general existen diferencias en el desempeño de los
bioprocesos a escalas diferentes, encerrando tres clases de fenómenos
importantes para el diseño de procesos:
IQ-2005-I-16
24
• Fenómenos termodinámicos
• Fenómenos microcinéticos (intrínsicos)
• Fenómenos de Transporte
(momento, calor y masa)
Los procesos de transporte son muy dependientes de la escala
convirtiéndose en la única razón de los problemas de escalamiento.
Usualmente éstos se ven más pronunciados en sistemas aeróbicos que en
anaérobicos y en procesos continuos que en batch [Mavituna and Atkinson,
1992].
En el caso de la fermentación aeróbica el predecir resultados a escala de
producción basados en el escalamiento de datos obtenidos en el laboratorio
o planta piloto requiere de un análisis cuidadoso de cada una de las escalas,
tanto en sus variables fisicoquímicas como biológicas [Quintero, 1990].
Idealmente, el cambio de escala debería realizarse de manera que las
condiciones en los grandes reactores fueran lo mas parecidas posibles a las
que obtenían mejores resultados en los recipientes pequeños, sin embargo
algunas restricciones en se van observando a medida que la escala
aumenta. [Doran, 1998].
5.10.1. Métodos de escalamiento
En la práctica se han escogido varios métodos para efectuar el cambio de
escala, todos ellos basados en resultados empíricos. [Quintero, 1990].
Dentro de los más utilizados están: [Mavituna and Atkinson, 1992].
• Métodos fundamentales
Dependiente de la escala
Independientes de la escala
IQ-2005-I-16
25
• Métodos semifundamentales
• Análisis dimensional
• Reglas de dedo (Heurísiticos)
• Prueba y error
Sin embargo a nivel industrial los métodos heurísticos son los más utilizados
para el escalamiento de bioprocesos, seguido por la utilización conjunta de
otros.
A nivel industrial los parámetros heurísticos más utilizados son: Tabla 1. Parámetros de escalamiento más utilizados en la industria. [Oosterhuis, 1984]
La importancia
en la conservación de parámetros heurísticos en las dos escalas de un
sistema se puede observar claramente en la figura 4, la cual muestra
esquemáticamente un sistema en el que la concentración relativa del
producto final en una fermentación es afectada por algún parámetro de
escalamiento específico. Vale la pena aclarar que el patrón hiperbólico que
se observa es general independientemente de las especies microbianas:
bacterias, levaduras o mohos.
% de industrias criterio de escalamiento utilizado 30 Potencia por unidad de volumen 30 Coeficiente de tranferencia de oxígeno20 Velocidad de la punta del agitador 20 Tension de oxigeno
IQ-2005-I-16
26
Figura 4. Relación entre la cantidad del
producto de interés y el parámetro de
escalamiento determinante de un sistema.
5.10.2. Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Oxígeno
Dentro de los biorreactores, la oxidación de la fuente de carbono y su
transformación en células productos y CO2 establece una demanda de
oxígeno que es esencial satisfacer a través de la aireación y mezclado del
cultivo. Cuando se calcula la transferencia de masa en una fermentación es
necesario calcular las resistencias a la transferencia que encuentra el
oxígeno antes de llegar a la célula. Esta transferencia se puede dividir en tres
pasos de la siguiente manera: Transferencia difusional del oxígeno a través
de las películas de gas y líquido que rodean las burbujas de aire; a través de
la película de líquido que rodea a la célula, y la reacción bioquímica
intracelular, siendo la transferencia a través del líquido que rodea la célula el
valor dominante [Quintero, 1990].
De esta forma se plantea una modificación de la ley de Fick para modelar la
transferencia de masa de sistemas biológicos de la siguiente manera:
NA = kL a (Cg*- CL)
IQ-2005-I-16
27
Donde:
NA= Velocidad total de transferencia de oxígeno por unidad de volumen.
kL a = Coeficiente volumétrico de de transferencia de masa (h-1).
Cg*= Concentración de oxígeno disuelto en equilibrio con el oxígeno de la
fase gaseosa o concentración máxima de oxígeno en el medio de cultivo
(usualmente entre 7 y 9 ppm).
CL= Concentración de oxígeno disuelto en el seno del líquido [Quintero,
1990]
El valor de kLa en la ecuación se toma como un solo termino debido a la
complejidad de calcular el área de transferencia o área superficial de las
burbujas, por lo cual este valor usualmente es el que se halla a partir de
valores de concentraciones de oxígeno en el medio a través del tiempo.
[Scragg, 1997]
Este parámetro depende tanto de variables como la agitación y la aireación,
así como de las características físicas del caldo fermentativo tales como la
composición del medio, la viscosidad, cantidad de antiespumante presente,
entre otros. [Jimenez, 2003]
Debido a las bajas concentraciones de oxígeno disuelto que se pueden
alcanzar en un medio de cultivo (aproximadamente 8ppm) y lo sensibles que
son los microorganismos a éstas, se ha determinado que la transferencia de
masa está fuertemente asociada con el comportamiento del sistema,
convirtiéndose en uno de los parámetros más estudiados y utilizados para
escalar procesos biológicos.
IQ-2005-I-16
28
Como un ejemplo de éste tipo de sistemas se encuentra la producción de
ácido glutámico. [Quintero, 1990]
5.10.3. Potencia por unidad de Volumen
El estrés hidrodinámico generado por los agitadores al medio de cultivo con
células puede afectar de forma notoria el crecimiento de los microorganismos
además de la producción de metabolitos o productos de interés. Por esta
razón, para algunos sistemas en los que las células son sensibles a
esfuerzos de este tipo, se toma como parámetro de escalamiento la potencia
entregada al medio dividida entre el volumen de trabajo.
Otra variable utilizada para describir el mismo fenómeno es el número
adimensional de potencia, el cual se describe como:
Donde:
P = Requerimiento de potencia para la agitación (W)
n = Velocidad de rotación del impeler (rpm)
Di = Diámetro del impeler (m)
ρ = Densidad del medio de cultivo (Kg/m3)
A nivel industrial, un ejemplo de sistemas sensibles a este parámetro de
escalamiento se observa en la producción de esteroides y el crecimiento de
células vegetales y animales. [Scragg, 1997]
ρ53i
DnPNP =
IQ-2005-I-16
29
6. Materiales y Métodos
6.1. Pruebas previas al biorreactor
6.1.1. Recuperación y aislamiento de la cepa
La cepa recombinante (tomada del cepario de CorpoGen), se descongeló y
se aisló en medio LB agar (10g/L Triptona, 10 g/L Cloruro de sodio, 5 g/L
Extracto de levadura, 15 g/L Agar) con ampicilina a 50 µg/ml. La caja de petri
se dejó en la incubadora a 37 ºC por 18 horas.
6.1.2. Confirmación de la cepa BL21-pET-ABF por PCR4 Para realizar la PCR se tomó una colonia fresca y se resuspendió en 40µL
de agua bidestilada, la cual se calentó a 90 °C por 10 minutos. Las
condiciones y primers de la PCR utilizadas fueron estandarizadas y
diseñadas en trabajos previos en CorpoGen (CorpoGen).
Las condiciones óptimas estandarizadas fueron: Buffer PCR (20 mM Tris-
HCl, 50 mM KCl), 1,3 mM de MgCl2, 0.2 mM de dNTPs, 0.8 µM de cada
iniciador (ABF-F y ABF-R), 0.625 unidades de Taq ADN polimerasa
(CopoGen) y 2µL de las células previamente resuspendidas en agua y
calentadas. Cada reacción se llevó a cabo en un volumen final de 12 µl.
Como control positivo de la PCR se tomó la cepa BL21-Gold con el plásmido
pET-ABF y como controles negativos se tomaron una cepa de E.coli BL21
Gold con el plásmido pET23 sin el gen de la ABF y uno en el que se
4 Ver Anexo 1
IQ-2005-I-16
30
reemplazó el ADN por agua (control abiotico). Los perfiles de temperatura
reportados y utilizados para la PCR fueron: Tabla 2. Perfiles de temperatura utilizados en la PCR.
Desnaturalización 5´ a 94°C.
Ciclado 35 ciclos
Desnaturalización 30” a 94°C.
Anillaje 45” a 67ºC.
Extensión 1´ 30” a 72°C.
Extensión final 5´ a 72°C.
Los iniciadores o primers utilizados para la amplificación fueron: Tabla 3. Primers o iniciadores utilizados para la PCR.
Con el fin de verificar que el producto de la PCR correspondía al gen ABFB
(1500 pares de bases), el amplificado se corrió electroforéticamente en un
gel de agarosa al 1% (P/V) y se coloreó con bromuro de etídio 50µg/mL
6.1.3. Estandarización de condiciones óptimas in Vitro
Tomando una colonia aislada se inocularon 3 ml de medio LB-Amp (10g/L
Triptona, 10 g/L Cloruro de sodio, 5 g/L Extracto de levadura, Ampicilina 50
µg/ml) y se dejó creciendo toda una noche a 37°C con agitación constante. Al
ABF-F 5´- cgg cga att cct gca gga cca tg - 3´ ABF-R 5´- ggg act cta gag caa aac cat tgg caa c- 3´
IQ-2005-I-16
31
día siguiente se tomó este cultivo crecido y se inocularon 10 tubos con 200
µl del culltivo en 5ml de LB-Amp a diferentes pHs. Las soluciones buffer
utilizadas para simular el pH del biorreactor fueron: para pH 5 Buffer citrato,
pH 6 (Buffer fosfato), pH 7 (Buffer fosfato) y pH8 (Buffer tris) en una
concentración de 50mM según el manual para buffers de CalbioChem
[CALBIOCHEM, 1990]. Para cada pH se dejó un tubo control sin inducción.
Posteriormente el cultivo se dejó creciendo hasta una densidad óptica a 600
nm (OD600) de 0.6 y se indujo la expresión con IPTG a una concentración
final de 0.4 mM. Todas las muestras obtenidas fueron observadas por medio
de electroforesis de poliacriamida con dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS-
PAGE).
Con el fin de obtener un valor aproximado de la cantidad de proteína
recombinante obtenida, las muestras se procesaron con el protocolo de
aislamiento de cuerpos de inclusión descrito a continuación, se observaron
en geles de poliacrilamida y se cuantificaron con reactivo Bradford (BioRad,
Inc)5.
Las pruebas de temperatura no se realizaron debido a que ya se habían
realizado en reportes previos con el mismo microorganismo [Chacón-
Martínez, 2003]
6.1.4. Aislamiento y solubilización de los cuerpos de inclusión
Para el aislamiento de los cuerpos de inclusión y la solubilización de la
proteína recombinante se utilizó una modificación del protocolo de
aislamiento de proteínas eucariotes activas a partir de cuerpos de inclusión
en E. coli [Biotechniques, 1991]. Para cada procedimiento se tomaron 5 ml
5 Ver Anexo 2
IQ-2005-I-16
32
del cultivo y se centrifugaron a 5.000 rpm durante 15 minutos, luego el pellet
se resuspendió en 250 µL de Buffer A (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, sacarosa
20% y EDTA 1 mM), se incubó por 10 minutos en hielo y se centrifugó 5
minutos a 6000 rpm. Posteriormente el pellet se lavó con 500 µL de agua fría
y se resuspendió en 500 µL de Buffer P (EDTA 5 mM, 1 mM PMSF en PBS);
ésta suspensión de células se sonicó en hielo tres veces durante 1 minuto
con pausas de 1 minuto entre cada sonicado. Luego el producto de la
sonicación se diluyó con 300 µL de Buffer P y se centrifugó a 11.000 rpm por
30 minutos; el pellet se lavó dos veces con 200 µL de Buffer W (Sacarosa
25%, EDTA 5 mM y Tritón X-100 1% en PBS) y se solubilizó en 70 µL de
Buffer D (Tris-HCl 50 mM pH 8.0, Urea 8M), manteniéndolo en hielo por una
hora.
El sonicador utilizado fue un GlenMills y se utilizó en nivel 3 lo cual era el
equivalente a la mitad de la potencia del equipo.
6.1.5. Renaturación de la proteína y determinación de su actividad
La proteína recombinante solubilizada se dializó lentamente a temperatura
ambiente contra 50 volúmenes de buffer salino fosfato (PBS) pH 7.2, durante
96 horas, con la utilización de una membrana Diálisis sack 250-7U (Sigma,
Inc), con cuatro cambios del tampón de diálisis a las 24, 36, 48 y 72 horas.
La determinación de la actividad enzimática de la ABF se realizó con la
utilización del p-nitrofenil-α-L-arabinofuranósido, PNP-A (Sigma, N3641)
como sustrato específico. Para ésto se mezclaron 180 µL PNP-A a una
concentración de 1 mM, precalentado a 50°C, con 20µL de la muestra
renaturada, se incubaron a 50ºC por 30 minutos y luego se frenó la reacción
con 100µL de Na2CO3 1M. Los ensayos se realizaron en tampón citrato-
IQ-2005-I-16
33
fosfato 50mM pH 6.0. Las concentraciones de para-nitro-fenol liberado se
leyeron a 415 nm en un lector de microplacas BIO-RAD 550 (BioRad, Inc). La
actividad se expresó como unidades internacionales (UI), en donde 1 UI se
define como la cantidad de enzima que produce 1 µmol de para-nitro-fenol a
partir del PNP-A, por minuto bajo estas condiciones [Christakopoulos, et al.,
2000, Kaneko, et al., 1998].
6.2. Pruebas en el biorreactor
6.2.1. Preparación del inóculo
Para cada fermentación se preparaba un inoculo en 200 ml de LB-Amp con 5
ml de células crecidas el cual se dejaba crecer toda la noche. Al día siguiente
se inoculaba el biorreactor con los 200 ml para que quedara al 10% del
volumen final (2L). El biorreactor utilizado para todas las pruebas fue un
Bioflow 3000 (New Brunswick Inc)
6.2.2. Determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno del medio
de cultivo (kLa)
El método utilizado para la determinación del kLa fue el descrito por Quintero
[Quintero, 1990] como un método indirecto por técnica de eliminación de gas
por burbujeo de nitrógeno, en el cual se asume que el kLa es una variable
dependiente únicamente del medio de cultivo. Para estas pruebas se utilizó
el biorreactor con 2L de agua, ya que se ha reportado que la transferencia en
medios de cultivo típicos es muy cercana a la del agua [Oosterhuis, 1984].
Adicionalmente se le agregaron 200 µl de antiespumante6, y se le burbujeó 6 Las pruebas se realizaron con antiespumante debido a que éste afecta la viscosidad del
medio de cultivo y de la misma forma el kLa.
IQ-2005-I-16
34
nitrógeno con el fin de retirar todo el oxígeno del medio y calibrar el cero del
electrodo de oxígeno disuelto. De la misma forma se aumentó la agitación a
500 rpm y la aireación a 7 L/min por 15 minutos para saturar el medio de
oxígeno y calibrar el 100 % del electrodo. Posteriormente se desoxigenó el
medio de nuevo con nitrógeno, se suspendió el flujo de éste y se abrió el flujo
de aire, tomando datos de oxígeno disuelto en el medio cada dos segundos
hasta alcanzar el valor de saturación.
6.2.3. Pruebas de kLa con la cepa recombinante
A partir de los valores de kLa tomados con el medio de cultivo se montaron
fermentaciones con las condiciones mostradas en la tabla 4 y 200 ml de
inóculo. Todas las fermentaciones fueron monitoreadas evaluando su
crecimiento por espectrofotometría, la expresión de proteína por medio de
geles de poliacrilamida y la cantidad de proteína producida por medio de
Bradford7. Tabla 4. Condiciones a las cuales se evaluó el kLa del sistema
6.2.4. Pruebas de P/V
7 Ver Anexo 2
Agitación (100 rpm) Aireación (L/min)
100 3
250 5
400 7
IQ-2005-I-16
35
Para estimar los valores de potencia por unidad de volumen (P/V) se
pusieron dos litros de medio en el biorreactor con condiciones fijas de
aireación y variables de agitación, midiendo en cada punto la potencia
entregada por el motor del biorreactor al medio de cultivo. Al valor obtenido
se le restaron algunas resistencias ejercidas por el sistema tales como
empaques y conexiones entre otras, obteniendo así un valor de potencia más
real. Luego, tomando este valor y dividiéndolo entre el volumen total por
fermentación (2L) se obtuvo el valor de P/V de las condiciones del sistema.
Este procedimiento se repitió hasta hallar tres puntos de P/V representativos
del sistema.
Tabla 5. Condiciones a las cuales se evaluó P/V en el sistema.
Agitación (100 rpm) Aireación (L/min)
100 5
250 5
400 5
IQ-2005-I-16
36
7. Resultados
7.1. Aislamiento de la cepa recombinante
El primer paso consistió en descongelar la cepa recombinante E.coli-pET-
ABF conservada a -80ºC y aislarla en medio LB agar suplementado con 50
µg/ml de ampicilina con el fin de obligar a la célula a conservar el plásmido.
Como resultado de ésto se obtuvieron colonias claramente aisladas.
7.2. Confirmación de la cepa BL21-pET-ABF por PCR
Con el fin de confirmar el clon con el que se estaba trabajando se hizo una
PCR con las condiciones descritas previamente tal como se observa en la
figura 5.
1 2 3 4
Figura 5. Producto de la PCR corrido en gel de agarosa al 1% (Fragmento de 1500 pares de
bases correspondiente a la ABF). 1 Clon (+) BL21-pET-ABF. 2 Clon (-) BL21-pET. 3 Control
(-) (Abiotico). 4 Marcador de peso molecular (Invitrogen, Inc).
IQ-2005-I-16
37
7.3. Estandarización de condiciones óptimas in Vitro
Para la primera prueba de pH se siguió el protocolo descrito anteriormente,
dando como resultado una cepa que al parecer expresaba una proteína del
tamaño esperado en altas cantidades, pero sin controlar la inducción con
IPTG tal como se ve en la figura 6.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 6. Foto gel de poliacrilamida primera prueba de pH. 1 Células sin control de pH con
IPTG. 2 Células sin control de pH sin IPTG. 3 Células pH 5 con IPTG. 4 Células pH 5 sin
IPTG. 5 Células pH 6 con IPTG. 6 Células pH 6 sin IPTG. 7 Células pH 7 con IPTG. 8
Células pH 7 sin IPTG. 9 Células pH 8 con IPTG. 10 Marcador de peso molecular (Biorad,
Inc).
7.4. Prueba protocolo de sonicación
Para asegurar el funcionamiento del protocolo de sonicación, se tomó una
muestra de 5 ml obtenida de la prueba de pH y se concentró la proteína
recombinante con el protocolo descrito previamente. El resultado de esta
prueba se observa en la figura 7.
Posible proteína recombinante
93 KDa
49 KDa
IQ-2005-I-16
38
1 2
Figura 7. Prueba de sonicación con 5 ml de células obtenidos de la prueba de pH. 1 muestra
sonicada y solubilizada. 2 Marcador de peso molecular (Biorad Inc).
7.5. Concentración y cuantificación de la proteína recombinante obtenida en la prueba de pH
Ya habiendo probado el protocolo de sonicación se procedió a concentrar la
enzima recombinante de las muestras de la prueba de pH. En la figura 8 se
muestran los resultados de este procedimiento. 1 2 3 4 5
Posible proteína recombinante
Posible proteína recombinante producto de aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión
IQ-2005-I-16
39
Figura 8. Gel poliacrilamida concentración de proteína recombinante por el protocolo de
aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión. Muestras obtenidas en la prueba de pH.
1 Células crecidas sin control de pH, 2 células crecidas con pH 6, 3 células crecidas con pH
7, 4 células crecidas con pH 8, 5 marcador de peso molecular (Biorad Inc).
Posteriormente, los sonicados fueron cuantificados por medio de una
modificación del protocolo de Bradford para microplacas de 96 pozos
(CorpoGen). Los resultados obtenidos mostraron que se producía mayor
cantidad de proteína cuanto no había control de pH en el medio de cultivo,
sugiriendo realizar las fermentaciones de esta forma. Debido a que la
densidad óptica de todas las muestras era diferente se decidió hallar un valor
promedio de peso seco de células con el fin de obtener un valor de cantidad
de proteína por gramo de células. Tabla 6. Resultados de la cuantificación de proteína recombinante a partir de las muestras
sonicadas de la prueba de pH8.
7.6. Pruebas de kLa
La primera prueba de kLa se hizo manteniendo constante la agitación y
cambiando solo el flujo de aire entrante al sistema. Los resultados de esta
prueba mostraron valores muy cercanos de kLa, infiriendo un rango muy
8 La tercera columna fue calculada multiplicando la absorbancia de cada muestra por la relación de peso/absorbancia mostrada más adelante.
Prueba µg de proteína/ml celulas Promedio Peso seco/ml celulas mg proteína/g celulaspH5 1973,43 0,0002448 8061,40 pH6 2576,53 0,0003844 6702,73 pH7 4435,41 0,0003904 11361,19 pH8 3139,01 0,0003368 9320,10
Sin Control 6985,21 0,0004108 17003,92
IQ-2005-I-16
40
corto para evaluar su influencia en el sistema, por lo cual se decidió cambiar
la agitación y la aireación para obtener puntos más distantes. Para evaluar
valores de kLa determinantes del sistema se siguió el procedimiento descrito
previamente para las siguientes condiciones: Tabla 7. Valores de kLa obtenidos a manteniendo una agitación constante y una aireación
variable.
Tabla 8. Valores de kLa obtenidos con agitación y aireación variable.
7.7. Pruebas de P/V
Para evaluar la potencia del sistema se hicieron conexiones al motor del
biorreactor con el fin de evaluar el voltaje y la corriente entregada para cada
una de las condiciones y así poder modelar la potencia como un circuito
eléctrico en el que:
Potencia= I (Corriente)*V (Voltaje)
Para las condiciones evaluadas se varió únicamente la agitación con una
aireación constante con el fin de expresar el parámetro de escalamiento en
términos de una sola variable. Los resultados de las pruebas se observan en
la tabla 9.
Agitación (100 rpm) Aireación (L/min) kLa (1/h) 250 3.5 27,72 250 5 50,58 250 6.5 31,68
Agitación (100 rpm) Aireación (L/min) kLa (1/h) 100 3 32.76 250 5 71.46 400 7 149.4
IQ-2005-I-16
41
Tabla 9. Valores de P/V obtenidos para las condiciones establecidas.
100 rpm 5 L/min
P(W) P entregado (W)
Sin carga 0,5546
Con medio 1,428 0,174
Sin medio 1,254
250 rpm 5 L/min
P(W) P entregado (W)
Sin carga 1,4204
Con medio 3,77 0,83
Sin medio 2,94
400 rpm 5 L/min
P(W) P entregado (W)
Sin carga 2,4035
Con medio 7,326 2,358
Sin medio 4,968
Por otro lado, también se calcularon los valores de este parámetro en
términos de número de potencia, obteniéndose los valores descritos a
continuación: Tabla 10. Valores de NP obtenidos para las condiciones establecidas.
Agitacion (rpm) Np 100 0.213 250 0.065 400 0.045
IQ-2005-I-16
42
7.8. Estandarización de un método para la producción de la proteína recombinante en el biorreactor
Aprovechando el inóculo hecho para la prueba de pH, se pasó a este a un
erlenmeyer de 200 ml y se creció toda la noche para meterlo al biorreactor al
día siguiente. El biorreactor se montó con 250 rpm y 5 L/min de aire tomando
muestras cada hora, las cuales se observaron en poliacrilamida dando como
resultado la pérdida de expresión de la proteína recombinante como se
observa en la figura 9.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 9. Gel de poliacrilamida lote prueba. 1 hora 0, 2 hora 1, 3 hora 2, 4 hora 3, 5 hora 4, 6
hora 5, 7 hora 6, 8 hora 7, 9 hora 8, 10 Marcador de peso molecular (Biorad, Inc).
A partir de los datos tomados a lo largo de la fermentación se realizó una
curva de crecimiento seguida por espectrofotometría. Los datos obtenidos
mostraron que con un inóculo de 200ml (10% del volumen del biorreactor) se
llegaba a fase estacionaria en aproximadamente 8 horas tal como se puede
ver en la figura 10.
Proteína recombinante esperada a esta altura
IQ-2005-I-16
43
y = 0,0004xR2 = 0,9853
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
0,001
0,0012
0,0014
0,0016
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Absorbancia (600 nm)
Peso
Sec
o (g
/mL)
Curva de crecimiento
0
0,5
1
1,5
2
0 5 10
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
a 6
00
nm
Figura 10. Curva de crecimiento del microorganismo E.coli-pET-ABF en el biorreactor a
partir de un inóculo de 200mL.
A partir de las mismas muestras también se estableció una relación entre
peso seco y absorbancia con el fin de obtener valores de proteína
comparables, ya que todas las muestras obtenidas en las fermentaciones
alcanzaban valores diferentes de absorbancia y por ende de cantidad de
células (Figura 11).
Figura 11. Gráfica relación peso seco/ absorbancia.
Al día siguiente, asumiendo que la cepa había cesado la expresión de la
proteína recombinante debido a la pérdida del plásmido por el uso de
antibiótico degradado, se partió del inóculo crecido en 3 ml inicialmente para
IQ-2005-I-16
44
la prueba de pH para inocular de nuevo los tubos con los diferentes pHs y
antibiótico recién preparado. Los resultados de esta prueba fueron iguales a
los obtenidos en el biorreactor, mostrando que por algún factor biótico o
abiótico la cepa perdía la expresión de la proteína recombinante tal como se
ve en la figura 12.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 12. Gel poliacrilamida prueba de pH. A pH 5 las células no crecieron.1 sin control de
pH con IPTG. 2 Sin control de pH sin IPTG. 3 pH 6 con IPTG. 4 pH 6 sin IPTG. 5 pH 7 con
IPTG. 6 pH 7 sin IPTG. 7 pH 8 con IPTG. 8 pH 8 sin IPTG. 9 Marcador de peso molecular.
Ya habiendo probado que no era el antibiótico la causa de la pérdida de
expresión se decidió de nuevo tomar una colonia fresca e inocular un tubo
con 5 ml de LB-Amp por 12 h a 37°C. Ya teniendo crecidas las células, se
pasaron 200 µL de estas a otro tubo igual, dejándolo crecer por 4 horas
hasta una OD600 cercana a 0.6. De nuevo, de este tubo con células crecidas
se tomaron 200 µL y se pasaron a otro tubo con LB-Amp para así simular
tres pases de las células a medio nuevo. Se realizó el mismo procedimiento
con una E.coli BL21-pET con el fin de tener un control negativo de la prueba
(Figura 13). La misma prueba también se llevó a cabo dejando crecer 2
colonias diferentes por 18 horas en un tubo y pasándolo a otro (Figura 14).
Proteína recombinante esperada a esta altura
IQ-2005-I-16
45
1 2 3 4 5 6 7
Figura 13. Gel poliacrilamida prueba de expresión con 3 pases. 1 pase 1 control, 2 pase 2
control, 3 pase 3 control, 4 pase 1 BL21-ABF, 5 pase 2 BL21-ABF, 6 pase 3 BL21-ABF, 7
marcador de peso molecular (Biorad Inc).
1 2 3 4 5
Figura 14. Gel poliacrilamida pase en fase estacionaria. 1 Células crecidas hasta fase
estacionaria a partir de colonia 1. 2 Células crecidas hasta fase estacionaria a partir de
colonia 2. 3 Células crecidas hasta fase estacionaria a partir de cultivo crecido en 1. 4
Células crecidas hasta fase estacionaria a partir de cultivo crecido en 2.
Como resultado de estas pruebas se observó que el problema con la cepa
recombinante radicaba en que la producción de la ABF al parecer se hacia
en fase log y una vez el microorganismo producía la proteína recombinante y
Pérdida de expresión de la proteína recombinante con pases sucesivos en una mayor cantidad de medio de cultivo
IQ-2005-I-16
46
llegaba a la fase estacionaria, éste conservaba el plásmido creciendo en
antibiótico y nuevo medio pero perdía la capacidad de producir la proteína de
interés.
Ya teniendo este resultado se creció una colonia en 5 ml de LB-Amp hasta
alcanzar una fase log a 37°C. De éste se inocularon los 5 ml a un erlenmeyer
de 200 ml del mismo medio de cultivo y se incubó hasta llegar a una OD600
aproximada a 0.6. Se pasaron los 200 ml como inóculo al biorreactor (200
rpm, 5L/min) tomando datos cada hora y se observó como se recuperaba la
expresión de la proteína recombinante pero en menores cantidades de las
que se obtenían creciéndola en el tubo. (Figura 15)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 15. Gel poliacrilamida fermentación con inóculo en fase log. 1 Hora 0. 2 Hora 1. 3
Hora 2. 4 Hora 3. 5 Hora 4. 6 Hora 5. 7 Hora 6. 8 Hora 7. 9 Hora 8. 10 Marcador de peso
molecular (Biorad, Inc). Debido a que las cantidades de proteína recombinante obtenidas eran
menores a las esperadas, se decidió hacer otra prueba basado en la figura
12. Tal como se observa en esta figura, al parecer, la cepa recombinante va
IQ-2005-I-16
47
perdiendo la capacidad de expresión poco a poco cada vez que se pasa a un
nuevo medio de cultivo, por lo cual se inoculó el biorreactor en las mismas
condiciones solo con los 5 ml crecidos a partir de una colonia.
Los resultados obtenidos a partir de esta prueba fueron mucho mejores
debido a que la cantidad de proteína observada era mayor a la obtenida
tomando 200 ml como inóculo del biorreactor.
1 2 3
Figura 16. Gel poliacrilamida fermentación con dos pases. 1 Muestra tomada a las 14 horas
cepa recombinante. 2 Cepa control. 3 Marcador de peso molecular (Biorad, Inc).
Ya teniendo un método para obtener altas cantidades de proteína en el
biorreactor, se evaluó de nuevo una curva de crecimiento con 5 ml de
inóculo. Como se observa en la figura 16 la única diferencia con la curva
anterior radicó en el tiempo que tardó el cultivo en crecer completamente,
mostrando que para las fermentaciones a realizar era necesario dejar el
cultivo creciendo por 12 horas con el fin de asegurar una fase estacionaria.
Proteína recombinante
IQ-2005-I-16
48
Curva de crecimiento
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
0 5 10
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
a 6
00 n
m
Figura 16. Curva de crecimiento con inóculo de 5 ml.
7.9. Resultados fermentaciones kLa
A partir del método establecido para llevar a cabo las fermentaciones, se
montaron en el biorreactor las células con las condiciones de agitación y
aireación para cada kLa, todas sin control de pH, y con un tiempo de
fermentación de 12 horas, asegurando así la fase estacionaria. A las 12
horas se tomaba una muestra de 5 ml, la cual se centrifugaba y se sonicaba
siguiendo el protocolo para aislamiento y solubilización de cuerpos de
inclusión descrito previamente. Finalmente las muestras sonicadas,
resuspendidos en buffer D, se cuantificaban protocolo de Bradford9. Debido
a que el buffer D esta compuesto por urea 4M, la cual es un agente
denaturante fuerte, la actividad de la enzima no se puede medir hasta este
punto, por lo cual solo se puede hablar de proteína hasta ahora.
9 Ver anexo 2.
IQ-2005-I-16
49
1 2 3 4 5 6 7
Las fermentaciones con las condiciones específicas de cada kLa fueron
llevadas a cabo por duplicado con el fin de sacar un promedio de cantidad de
proteína obtenida, tal como se observa en la tabla 10. En la figura 17 se
muestra el gel de poliacrilamida de los lisados intracelulares de las muestras
tomadas en cada fermentación. Tabla 11. Resultados de las fermentaciones de kLa.
Agitación (rpm)
Aireación (L/min)
kLa (1/h)
Peso seco /ml cel
Proteína µg/ml cel
Proteína mg/g cel secas
100 3 32.76 0,00076 4228,769 5564,170
250 5 71.46 0,000772 5062,189 6557,240
400 7 149.4 0,000752 5601,574 7448,902
Figura 17. Gel de poliacrilamida de proteínas totales de células obtenidas a partir de cada
una de las fermentaciones de kLa. 1 Fermentación 1 (100 rpm, 3 L/min). 2 Fementacion 1
replica. 3 Fermentación 2 (250 rpm, 5 L/min). 4 Fermentación 2 replica. 5 Fermentación 3
(400 rpm, 7 L/min). 6 Fermentación 3 replica. 7 Marcador de peso molecular (Biorad, Inc).
Proteína recombinante
IQ-2005-I-16
50
En la figura 18 se muestran los resultados de kLa de una forma gráfica con el
fin de observar un punto óptimo o una tendencia del sistema hacia el
parámetro de escalamiento.
Figura 18. Resultados gráficos de cantidad de proteína obtenida versus kLa.
7.10. Resultados fermentaciones P/V
De la misma forma que para las fermentaciones de kLa, se montaron las seis
fermentaciones a las condiciones establecidas previamente para evaluar este
parámetro. Los resultados obtenidos en términos de proteína recombinante
se observan en la tabla 11. De la misma forma, en la figura 19 se observan
los lisados celulares de las fermentaciones correspondientes a éste
parámetro.
kLa
0
2000
4000
6000
8000
0 1 2 3 4 5
kLa (1/h)
[] Pr
oteí
na m
g/g
cel
IQ-2005-I-16
51
Tabla 12. Resultados de las fermentaciones de P/V
Figura 19. Gel de poliacrilamida de proteínas totales de células obtenidas a partir de cada
una de las fermentaciones de P/V. 1 Fermentación 1 (100 rpm, 5 L/min). 2 Fementacion 1
replica. 3 Fermentación 2 (250 rpm, 5 L/min). 4 Fermentación 2 replica. 5 Fermentación 3
(400 rpm, 5 L/min). 6 Fermentación 3 replica. 7 lisado celular cepa control (E.coli BL21-pET)
8 Marcador de peso molecular (Biorad, Inc).
Con el fin de observar gráficamente la cantidad de proteína obtenida en cada
una de las fermentaciones, en la figura 20 se muestra la tendencia de éste
parámetro de escalamiento en el rango estudiado.
Agitación (rpm)
Aireación (L/min)
P/V (W/L)
Peso seco g/ml cel
Proteína µg/ml cel
Proteína mg/g cel secas
100 5 0,09 0,000812 6498,33 8002,87
250 5 0,42 0,000772 5062,19 6557,23
400 5 1,18 0,000768 6864,86 8938,62
1 2 3 4 5 6 7 8
Proteína recombinante
IQ-2005-I-16
52
P/V
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
P/V
[] P
rote
ína
mg/
g ce
l
Figura 20. Resultados gráficos de cantidad de proteína obtenida versus P/V.
7.11. Renaturación de la proteína y prueba de actividad
Debido a que el protocolo de aislamiento y solubilización de cuerpos de
inclusión termina resuspendiendo las proteínas en un buffer con altas
cantidades de urea (4M), se hace indispensable retirar este compuesto de la
muestra con el fin de facilitar la renaturación de las proteínas, y así, en ayuda
de un sustrato específico observar su actividad enzimática.
Para retirar la urea de la muestra se utilizó una membrana de diálisis, la cual
actúa como un tamiz molecular con un tamaño de poro definido y retira la
urea por medio de ósmosis al ser enfrentada con buffer PBS. El buffer PBS
se cambió 4 veces durante 4 días con el fin de reducir la cantidad del agente
denaturante hasta el punto en el que las enzimas pudieran recuperar su
actividad.
IQ-2005-I-16
53
A partir de la muestra renaturada, se realizó la prueba de actividad
enfrentando ésta contra el sustrato específico p-nitrofenil-α-L-
arabinofuranósido. En esta reacción, los sustratos incoloros reaccionan
liberando p-nitrofenol, el cual da una coloración amarilla a la muestra para
ser cuantificada por espectrofotometría a 415nm. A partir de los datos
obtenidos en el espectrofotómetro, se interpolan los valores en una curva
patrón de p-nitrofenol, obteniéndose así un valor en µg/ml. Tomando este
valor y convirtiéndolo a µmoles/(ml*min), se obtienen unidades
internacionales por mililitro (UI/ml), tal como se observa a continuación:
Valor promedio de p-nitrofenol obtenido: 188.914 µg/ml p-nitrofenol
188.914 µg/ml p-nitrofenol * 1 µmoles p-nitrofenol = 1.3581 µmoles/ ml p-nitrofenol
139.1 µg p-nitrofenol
Tiempo de duración de la prueba 30 minutos
1.3581 µmoles/ ml p-nitrofenol = 0.0452 µmoles/ ml p-nitrofenol*min = 0.452 UI/ml ABF
30 minutos
IQ-2005-I-16
54
8. Análisis de Resultados
8.1. Importancia de la PCR para trabajos con sistemas recombinantes
A nivel molecular la capacidad de un microorganismo recombinante para
producir una proteína específica está dada por un plásmido con el gen de la
proteína que queremos producir. Ésta capacidad depende únicamente de
que el microorganismo conserve o no el plásmido dentro de él, lo cual está
directamente relacionado con que en el medio haya antibiótico o no; ya que
las células que pierdan el plásmido perderán la resistencia al antibiótico y en
medio de cultivo con antibiótico morirán.
Para este caso específico el plásmido insertado a la cepa E.coli BL21 Gold
fue el pET 23, el cual le confiere resistencia a ampicilina, por lo cual, con el
fin de asegurar que en ningún momento se dé la pérdida del plásmido, esta
cepa se aisló y se creció siempre en medio LB con 50 µg/ml de ampicilina.
Sin embargo, existía la posibilidad de que las células descongeladas y
aisladas hubieran perdido de alguna forma el plásmido o lo conservaran pero
sin el gen de la proteína de interés, por lo cual se decidió como primer paso
realizar una PCR10 de una de las colonias aisladas de la cepa con la que se
iba a trabajar.
El resultado obtenido de la PCR (figura 5) fue satisfactorio debido a que se
amplificó del gen de la ABF (1500 pares de bases) en la muestra de la
colonia recombinante, lo cual no se observó en ninguno de las otros carriles
teniendo como control una cepa idéntica sin el gen de la ABF y un control
abiótico.
10 Ver anexo 2.
IQ-2005-I-16
55
Vale la pena recalcar que a nivel industrial, la PCR es un método rápido y
común para la confirmación y control de calidad de cepas recombinantes que
van a ser el inóculo de grandes lotes para la producción de enzimas
recombinantes.
8.2. Importancia del control de pH
Una de las condiciones importantes para la producción de proteínas
recombinantes se basa en un estricto control de pH. Éste se lleva a cabo en
todo momento principalmente en sistemas de producción extracelular debido
a que las enzimas producidas son sensibles a un rango de pH lejano al
óptimo de ellas. Con el fin hacer un acercamiento a este efecto y observar si
el control de pH afectaba en algo la producción de una proteína intracelular,
ya sea estimulando o inhibiendo su producción, se planteó una prueba en
tubos de ensayo simulando un control de pH con Buffer específicos para pH
5, 6, 7, 8 y sin control de pH. Los resultados de la prueba mostraron todo lo
contrario a lo que se pensaba, ya que no era muy notable la estimulación o la
inhibición de la producción de la proteína, pero si se observaba una fuerte
influencia del pH en el crecimiento de las células. La mayor cantidad de
proteína y de células se obtuvo en la muestra sin control de pH después de
dejar crecer todas las muestras por el mismo tiempo. Por otro lado, se pudo
observar que el pH 5 inhibe el crecimiento de la E.coli, mientras que los otros
pH utilizados (6, 7 y 8), más cercanos al neutro, afectan levemente el
crecimiento de la célula. Se esperaba que depronto la producción a pH 7,
(cercano al del LB: 6.88), tuviera un comportamiento cercano al de las
células sin control de pH, pero sin embargo se notó que éste control también
influenciaba el buen desempeño de la cepa recombinante debido a que ésta
en su metabolismo normal sin control de pH era capaz de bajar el pH hasta
IQ-2005-I-16
56
un valor cercano a 5.5 en la fase log, para de nuevo subirlo hasta un valor
cercano a 6.4 en la fase estacionaria. Éste efecto se da posiblemente debido
a que el medio de cultivo sin control de pH le permite a la célula liberar de
una forma más fácil todo tipo de metabolitos y absorber nutrientes, siendo
esto directamente proporcional al crecimiento y producción de la proteína
recombinante. Vale la pena decir que debido a que la prueba solo se llevó a
cabo por un tiempo específico, puede que únicamente la muestra sin control
de pH hubiera llegado completamente a la fase estacionaria y por esto se
hubiera producido la mayor cantidad de proteína. Esto puede decir que el pH
si tenga un efecto sobre la producción de la proteína recombinante y que en
alguno de los otros pH´s evaluados se llegue a producir mayor cantidad de
proteína al llegar a fase estacionaria. Sin embargo, como el fin del ésta
prueba era hacer un enfoque del control de pH en la producción de un
proteína recombinante intracelular con miras a un escalamiento industrial, un
mayor tiempo de producción se ve expresado en dinero, por lo cual se
decidió que la mejor alternativa era no llevar a cabo el control de pH dentro
del biorreactor.
Por otro lado en esta prueba también se observó la capacidad de la cepa
para controlar la expresión con IPTG. El resultado de ésta mostró que la
cepa había perdido por completo el control de inducción y por esto estaba
produciendo la proteína recombinante en iguales cantidades con y sin
inducción tal como se observa en la figura 6. Este resultado sugeriría la
ocurrencia de una alteración en la región operadora del operón lactosa. Por
otro lado, visto desde el punto de vista industrial, una cepa recombinante
inducible con un compuesto tan costoso como el IPTG no es rentable para
producción a escala grande, por lo que esta falla en la cepa recombinante es
una buena alternativa para reducir los costos en el caso en que se produjera
la ABF a escala industrial.
IQ-2005-I-16
57
A nivel industrial, el pH es uno de los factores vitales en la generación de
productos biotecnológicos. Esto se puede observar a simple vista en
procesos de primera era como son la producción de yogurt y cerveza, en los
cuales los microorganismos y las enzimas dependen de un pH específico
para llevar a cabo su tarea de una forma eficiente. En el caso del yogurt, la
acidificación de la leche ayuda en la hidrólisis de azúcares y otros
compuestos favoreciendo la acción de los lactobacilos, por lo cual este factor
se convierte en una parte vital del proceso con el fin de asegurar un óptimo
desempeño de los microorganismos, expresado en tiempo y dinero. En el
caso de la cerveza, el pH a controlar es el del mosto el cual es el conjunto de
enzimas que se liberan de la germinación de los cereales utilizados. Estas
enzimas, en su mayoría alfa-amilasas, beta- amilasas xilanasas y celulasas
entre otras, son las encargadas de convertir la celulosa presente en la pared
vegetal de todos los compuestos presentes en la mezcla, en unidades
asimilables o azucares simples para que las levaduras puedan llevar a cabo
el proceso de fermentación. Es por esta razón que un control de pH y
temperatura es el punto de optimización en esta parte del proceso, debido a
que si se mantienen las condiciones específicas para que toda esta
maquinaria enzimática funcione a su máximo rendimiento, esto de igual
forma se verá representado en tiempo en el proceso. Para el caso de la
producción de proteínas recombinantes, los sistemas utilizados comúnmente
son inducibles y extracelulares con el fin de producir mayores cantidades y
reducir costos en purificación. Un control estricto de pH en el momento de la
producción de la enzima en el biorreactor a escala industrial, asegurará la
estabilidad de la enzima en el medio de cultivo, lo cual se verá representado
en una alta cantidad y actividad de la misma después de la purificación. En el
caso del inductor, los sistemas comerciales de levaduras a gran escala,
utilizan otros compuestos como el metanol, asegurando altas cantidades de
IQ-2005-I-16
58
la enzima extracelular a un bajo costo en comparación con el sistema de
IPTG.
8.3. Sensibilidad de los sistemas recombinantes a la temperatura
A diferencia que en el control de pH, con el control de temperatura si se
observa una alta influencia en la expresión de una proteína recombinante. El
esquema y tiempo óptimo para inducción puede cambiar debido a que las
características de cada producto de un gen específico son únicas. Por
ejemplo, el crecimiento a 37 ºC causa la acumulación de algunas de las
proteínas insolubles en cuerpos de inclusión, mientras que en algunos casos
la incubación a 30 ºC genera una mayor cantidad de proteína soluble y activa
[Mierendorf, et al., 1994]. Por otro lado, el crecimiento e inducción a 25ºC o
30ºC puede llegar a ser óptimo cuando la proteína objetivo, expresada en un
vector pET con un péptido señal de exportación, se puede liberar al medio de
cultivo. En otros casos, una inducción larga (12 h) a bajas temperaturas
(15ºC-20ºC), puede también ayudar a un alto rendimiento de proteína
recombinante soluble [Mierendorf, et al., 1994].
En este proyecto de grado no se realizó ninguna prueba de temperatura
debido a que en trabajos previos con la cepa recombinante se habían
evaluado 3 temperaturas obteniendo la misma cantidad de proteína en todas
ellas [Chacón-Martínez, 2003]. Las temperaturas evaluadas fueron 37 ºC, 32
ºC y 28 ºC debido a que la cepa contaba con un plásmido de producción
intracelular. Los resultados obtenidos se evaluaron de la misma forma que la
prueba de pH, observando las proteínas en geles de poliacrilamida y
cuantificándolas por medio de Bradford. La temperatura escogida para todas
las pruebas fue 37 ºC debido a que es una temperatura típica para
crecimiento de E.coli, y es la temperatura utilizada para la producción de la
IQ-2005-I-16
59
Taq DNA polimerasa recombinante en CorpoGen, expresada en el mismo
sistema.
A nivel industrial, la estandarización de temperatura, al lado de la de pH, es
uno de los parámetros más importantes que influencia la producción de un
sistema recombinante. Debido a que la proteína se produce de forma
intracelular en cuerpos de inclusión, la evaluación realizada fue solamente
con respecto a la cantidad de proteína recombinante obtenida, sin embargo,
en sistemas extracelulares la importancia de la estandarización de
temperatura radica principalmente en la cantidad de proteína soluble activa
que se pueda obtener. Esto, a escala industrial puede ser una característica
determinante de la producción, principalmente para productos enzimáticos
que no requieran una alta purificación como extractos crudos. Un ejemplo de
esto se puede ver en productos como la alfa-amilasa utilizada como
suavizante para textiles, ya que debido a que no se requiere un alta
purificación por no ser una enzima para consumo humano, se pueden utilizar
extractos crudos obtenidos directamente de la fermentación del
microorganismo que la produce.
8.4. Fases del crecimiento de la cepa recombinante y expresión del producto de interés
En la producción de proteínas utilizando sistemas recombinantes se hace
indispensable el estudio del crecimiento y expresión del microorganismo, con
el fin de definir el tipo de fermentación óptimo para la cepa. Para el caso en
el que se utilice una cepa inducible, se montará típicamente una
fermentación tipo batch o por lotes, debido a que las células frescas deben
alcanzar una densidad óptica específica para ser inducidas por un tiempo
IQ-2005-I-16
60
estandarizado, y finalmente ser retiradas con el fin de evitar la proteólisis del
producto de interés. Por otro lado, en el caso en que la producción sea
constitutiva, se pensará en una producción semi-continua o continua con el
fin de obtener mayores cantidades de proteína recombinante en un menor
tiempo. Para el primer caso el estudio del crecimiento del microorganismo y
expresión de la proteína recombinante se hace un factor importante, debido a
que se debe definir un tiempo específico para que la cepa recombinante
alcance una densidad óptica específica y un tiempo para que exprese la
mayor cantidad de proteína y no alcance a haber proteólisis, lo cual a nivel
industrial se verá representado en optimización del tiempo y reducción en
costos. Para el segundo caso el estudio del crecimiento y expresión se hace
más indispensable aún, debido a que dependiendo de la fase en la que se de
la expresión del producto de interés, se estandarizará el tiempo en el que se
activará el sistema continuo o semi-continuo.
Los resultados obtenidos en este proyecto fueron un poco confusos con
respecto a este punto debido a que la cepa utilizada debía responder al
estímulo con IPTG pero su expresión se dio de forma constitutiva. Para este
caso, la forma óptima de producción sería en un sistema continuo para lo
cual tocaría hacer un estudio más profundo del punto exacto en la fase de
crecimiento del microorganismo en el que se lleva a cabo la expresión. El
funcionamiento de un sistema en continuo se basa en mantener las células
en una fase de crecimiento específica por un tiempo prolongado, por lo cual,
para este caso las células se crecerían en un sistema batch hasta el punto
de expresión, y se activaría la entrada y salida del medio de cultivo en el
sistema, asegurando una misma densidad celular dentro del biorreactor.
En la industria, los sistemas recombinantes más utilizados son los inducibles
debido a las altas cantidades de proteína obtenidas en un menor tiempo en
IQ-2005-I-16
61
comparación con los sistemas constitutivos, por lo cual para estos casos se
utiliza comúnmente la producción batch. Sin embargo, la mayoría de
sistemas para producción de proteínas no recombinantes utilizan
fermentación en continuo debido a que se debe mantener la fase específica
de crecimiento en la que los microorganismos nativos produzcan la proteína
de interés. En comparación con los sistemas recombinantes, las cantidades
obtenidas en este tipo de fermentación son mucho menores, y su purificación
se hace mucho más compleja, aumentado su costo de producción.
8.5. Concentración y purificación de proteínas
La concentración y purificación de proteínas constituye el paso más costoso
y complicado de la producción, convirtiéndose en el punto de evaluación para
ver si un producto de este tipo es rentable o no. Para este caso se utilizó
solamente un protocolo preliminar para purificación de proteínas
recombinantes en E.coli, aprovechando que la enzima se producía insoluble
en cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión son acumulaciones de
proteína insoluble e inactiva (casi siempre recombinante), la cual se acumula
debido a su sobrexpresión [Lilie, et al., 1998]; sin embargo no existe una
correlación entre las propiedades intrínsecas de la proteína expresada, como
hidrofobicidad, peso molecular o plegamiento, con la formación de los
cuerpos de inclusión [Lilie, et al., 1998].
La acumulación de proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión tiene
varias ventajas y desventajas [Lilie, et al., 1998, Mierendorf, et al., 1994].
Dentro de las desventajas, se conoce que ciertas proteínas no pueden ser
renaturadas debido a que su acumulación produce una desnaturalización
irreversible, impidiendo de esta manera obtener proteínas activas; de la
IQ-2005-I-16
62
misma manera, las proteínas con multidominios son muy difíciles de
renaturar [De Bernardez, 1998]. Sin embargo, la acumulación de la proteína
recombinante en los cuerpos de inclusión no siempre es indeseable, y por el
contrario puede ser una ventaja. Las proteínas presentes en los cuerpos de
inclusión son protegidas de la degradación proteolítica debido a su alto nivel
de expresión y acumulación; los cuerpos de inclusión pueden representar
una mayor producción de la proteína de interés del 75 al 95%; y además,
estos cuerpos son fáciles de aislar con un primer paso de purificación
[Mierendorf, et al., 1994].
Un segundo paso de purificación se realizó también con la diálisis del
producto obtenido a partir del protocolo de sonicación, en la cual la
membrana de diálisis actúa como un tamiz molecular dejando pasar
proteínas de menor tamaño al tamaño de poro y compuestos como la urea,
la cual, en este punto, es la causa de inactividad de la enzima.
Dentro del protocolo utilizado se encontraron diversas variables como el
tiempo de sonicación, ubicación del sonicador, problemas de solubilización y
difícil diálisis de las muestras, las cuales afectan directamente la
reproducibilidad de la prueba sugiriendo el uso de nuevas tecnologías de
purificación para el estudio de escalas mayores. Para este caso los estudios
se realizaron en 5 ml de muestra tomada a partir de cada fermentación
debido a que su propósito era netamente investigativo, pero en el caso en
que se piense en la purificación de la proteína recombinante a nivel industrial
el método de sonicación no es una alternativa muy eficiente. Como
alternativas paralelas valdría la pena evaluar otros métodos de lisis celular en
los que se asegure una baja proteólisis y una purificación por medio de
filtración, centrífuga o ultrafiltración, en las cuales, al igual que en la diálisis,
la muestra se concentra y purifica a través de una membrana con tamaño de
IQ-2005-I-16
63
poro específico, aprovechando en el primer caso la fuerza ejercida por una
centrifuga y en el segundo caso la presión ejercida por una bomba
peristáltica.
En el caso en el que la proteína sea para consumo humano y se necesite
una mayor purificación, se debería recurrir a métodos mas complejos como la
cromatografía, la cual incrementa de forma radical el precio de purificación de
la muestra, pero su valor se ve representado en la alta recuperación del
producto de interés, por lo cual sigue siendo uno de los métodos más
utilizados a nivel industrial para la purificación de proteínas recombinantes.
8.6. Actividad de la proteína recombinante
La actividad de una enzima, es el valor que muestra numéricamente su
efectividad al reaccionar con un sustrato específico. Se expresa usualmente
en unidades internacionales por microlitro (UI/µL), mostrando así la cantidad
de sustrato específico que se hidroliza por microlitro de enzima utilizado.
Para el caso específico de la ABF, 1 UI se define como la cantidad de
enzima que produce 1 µmol de para-nitro-fenol a partir del PNP-A, por minuto
a las condiciones descritas previamente [Christakopoulos, et al., 2000, Gilead
and Shoham, 1995, Kaneko, et al., 1998].
Los resultados de la prueba de actividad dieron un valor de 0.0452 UI/µL, el
cual es un valor muy cercano al obtenido en trabajos previos con la misma
cepa (0.05 UI/µL). Por otro lado, en el mismo trabajo también se evaluó la
actividad de la ABF extraída directamente del hongo, la cual dio un valor de
0.21 UI/µL; el cual en comparación con el valor obtenido en la cepa
recombinante, muestra que esta es capaz de hidrolizar aproximadamente 5
IQ-2005-I-16
64
veces más la cantidad de sustrato específico. Sin embargo, el hongo para
producir esta cantidad de proteína se demora en crecer alrededor de 2
semanas, por lo cual, así se obtenga la proteína con menor actividad, sigue
siendo mucho mas rentable la producción a partir de la cepa recombinante
debido a su corto periodo de producción (13h).
A nivel industrial se maneja más el término de actividad específica, la cual
corresponde a la actividad dividida entre la cantidad de proteína expresada
en UI/mg. Esto se hace con el fin de observar si la cantidad de proteína
obtenida conserva la misma actividad, ya que en producción en continuo a
veces se obtiene la misma cantidad de enzima pero su actividad tiende a
bajar [CorpoGen, 2005] Por otro lado, debido a que la actividad de la enzima
está dada por su estructura tridimensional, la producción de proteínas
recombinantes intracelulares inactivas presenta pérdidas debido a problemas
de solubilización y renaturación, siendo una alternativa menos rentable en
comparación con su producción en sistemas extracelulares en los que la
enzima se produce activa.
8.7 Efectos de la escala en la producción de la proteína recombinante
A medida que la escala aumenta en la producción de proteínas
recombinantes, diversas variables representadas en la agitación y la
aireación afectan notoriamente la producción de metabolitos. Es por esta
razón, que usualmente a nivel industrial no se obtienen las mismas
cantidades que se obtienen a nivel de laboratorio. Factores como el tiempo
de mezclado, el tamaño de burbuja y la potencia requerida cambian
drásticamente a medida que la escala aumenta, convirtiéndose en un
IQ-2005-I-16
65
problema mas de diseño del biorreactor a escala industrial que de
transferencia de momento, masa y calor.
En este proyecto no se alcanza a observar este efecto debido a que no se
contaba con dos escalas con condiciones parecidas con el fin de hacer la
comparación. Por el contrario, se pudo observar la diferencia de 2 escalas
con condiciones diferentes como son la producción de la proteína
recombinante en un tubo de ensayo y en el biorreactor. Los resultados
obtenidos de esta prueba fueron contradictorias, debido a que se esperaba
que las cantidades obtenidas en el tubo de ensayo fueran menores debido a
la baja aireación y mala homogenización de nutrientes y células obtenidas en
el shaker; sin embargo las cantidades obtenidas fueron mucho mayores a las
del biorreactor, infiriendo una sensibilidad de la cepa recombinante a los
efectos de la aireación y la agitación.
Trujillo y colaboradores [Trujillo, 2005], reportó problemas de este tipo en la
producción de PHB a partir de azotobacter, debido a los perfiles de oxigeno
que se daban en la producción en un erlenmeyer. Ellos comprobaron que la
cepa era sensible a las bajas concentraciones de oxígeno disuelto obtenidas
con un shaker, produciendo mayores cantidades del producto de interés. La
sensibilidad del sistema utilizado en este proyecto a los perfiles de DO no se
evaluó pero es una posibilidad para explicar el fenómeno observado en las
pruebas realizadas. En trabajos futuros con la cepa recombinante, este
puede ser otro factor a estudiar con el fin de llevar a cabo un óptimo
escalamiento.
IQ-2005-I-16
66
8.8 Parámetros de escalamiento
8.8.1 Ubicación de éste proyecto dentro del proceso de escalamiento
Para llevar a cabo el escalamiento de la producción de una proteína
recombinante usualmente se llevan a cabo estudios en tres escalas:
laboratorio, piloto, industrial [Scragg, 1997]. La primera etapa corresponde a
la estandarización de condiciones que puedan afectar el desempeño de la
cepa, así como la determinación del o de los parámetros de escalamiento
que mas se acoplen al sistema. Estas pruebas se llevan a cabo usualmente
en biorreactores pequeños (hasta aproximadamente 50 L), con el fin de
reducir los costos en medios de cultivo, ya que usualmente estas pruebas se
realizan con medios de cultivo comerciales. A partir de los datos obtenidos
en este estudio se establecen relaciones entre los parámetros y las variables
que afecten el comportamiento de éste, con el fin de desarrollar un modelo
teórico capaz de definir el sistema.
La segunda etapa o escala piloto corresponde al proceso intermedio en el
escalamiento (50-200L) y es el punto donde se observa como las
condiciones evaluadas a nivel de laboratorio se ven afectadas por el cambio
de escala. En este punto ya se observa que usualmente al escalar un
proceso de este tipo, no se utiliza un método geométrico debido a lo difícil
que se hace el control de todas las condiciones y la homogeneidad tanto de
nutrientes como de células en un volumen mayor. Por otro lado, en este
punto también se evalúan diferentes medios de cultivo no comerciales con el
fin de reducir costos en la producción. Para esto se reemplazan las fuentes
de carbono y nitrógeno por compuestos mas económicos, como la melaza y
el suero de leche, las cuales se complementan con algunas otras sales y
compuestos útiles tanto para el crecimiento de las células y la producción de
IQ-2005-I-16
67
la proteína, así como para evitar la proteólisis y aumentar la recuperación del
producto de interés. Al igual que en la escala de laboratorio, en esta escala
también se evalúan modelos teóricos que se acoplen al sistema con el fin de
compararlos y determinar cuales con la variables que mas se ven afectadas
con el cambio de escala.
Finalmente, después de evaluar y comparar los modelos teóricos obtenidos,
se lleva a cabo la producción a escala industrial, en la cual se conserva el
valor óptimo del parámetro de escalamiento evaluado. Para esto toca de
nuevo establecer las condiciones a las que el nuevo medio de cultivo y las
células se mantengan en el valor óptimo de escalamiento.
El objetivo de este trabajo era hacer un acercamiento a la parte inicial del
estudio en la escala de laboratorio, realizando la estandarización de
condiciones para la producción de la proteína recombinante, así como un
estudio preliminar de kLa y P/V como parámetros de escalamiento del
sistema. Debido a que nunca antes se habían realizado estudios de este tipo
en el departamento con microorganismos recombinantes, este proyecto abre
la posibilidad de continuar el estudio con este microorganismo y llevar a cabo
un escalamiento real, aplicando conceptos de transferencia de masa, calor, y
momento en el área de biotecnología a un nivel industrial.
8.8.2. kLa como parámetro de escalamiento
El termino kLa depende de las propiedades físico-químicas del medio del
biorreactor y de las condiciones físicas y condiciones de operación del
recipiente, por lo cual el valor de este coeficiente volumétrico de
transferencia de masa puede ser controlado por las condiciones de agitación
IQ-2005-I-16
68
y flujo de aire principalmente. El conocimiento del comportamiento de kLa
permite la operación de los biorreactores en condiciones en las cuales el
oxigeno no es un factor limitante para el crecimiento, debido a que se puede
hacer que el sistema mantenga altas concentraciones de oxigeno disuelto en
todo momento [Scragg, 1997]. Se han creado numerosas técnicas para la
determinación experimental de kLa. La técnica mas directa es la dinámica de
régimen estacionario [Scragg, 1997], la cual usa solamente un electrodo de
oxigeno disuelto, y se describe previamente en este trabajo.
Para el caso específico del sistema E.coli-pET-ABF, en el rango evaluado no
se observó ninguna tendencia a formar un domo, sin embargo, debido a que
E.coli un microorganismo netamente aerobio, se esperaría que el sistema
fuera más sensible a kLa en comparación con P/V. A partir de los datos
obtenidos de cantidad de proteína no se puede decir como se comportaría el
sistema por lo cual valdría la pena evaluar otros puntos en futuros trabajos,
con el fin de observar el domo completo y determinar las condiciones óptimas
de kLa para la producción de la proteína recombinante, en el caso en el que
este fuera el parámetro determinante del sistema.
Debido a que el objetivo de este trabajo se centró en hacer un acercamiento
al escalamiento de la producción de una proteína recombinante, solo se
evaluaron algunas condiciones específicas en el biorreactor, expresadas
como variables heurísticas, con el fin de compararlas con la cantidad de
proteína obtenida. En orden de continuar este escalamiento asumiendo que
kLa es el parámetro de escalamiento del sistema, tocaría evaluar la relación
de éste con otras variables como la viscosidad, presión, tipo de agitador,
cantidad de agente antiespumante entre otras, además de estudiar muchos
más valores de kLa con el fin de observar el domo completo y poder predecir
un modelo matemático.
IQ-2005-I-16
69
8.8.3. P/V como parámetro de escalamiento Conforme se aumenta el volumen del recipiente se aumentan los recorridos
del flujo para la circulación del fluido. Para mantener constante el tiempo de
mezcla deberia aumentarse la velocidad en el tanque en proporcion directa a
su tamaño. A grandes rasgos, bajo condiciones turbulentas, la potencia por
unidad de volumen es proporcional a la velocidad de fluido al cuadrado:
[Doran, 1998]
P/V= v 2
El efecto de esta relacion sobre la potencia consumida representa en
muchos casos un aumento excesivamente alto, y superior a lo que tanto
técnica y económicamente es posible en la mayoria de equipos de agitación.
Puesto que el criterio de tiempo de mezcla constante es raramente aplicable
al cambio de escala, es inevitable que los tiempos de mezcla aumenten con
la escala. Es por esto, que usualmente se mantiene como parámetro de
escalamiento P/V, y el tiempo de mezclado puede esperarse que aumente en
proporcion directa al diámetro del recipiente elevado a la potencia 0.67.
[Doran, 1998]
Normalmente en el cambio de escala de biorreactores se produce una
reducción de productividad y rendimiento como consecuencia de la menor
eficacia de mezcla y de la alteración consiguiente del ambiente fisico. [Doran,
1998] Es por esto, que éste parámetro se convierte en una util herramienta
para el diseño de biorreactores a escala industrial debido a que a partir de
las restricciones de potencia en esta escala, se pueden optimizar variables
IQ-2005-I-16
70
de producción a escala de laboratorio, intentando mantener el tiempo de
mezclado en las dos escalas.
Otro de los factores que afectan la potencia entregada al sistema, esta dada
por la aireación del sistema. La reducción de la potencia esta dada
principalmente debido a que la densidad del liquido, alrededor del agitador en
particular, aparentemente decrece debido a la existencia de burbujas. La
relacion entre el sistema con y sin aireación (Pg/P) oscila entre 0.3 y 1,
dependiendo del tipo de agitador y el flujo de aire. En otras palabras, este
término representa el grado de dispersión de las burbujas alrededor del
agitador y del recipiente. [Aiba, et al., 1965]
A partir de los valores obtenidos de P/V en este proyecto no se puede decir
mucho, debido a que se cuenta con muy pocos puntos para observar una
tendencia o predecir un modelo matemático. Sin embargo, las cantidades de
proteína obtenidas con éste parámetro de escalamiento fueron mayores a las
obtenidas en los tres puntos evaluados de kLa, infiriendo que a partir de los
datos evaluados la producción más optima de a proteína recombinante seria
dada por el valor más alto evaluado en este parámetro.
Vale la pena recalcar que a pesar que no se logró observar una clara
tendencia de ninguno de los dos parámetros de escalamiento para definir el
sistema, este proyecto hizo un acercamiento a lo complejo e impredecibles
que pueden llegar a ser los sistemas recombinantes. Por otro lado, siendo
que nunca se había trabajado con sistemas recombinantes para la
producción de proteínas en el departamento, este proyecto abre las puertas
a un nuevo campo de estudio, mostrando un nuevo campo de la ingeniería
química no explotado en la aún.
IQ-2005-I-16
71
Conclusiones
• El microorganismo E.coli-pET-ABF expresa la proteína recombinante
en fase estacionaria.
• Para la producción de la proteína recombinante es indispensable
mantener el inóculo en fase log, ya que después de llegar a fase
estacionaria pierde la capacidad de volver a expresarla.
• A partir de la prueba de expresión a pH´s diferentes, se observó que la
mayor cantidad de proteína se obtuvo en el sistema montado sin
control de pH debido a que esto puede facilitar la liberación de
metabolitos por parte de la célula, facilitando de la misma forma su
crecimiento y expresión de la proteína recombinante.
• Las cantidades de proteína recombinante mas altas se observan en
tubo de ensayo en comparación con el biorreactor. Esto puede ser
debido a los perfiles de DO a lo largo del crecimiento del
microorganismo recombinante.
• Se obtuvo una actividad de la proteína recombinante equivalente a
0.045 UI/mL ABF. En comparación con la obtenida con el hongo (0.21
UI/mL), es baja pero presenta la ventaja de un rapido crecimiento.
• Los resultados de la cantidad de proteína obtenida versus kLa y P/V no
son muy claros, por lo cual se deberían evaluar más puntos para tener
un punto óptimo de agitación y aireación. De todas maneras se puede
observar que con algunos valores de P/V se obtiene mayor proteína
IQ-2005-I-16
72
recombinante infiriendo una posible dependencia del sistema con este
parámetro de escalamiento.
• Para la producción de esta enzima a nivel industrial se podría plantear
una fermentación en continuo con el fin de mantener al
microorganismo en la fase específica de producción de la proteína
recombinante.
• Vale la pena recalcar que para el estudio de sistemas de este tipo, se
vuelve indispensable para el ingeniero químico el conocimiento de
sistemas biológicos.
IQ-2005-I-16
73
ANEXO 1 Conceptos Biológicos
Promotores
Es la región de DNA que reconoce la RNA polimerasa para unirse a la hebra
templado y así dar comienzo a la transcripción. En procariotes, se ubica
aproximadamente de 10 a 35 nucleótidos antes del gen o conjunto de genes
que se van a expresar. Dependiendo de la fuerza del promotor, o capacidad
para poder unir la RNA polimerasa, éste es el encargado de controlar o
regular la expresión de los genes que estén después de él. Los promotores
pueden ser constitutivos o inducibles. Los primeros son aquellos que
expresan constantemente un gen, mientras que los segundos son
controlados por estructuras llamadas represores que se unen al promotor
convirtiéndose en un impedimento estérico para la RNA polimerasa. Estos
represores son liberados en presencia de estímulos específicos para que se
pueda dar comienzo a la transcripción. Dentro de los promotores inducibles
uno de los más estudiados es el promotor lac de E.coli., el cual en presencia
de lactosa o un homólogo como el IPTG libera su represor y genera altas
cantidades de las enzimas encargadas para la degradación de esta hasta
que los niveles de lactosa en el medio lleguen a la normalidad.
Plásmidos
Los plásmidos son estructuras de ADN de cadena doble circular ajenas a los
cromosomas. Éstos se presentan en bacterias, levaduras y otros organismos
eucarióticos superiores y existen en una relación simbiótica con su
hospedero. De la misma forma que el ADN cromosomal, los plásmidos son
duplicados en pasados de generación en generación a células hijas,
IQ-2005-I-16
74
permitiendo que las mismas características sean propagadas [Darnell, et al.,
1986].
La estructura básica de un plásmido consiste en un origen de replicación,
una resistencia a un antibiótico, y un sitio múltiple de clonaje. El origen de
replicación (ORI) es una región específica para cada microorganismo que
delimita el punto en el que se separan las hebras de ADN para dar comienzo
a la replicación del plásmido en el momento de la división celular. Por otro
lado la resistencia al antibiótico es lo que se conoce como un marcador de
selección y es el encargado de separar las células en las que el plásmido fue
insertado satisfactoriamente. Su funcionamiento radica en la expresión de un
péptido capaz de unirse al antibiótico e inhabilitarlo; de esta forma si el
plásmido tiene una región que codifica para resistencia a ampicilina, las
células que crezcan en un medio con ampicilina serán en las que el plásmido
entró y expreso dicha resistencia. Por esta razón, con el fin de conservar el
plásmido dentro de la célula, estas deben ser crecidas siempre en medio de
cultivo con antibiótico. Finalmente, el sitio múltiple de clonaje es la zona
donde el gen de interés es insertado. Este contiene los sitios específicos
para diversas enzimas de restricción o “tijeras moleculares”, las cuales
realizan cortes específicos en regiones del ADN.
Dependiendo del uso que se le vaya a dar al plásmido éste puede ser de
clonación o de expresión. El primer tipo está conformado por plásmidos con
las especificaciones previamente dichas. Este tipo de estructuras sirven para
generar lo que se conocen como librerías de ADN ya que principalmente se
utilizan para secuenciar los fragmentos insertados. El segundo grupo
además de poseer las regiones básicas contiene un promotor inducible
previo al sitio múltiple de clonaje, con el fin de obtener altas ratas de
IQ-2005-I-16
75
expresión del gen de interés una vez sea agregado el estimulo que enciende
el promotor. [Darnell, et al., 1986].
Figura 21. Mapa básico de un plásmido de expresión en el que se muestran: 1 el origen de
replicación (ORI), 2 el sitio múltiple de clonaje, 3 la resistencia a antibiótico (Kanamicina), 4 el promotor CMV, y 5 un gen reportero para detección de la proteína con anticuerpos.
Promotor lac
Es uno de los promotores de regulación o inducible más utilizado de E.coli.
Su regulación se basa en la utilización de un represor (lac I) o molécula que
se une a la hebra de ADN entre el promotor y el gen, generando un
impedimento estérico para la RNA polimerasa e inhibiendo la transcripción
del gen. El operon o conjunto de genes bajo la regulación de este promotor
son los encargados de convertir la lactosa en subunidades o azúcares
simples para que sean más asimilables para la célula en el caso en que ésta
15
4
3 2
IQ-2005-I-16
76
sea su única fuente de carbono. Su funcionamiento se basa en que el
represor en presencia de lactosa o un análogo químico a ésta como el
isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se suelta de la hebra de ADN
permitiendo la transcripción de los genes bajo el control del promotor. (ref
molecular biotechnology) Ver figura 22. Este sistema de expresión es
comúnmente inducido con IPTG en vez de lactosa debido a que el IPTG es
efectivo en bajas dosis, la inducción no es afectada por la presencia de
lactosa y el inductor no es metabolizado por la célula, sin embargo el IPTG
en altas cantidades es toxico y comparablemente costoso [Donovan, et al.,
1996].
Figura 22. Esquema general del funcionamiento del promotor lac.(Operon lac, 2005)
IQ-2005-I-16
77
ANEXO 2 Métodos Moleculares
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
El PCR es una técnica para la amplificación in vitro de secuencias
especificas de ADN a partir de la extensión simultánea de oligonucleótidos
complementarios a las cadenas. [McPherson, et al., 1996].
Componentes de la Reacción
DNA Polimerasa Es la enzima encargada de tomar como plantilla una hebra de ADN a partir
de un iniciador y extenderla para realizar una copia complementaria de ésta
de la misma forma en la que se lleva a cabo la replicación en cualquier
célula. La enzima utilizada para estos propósitos es la Taq polimerasa
(aislada de T. Aquaticus) debido a su alta estabilidad a temperaturas
elevadas [McPherson, et al., 1996].
Deoxinucleósidos trifosfato (dNTP´s) Son los encargados de suministrar la energía y los nucleósidos
complementarios a la hebra plantilla de ADN para llevar a cabo la síntesis de
la nueva hebra con la acción de la Taq Polimerasa. [McPherson, et al., 1996].
Cloruro de Magnesio Es el compuesto (cofactor de la enzima) encargado de estabilizar y optimizar
el desempeño de la Taq Polimerasa.
IQ-2005-I-16
78
Iniciadores (Primers) Son secuencias cortas de ADN (comúnmente entre 18 y 30 nucleótidos) que
se unen complementariamente a una hebra plantilla, para servir de punto de
inicio para que la Taq Polimerasa comience su trabajo. Usualmente se
prefieren que tengan un contenido parecido de guanina y citosina y una
estructura secundaria débil con el fin de facilitar el anillaje [McPherson, et al.,
1996].
Buffer de Reacción Es el encargado de dar estabilidad a la mezcla y facilitar la reacción. Esta
compuesto comúnmente por Tris, KCl y un detergente no iónico en bajas
concentraciones [McPherson, et al., 1996].
DNA Objetivo El ultimo esta dado por el ADN del cual se quiere amplificar la región. Este se
coloca en bajas concentraciones debido a que una alta cantidad puede
inhibir que se dé la reacción.
Pasos de la PCR
Denaturación: Ocurre cuando la reacción es calentada a 92-96 °C. En este
paso las cadenas de ADN rompen sus puentes de hidrógeno y se separan.
Este paso se lleva a cabo por aproximadamente 1 minuto [Glick and
Pasternak, 1998].
Anillaje: En este paso se disminuye lentamente la temperatura hasta
aproximadamente 55°C con el fin de que los iniciadores se unan
IQ-2005-I-16
79
complementariamente a las hebras de ADN. Este paso se lleva a cabo por
solo unos segundos [Glick and Pasternak, 1998]
Elongación: En este paso se extiende la cadena de ADN a partir de las
secuencias iniciadoras debido a la acción de la polimerasa termoresistente.
Este paso se realiza a aproximadamente 72°C debido a la óptima actividad
de la polimerasa y el tiempo de este paso depende de la longitud del
fragmento que se va a amplificar. [Dieffenbach and Dveksler, 1995].
Electroforesis
Electroforesis es el proceso de mover moléculas cargadas en solución,
aplicándoles un campo eléctrico a través de la mezcla. Debido a que las
moléculas en un campo eléctrico se mueven con una velocidad dependiente
de su carga, forma y tamaño, la electroforesis se ha convertido en una
herramienta de uso común para realizar separaciones a nivel molecular.
Como una herramienta analítica, la electroforesis es un método simple y
rápido. Esta permite observar y purificar diversos tipos de macromoléculas
tales como proteínas y ácidos nucleicos, y otras moléculas más simples
como azúcares cargados, péptidos, aminoácidos e iones simples.
La electroforesis de macromoléculas es usualmente llevada a cabo
colocando una delgada capa de muestra en una solución estabilizada por
una matriz porosa. Bajo la influencia de un voltaje aplicado, diversas
especies de moléculas en la muestra se mueven a través de la matriz a
diferentes velocidades. Al final de la separación, estas especies diferentes
son detectadas como bandas en diferentes posiciones de la matriz. Una
matriz es necesaria debido a que la corriente eléctrica pasando a través de la
IQ-2005-I-16
80
solución de electroforesis genera calor, lo cual causa difusión y mezcla
convectiva de las bandas en ausencia de un medio estabilizador. La matriz
puede estar compuesta de diversos materiales incluyendo papel, celulosa,
acetato o geles hechos de poliacrilamida, agarosa y almidón.
Los geles de poliacrilamida y agarosa son los medios estabilizadores más
usados a nivel de laboratorio. Las matrices de poliacrilamida son las más
usadas comúnmente para separar proteínas, mientras que para ácidos
nucleicos se utiliza agarosa y en algunos casos poliacrilamida dependiendo
del tamaño de la molécula analizada.
En la mayoría de unidades de electroforesis, el gel es montado entre dos
cámaras de buffer con el fin de que el único camino por el que exista
conexión eléctrica entre las dos cámaras sea a través del gel. Por esta razón,
el contacto entre el gel y el buffer debe ser contacto líquido directo o a través
de una delgada capa ya sea de papel o de gel. [Hoefer, 1990].
SDS-PAGE
En las separaciones con geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), la
migración está determinada no por la carga intrínseca de los polipéptidos
sino por peso molecular. Para este tipo de electroforesis se utiliza
dodecilsulfato de sodio (SDS), el cual es un detergente aniónico que
denatura las proteínas envolviéndose alrededor de la estructura del
polipéptido. En este proceso, el SDS confiere a la macromolécula una carga
neta negativa proporcional a su longitud. En otras palabras, cuando una
muestra es tratada con SDS y un agente reductor, los polipéptidos quedan
IQ-2005-I-16
81
convertidos en barras cargadas negativamente con densidad de carga o
carga por unidad de longitud igual.
SDS-PAGE es capaz de mostrar mezclas complejas en cientos de bandas en
un gel. La posición de una proteína, observada en una banda, es una buena
aproximación de su tamaño, y después de teñido el gel la intensidad de la
banda puede ser un indicador general de la cantidad de proteína por
muestra [Hoefer, 1990].
Sonicación
Método que utiliza la vibración rápida de una punta de titanio para producir
ondas sonoras de alta intensidad, las cuales generan burbujas microscópicas
de gas creando una cavitación suficiente para generar altos gradientes de
esfuerzo de corte debido a la formación de microcorrientes.
El rompimiento de células utilizando este método es muy común debido a
sus bajos costos y efectividad; sin embargo una desventaja limitante del uso
de éste es que la ruptura no es instantánea, por lo cual una suspensión de
células debe ser tratada desde 30 s hasta varios minutos para que exista un
considerable rompimiento de células. Durante este tiempo, las partículas
subcelulares liberadas de las células rotas son también sometidas a las
mismas fuerzas de corte ejercidas sobre las células sin romper, dañando
algunas de las proteínas solubilizadas.
Por otro lado, es difícil controlar la temperatura de la muestra mientras se
hace el rompimiento, la generación de espuma puede producir denaturación
de proteínas, y el fenómeno de cavitación promueve la oxidación de enzimas
IQ-2005-I-16
82
sensibles al oxígeno y lípidos insaturados. Los problemas de espuma y
temperatura pueden ser minimizados sometiendo la muestra a lapsos cortos
en el sonicador (15 a 30 s) en vez de un tratamiento continuo, y enfriando la
muestra en hielo entre estos lapsos. Finalmente, los problemas de oxidación
pueden ser minimizados cubriendo la muestra con argón durante el
tratamiento [Gerhardt, et al., 1994].
Método Bradford (Prueba para cuantificación de proteínas)
La prueba de Bradford es un procedimiento común para determinar
cantidades de proteína en microgramos. Su funcionamiento está basado en
el colorante Azul de Coomasie G (Serva Blue G), el cual al ser mezclado con
acido fosfórico y etanol tiene una absorbancia máxima de 465 nm. Cuando el
colorante es mezclado con proteína la absorbancia máxima del colorante
cambia a 595 nm. Al darse la unión colorante proteína, la proteína estabiliza
la forma aniónica del colorante mediante interacciones iónicas e hidrofóbicas,
interactuando principalmente con aminoácidos como la arginina y un poco
menos con histidina, lisina, tirosina, triptófano y fenilalanina [Bradford, 1976].
La prueba de Bradford es rápida, requiere pocos pasos y mezclas, no
requiere calor, y da una respuesta colorimétrica más estable en comparación
con los otros métodos (Lowry, Smith). Sin embargo, al igual que en los otros
métodos, su respuesta se ve influenciada por algunas sustancias no
protéicas, especialmente detergentes. (Método Bradford, 2005)
IQ-2005-I-16
83
Recursos Electrónicos
Curva de crecimiento, U.S. Microbics Inc. [En Línea]
http://www.bugsatwork.com/XYCLONYX/MICROBES_101/sld026.htm,
Consulta 20 Mar 2005
Deuteromicete, Control Biológico [En Línea] http://www.control-
biologico.com/monog.trichoderma.htm, Consulta 21 Jul 2004.
Operon lac, control de expresión génica en procariotes. Instituto de ciencias
Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais [En Línea]
http://www.icb.ufmg.br/~lbcd/grupo7/iniciar/aulaexp/exp1-2.html, Consulta 24
Feb 2005
Mapa Vector pUMVC1, Vector Mcore, University of Michigan [En línea]
http://www2.med.umich.edu/medschool/vcore/PlasmidItem.cfm?recordID=pU
MVC1-CAT, Consulta 15 Ene 2005
Método Bradford, total protein assays , Departamento de Bioquímica , Smith
College, [En línea], , http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/
%20Biochem_353/Bradford.html
Consulta 21 Feb 2005.
Hepatitis B, National Center for Infectious Diseases, [En Línea] ,
http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/b/factvax.htm, Consulta 01 Jul
2005
IQ-2005-I-16
84
Bibliografía
1. Agrios G. Fitopatología. Mexico; Editorial Limusa; 1998.
2. Aiba S, Humphrey A, Millis NF. Biochemical Engineering. USA;
Academic Press; 1965.
3. Barrera A, Gómez S, Arbeláez G. Determinación de razas fisiológicas
de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi en ocho fincas del "Grupo Chia"
cultivadoras de clavel, localizadas en la sabana de Bogotá. Acopaflor
1998;5:4-16.
4. Biotechniques. Purification of active eukariotic proteins from the
inclussion bodies in E.coli. Biotechniques 1991;11:748-752.
5. Bradford M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding. Anal. Biochem. 1976;248-254.
6. Brock T, Smith D, Madigan M. Biiology of microorganisms. USA;
Prentice Hall; 1984.
7. CALBIOCHEM. BUFFERS. A guide for the preparation and use of
buffers in biological systems. Alemania, 1990, p.
8. Chacón-Martínez CA. Caracterización molecular y bioquímica de una
alfa-L-arabinofuranosidasa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza
2. Facultad de Ciencias. Carrera de Microbiología Industrial., Bogotá,
Colombia, Pontificia Universidad Javeriana.; 2003, p. 113
9. Christakopoulos P, Katapodis P, Hatzinikolaou D, Kekos D, Macris B.
Purification and characterization of an extracellular alpha-L-
arabinofuranosidase from Fusarium oxysporum. Applied Biochemistry
and Biotechnology 2000;87:127-133.
10. CorpoGen C. Expresión industrial de proteínas. 2005, p.
11. Crous J, Pretorius I, van Zyl W. Cloning and expression of alpha -L-
arabinofuranosidase gene (ABF2) of Aspergillus niger in
IQ-2005-I-16
85
Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology
1996;46:256-260.
12. Darnell J, Lodish H, Baltimore D. Molecular Cell Biology. USA;
Scientific American Books; 1986.
13. De Bernardez E. Refolding of recombinant proteins. Curr. Opin.
Biotechnol. 1998;157-163.
14. Dieffenbach C, Dveksler G. PCR PRIMER, A laboratory Manual. USA;
Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1995.
15. Donovan RS, Robinson CW, Glick BR. Review: optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter. J Ind Microbiol 1996;145-154.
16. Doran P. Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. Australia;
Editorial Acribia; 1998.
17. Flipphi M, Visser J, van der Veen P, de Graff L. Cloning of the
Aspergillus niger gene encoding alpha-L-arabinofuranosidase A.
Applied and Environmental Microbiology 1993b;39:335-340.
18. Gerhardt P, Murray RG, Krieg N. Methods for general and molecular
bacteriology. USA; American Society for Microbiology; 1994.
19. Gielkens M, Gonzalez-Candelas L, Sanchez-Torres P, van de
Vondervoort P, de Graaff L, Visser J, Ramon D. The abfB gene
encoding the major alpha-L-arabinofuranosidase of Aspergillus
nidulans: nucleotide sequence, regulation and construction of a
disrupted strain. Microbiology 1999;145:735-741.
20. Gilead S, Shoham Y. Purification and characterization of an alpha-L-
arabinofuranosidase from Bacillus stearothermophilus T-6. Applied and
Environmental Microbiology 1995;61:170-174.
21. Glick B, Pasternak J. Molecular Biotechnology, Principles and
applications of recombinant DNA. USA; ASM Press; 1998.
IQ-2005-I-16
86
22. Goodman R, Kiraly Z, Word K. The Biochemistry and Physiology of
plant disease. USA; University of Missouri Press; 1986.
23. Hoefer. Protein Electroforesis. Alemania, 1990, p.
24. Jimenez I. Escalamiento para la produccion de un biopesticida a partir
de Bacillus thuringuiensis suesp.kurstaki e fermentadores de 14 y 250
L con base en la transferencia de oxígeno. Departamento de
Ingeniería Química, Universidad de los Andes; 2003, p.
25. Kaji A. L-arabinases. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1984;383-394.
26. Kaneko S, Arimoto M, Kobayashi H, Ishii T, Kusakabe I. Purification
and substrate specificities of two alpha-L-arabinofuranosidases from
Aspergillus awamori IFO 4033. Applied and Environmental
Microbiology 1998;64:4021-4027.
27. Kimura I, Yoshioka N, Kimura Y, Tajima S. Cloning, sequencing and
expression of an alpha-L-arabinofuranosidase from Aspegillus sojae.
Journal of Bioscience and Bioengineering 2000;89:262-266.
28. Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins
produced in E. coli. Current Opinion in Biotechnology 1998;9:497-501.
29. Margolles-Clark E, Tenkanen M, Nakari-Setala T, Penttila M. Cloning
of genes encoding alpha-L-arabinofuranosidase and beta-xylosidase
from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cerevisiae.
Applied and Environmental Microbiology 1996;62:3840-3846.
30. Matsuo N, Kaneko S, Kuno A, Kobayashi H, Kusakabe I. Purification,
characterization and gene cloning of two alfa-L-arabinofuranosidases
from Streptomyces chartreusis. Biochem. J. 2000;9-15.
31. Mavituna F, Atkinson B. Biochemical engineering and biotechnology
handbook. USA; Strockton Pr; 1992.
32. McPherson MJ, Taylor GR, Quirke P, Hames BD. PCR, A practical
approach. USA; Oxford University Press; 1996.
IQ-2005-I-16
87
33. Mierendorf R, Yeager K, Novy R. The pET system: your choice for
expression. InNonations: advanced products and protocols for
molecular biology research 1994;1:1-12.
34. Morales P, Sendra J, Pérez-González J. Purification and
characterization of a alpha-L-Arabinofuranosidases from Bacillus
polymyxa expressed in Bacillus subtilis. Applied Microbiology and
Biotechnology 1995;44:112-117.
35. Novagen. pET23 (+) Vector. 2005, p.
36. Oosterhuis NMG. Scale up of Bioreactors: A scale down approach.
Delf University; 1984, p.
37. Pentilla M, Andrade E, Saloheimo M, Lehtovaara P, Knowles J.
Expression of two Trichoderma reesei endoglucanases in the yeast
Saccharomyces cereviciae. Yeast 1987;3:175-185.
38. Quintero R. Ingeniería Bioquímica. Teoría y aplicaciones. México;
Editorial Alambra; 1990.
39. Saha B. Alpha-L-arabinofuranosidases: biochemistry, molecular
biology and aplications in biotechnology. Biotechnology Advances
2000;18:403-423.
40. Sánchez-Torres P, González-Candelas L, Ramón D. Expression of a
wine yeast strain of Aspergillus niger abfB gene. FEMS Microbiology
Letters 1996;145:189-194.
41. Schwarz W, Adelsberger H, Jauris S, Hertel C, Funk B, Staudenbauer
W. Xylan degradation by the thermophile Clostridium stercorarium:
cloning and expression of xylanase, beta-D-xylosidase and alfa-L-
arabinofuranosidase genes in Escherichia coli. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 1990;368-374.
42. Scragg A. Biotecnología para ingenieros. Sistemas biológicos en
procesos tecnológicos. Mexico; Editorial Limusa S.A.; 1997.
IQ-2005-I-16
88
43. Stratagene. BL-21 Gold Competent Cells, BL-21-Gold (DE3)
Competent Cells, ans BL-21-Gold (DE3)pLysS Competent Cells. 2005,
p.
44. Trujillo M. II Simposio Biofrabricas. Avances de la biotecnología en
Colombia. 2005, p.
