IQB201 – Bioquímica Básica I

Sequenciamento de Proteínas

Joab Trajano SilvaInstituto de Química/UFRJ

Sequenciamento de Proteínas

A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica, ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.

• Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína

• Clivar as pontes de enxofre (se houver)

• Purificar cada uma das subunidades

• Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade

• Determinar o resíduo N-terminal

Preparo da Proteína para o Sequenciamento

I. Redução das Pontes Dissulfeto

II. Composição de Aminoácidos da Proteína

I ndividual Amino Acids24 h

110o

Seal

Protein6N HCl

N2

Ala + Asp + Ser*110°, 24h6N HCle.g. AlaAspSer

II. Composição de Aminoácidos da Proteína

H H

: :

H 3 N CH

R 1

C NH

O

CH

R 2COO

H 3 N CH

R 1

C NH

O

CH

R 2COO

H3N CH

R 1

COO–

H3N CH

R 2

COO–

H H

C NH

O

HH

+

+

+ _

_+

O H+O

H+

• Completa destruição de Trp

• Perda parcial de Ser, Thr e Tyr

• Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn

R 1

H 3 N

C

C

N

C

C

N

C

C

O CH 2 H O

R 2OH

C

O NH 2

+

Asn

(also hydrolysis of peptide bonds)

H+

NH C

H

NH C

CH 3

NH C

CH 3

OO O

H B

D-amino acidL-amino acid

_

base + :BH

CC

CH3

C

B:

A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h

•Decomposição de Cys, Ser e Thr

•Desaminação e racemização de outros aminoácidos

•Permite a quantificação de Trp

Hidrólise Alcalina

Determinação do Resíduo N-terminal

Análise do N-terminal (Edman)

C-terminal Análise por Carboxipeptidase

A F V MG

C C

OH

CH2OH

H

NH3N C C

H O

CH3 CH2CH2SCH3

H O

CC ON

H

C C

OH

H

N

H

C C

OH

CH(CH3)2

N

HH

N

CH2

H O

CC

C CO

OH

H

N

CH2CH2SCH3

H O

COCNH3

H3

+

S

G

M

Carboxypeptidase

C C

OH

CH2OH

H

NH3N C C

H O

CH3

C CO

OH

H

N

H

C C

OH

CH(CH3)2

N

HH

N

CH2

H O

CC

Carboxypeptidase

C C

OH

CH2OH

H

NH3N C C

H O

CH3

C CO

OH

CH(CH3)2

N

HH

N

CH2

H O

CC +

Separação dos aminoácidos por HPLC

10 min

20 min

30 min

40 min

S G A V M F

S A V M FG

Leucina aminopeptidase: Análise do N-terminal

A F V MG

C C

OH

CH2OH

H

NH3N C C

H O

CH3 CH2CH2SCH3

H O

CC ON

H

C C

OH

H

N

H

C C

OH

CH(CH3)2

N

HH

N

CH2

H O

CC

S

A (first aa released) F V GS

Leucineaminopeptidase, 10 min

Leucineaminopeptidase, 10 more min

F VS (2nd aa released) G

+

M

C C

OH

CH2OH

N

CH2CH2SCH3

H O

CC ON

H

C C

OH

H

N

H

C C

OH

CH(CH3)2

N

HH

N

CH2

H O

CCH3N C CO

H O

CH3

H3

C CO

OH

CH2OH

N

M

CH2CH2SCH3

H O

CC ON

H

C C

OH

H

N

H

C C

OH

CH(CH3)2

N

H

N

CH2

H O

CCH3 H3+

Separação dos Aminoácidos Liberados

S G A V M F

S G A V M F

10 min

20 min

30 min

40 min

Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica

• Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados diretamente

• Purificar cada fragmento

• Determinar a sequencia de aminoácidos de cada fragmento purificado

• Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso de outro método de clivagem