AMADOR BURGOA JULIO CÉSAR J

NOMBRE :

MATRÍNLA: 513328588

LICENCIATURA: / INGENIERÍA DE LCS ALIMENTOS UNIVERSiDAL .hUT&~O>!A. XETROPOLITANA UNIDAD IZTAPALhFA DIVISIÓN DE CIENCIAS BLOLÓGICAC Y DE LA SALUD J

TELÉFONO: I44 7 9 32 * TRIMESTRE LECTIVO: 97-3

HORAS A LA SEMANA: 2 0

/TITULO DEL TRABAJO: OBTENCI6N Y CARACTERIZACIÓN DE PkPTIDOS A PARTIR DE PROTEfNA DE SUBPRODUCTOS DE PESCADO

~

UTILIZANDO LA ENZIMA NEUTRASA.

/ ASESORES: - DRA. PROFESOR TITULAR "B" DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGfA - DR. SERGIO HUERTA OCHOA PROFESOR TITULAR "C" DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGfA

LILIA ARELY PRADO BARRA-

LUOAR DE REALIZACI~N DEL SERVICIO: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-IZTAPAP LABORATORIO S-146 Y PLANTA PILOTO 4

FECHA DE IN ICIO : 2 OCTUBRE 1 9 9 7

Jmci-m DE TERMINACIÓN: z ABRIL 1998 1 CLAVE: IA. 055.91

NOMBRE DEL PROYECTO: INTRODUCCI~N, ADAPTACI~N Y DESARROLLO DE w TECNOLOGÍA DEL CULTIVO DE LA LANGOSTA DE AGUA DULCE (Cherax quadricarinatus)

I

ALUMNO AMADOR BPGOA JULIO CÉSAR

ASESOR DRA. LILIA ARELY PRADO BARRAGÁN

ASESOR # DR. SERGIO ñUERTA OCHOA

I

UNIVERSIDAD AUTONOYA METROPOLITANA DlVlSlON DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SEWICIO SOCIAL . .

, . . . , , , . . . . , " ..... , . ~ . < "

Por medio de la presente se hac. star que (la): DR. SERGIO HUERTA OCHOA

del Departamento de BIOTECNOLOG/A de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio

TITULO

ALUMNO Amador Burgoa Julio César MATRICULA 93328688 LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a once de Diciembre de mil novecientos noventa y ocho.

A T E N T A M E N T E , "Casa Abierta al Tiempo'

Obtención y caracterización de péptidos a pariir de proteína de subproductos de pescado utilizando la enzima neutiasa.

Octubre 2, 1997 a Abril 2, 1998.

SECRFTARIO AC

,

UNIDAD ETAPALAPA Av. Michosdn y La Purlrim. Iztapalip. 09340, M6xwico. D F. A.P. 55-535 Fax: (5)612-3 Tds. 724-4581 Y 85

I

casa abiera si 1,empa

UNIVERSIDAD AUT~NOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD Departamento de Biotecnología Area de Microbiología

3 de Noviembre de 199s

DR. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA DIRECTOR, DIVISION CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD P R E S E N T E

.

Por medio de la presente, le comunicamos que el alumno Julio Cesar Amador Burgoa, matricula 93328588 de la carrera de Ingeniería de los Alimentos, d t j ~ o l l ü y concluyó saijfactonamente el proyecto y reporte final del trabajo titulado: u OBTEKCIOS Y CARACTERIZACIOS DE PEPTIDOS A PARTIR DE PROTEINA DE SUBPRODUCTOS DE PESCMO UTILIZANDO LA FXfDIA NEUTRASA”. Dicho proyecto se realizó en la planta piloto 4 del departamento de Biotecnolcgia, bajo nuestra dirección y supervisión.

Así mismo, hacemos de su conocimiento que el retraso en la entrega del repone %ai se debió a la necesidad de la repetición de ensayos durante el desarrollo del proyecto.

Sin otro particular, aprovechamos la ocasión para reiterar a wed nuestra más atenta Zonsideración.

A T E N T A M E N T E “Casa abierta a i tiempo”

‘ J Dra. Liiia Arely Prado Barragán Profesor Tihilar

I

Profesor Titular

UNIDAD TZTAPALAPA Av. Michoacan y la Purisim. Coi. Vicentina, impalapa 09340, D.F. Tel.: (Wi3-6355, Fax: (617234355

ÍNDICE

INTRODUCCION La importancia de los subproductos de pescado La proteína de pescado como subproducto Recuperación de proteína: Tecnologías utilizadas - Grad’o de hidró1i;is Cinética eminiática Efecto del pH v temperatura Determinación de péptidos solubles Caracterización molecular Substrato Enzima

OBJETIVOS

METODOLOGf A Análisis bromatológico - Determinación de activi-..id proteL..tica -2 Neutrasa uti...zando como

Determinación de la cinética enzimática de Neutrasa utilizando como

Caracterización molecular: Electroforesis CDS-PAGE

substrato alterno Hemoglobina

substrato Desechos de pescado

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

RESULTADOS Y DISCUSIONES

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

APENDICES

BIBLIOGRAFIA

1 . 1 2 3 4 4 7 . 9 9 10 11

12

13 13

14

16 19

22

23

38

40

42

46

OBTENCI~N Y CARACTERIZACIÓN DE PÉPTIDOS A PARTIR DE PROTEINA DE SUBPRODUCTOS DE PESCADO

LTlLIZANDO LA ENZIMA NELJTRASA

"La importancia de los subproductos de pescado" * En México >- en muchos otros países del mundo,

diariamente se gezersn enormes cantidaaes de desechos en la Industria Eesquera. Estos desperdicios van desde los. sobrantes del filete0 llevados a cabo en los mercados de distribución municipales y ~ en , las plantas procesadoras de atún, sardina, etc., ha fauna de acompañamiento- atrapada en la captura minada especie marina. La contaminación y los daños e gicos que se generan con estos desechos son severos ya que descomponerse causan focos de infección, enfermedades, es desagradables, etc. Sin embargo es posible disminu poco estos daños al medio ambiente tratando de una a adecuada estos desechos (Rodríguez-Estrada et a l , 1996).

En la actualidad se hacen esfuerzos para remediar estos desperdicios. Una opción interesante para llevarlo a cabo es no limitarse a la ext.racci6n y refinado del compuesto dominante, sino extraer todos los compuestos que puedan interesar a la industria productora de alimentos u' otras industrias (Bourgeois & Le ROUX, 1 9 8 6 ) .

Dentro de la composición de los desechos pesqueros, se encuentran cantidades importantes de material recuperable como aceites, enzimas y sobre' todo de proteína. Por otro lado, bien es sabido e l alto valor nutritivo del pescado debido a que es una fuente proteica de excelente calidad por su alto contenido de aminoácidos escenciales, el cual es comparable con el de otras fuentes proteicas de origen animal como la leche, huevo, etc. Si a esto adicionamos, que actualmente se ha incrementado la demanda de fuentes' proteicas de buena calidad, entonces resulta factible el tratar de convertir este material desperdiciado en otras formas más aceptables y comercializables (Hoy le & Merrit, 1994).

A pesar de que los desechos de pescado podrían cubrir en parte la demanda de proteína para consumo humano y animal, en la actualidad solamente se industrializa parte de este material para la producción de harinas de pescado (Rivera, 1990).

1

Como resultado d c todo lo anterior, surge el interés de científicos e investigadores en alimentos para la producción de material de ilto valor agregado a partir de fuentes abundantes y baratas iVieira et al,. 1995).

Es claro que esto involucra el desarrollo de tecnologías e para la eficiente recuperación de las proteínas y de mayor importancia aún es el desarrzllc de procesos para modificar sus propieaades fisico-quixicas de tal manera que puedan. realizar funciones específicas en alimentos y sigan conservando un adecuado valor nutricional (Montecalvo, 1984).

Ahora bien, el proceso de transformación de los subproductos o residuos pesqueros tiene además ventajas económicas, ya que la industrialización de productos que en estado natural no poseen ningún valor, abre nuevos mercados de consumo que serán más baratos que los que se obtienen por otras fuentes.

“La proteína de pescado como subproducto“

~~

El uso de proteínas como aditivos en alimentos, se debe principalmente a sus cualidades nutricionales y funcionales. Nutricionalmente las proteinas son fuente de energía y de aminoácidos l o s cuales son escenciales para el crecimiento y desarrollo, mientras que funcionalmente son importantes por las propiedades que proveen. Estas propiedades funcionales se aplican en términos de la tecnología de alimentos y de acuerdo a la aplicación deseada, las proteínas se adicionan como ingredientes funcionales para emulsificar, ligar agua o grasa, formar espumas o geles y alterar el sabor, textura y apariencia í tienen capacidad de adhesión, cohesión, viscosidad, etc.), obteniendo la deseada calidad organoléptica en una gran gama de productos alimenticios (Addler-Nissen, 1986; Mohamed, 1994).

*

Las capacidades funcionales de cada molécula proteica están influenciadas por una serie de factores como la estructura espacial que posean, las secuencias de aminoácidos que conforman a la cadena, interacciones con otros grupos, pH y temperatura a la que sean sometidas, tamaño de cadena y en general a todo lo que componen el medio en donde se encuentren localizadas tales proteínas (Bourgeois & Le Roux, 1986).

Dentro de las tecnologías utilizadas para la recuperación de materia? proteico de pescado, está el proceso de hidrólisis. Desde tiempos atrás, se ha empleado la hidrólisis química como método de recuperación proteica. Esta hidrólisis emplea fuertes solventes químicos de carácter

(Cheftel e t a l , 1971; Vieira e t a l , 1995; Hevia et a l , 1976). Sir! embargo este t ratamienr ; provoca reacciones no deseables para su uso en alimentos, tales como racemización de residuos' de aminoácidos, reacciones de efectos tóxicos (Linder et al, 1995), pérdida. de aminoácidos como cisteina, tirosina y metionina (Nair et a l , 1976) y fomaciód de sustancias tóxicas como lisino-alanina (Lalh & Braun, 1994), además de que un hidrolizado proteico obtenido a través de una hidrólisis química no es seguro para la aplicación en alimentos de consumo humano.

ácido o alcalino para llevar a cabo la ruptura proteica *

Como respuesta a estos inconvenientes, han surgido alternativas para llevar a cabo la hidrólisis proteica. Entre estas alternativas se encuentra la hidrólisis enzimática (Cheftel et a l , 1971; Quaglia & Orban, 1987; Hoyle & Merrit, 1994; Nair et a l , 1976; Civit et al, 1982). Este método involucra una hidrólisij limitada de proteína con enzimas proteolíticas selectas para romper puentes peptídicos específicos produciendo cambios en sus características fisico-químicas (Montecalvo et al, 1984).

La hidrólisis enzimática es muy eficiente y puede llevarse a cabo bajo condiciones biológicas tales que le proporcionan ventajas sobre la hidrólisis química (Addler- Nissen, 1986; Vieira et al, 1995; Nair et a l , 19761, por ejemplo: a) minimiza la pérdida de nutrientes (Linder et ai, 19951, b) mejora las propiedades funcionales (Vieira et ai, 1995; Linder et a l , 1996; Quaglia & Orban, 1987; Novo Nordisk, 1997), c) produce hidrolizados con un perfil peptidic0 bien definido (Lahl & Braun, 1994) y d) produce péptidos de fácil incorporación a alimentos para aumentar su valor nutr-cional (Sekul t?t a l , 1 9 7 8 ) .

Además de esto, la hidrólisis enzimática es un método biológico, es decir, no intervienen reactivos o sustancias dañinas así como tampoco se producen metabolitos intermediarios tóxicos por lo que es un proceso apto para aplicarlo a proteínas de consumo humano.

.-

3

"Grado de hidrólisis"

realizar cualquier tipo de hidr6lisis, es de suma importancia el control de ciertos paránetros (índices de^ hidrólisis) tales como concentración de sLSstrato, proporción enzima-sustrato, pH, tiempo y temperatura .(Quaglia & Orban, 1987) . Estos parametros son los determinantes primarios de la rapidez del proceso de reacción así como de las características del producto de hidrólisis (Adler-Nissen, 1 9 8 6 ) . .

Una medida de la extensión de la degradación hidrólitica es el Grado de Hidrólisis (GH) (Adler-Nissen, 1986). El GH se define como el porcentaje de puentes peptidioos-drsociados, en/otras palabras, es la cantidad en porcentaje de grupos amino o grupos carboxilo libres al transcurrir una reacción de hidrólisis. En el curso de &Sta reacción, el .GH va incrernentándose hasta un valor determinado en el cual la reacción se termina por inactivación de la ~enzima. Debido a esto, el GH es un parámetro con el que se puede controlar una reacción de hidrólisis.

El utilizar el GH, en lugar del tiempo de reación (t), como parámetro para controlar una hidrólisis tiene la ventaja de que las propiedades del hidrolizado dependen únicamente del GH y son independientes de los cambios -en lai concentración de substrato, (SI; proporción enzima-substrato, (E/S) ; y temperatura, (T) . Esto permite al investigador, reducir considerablemente el número de experimentos en un estudio. Así , en lugar de trabajar con cinco variables independientes ( S, E / S I pH, T y t), se pueden condensar a dos variables GH y pH (el pH si es independiente,. ya que aunque en menor grado, influencía sobre las propiedades del hidrolizado). Una vez elegido el substrato y la enzima con las que se va a trabajar, el GH seria la principal variable a utilizar en la optimización de procesos de hidrólisis proteica (Adler-Nissen, 1993) . "Cinética enzimática"

En ciialquier hidrólisis proteica de tipo enzimática y en general en cualquier reacción enZimátiCa, es de gran ayuda conocer el comportamiento de la enzima involucrada. Para esto se realizan estudios de cinética enzimática, la cual estudia el comportamiento de l a velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de esta cinética proporcionan una herramienta muy Útil para el calculo de la concentración de enzimas en muestras biológicas Y comparar su actividad

A

catalítica con otras enzimas (Colby, 1980). Así mismo la rinética enzimática es útil para conocer los factores que afectan y de que manera afectan una reacción catalizada por ..n enzima.

LOS factores más importantes son la. concentración de enzima, la concentración de substrato, presencia de activadores o inhibidores, fuerza iónica, pH y temperatura Isegel, 1993).

Lo. concentración de enzixz y de substrato controlan en. parte la velocidad a la que procede una reacción enzimática. Esta velocidad, se mide por la disminución de la concentración de r react antes . o por el aumento de^ . 1s concentración de productos con respecto al tiempo,

. .. ' ~ . .. . Se ha demostrado que la velocidad de una reacción'-i,.:

catalizada por una enzima, depende de l a concentración de' substrato, de tal manera que a concentraciones bajas de substrato, la velocidad de la reacción aumenta casi en fonna lineal con el aumento de dicha concentración, mientras que a concentraciones altas de substrato, la velocidad alcanza un valor^ limitante (máximo) conocido como Vmax. La reacción alcanza su Vmax cuando la cantidad de enzima está saturada ron el substrato. Esto se observa más clarñmente en la figura 1:

- Fig 1. Velocidad de reacción

Vs. Concentración de substrato

Otro término importante es la ecuación de .Michaelis- Menten, la cual describe la dependencia de la velocidad de reacción de l a concentración del substrato [ S I . En una reacción cataiizada por una enzima, esta se combina con el substrato para formar un complejo enzima-substrato, que a su 7:ez se degrada a enzima y substrato o a enzima y producto. En este modelo la velocidad inicial de una reacción se expresa en términos de Vmax, y tomando en cuenta l a s velocidades a las que ocurren estas reacciones parciales y definiéndolas como una constante (Km), se puede escribir la ecuación de Michaelis-Menten como sigue:

5

ra- m.

a!- -

v m 2 x [SI

I s ] + Km .............. "._.I ..... ( 1 ) vo =

si se resuleve la ecuación 1 para varias concentraciones de substrato, se tiene que Km es aquella' Concentración de substrato en donde la velocidad de la reacción catalizada por enzimas se desarrolla a la mitad de la velocidad máxima (figura 21.

Fig 2. Curva de Michaelis-Menten

Es dificil determinar con presici6n la Vmax de una enzima a partir de una gráfica de velocidad contra concentración de substrato y no puede determinarse km. Estas dificultades se superan al usar un método alterno como el de Lineweaver-Burk. Esta ecuación es l a recíproca de l a de Michaelis-Menten por lo que la curva se convierte en una ecuación recta ( y = mx + b):

1 Ian 1 1 ---- --___ _ _ _ _ + _---- VO V max [ S I V max

La gráfica de Lineweaver-Burk se representa de la siguiente manera (figura 3) :

1/vo I pendiente = kin/\haax

Fig 3 . Gráfica de Lineweaver-Burk

-.

6

En esta figura se observa ,que al graficar el inverso de la velocidad inicial contra el inverso de l a concentración de substrato, la pendiente será igual a la relación km/Vmax y la intercepción de ésta con el eje de las ordenadas, nos dará l/Vmax. También vemos que si l/Vo = O, entonces l/ [s ] = - l/km. De esta manera es posible obtener l o s valores de Km y Vmax .

"Efecto del pH y temperatura"

Como se mencionó anteriormente, dos de l o s factores que afectan una reacción enzimática son el pH y la temperatura-' Una enzima tiene una actividad máxima solamente a un determinado rango de pH y de temperatura. Por encima o por debajo de estas condiciones, la actividad de la enzima disminuye (Adler-Nissen, 1993) .

Efecto del pH:

Los sitios activos de las enzimas generalmente están compuestos de grupos ionizables los cuales deben mantenerse en la forma iónica apropiada para a su vez mantener la conformación del sitio activo, ligar al substrato o catalizar una reacción. Por otro lado, el substrato puede poseer grupos ionizables, y solamente una de esas formas iónicas será capaz de unirse a la enzima o proseguir la reacción de catálisis(Sege1, 1993). Así, el pH puede causar cambios en la ionización de l o s grupos enzimáticos o del substrato. Este efecto se manifiesta como cambios en la actividad enzimatica, estabilidad o interacción con otros grupos o como un cambio en el equilibrio de la reacción (Parkin, 1993).

-

Si realizamos una reacción enzimática a distinto pH (manteniendo constante la temperatura)! encontraremos que la actividad de la enzima tiene un máximo a cierto valor o rango de pH (pH Óptimo de actividad de la enzima). Eli valor de pH óptimo de actividad de una enzima es variable. Puede ir desde un valor de 2 (pepsina) hasta un valor de 10 (fosfatasa alcaiina) aunque la mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo de actividad cerca del valor neutro (Whitaker, 1972).

En algunos casos el efecto del pH sobre la actividad de la enzima puede ser explicado en términos de la estabilidad conformacional de la enzima y por ello es escencial realizar. estudios de estabilidad al pH en cualquier caracterización

i

. .

enzimática. Este efecto se muestra fácilmente preincubando una solución de enzima a distinto p H , y luego realizar un ensayo en el pH Óptimo de actividad (Parkin, 1993). en^ algunos casos 'una enzima es estable en valores de pH en l o s cuales no presenta actividad (Adler-Nissen, 1993).

La estabilidad al pH de una enzima depende de varios Rctores : temperatura, fuerza iónica, naturaleza química del bi?ffer, presencia o ausencia de conservadores, concentración de icnes matálicoc coctaminactes, concentración de substrato o de cofactores y concentración de enzima (Segel, 1993). En muchos casos el substrato puede inducir un cambio en la conformación de la enzima a otra forma más resistente o menos resistente al pH o a la desnaturalización por temperatura. La concentración de la enzima también resulta importante, ya que a bajas concentraciones, la enzima se puede disociar en monómeros u oligómeros de menor tamaño, los cuales pueden ser menos estables que el oligómero original (Segel, 1993).

Efecto de la temperatura:

.~

Por otro lado la temperatura también es un factor crítico en las reacciones enzimáticas. La mayoría de las reacciones químicas aumentan su velocidad al incrementarse la temperatura. Un incremento en la temperatura imparte más energía cinética a las moléculas que reaccionan produciendo mas colisiones por unidad de tiempo. Una molécula de enzima es una estructura frágil. Si la molécula absorbe demasiada energía, la estructura terciaria se rompe y además se generan un mayor número de colisiones entre la enzima y el substrato originando que la enzima se desnaturalice perdiendo actividad catal~ítica (Segel, 1993) .

De la misma manera que con el pH, en las reacciones enzimáticas hay una temperatura Óptima. En muchos casos, la temperatura óptima de una enzima disminuye conforme aumenta el tiempo de reacción. Esto puede ser expllcado por la inactivación progresiva de la enzima durante e1 periodo de incubación (Parkin, 1993). La verdadera temperatura óptima al realizar un ensayo es la maxima tertperatura en la cual la enzima muestra una actividad constante en un periodo de tiempo tan largo como el tiempo de ensayo. El efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas está relacionado con la composición del medio, la fuerza iónica, la actividad de agua y el pH (Parkin, 1993). El substrato generalmente protege a la enzima contra la desnaturalización por temperatura. Las enzimas de bajo peso molecular que posean cadenas polipeptídicas simples y además posean puentes

8

disulfuro, usualmente son más estables que aquellas con un peso molecular elevado y de composición oligomérica (Segel, 1993; Parkin, 1993).

"Determinación de peptidos solubles"

Una vez llevada a cabo una hidrólisis enzimática 'es conocer la cantidad de producto obtenido. La

canti. imporste 3 de proteína presente en una muestra se puede determinar de diferentes formas, entre los métodos más uti;:zados están los.colorin&iricos. La base de estos métodos es la reacción entre un reactivo (p.e. Folin-Ciocalteau) y' los aminoácidos que componen a la proteína (p.e. tirosina), produciendo una coloración clara u obscura -dependiendo de la concentración. proteica- que se mide espectrofotamétricain&te (John, 1993).

Estos métodos presentan algunas interferencias cuando las muestras son sometidas a tratamientos con muchas substancias. Algunos compuestos que pueden interferir son los detergentes, derivados aminos, ciertas soluciones amortiguadoras, lípidos, azúcares, ácidos nucleicos, sales, etc (John, 1993).

"Caracterización molecular"

El producto de una hidrólisis comprende moléculas proteicas de diferente peso molecular las cuales tienen implícitamente distintas características fisico-químicas: solubilidad, densidad, distribución de carga, hidratación, tamaño, forma y estabilidad relativa. Es por ello la necesidad de caracterizar o clasificar los productos obtenidos mediante un método de purificación (Garfin, 1990).

Dentro de l o s métodos existentes para la caracterización molecular, la electroforesis es uno de l o s más utilizados.

El principio básico de la electroforesis radica en que una molécula de proteína a cualquier pH distinto a su punto isoeléctrico tiene una carga promedio neta. Esto provoca su movimiento en un campo eléctrico el cual provoca la separación de las proteínas de aclierdo a su carga (Scopes, 1994).

De entre los tipos de electroforesis existentes, uno de l o s más utilizados es la electroforesis con sulfato-duodecil de sodio y gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés). Este es un excelente método con el cual se estiman

9

pesos moleculares de subunidades de proteína y determina la composición de proteinas purificadas. En general, esta separación se basa en el tamaño, forma y carga neta de las moléculas.

El SDS-PAGE, es un sistema discontinuo y consiste en dos geles diferentes: un gel de resolución (gel separador) y un gel "stacking". Ambos geles tienen porosidades, pH y fuerza iónica difereees. Las muestras se preparan en un bufer de ba)a conductividad 10.06 M Tris-C1. PH 6.8) y son inyectadas entre el bufer de- electrodo de alta conductividad (0.025 M, Tris, 0.192 M gilcina. pH 8.3) y el bufer del ge l "stacking" (0.125 M Tris-C1, pH 6.8). Cuando se aplica cierto voltaje, este hace que la muestra se mueva hacia el gel "stacking!', LOS iones de glicinato del bufer de electrodo siguen a 1 proteínas dentro del gel "stacking". Se forma entonces región en donde las proteínas se mueven entre un frente iones cloruro y un frente de iones glicinato que se disipan en sentido opuesto, es decir, se forma un gradiente de voltajes provocando que el complejo SDS-proteína migre entre las fases cloruro y glicinato. Las proteínas se condensan en una región dentro del gel "stacking" y entran al gel de resolución (gel separador). En la interfase del gel separador y el gel "stacking", puede haber una demora en la movilidad de las proteínas dependiendo del tamaño de poro del gel de resolución (las proteínas demasiado grandes y que no puedan entrar a l gel de resolución se detendrán en la interfase). Una vez en el gel de resolución, las proteínas se moverán lentamente hacia la matriz del gel. Dependiendo del peso molecular de las proteínas, es la distancia que recorrerán dentro del gel de resolución (Garfin, 1990).

"Substrato"

Existen muchas especies marinasde las cuales se podrían obtener cantidades importantes de desechos. Como se mencionó anteriormente, los desechos de pescado se obtienen. principalmente de las Industrias procesadoras y de Los mercados de distribución. El atún es la especie que más volumen de producción registra anualmente en nuestro país (129,415 ton) teniendo una participación del 8.468. El atún constituye además una de l a s especies que más desechos arroja debido a que es la especie que más se industrializa (p.e. enlatado) y es la que más se exporta ( S E m A P , 1996). Es por ello que l o s desechos del fileteo de atún pueden utilizarse para la extracción de proteína con la seguridad de que en algún futuro no causen más estragos en el medio ambiente.

10

"Enzima"

NEUTRASE": Es una endopeptidasa bacteriana producida ppr una cepa de B a c i l l u s amyloliquefaciens (B. subtilis). Es clasificada dentro de las metaloproteasas las cuales contienen un átomo metálico, usualmente 2.n y tienen un pH cercano al neutro. Neutrasa íEC 3.4.24) es estabilizada con

inhibida por agentes quelantes fuertes como EDTA (Adler-Nis Y en, 1993). Ca" y por io tanto

Neutrasa se utiliza principalmente en la industria de bebidas en donde se usa durante el lavado para incrementar la' cantidad de nitrógeno soluble. También se utiliza en la hidrólisis de carne y gelatina. En 1.a industria de la panificación se utiliza para-la modificación de galletas ..y pasta de bizcochos. Adicionalmente puede emplarse para mejorar la producción de proteína en el proceso de leche de soya (Eriksen, 1993). Se utiliza también cuando es necesario ablandar el gluten de trigo por ejemplo en la producción de galletas (Novo Nordisk, 1997).

Neutrasa es estable a temperaturas bajas (<50°C), tiene ,

una masa molecular de 31kDa y posee especificidad en el aminoácido Leucina y en la unión Phe-Nh2 principalmente.

11

* OBJETIVOS

3)-

4 - . a-.

GENERAL

Recuperación de proteína a partir de subproductos de la Industria Pesquera por medio de un proceso a-. . enzimático. . *

_- a-

ESPECÍFICOS .

.. - ~ - - e . ~Pp r medio ,de la enzima Neutrasa,. iiev hidrólisis de proteína de pescado.

r las fracciones peptii términbs del peso molecular.

.. .,

- ~~

METODOLOGÍA

Materiales:

- 1 desec5.s de pescado se o b t u v u ael fileteo de atún prod’icido en el r?.ercado de la Nueva Viga (principal centro de anasto pesquero de la Cuidad de Mexico). Los desechos

e incluían cabeza, cola, huesos y una cantidad pequeña de músculo. LES desechos fuergn tomoneneizidos. emuacados al

!

Reactivos:

Cinética enzimática: Acido acético, ácido bórko, ácido fosfórico, hemoglobina, urea, ácido tricloroacGticof tirosina, reactivo de Folin 6 Ciocalteau, hidróxido de sodio, ácido clorhídrico.

.,

Electroforésis: CDS, tricina, tris; glicerol, acrilamida, bisacrilamida, piranha, TEMED, persulfato de amonio, mercaptoetanol, azul de Coomassie, .

La enzima utilizada fue Neutraca 1 . 5 MG en presentación granular con una actividad enzimática reportada de 1 . 5 AU/kg (Novo Nordisk).

Métodos :

I .- ANÁLISIS BROMATOLÓGICO DE DESECHOS DE PESCADO

~~

El análisis bromatológico correspondiente a las muestras de DP, se realizaron de acuerdo a las metodologías oficiales. El análisis estaba conformado por determinación de proteína por el método Kjeldahl (AOAC, 1990), determinación de humedad total de acuerdo a la norma NMX-116-SSAI-1994, determinación

3 de cenizas de acuerdo a la norma NM(-F-66-S-1978, y determinación de grasa de acuerdo ~a la norma Am-F-89-S-1978.

w I

b- rl

.-

3- 2r a-

PF

s-. c

- 4..

-

13

11.- DETEP.MINAC~N DE ACTIVIDAD FRCXOLÍTICA DE NEUTWSA UTILI ZAN.90 COMO SUSSSRTTO ALTERNO

HFMCGLCEIKA=A ___

Nota: Todas las deierminaciones fueron realizadas por triplicado.

se definió una Unidad Cnzimática C O ~ la cantidad de *

e:.: X.Z. n e r i c r i a par; :::c:exer.tzr ';ns x-.i5zci 5s abscrbencia a 28i mL a través ae 1 c z . ae longitua de troyecmria. . Preparación de la soluzión de hemoglobina:

Se disolvió 16 g de'urea en 16 mL de agua destilada con agitación constante. Posteriormente se adicionó 1 g de hemoglobina y se agitó suavemente evitando la formación de espuma. La solución se incubó a 37'C durante 1 h para después ajustar el pH a un valor de 6 con buffer universal 0.05 M. Se aforó a 50 mL con el regulador ajustado al mismo pH (Sarath et a l , 1989).

Actividad proteolítica:

Una vez preparada la solución de hemoglobina, se tomaron alícuotas de 2.5 mL y se llevaron a 50°C. Posteriormente se adicionó 0.5 mL de una solución de enzima al 0.1% y se incubó a diferentes tiempos (O, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min.). La reacción fue detenida por la adición de 5 mL de una solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5 % . Se enfrió a temperatura ambiente (25'C) y se centrifugó (100 g - 10 min). Se leyó absorbencia a una longitud de onda (1) de 280 nm. Se construyó una gráfica abs Vs tiempo.

Determinación de pH óptimo de actividad de Neutrasa:

Se prepararon soluciones de hemoglobina' en buffer universal ajustado a diferente pH (4 , 5, 6, 7, 8 y 9) y se tomaron alicuotas de 2.5 mL. Se preincubó hasta 50'C y se adicionó 0.5 mL de una solución de enzima al 0.1%. La reacción se detuvo a l o s 15 minutos coil 5 mL de una solución de TCA al 55,. Se enfrió a temperatura ambiente (25°C) y se centrifugó (100 g - 10 min.) .Se leyó abs (h=280 LT) y se construyó una gráfica abs Vs pH (Sarath et a l , 1989).

I

Determinación de temperatura Óptima de actividad de Neutrasa:

Se prepar,5 una solución de hemoglobina a pH 6 y se ,arcn alicuotas d.- 2.5 m.L. Se inc.uk.$ z distintas

íenperatiiras ( 3 ¿ , 413, 50, €O y 7 G ° C ) y se adicicnó 0.5 mL de .jr.a soluciCn de enzina ai 0.14. La reacción se detuvo a los 15 minutQs con 5 rnL de una solución de TCA al 5? . Se enfrió a temperawra ambiente (25°C) y se centrifugó ( 1 0 0 g - 10 p.22.) .>e Ley6 abs íi.=i80 nm.) y se ccnctruyj una gráfica abs I

.. I 3 - _ .<rnpsr?Lzura .:ar---. c -:. -. . - I , 1 Y 3 9 1) . . Determinación de pS de estabilidad de Neutrasa:

Se prepararon soluciones de~enzima al 0-.1% en buffer universal a diferente pH (4, 5, 6, 7, 8 y 9 ) y además en a destilada (pH= 7 ) . Se almacenó durante 18 horas a 4OC. vez transcurrido el tiempo se determinó activi proteolítica residual (60°C) siguiendo la metodologf descrita para pH Óptimo de actividad.

Determinación de termoestabilidad de Neutrasa:

Se prepararon soluciones de enzima al 0.1% y se incubaron a distintas temperaturas ( 4 , 20, 30, 40, 50 y 6OoC) durante 1 8 horas. Una vez transcurrido el tiempo se determinó actividad proteolítica residual (pH 6, 60'C) siguiendo la metodología descrita para temperatura óptima de actividad.

Determinación de estabilidad de Neutrasa:

Se preparó una solución de hemoglobina y se mantuvo en condiciones -óptimas de pH y temperatura de estabilidad^ (6 y . 4OC respectivamente) durante 26 horas determinando actividad proteolítica cada 2 horas en co.ndiciones Óptimas de actividad ( 6 y 6OoC respectivamente). Se construyó una gráfica abs Vs tiempo.

Nota: Se prepararon tubos test.igo y blanco para cada serie por triplicado de tubos de la siguiente manera:

Testigo.-. mezclar 2.5 mL de solución de hemoglobina, 5 mL de TCA al 5% y 0.5 mL de solución de ~enzima--íh-~O.l% en este orden.

Blanco.- mezclar 2.5 mL de solución de hemoglobina, 0.5 mL de agua destilada y 5 mL de TCA al 5%

Tanto al blanco como al testigo se le dio el mismo tratamiento que a las muestras.

I5

111.- 2ETERMINACIÓIJ PE LA CIRÉTICA ENZIMÁTICA DE NZITRkSA rJT;LIZ>XJDO COMO SUBSTRAT0

DESECHOS DE ,>ESCADO

?,:;-=a: Tsaas lás determicaciorLes fueron realizadas por triplicado. *

Se Crfir.:, ~rna Criilad E.nzimáti-a como la cantidad de e::zina srxisfurma p;r P , ~ T ~ U E G ilrL nicromol de substrato en productc.

Elaboración de curva patrón de tirosina:

Se preparó una solución stock de tirosina con una concentración de 2 mg/mL en TCA 0.3M. A partir de esta, se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 . 0 , 1.2, 1 . 4 , 1 . 6 , 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8 y 3 . 0 mg tirosina/mL). De las soluciones preparadas se tomaron alícuotas de 25 pL y se les adicionó 0.225 mL de agua destilada, 1.25 mL de NaOH O.5N y 0.25 mL de Reactivo de Fzlin & Ciocalteus Fenol 1N. Se mezcló inmediatamente y se incubó a 30 °C (15 mini. Se leyó absorbancia (h=578 nm). Se elaboró un bianco adicicnando 25pL de agua destilada, 0.225 nL de agua destilada, i.25 mL de NaOH 0.5N y 0.25 mL de Reactivo de Folin & Ciocalteus Fenol 1N. Se le dio el mismo tratamiento que a las muestras. Se construyó una gráfica abs Vs mg tirosina/mL. Esta curva se utilizará en cada determinación.

Hidrólisis enzimática:

En un vaso de reacción se- mezcló buffer universal (0.05M, pH 6 ) y desecho de pescado (DP) en proporción 2:l. La mezcla se llevó a 50'C y posteriormente se adicionó una solución de enzima (10 Aü/kg) y se mantuvo con agitacióh constante. A tiempos de reacción de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 1 8 , 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 9 0 , 1 0 0 , 110 y 120 micutos se tomaron alícuotas de 25 pL y se les adicionó 0.225 mL de agua destilada, 1.25 mL de NaOH 0.5N y 3.25 mL de Reactivo de Folin C Ciocalteus Fenol 1N. Se mezcló irmediatamente y se incub6 a 3OoC (15 nin). S e leyó absorbancia (A=578 nm). Se elaboró un blanco adicionando 25pL cie agua destilada, 0.225 mL de agua destilada, 1.25 mL de :,izOH 0 . 5 N y 0.25 mL de Reactivo de Folin & Ciocalteus Fenol IN. Se le dio el mismo tratamiento que a las muestras. Las absorbencias leídas se extrapolaron en la curva estándar de

~.

16

cirosina y se construyb ur,a grdfica mg tirosina/mL VS tienpo (Baek C Cadwallader, 1995).

Efecto de la proporci67. bEfer:s,LCstrato:

Se realizaron hidrólisis e~~zimáticas Con DP variando la proporción buffer:subs:rato de I s siguiente manera: 1:1, 2:1, 3:l y 4 : l respectiva-Lite. Se utilizó una concentración de

e* .. ---.iron . - alicuotas c.: ?E u: '; se ,determinó proteici 3- l a j i 7 e - misma forma que en la 'ni3z &--:s enzimática descriia con

anterioridad. Las absorbencias ieidas se extrapolaron en la curva estándar de tirosina y se construyó una gráfica mg tirosina/mL -Vs proporción buffer:substrato . (Benjakul &, Morrissey, 1997).

enzima de 10 AU/kg. ' C . * .- :< vez terninada la reacción (20 min!,

. . . I

Efecto de la concentración de enzima:

El efecto de la concentración de enzima se determinó adicionando diferentes concentraciones de enzima (5 y 20 AU/kg). La proporción buffer:substrato fue de 3:l. Una vez terminada la reacción (20 min), se tomaron alícuotas de 25 pL y se determinó proteína de la misma forma que en la hidrólisis enzimática descrita con anterioridad. Las absorbencias leídas se extrapolaron en la curva estándar de tirosina y se construyó una gráfica mg tirosina/mL Vs tiempo (Benjakul & Morrissey, 1997).

Efecto de la concentración de substrato:

Se prepararon mezclas de distintas concentraciones (30, 60, 100, 130, 160, 200, 230, 260, 300 y 330 mg DP/mL) de desecho de pescado con buffer universal (0.05M, pH 6 ) , en proporción 3:l. Cada una de las mezclas se incubaron a 50°C durante 10 minutos y después se adicionó-una concentración de enzima de 5 AU/kg. Para cada concentración de substrato se tomaron alícuotas de 1 mL cada 5 minutos en un intervalo de tiempo de O a 20 minutos y se adicionaron a tubos que contenían 2 mL de una solución de TCA 0.3 M. Se enfrió a temperatura ambiente (25'C) y se centrifugó (100 g-10 minutos). Posteriormente se tona ior i alicuotas de 25 pL y se ~ .~

determinó proteína de la mism forma que en la hidrólisis enzimática descrita con anterioridad. Las absorbencias leidas se extrapolaron en la curva estándar de tirosina y se construyeron gráficas de mg tirosina/mL Vs tiempo para cada concentración de substrato. Con estas gráficas se obtuvieron las pendientes de las rectas trazadas. Estas pendientes

17

fueron las velocidades iniciales que se graficirori contra cada concentración de sabstrato {Xhitaker, 19721 .

. - Se deterrr.ir.6 matemáticane:.re l a Vmax y 1s kn de la er.zin:a mediante si ~,-2::i:. :ie Lizeweaver-Burk:

Determinación d e pH Óptiriic~ de uc-ividad de Neutrasa:

Se prepararon homogeneizadcs de iP con buffer universal (0.05 y ! en priForz:>n 2:: a ci-st ir i tc r!! ( 4, 5 , 6, 7 y 8 ) . Se calentó & ZO?C s' z - + , . . - . , . - ~, ~ . . ~

-lL~\..., c,....,entrac::r. oe enzima de 5 AUlkg. Para cada pH se tomaran alicuotas de 1 mL cada 5 minutos en un intervalo de tiempo de O a 20 niinutos y se adicionar0.n a tubos que contenían 2 mL de una solución de TCA 0.3 M. Se enfrió a temperatura ambiente (25'~C) y se centrifugó (100 g - 10 min.) . posteriormente se tomaron alícuotas de 25 pL y se determinó proteína de la misma forma que en la hidrólisis enzimática descrita con anterioridad. Las absorbencias leídas se extrapolaron en la curva estándar de tirosina y se construyeron gráficas de mg tirosinah& Vs tiempo para cada pH. Con estas gráficas se obtuvieron las pendientes de las rectas trazadas. Estas pendientes fueron ?as velocidades iniciales que se graficaron contra cada pH (Benjakul & Morrissey, 1997).

Determinación de temperatura óptima de activiaad de Neutrasa:

e- - . .

Se prepararon homogeneizados de DP con buffer universal (0.05 M, pH 6 ) en proporción 3:l. Se calentaron a distintas temperaturas ( 3 0 , 40, 50, 60 y 7 0 ° C ) . Posteriormente se adicionó una concentración de enzima de 5 AU/kg. Para cada temperatura se tomaron alícuotas de 1 mL cada 5 minutos en un intervalo de tiempo de 0 a 20 minutos y se adicionaron'a tubos que contenían 2 mL de una solución de TCA 0.3 M. Se enfrió a temperatura ambiente (25°C) y se centrifuge: (100 g- 10 min.) . Posteriormente se tomaron alicuotas de 25 pL y se determinó proteína de la misma forma que en la hidrólisis enzimática descrita con anterioridad. Las absorbencias leídas se extrapolaron en la curva estándar de tirosina y se construyeron gráficzis de mg tirosina/mL Vs tiempo para cada temperatura. Con estas grAficas s e obtuvieron las peridientes de las rectas trazadas. Estas pendientes fueron las velocidades iniciales que se graficaron contra cada temperatura (Benjakul & Morrissey, 1997) .

18

Determinación del grzk de hidrilisis (GH) :

El grado de Y i j r t l i s i s (GH) se determinó según el método descrito pcr Baek i :sjwsllader (l995), y se Calcula Como:

,it - G o ) * 100 GH = ---_-------

Gnax - G o ) .e donde :

Gt = péptiuas sclaiiles en TCA 0.3M, al tiempo t ( 1 0 , 20,' 30, 60, 90 y 120 min), expresados como tirosina (mg/mL! .

hidrólisis total ( 0 . 5 mL de hidrolizado en 4 . 5 mL de HC1 6 N A 100°C, durante 24 h)

Go = péptidos solubles e n TCA 0.3M ai tiempo cero. Gmax = péptidos solubles en TCA 0.3M después de una

Graficar %GH Vs. tiempo

Caracterización molecular: Electroforesis SDS-PAGE :

El método electroforético se llevó a cabo según l a metodologia descritz por Schagger & von Jagow (1987).

PREPARACION DE GEL'Ef: Se utilizaron las soluciones que se muestran en la Tabla 1 . La composición de las mezclas de acrilamida y de l o s geles se definió' con las letras "T" y "C". La T denota la concentración total en porcentaje de la mezcla de acrilamiaa y bisacrilamida. La C denota la Concentración del ligador relativo a la concentración total de T. Todas las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente (25°C) 'con excepción de la mezcla de acrilamida y bisacrilamida, la cual se almacenó a 4°C.

- La composición de l os geles espaciador, separador y

"stacking", se muestran en la Tabla 2. Primero se colocó el

para electroforesis Bio Rad, el gel se recubrió por el gel espaciador (10%T, 3 r C ) que nuevamente fue recubierto pero ahora con el gel "stacking" ( 4 K T , 3 t C ) .

I

! gel de poro más peque5c (gel separador, 16.5%T) en un aparato i

Los ge les separador y espaciador se polimerizaron juntos (15 min! al adicionar 1OOpL de una solución de persulfato de amonio al 103 y 10pL de TEMED/30 mL. El gel espaciador fue recubierto con agua. respués de la polimerización el agua fue reemplazada por el gel "stacking" que se polimerizó con l a adición de 1OOpL de una solución de persulfato de amonio al 1 0 % y 1OpL de TEMED/l2.5 mL.

19

TABLA 1 .~ ~

Soluciones stock para la electroforesis SDS-PAGE Bufer Tris Tricina PH SDS

(M) ( % ) - S.9' - (M)

Bufer tie '3 . Z ánotio

* Bufer de 0.1 0.1 8.25' 0.1 cátodo

gsl . Mezcla de Porcentaje de Porcentaje de acrilamida - acrilamida (p/v) bisacrilamida (p/v) bisacrilamida 49.5%T, 38C 48 1.5 49.5%T, 68C 46.6 3.0

%o se corrige el pH el cual es aprox. 8.25 aAjustado con HC1

PREPELRACION DE MUESTRAS: Las muestras de péptidos (obtenidos a través de una hitirólisis enzimática de DP a O, 10, 30, 60, 90 y 120 minutos de reacción a pH 6 y 5 O o C ) , fueron centrifugadas (1200 rpm-10 min). Se tomaron alícuotas de lOpL a las cuales se adicionó 10pL de buffer de muestra (10 mL) preparado con 4 m.L de agua desionizada, 2 mL de una solución de Tris-HC1 0.5 M a pH 6.8, 2.4 mL de glicerol, 1 I& de CDS al lo%, 0.2 mL de mercaptoetanol y 0.4 mL de azul de Coomassie al 0.5 O. Cada muestra fue inyectada dentro de l o s geles polimerizados, inyectando en los carriles laterales el marcador de pesos moleculares.

TABLA 2 Composición de l o s geles separador, espaciador y retención.

Gel de Gel Gel retención espaciador separador 4 % T , 3%C 10%T, 3%C 16.5%T, 6%C

- Solución 0.5 mL 1 mL 49.50T, 3C,C Solución - - 3.3 mL 49.5%T, 6'C Gel de bufer 1.55 mL 1.65 mL 3.3 mL Glicerol Aforar con 5mL 5 mL 10 M1 agua a:

I g - -

20

r 3a

c

CORRIDA DE GEL: Se conectaron l os electrodos adecuadamente Aespubs de haber colocado los t.cffer de ánocio y cátodo (la corrier,te debe fluir hacia i.1 k z 5 0 j . . . La electroforesis se I l i ~ 6 a cabo a temperarura &?̂ .:ente (25°C). El voltaje inicial de la corrida f.ae de 39 .J. Después de qlie la muestra entró completamente al gel "stacking" (30 min) , el voltaje se cambió a 8 5 V. . * FIL7-3 - TE,FII,"C Y DESTZJ13C: :ES bandas de pépti5;s se fijaror. i 3 0 min) er. una soluci6r. cGmpuesta por 502 metanol y * 1 0 % ácido acético. Posteriormente se tiñieron con azul de Coomassie en 10% de ácido acético (1 hl. El desteñido se realizó con una solución compuesta por 10% ácido acético y ; - '

4 0 5 metanol durante 24 h.

21

.-

1. Revisión bibliográfica ~e Las metcdologías empleadas en este estxdio se basaron

U a - ~ ~ ~ : i c i L'zs res;~:rad:s 2bter.icios se compararon con o t m s similares realizados en distintos- Centros de Investigación a nivel Internacional.

en k>k:+-:Tx-I;a - , a,-:..-:.,--

.~ . 2 . Caracterización de enzima Esta se llevó a cabo en un substrato alterno

(hemoglobina), de acuerdo a l a s especificaciones encontradas en bibliografía obteniendo resultados satisfactorios.

3. Análisis bromatológico de la materia prima Se realizó según métodos oficiales.

4 . Hidrólisis enzimática en pescado de desecho para la

La caracterización de la enzima, permitió que la hidrólisis se realizara bajo l o s procedimientos descritos en la bibliografía obteniendo nuevos resultados que servirán en la realización de estudios mas avanzados.

recuperación de proteína

5. Caracterización de las fracciones peptídicas La determinacibn del peso molecular de l o s péptidos

obtenidos se llevó a cabo sin complicaciones y de acuerdo a metodologías actuales.

6 . Elaboración de reporte final

22

RESULTADOS Y DISCUSIONES _ _ _ - I . - AI\:.L,ISI.S ??.Cl?.%TCLiCGiCO EE . ;:=-4OC DE ?ESCADO

De aii;irdo a; , análisis realizc2z, .las xuestras de desecho de atún tiezen la siguiente ¿cz.pisición:

3 6 5 ; Prateina ....................... ................... - L . 7

4 :: cenizzs ................. ................................... - . 71.79 + Humedad ...................................................................

Lípidos ................................................................... 2.89 ?.

Nitróger.9 tctal ......................... . - . _ 1 -I .

.

Esta es una aproximación de la composición &e presenta en promedio la especie de los "túnidos" (a la cual pertenece el atún).

Rivera l i 9 9 ' , l

La variación se debe principalmente a que se realizó un análisis bromatológico de desechos de pescado y no de la especie efitera. Aún asi, no existe gran diferencia entre los valores teóricos y prácticos. En general, todas las especies presentan una composición similar, la diferencia principal radica en el contenido de lípidos y de humedad. Rivera (1990) reporta además que los "túnidos" es una de l a s especies con mayor contesido proteínico lo que la hace especialmente atractiva para l a recuperación de proteína a través de una hidrólisis enzimática.

En este caso no se realizó determinación de carbohidratos ya que se considera que el contenido de estos en e l pescado es insignificante (Pigott, 1990).

RECUPERACION DE PROTEINA DE DESECHOS DE PESCADO __ CON NEUTRASA:

La enzima Neutrasa ha sido estudiada por varios autores (Shahidi et a l , 1994; Linder et a;, 1995; Linder et a l , 1996; Benjakul & Morrissey, 1997; Quaglia & Orban, 1987) en experimentos de hidrólisis de proteína <e pescsdo. E l l o s han evaluado ba2o distintas condiciones de proteólisis el grado de hidrólisis que se puede obtener con el uso de determinadas enzimas así como el efecto que tiene dicho grado de hidrólisis sobre los péptidos obtenidos. El presente trabajo

23

de la misma forma que l o s anterlsres, analiza el comportamiento de la enzima asi como los péptidos obtenidos a partir de la especie de pescado más ~ccnercializable en la Indcstria Pesql22ra (SEHA..NAP, 199fi .

Como etapa preliminar ai cumpiimiecro de l G S objetivos ds este es-udic, se realizaron algunas prueo'as a la enzima en un substrato aiterno para observar su Comportamiento durante una reacción de catálisis. Estas pruebas se realizaron utilizandc ur.z s3luciCr. de hemoglobina-urea ( l a función de la area zs hacer que la e n z i x a enrJertre 3.2s aispcnikles 19s sitios hidroliticos del substrato: (Beynon & Bond, 19941. .

. .

Se procedió a determinar experimentalmente los parámetros Óptimos de reacción (pH, temperatura y tiempo). Ls detrminación de péptidos solubles se llevó a cabo por l a medición del aumento gradual de la absorbencia (Á. = 280 nm).

Es importante mencionar que Neutrasa fue totalmente soluble en agua por lo que en su manejo no hubo limitaciones o complicaciones durante la realización de todos los experimentos tanto con hemoglobina como con DP.

11.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PROTEOLfTICA DE NEUTRASA UTILIZANDO COMO SUBSTRATO ALTERNO

HEMOGLOBINA

En la figura 1 se muestra la actividad proteolitica de la enzima a difererites tiempos de incubación sobre hemoglobina. Se observa que el mayor incremento en la actividad se presenta en l o s primeros cinco minutos, posteriormente hay un ligero incremento el cual parece estabilizarse a partir de los veinte minutos. La reacción se .llevó a cabo en las condiciones de temperatura ( 5 O o C ) y pH (6) reportados como óptimo por el proveedor (Novo Nordisk, 1997). Es muy posible .que después de los 30 minutos de reacción, no existan cambios relevantes en el comportamiento de hidrólisis, por lo que se consideró que 20 minutos de reacción eran suficientes para llevar a cabo las siguientes pruebas.

Parámetros Óptimos de reacción:

En la figura 2 se observa el efecto del pH en la actividad enzimática. Se puede observar que a un pH de 6 l a enzima se encuentra el en punto de mayor actividad. Este vaior concuerda con el reportado en la ficha técnica del

24

proveedor (Novo Nordisk, 1997). P. pH's inferiores a 5 y superiores a 8, la enzima baja su actividad considerablemente y a un valor de 9, la enzima Neutrisa presenta una actividad proteolítica casi nula. Esta disiinución en la actividad enzimática se debe a cambios estruc:::rales en el sitio activo de la enzima que se dan sobretodo en valores de pH ácidos y alkalinos lo que provoca su desnaturalizacijn (Stanffer, 1987).

0.35 , I

O 5 10 15 20 25 30

tiempo (minl

FIGURA i. Actividad pmieolitw de neuirasa (Substrato: hemoglobina, 5O'C.pH 6)

4 5 6 7 8 9

PH

FIGURA 2. Efecto del pH en [a actividad eníimática de Neutrasa (Substrato: hemoblogins. SOT)

-___~ .. .~

La temperatura óptima de reacción de l a enzima fue de 60°C (figura 3 ) . A 5 O o C la enzima presenta también una elevada actividad. Alrededor de los 70°C, l a enzima reduce su

25

.

actividad por la desnaturzlización tipica de las proteínas con temperaturas elevadas (Satnffer, 1987). La ficha técnica reporta que entre 4 5 y 5 5 O c la enzima presenta máxima

mayor actividad de la enzixa se observó a ios 55°C. Estas v,riaciones en la ter~Feratura óptima puede deberse principalmente a la diferencia de substratos utilizados (Adler-Nissen, 1986) .

act' :-:dad. 1 - 7 En el estudio 6s Benjaksl & Morrissey (1997), .la

..-

...... ~ ~~

0.25 - . .~ . .

Iemperablra W ) FIGUñA 3. Efecto de la temperatura en la aciividad cnrimíüa

de Neuirau.

~

. (Subttraio: hemoglobina. pH 0)

Estabilidad a pH y termoestabilidad:

Para el mantenimiento de Neutrasa en condiciones adecuadas que permitieran que trabajara de manera regular, fue necesario realizar también determinaciones de pH y temperatura de estabilidad, y con ello evitar que parámetros diferentes a los de la reacción de hidrólisis pudieran interferir de manera significativa en la proteólisis de DP.

.~

En las gráficas 4 y 5 se observa la actividad de Neutrasa después de haber sido almacenada por 18 hrs. a distintas condiciones de pH y temperatura. Se observa que la enzima conserva una actividad proteolítica elevada en un rango de pH de 6 a 9 a una temperatura de 60°C. Adler-Nissen (i593), ; t t ~ ~ c i ~ i - , ~ algunas proteasas son estzbles a pH's en los cuales no presentan actividad. Esto significa que la enzima puede almacenarse a pH's ligeramente alcalinos sin perder su actividad. Si l a enzima se almacena en agua (pH=7), entonces no sufriría cambio alguno en su actividad ya que se encuentra en zona neutra. A pH's menores a 5, la enzima es inhibida debido a la acidez del medio (Novo Nordisk, 1997). La acidez puede provocar una reacción de autólisis en la enzima (Adler-Nissen, 1993). Así mismo la enzima presentó una

26

mejor estabilidad a una temperatura ae 4 O C y pH 6 y se conserva a temperaturas cercan&s a los 40°C al mismo pH. A temperaturas mayores que esta, la enzima pierde considerablem.ente su sctivi?.ad. Con el :Lempo, entre ??As alta se2 la temperaturi, meror acr-ividad presenta la enzima. Resulta interesante ,mencionar qae estcs resultados solo son incicativos de le estabilidad que presenta la enzima ya que al estar en contacto con el substrato, su estabilidad se ve * incrementada (Adler-Nissen, 1993) .

4 20 30 40 5 0 . 60 temperatura pC)

FIGURA 6. Tennoestabilidad de Neubaa (Substrata: hemoglobina, pH 6)

4 5 6 7 8 O

PH

FIGURA 4. Estabilidad de Neutra= al pH (Subrtraio: hemoglobina, 6O.C)

I I

I

I I! I

La figura 6 muestra el tiempo en que Neutrasa es estable a l a s condiciones de reacción. Como es notable, la enzima puede mantenerse trabajando regularmente durante un periodo considerable (20 hrs). Después de ese tiempo, la actividad de

la enzima disminuye en 28.5'~ aproximadamente y por 10 tanto ya no resulta eficiente: Stanffer 11987) menciona que conforme transcurre el tienpo a cierta temperat,Jra, la enzima

iordiendo icíi~lc',ad catalitica lentscinte debido a s:: dencizuralizacibn. 01 datc' de 1a estabilidid C e una enzima es de Gran ayuda para la correcta e l e c c i ó n ~ de una enzima en Frocescs continuos a cualquier nivel en los cuales se requigzn de tiempos de reacción largos en l o s que la enzima presente buena estabilidad.

I N * w m o " o o f R M X W

tiempo (h)

FIGURñ 8. Esiabilidad de N e m e (Subhato: hemoglobina, C0.c. pH 6)

L L

111.- DETERMINACION DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA DE NEUTRASA UTILIZANDO COMO SUBSTRAT0

DESECHOS DE PESCADO

Efecto de la proporción buffer/substrato:

En l a figura 7 se muestra el efecto de la relación existente entre la cantidad de buffer y la cantidad de substrato sobre la cantidad de péptidos solubles (expresados como mg de tirosina / mL) obtenidos durante una hidrólisis de DP. En general se observa que al aumentar la cantidad de buffer en la mezcla de reacción, existe también una disminución en la cantidad de péptidos solubles ~ obtenidos manteniendo una concentración de substrsto ccnstznte. Esto se da debido a que entre mayor es el medio de difusión (buffer), menor es l a concentración de sólidos (péptidos) presentes en el rriedio. La relación 1:l [buffer:substrato) es la que proporciona la mayor cantidad de péptidos solubles. En las proporciones 2:1, 3:l y 4:1, la cantidad de péptidos recuperados disminuye conforme aumenta la cantidad de buffer

28

.

en la reacción. Sin embarco, una cantidad de buffer mayor a la del substrato, facilita el manejo de las muestras debido a 1 3 ?:omogeneización del nedii. y también mejora la' dispersión CE 13 enziF.3 en el medio-. Es pzr esto que se ccnsideró que la pr3porciCn 3:l es la m a s a'iecuada para trabajar durante las hidrólisis enzimáticas pcsteriores. Benjakll & Morrissey i 1997) tarbién evaluaror. esta rnisma relación cuando hidrolizarq proteína de desechos de pescado de las costas e e l Pacific:: con Nfctrasa, y concluyeron que existe un incrs í -ntc en' la c,:.:cictrrción d3 u-ar.iziácicios a mencr cantiilad de buffer aaicionadc en la mezcla de reacción. .

1 2

1

d %

f 0.6

E 0 4

o2

c

I O

proporción de buferlsubsirab

de Dp (50% pH 6) FIGURA?. Efecto de la propomidn bufer:wstrato en hidrólisir

111

Efecto de la concentración de enzima:

El efecto^ de la concentración de enzima en la recuperación de péptidos solubles se puede observar en la figura 8. Se utilizaron dos concentraciones de enzima (5 y 20 AU/kg) observandose que al incrementar la concentración de enzima de 5 a 20 Aü/kg, se obtiene un aumento en la cantidad de péptidos solubles recuperados, no obstante, a una concentración de 20 AU/kg y quizá mayores, la enzima llega al punto de saturación en el cual aunque se aumente la concentración de stjbst:L;'iC, 1.a velocidad de la reacción permanece cznstante. En contraste a u;ia concentración de 5 AU/kg, el aumento graclual en la concentración de péptidos solubles es más lento y se observa de forma más definida la etapa de velocidad inicial. Estos resultados son similares con los obtenidos por B e n j a k u l & Morrissey (1997) así como con l os de Quaglia & Orban (1987) quienes utilizaron Neutrasa para hidrolizar proteína de pescado. Ellos observaron que al incrementar la concentración de enzima, se incrementa también

29

la velocidad de la r'eacció!: hasta llegar 3 'xi velocidad constante, utilizando concentraciones de enzina de 5 y 10 AU/kg. En la figura 8, se observa además que después de S5 niirictos de rescción, SE bl:anzó cnc fase coris:~:.:~ en la cual la veloci.da5 de la reacciir.' no cl'z.i:.:: en ambas concentraciones de erLzima. De l o anterior se aeduce que en base al comportamier.to de 1% enzima, la cgncentración adecuada para realizar los experimentos de cinética enzimática es de 5 Ab-:g.

0 6

0 5

i O '

e 0 2

& 0 3

O. I

O

tiempo (min)

FIGURA 8. Efecto de la mncentracián de enzima en Ir hidrálisir de W (53.~2, pH 6)

___

II FIGURA 9. Adividad pmteolitica de Neubah, en la hidr6liss de DP (50'C. pH 6)

La figura 9 muestra la hidrólisis enzimática de DP con Neutrasa, en condiciones de reacción de FH € y 5 O o C de temperatura. En la curva se observa que al inicio de la reacción, la velocidad de la misma aumenta casi de forma

30

exponencia1 y poscerirzmen:& la velocidad disminuye. Hacia los 20-25 ?iinurcc, :a rezzzi.52 se encuentra en velocidad inicial. 2 s har. er-,::ztrsz: rcxportamientos similares en

r e 5 : i z a k s c:r ~e:.:e.k-:: & Horr issey (1997), Eaek & Cadwallader ( 1 9 9 5 ; y por ;-;aglia & Orban (1987). Estos últimos que trabijarcr. i . 2 ~ sarcina, adeniás reportan que a partir de los 1 0 0 minutos, .-a no hay un incremento en la hidrólisis proteica ccn Ne'i_-ssa y es un comportamiento que cambier; 51 'i=rde ibser7ar e?. 1;_ rlgura 9.

- . . -

A: - _ .

Determinación de pH óptirno de Neutrasa:

El pH Óptimo de actividad para Neutrasa fue encontrado en el- rango comprendido entre 5.5 ~y -6.5 (figura 11) . De l a figura 10 obtenemos los valores de velocidad inicial para cada pH. De la misma manera que con el substrato hemoglobina, el pH cercano al neutro (pH 6) es donde mejor se desempeña la enzima, no teniendo actividad en pH's ácidos (2 a 5) o por el contrario muy alcalinos (8-10). De hecho, muchas enzimas no muestran actividad importante en estos rangos, sobre todo en pH's ácidos (Adler-Nissen, 1993). En los estudios de Benjakul & Morrissf? (19d7), en l o s cuales utilizaron desechos sblidos de FesCado del Pacífico como substrato y Neutrasa como enzima, el pl? donde mejor actuó esta fue entre valores de 6 . 5 y 8 . 5 tenierdo un máximo en I . En realidad esto depende mucho del substrato con el que se trabaja y sobre todo del control que se tenga durante la reacción (Adler-Nissen, 19861. Los datos reportados por el proveedor de la enzima, ir:dican que h'eutrasa tiene sus Óptimos entre 5 . 5 y 5.7, lo que confirma cpe la naturaleza del substrato es en cierto modo un factor determinante para encontrar un óptimo de pH. Sin embargo, en este estudio el pH Óptimo para la actividad de l a ezzima ya sea en hemoglobina o en DP fue en el rango de 5.5 y 6 . 5 (figura 2 y 11). Por encina o debajo de esos valores, hay forcación de formas iónicas impropias del substrato o de la enzina reflejándose en una disminución de l a actividad enzizática {Segel, 1993). Al alejarse del valor de pH óptizo de la enzima, l a actividad de la enzima disminuye (figura 11) debiao a tres posibles razones: a) hay un cambio en l a ccnzlgursciún estructural de l a proteína, bihay una alteración en l a ionización de los aminoácidos que conforman el sitio aczivo irnpidiendo que el complejo enzima- substrat:] se transforiie a producto y, c) hay cambios en la ionización de l a er.zima o en el substrato o en ambos (Stanffer, 1987).

.

31

O 5 10 15

bempo (min)

FWRA 10. Ekcío del pH en la velocidad inicial de la Mdróliisde üP (sow

0.12

o. 1

0.08

3 0.06

0.04

0.02

O

4 5 6 7 a PH

FIGUñA 11 Efecto del pH en la adividad enzim&ic'd de Neubasa en la hidróiiws de W (5ü.C)

Determinación de temperatura óptima de Neutrasa:

En la figura 13 observamos las ñctividades que presentó la enzima Neutrasa a distintas tenperaturas de reacción. En esta figura se qraficaron los datos cbtenidos de la gráfica 12 que proporciona las pendFentes :5s l i s rectzs (velocidades iniciales) . La temperatura donde Xeutrasa presenta una mayor producción de péptidoe so1i:bles es a 50°C disminuyendo su actividad considerablemente a tep.peraturas por debajo de l o s 30°C y por encima de l o s 60°C. fri altas temperaturas l a enzima, no presenta gran actividad debido a que su inactivación térmica se ve más pronunciada (Adler-Nissen, 1993), además de que la exposición a temperaturas elevadas

afecc: l a conformación e::ruc:ur;: ,;rLica que presentan l a s eximas ISstnffer, 1 9 6 7 i . La fichi: técnica de Neutrasa (Novo Nordisk, 1 9 9 7 ) , reports mayor actividad de 45 a 55OC. Así r,L.x.c Zenjakul & X3rrissey (199:; rep>rzan que la actividad

-a er.zima fue m a y n r a ~ r . a : 2 r , ~ e r a z . , ~ s le 55"': seguida .de u:.a c i i d a en l a actividad a Eemperzzuras ira:mres z esta. Esto ccincide el dato enccntrado cuan53 se t r a b a j ó cor. hemoglobina como substrato, no habiendo difereccias en ei perfil cinético

1 .

de ambas curvas (figuras 3 y 13). * ~~ ~ - .~ I ¡ . ! I I

'

'

o 5 O 4 5 04

_- __ +JOT

0.35 +-4O'C

@ 0.3 4 5 0 - c I - I

O 1 O 0 5

O i I 1

temperatura 1 'C )

O 5 10 15 20

tiempo @An)

FIGURA 12. Eiecio de la iemprahira en Io velocidad inicial de II hidróliss de DP (PH 6)

I! FIGURA 13. Efecto de la temperatura sobre la actividad enrimática de

Neutiara en la hidrblirisde DP (PH 6)

33

Efecto de la concentración de subsrrato:

La figura 15, muestra la curva clásica de Michaelis- Menten obtenida al variar las concentraciones de substrato a 1ma concentración de emima constante. E~sta gráfica se obtuvo a partir de la figura 14 en la cuñi se observa el aumento graduai de la velocidad inicial de reacción a distintas concentraciones de substrato. La curva de Michaelis-Menten (figura 15 ) , muestra que a una concentración de mstrato baja, la velocidad inicial de la reacción es casi p r .: -2 3 r c i irla 1 z c !-. s i de r ando s e coma una reacci5n d2 primer orden. A medida que la- Concentración de substrato auiienta hacia 200 mg/mL min, la velocidad de reacción disminuye y deja de ser proporcional a la concentración de substrato. Con un aumento posterior de -~ péptidos solubles, la velocidad de la reacción llega a ser^ independiente de la concentración de substrato y se aproxima a una velocidad constante que es la Vmax.

. . 2 i a I c 7.c s r-;t r a c i3r i de L' ~ 5 , s trato

0 4

O 35

0 3

3 025

g o 1 5

-. 02 - O 1

O 0 5 C

O 5 10 15 io tiempo min)

-%--I60 m$mL t 2 W m$mL

-260 m$mL

. II FIGIJRA 14. Eiecto da I. concenhcl6n de ubstnto en la vel= inicial da la hidrólisis de DP l50.C. pH E) i 'I

La Vmax para la hidrólisis de proteína es de 3.0131 mg/mL min. En este valor la reacción es ya de orden cero y la velocidad no varía aunque aumente la concentración de substrato. El valor de Vmax, fue calculado por la ecuación de Lineweaver-Burk, que transforma la ecuación de Michaelis- Menten tomando l o s recíprocos de Vo y concentrbción de substrato (figura 16). Existen otros métodos para determinar matemáticamente los parámetros cinéticos (Km y Vmax), sin embargo, el método de Lineweaver-Burk es de los más utilizados (Whitaker, 1972). Con este modelo, también se puede determinar fácilmente el valor de km del sistema. En

34

.>,

este caso fue de i l r i . 8 3 3 5 mg/mL. La km representa una constante que relaciGna la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente con la concentración de substrato. Entre más ba ja sea e l valor de km, más afinidad tiene la enzima por el substratn.. Ur?a vez obtenidos km y Vmax es posible obtener Una constante K cuyo significado fisico es l a fracción Se substiato presente que es convertida a producto por unidad de tiempo. De esta manera, K = Vmax/km, por lo que K = 1.182 X iO'4~ min". Este valor significa que el S.015 del substrats presente a cialquier tiempo es convertido a prsductc e-. 1 ; ~ IT~I::UCLC. Xsi r.isr.82 si convertimos K = i.182 X lo-' min-'/60 s min", obtenemos 1.97 X que significa que' 1.97 X 10-c' de la concentración de substrato es utilizada por

*

segundo.

O.M2 -. = 0.m -. E J 0 . m I.

E E a 0 . m --

g 0 . m - - - om .-

@JT

4.02 :-

0.01 0.02 0.03 OM

1,lrl FIGURA 16. L i n e w e i w r ~

Determinación del gr3ao de kidrólisis iGH):

La curva que describe como va incrementándose la hidrólisis groteica de C)? ccn Neurrasa se muestra en la figura 17. La producción de péptidos solubles va aumentando a través del tiempo. .Con una concentración de enzima de 5 AU/kg y dos horas de tiempo de reacción, se obtiene un grado de hidrólisis de poco más del 204. A los 30 minutos de reacción, el GH es de aproxina3amente 16.3: , valor superior al reporrad.: s?r E,e~.;a.k~:L 5. M?~T~sL?.: !L???:; cara un pH de 7 y 55°C como condiciones de reaccion y desechos sólidos de. pescado del Pacifico como substrato. Así mismo Shahidi (1994) reporta que se obtiene 15% de GH al término de tres horas de reacción.

O

O 10 20 Jo €0 80 120

tiempo (min) I

j FIGURA 17 Grado de hidrólisis de Naubrsa a t r d s del tiempo (Subaámto: op. 5üa.C. pH6)

CARACTERIZACION MOLECULAR: Electroforesis SDS-PAGE

Para la caracterización de los péptidos obtenidos a través de la hidrólisis proteica de DP, se llevó a cabo el método SDS-PAGE. El peso molecular de las fracciones peptídicas es determinado por la comparación de sus movilidades a través de un campo eléctrico con las de otras proteínas (estándares) de peso molecular conocido.

En la figura 18 se pueden observar las muestras de las fracciones peptídicas de DP tratadas con la enzima Neutrasa en un sistema SDS-PAGE. La muestra tc es el control (DP sin tratamiento enzimático). En ésta se observan bandas de proteína que van desde l o s 4000 Da hasta mayores de 26000 Da.

36

26625 Ua

16950 Da 7

'IC--

3496 Da -

Fig. 18 Caracterización molecular por SDS-PAGE de l a hidrólisis de DP con Neutrasa. Los números representan el tiempo de reacción (min). "E" es el estándar de peso molecular.

Estas bandas corresponden a proteínas nativas o a productos de l a degradación de miosina debidas a autólisis durante el manejo o almacenamiento de los desechos (Benjakul h Morrissey, 1997). Se observa que predominan bandas de proteína de 17000 Da y mayores de 26000 Da. La figura muestra además que la intensidad de las bandas de proteína (tto, t33, t60 y tiza) va disninuyendo al incrementarse e l tiempo de reacción. A los 120 minutos de hidrólisis (t123) aún se observan bandas proteicas de aproximadamente 17000 Da. En los estudios realizados por Benjakul & Morrissey (19971, en l o s cuales utilizaron SDS-PAGE para caracterizar péptidos. de desechos de pescados de la zona del Pacifico tratada con NeUtraSd, observaron también gran intensidad de bandas proteicas en l o s 17000 Da y menores, y de igual forma al transcurrir el tiempo de hidrólisis ( 6 0 min), la intensidad de las bandas disminuia.

Este método electroforético se empleó debido a la resolución qze se 0h:ier.e en el rango de peso molecular entre 5000 y 20000 Da. Schagqer (1907) recomienda que para una mayor resolución en ba:idas menores a 5000 Da, se adicione urea en lugar de glicerol al preparar el gel espaciador.

37

CONCLUSIONES

Primeramente es Lmportanre mencionar que l o s estudios realizados a la enziz.5 arites de realizar la kidrólisis enzimgtica faeron un f z c t c r determinante para llevar a cabo los experimentos posteriores ya que :a enzima al ser un material biológico, puede perder su actividad al no mantenerse en las condiciones adecuadas de trabajo y esto provoczria Fcr consec:iencia i~.pre~ición en los resultados.

La enzima Neutrasa trabaja óptimamente en condiciones de - pH cercanas a i neutro (6-71 y a temperaturas relativamente altas~ ( 5 0 - 6 0 ° C ) . Si nos encontramos a nivel Industria,l, podemos darnos cuenta que el pH óptimo de la enzima al ser ~' cercano al neutro puede no ser un factor limitante en l a hidrólisis ya que no será necesario ácidos o bases fuertes para llegar al Óptimo de trabajo. Claro que esto depende en gran parte del pH natural del substrato con el que se trabaje. Esto tendrá ventajas económicas y lo más importante es que al no adicionar compuestos como ácidos o álcalis, se tendrá la seguridad de poder utilizar los productos en la alimentaci.ón humana. La temperatura en cambio, se verá reflejada -desde el punto de vista económico-, en costos de mayor consideración por un lado, y por otro por el gasto en la compra de enzima con una mayor frecuencia (por la desnaturalización térmica de la enzima y por la no recuperación de la misma).

Refiriéndose a la caracterización de los péptidos obtenidos a través de la hidrólisis enzimatica, l o s resultados muestran que las fracciones peptídicas tienen pesos moleculares inferiores a l o s 17000 Da a un grado de hidrólisis de 20 P, aproximadamente, por lo que l o s estudios que prosigan al presente deben ser enfocados a proteínas de dicho tamaño.

Es claro que se requieren estudios de caracterización de los péptidos que se obtengan para poder sugerir usos y aplicaciones de los mismos, y a partir de estos estudios se podrán detectar ñqcel los que provean de l a s mejores cualidades funcionales y ~nutricionales y en base a esto determinar el grado de hidrólisis Óptimo para el fin requerido.

Además de los estudios de los péptidos, sería muy interesante realizar la recuperación de proteína de diversas especies pesqueras y observar las similitudes existentes con el atún. De la misma manera, la enzima puede ser sustituida

38

3D r' * BL

L

c

por otra que trabaje en menor tiempo o que posea una 3 r. actividad proteolítica más elevada. Actualmente se realizan

? * ai

ensayos con otras enzimas de origen bacteriano como, Alcalase@ ;i FiavourzpeE.

Mucho depende de l a finalidad de los- péptidos que se cbtengan para la elección correcta de la enzima a utilizar. Sin embargo el presente estudio como preámbulo para determinar condiciones de proceso en caso de utilizar la enzima Neutrasa. .

c

RECOMENDACIONES

Es importante realizar estudios de composición de la especie . =esquera a >utilizar, ya que algunos componer::oz ( l i p i d a s , pigmentos, tejido ccnectivo, etc.) pie--len afectar la eficiencia de la reacción o dar prodicros con características indeseables. * EL homecezeizado del substrato (dese,zhos de pescado) es UE facror fundamental para llevar a cabo adecuadarente la hidrólisis proteica, ya que una deficiente homogeneización traerá como consecuencia una menor disponibilidad del substrato lo cual interfiere en la eficiencia del proceso.

Durante l os estudios realizados, se observó que el pH y la tenperatura son dos factores que influyen determinantemente en l a actividad enzimática por lo que es necesario tener un estricto control sobre ellos. El pH durante la reacción de hidrólisis tiende a disminuir por lo que se vuelve indispensable medirlo constantenente sobretodo cuando el rango de pH Óptimo de la enzima es pequeño. En contraste, la temperatura del procesg no tiene una variación considerable como el pH. Sin errharcjo es fundamental controlarlo de la mejor manera posible. Lo más recomendable es utilizar un vaso de reacción con chaqueta integrada.

Los proveedores de enzimas comerciales no garantizan que su producto pueda emplearse sin un ensayo previo. Por esto siempre se recomienda realizar estos, en substratos no complejos (hemoglobina, caseína, etc.) para asegurar que se conserve la actividad reportada.

Otra consideración a tomar en cuenta .durante la hidrólisis es el crecimiento de microorganismos por lo que seria recomendable hacer estudios en ese sentido ya que la temperatura y el pH pueden no ser suficientes p i a -vi tar la proliftracjon microbiana. Haciénaose necesaria la adición de algún conservador.

A nivel Industrial, a diferencia de nivel laboratorio, la cantidad de enzima a utilizar durante el proceso se vuelve ue relevante importancia, ya que la falta de un método para la recuperación de la enzima trae consigo un considerable aumento en l o s costos. Esto hace

necesario la búsqueda de tecnologías adecuadas para la reutilización de la enzima (por ejemplo inmovilización enzimática) y con ello aprovechar su ac,tividad al máximo.

Este estudió se limitó a la caracterización por peso molecular de los péptidos obtenidos, pero para una aplieción de éstos, es necesario realizar otro tipo de 6i.ilisis como la separación de las fracciones Feptidicas, cc'ajosici6n de aminoácidos, etc. De esta maner-& su aplicación no se verá limitada a la aquacultura, sino hacia alimentos de consumo humano.

41

APENDICES

APÉNDICZ A

Cálculo de unidcdes enzimáticas

Se trabajó con @.idades Anson ( U) Se determinan de la ,:quiente manera:

Ad1 r-Nissen, 1993).

Pari determinar la cantidad de enzima para tener una . concentración de 5AU/kg se realizó el siguiente Calcilla:

5AU ----- 1000 g substrato x, ------- Y g substrato Xi = 0.005 AU

1.5 AU ----- 1 g enzima xz = 0.00333333 g enzima 0.005 AU ----- Xz

Donde ... . 5 AU : concentración requerida de enzima Y g cubstrato : cantidad a utilizar de subctrato 1.5 AU : actividad reportada por el- proveedor (Novo Nordisk)

X2 : cantidad de enzima a utilizar

APÉNDICE B

Curva estándar de tirocina.

42

I 20 10 15 O 5 10 20 O 5 15

[s] = 100 mglmL [SI = I30 mglmL

y = O W7x + O 1017 R‘ = O 9237

O 0 6 O04 R ’ = 0 9 I 2 3 o o2

O

y = o w55x f o C ? ? i

20 15 15 20 O 5 10 10 O 5

[SI = 160mglmL

o 21

0:

o 19

O 17 O 16

0 i a

20 15 0 5 10

I

’* !

[SI = 200 mglmL

022 y-OOOü8x~O2163 o 21 R’= O 9 7 1 0 2 ,

I 20 15 O 5 10

fs] = 260 rnglmL

20 15 O 5 10

[SI = 230 mglmL

0 3

O 28

O26

0.24

0.22

.

I = 0 . m + 0 . m

O 5 10 15

[SI = 300 mglrnL

m 15 O 5 10

[SI = 330 m g h L

o 35

o 34

o 32

0 3

o ‘8 O 5 10 15 20

43

Las siguientes gráficzs representan las velocidades iniciales 'Jariando el pH. Ccn ellas fue posible calcular l a s pendientes y trazar la curv3 tie pE óptimo.

PH 4 i 0 2

O 15

o 1 y = 00222 00705

I O

20 15 5 10

PH 6 I

. o 2 y=01wzx.0:130 R'=O3416 I

o 1

5 10 15 20

I

~

PH 5 I * 03

3 25

02 o 15

1

o 1 y=0.035ix*0.1iu

O05 O

O 5 I O 15 a

PH 7

0 3 O 25

0.2 o 15

o 1

o o5

O

y = 0.0345x + 0.103

iu 15 O 5 10 I

) G 0244r * O 0765 R' = c 8jaa o o5

O 5 15 20 10 j

30 "C

y = O 0209" * O 02% O 0 4 o 02

O -- -, 1s O 5 10 1

50 'C

V - O O ~ X - 3 io82 02

o 1 R* = 3 3353 O

i o 5 10 1s :I

o 1

O05 O

y = o o m 0034s

M 10 15 O 5

60 "C

y = o 059% o o48 o 15 o 1 O 0 5

O

R'=O9928

O 5 10 15 M

70 'C

~

O 15 ~

I o 2

o 1

O 05

O

V E O 0241x * O 04%

20 15 O 5 10

!

BIBL IOGW-

A09.C. ;1990) 0-FICIAL METHODS OF PJ>L>-SIS. 15" edic. >-sssciation of C,ffirial halytical che~is~s. Kss<ington, DC.

H E-dler-Nissen J. (1986) ENZIMYC HYDROLYsIZ 2F FC,:: PROTEINS. Elsevier Applied Science Publishers Y:: . ?.3la?.5 Adler-Nissen J. (1993) "Proteases" in ZNZYICS IN FOOD

Biek, H. Cadwallader, K.R. (1995) EN2YG:IC r.:u$.OLISIS OF L~A%:tIS! i FROCESSI::G EY PRODUCT:. J G G T T ~ ~ ; ;f ?::a Scienc~e. vol. 6C Beynon, R.J. Bond, J.S. (1989) PROTEOLZTIC ENZYMES: A PRACTICAL APPROACH. IRL Press, UK Benjakul, S. Morrisey, M.T. ~ (1997) PROTEIN HYDROLYSATES FROM PACIFIC WHITING SOLID WASTES. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 45 (9) 3423-3430

=Bourgeois, C.M. & Le Roux, P. (1986) PROTEINAS ANIMALES. El Manual Moderno, México Colby, D.S. (1987) COMPENDIO DE BIOQUIMICA. El Manual Moderno, México. Cheftel, C., Ahern, M. & Wang, D.I. (1971) ENZIMATIC SOLUBILIZATION OF FISH PROTEIN CONCENTRATE: BATCH, STUDIES APLICABLE TO CONTINUOUS ENZYME RECYCLING' PROCESSES. Journal of Agriculture of Food Chemistry. Vol. 19 (1) 155-161

m Civit, E.M. (1982) RECOVERY OF PROTEIN AND OIL FROM FISHERY BLOODWATER WASTE. Water Research. Vol. 16 809-814 Erickson, (1993) in ENZYMES IN FOOD PROCESSING 3' edic., Academic Press Garfin, D.E. (1990) "Electroforesis" in METHODS IN ENZYMOLOGY: Guide to protein purification. Vol. 182, Academic Press, 425 Hevia, P. (1976) SOLUBILIZATION OF A FISH PROTEIN CONCENTRATE WHIT PROTEOLYTIC ENZYMES. Journal of Agriculture and Food Chemistry. Vol. 24 (2 ) 383-385 Hoyle, N.T., Merrit, J.H. (1994) QUPLIT? OF FISH PROTEIN HYDROLYSATES FROM HERRING ( C1 upea harexgus) . Journal of Food Science. Vol. 59 (1) 76-79 John, R.A. (1993) "Photometric assays" in ENZYME ASSAYS: A PRPCTICAL APPROPCH. IRL Press, LrK

R Lahl, W.J., Braun, S.D. (1994) ENZYMkiIC ?ROEUCTION OF PROTEIN HYDROLYSATES FOR FOOD USE. Food iechnolugy. Octubre

Linder, M., Fanni, J., Parmenter, M. (1995) PROTEIN RECOVERY FROM VEAL BONES BY ENZYMATIC HCDROLYSIS. Journal of Food Science. Vol. 60 (5) 949-952

PROCESSING. 3' edic., Academic Press, 159-203 * ,...r'-

- rr .-- .

68-71

46

m Linder, M., Fanni, J., Parmenter, M. (1996) FUNCTIONAL PROPERTIES OF VEAL BONE HYDROLYSATES. Journal of Food Science. Vol. 61 (4) 712-716

m Hohinied, I.M. (1994) PHYSICOCHEMICAL, AND ~ .FUNCTIONAL 'IR33ERTIES OF PRCTEIN HYEROLYSATES IN NU'i3ITIONAL PRODUCTS. Food Technology. Octubre 39-94

ENZYMATIC MODIFICATION OF FISH FRAME PROTEIN ISOLATE. ,

Journal of Food Science. Vol. 49 1305-1309

OF F9OC PRCTEIN FO3 AiiINO AZIE ANALYSIS I. SOLUBILIZATION- OF THE PROTEIN. Journal of Agriculture and Food Chemistry. Vol. 24 (2) 386-389

.Ii NEUTRASE (ficha técnica 19971, Novo nord disk, Enzyme Process Division Parkin, K.L. (1993) "Enviromental effects on enzymatic activity" in ENZYMES IN FOOD PROCESSING. 3' edic., Academic Press, 39-69 Parkin, K.L. (1993) "General characteristics of enzymes" in ENZYMES IN FOOD PROCESSING. 3" edic., Academic Press, üK

Ii Pigott, G.M. Tucker, B.W. (1990) SEA FOOD. Marcel Dekker Inc. USA

H Quaglia, G.B., Orban, E. (1987) ENZYMIC SOLUBILISATION OF PROTEINS OF SARDINE (Sardina pilchardus) BY COMMERCIAL PROTEASES. Journal of the Science and Food Agriculture.

H Rivera, M. (1990) HIDROLIZADO DE PROTEINA DE PESCADO DE DESECHO. Inst. Inv. Biomédicac. UNAM, México D.F. Rodríguez-Estrada, M.T. e t al. (1994) SOLIDS EXTRACTION OF CODE FRAME AND EFFECTS ON ULTRAFILTRATION OF THE AQUEOUS EXTRACT. Journal of Food Science. Vol. 59. (4) 799-803 Sarath, G., De La Monte, R., Wagner, T.W. (1989) "Protease assay methods" in PROTEOLITIC ENZYMES: A PRACTICAL APPROACH. IRL Press, UK Scopes, R.K. (1994) PROTEIN PURIFICATI0N:Principles and practice. 3" edición, Springer-Verlag. New York.

m Segel, I. (1993) ENZYME KINETICS. John Wiley & sons Inc. USA

m Sekul, A.A. (1978) SOME FUNCTIONAL PROPERTIES OF PEANUT PROTZIKS PAiiTIALLY NYDROLYZ,ED WITH PAPAIN .' journal of Agriculture and Food Chemistry. Vol. 26 855-858 SEMARNAP (1996) Anuario Estadístico de Pesca

CKARACTERISTICS OF PROTEIN HYDROLYSATES FROM CAPELSN

m Montecalvo, J., Constantinides, S.M., Ynag, C. (1984)

m ):ai:, 3.M., C S ; ~ , ?.., .?SF, N. ( l i i ? 5 ' ZNZYMATIC HYDFiL-!SIS

Vol. 38 263-269

Shahidi, F., Han, X., Synomiecki, J. (1995) PRODUCTION AND

(Mallotus villosus). Food Chemistry. Vol. 53 285-293

41

Stanffer, C.E. (1987) "Some general aspects of enzyme chemistry" in ENZYMES AND THEIR ROLE IN CEREAL TECHNOLOGY. AACC. Inc . USA

m Vie'ira, G., Martin, A.M., Goncálvez, C. F. (1995) STUDIES ON TEE ENZ'MTIC HYDROLYSIS OF BRAZYLIAN LOBSTR (Panuliruc spp.j PROCESSING WASTES . Journal of the Science and Food Agriculture Vol. 69 6 i - ó 5 Whitaker, J.R. (1972) PRINCIPLES OF ENZIMOLOGY FOR THE FOOD SCIENCES. Marcel-Decker Inc. New York, USA.

.

NOMBRE : IMTRICDLA: 93328588 LICENCIATURA : Ingeniería de los Alimentos PITULO DEL PROYECTO: OBTENCION Y CAWLCTERIZACION DE PEPTIDOC

A PARTIR DE PROTEINA DE CUBPRODUCMC DE PESCADO WILIZANDO LA ENZIMA NEUTRASA

PECHA DE REGISTRO: 2 octubre 1997 PECHA DE ENTREGA: 3 noviembre 1998 hSECORE5: - Dra. Liiia Arely Prado Barragán

Profesor titular "B" secartamento de Bistecnología - D r . Sergio Xuerca Ochoa Profesor titular "C" Departamento de Biotecnología

RIIIDIPI:

La recuperación de proteína a partir de desechos < subproductos de pesquería puede contribuir a la disminución de Ir contaminación ambiental por un lado, y por otro se puede aprovechar UI nutriente -que normalmente se desperdicia- para utilizarlo como aditivc en la Industria de los Alimentos. El atún es un ejemplo de una especie pesquera, de la cual se obtiene una considerable cantidad de material proteico recuperable ya que este proviene de las industrias atuneras Esta recuperación se puede llevar a cabo por medio de una hidrólisir enzimática de los desechos de pescado. La enzima Neutrasa es uni proteasa bacteriana que puede ser utilizada para este fin. Como pasc preliminar a la hidrólisis enzimática, se realizaron determinaciones de parámatros óptimos de reacción (pii y temperatura de reacción) y dc estabilidad (pH y temperatura) con un substrato alterno (hemoglobina) 1 posteriormente con desechos de atún con lo que se comprobó la actividac reportada por el proveedor de la enzima. Se encontró que Neutrasa tiene una mayor actividad a pii 6 y a 50°C. Posteriormente se estudió 1: cinetica enzimática de Neutrasa sobre desechos de atún obteniendc parametros de km (110.8335 my/&) y Vmax (O.O1311I1g/ml min). La hidrólisis de proteína de desechos de atún se llevó a cabo en lar condiciones óptimas de reacción (pH 6 , S O T ) durante 120 min. Cc ibserv6 un aumento gradual en el grado de hidrólisis conforme aumenta el tiempo de reacción, alcanzando hasta un 20% de grado de hidrólisis al término del mismo. Los péptidos obtenidos se caracterizaron de acuerdo i su peso molecular a través de un sistema CDC-PAGE observando un¿ disminución del peso molecular de las fracciones peptídicas conforme sf incrementa el grado de hidrólisis. El peso molecular de las fraccionef peptídicas se encuentran en el rango de 5 a 17 Kda para un grado da hidrólisis de 5 y 205 respectivamente. El presente estudio sirve comc pauta para la realización de pruebas posteriores que determinen las características funcionales y nutricionales de los péptidos obtenidos por medio de este método.

.

VoBo. Dra. Lilia Arely Prado Barragb

.

__________ ~ -..-*--

VoBo:Dr. Sergio Huerta Oclioa