Jarra de anarobiosis

Sistema de incubación de placas petri en anaerobiosis práctico y sencillo. De 1,0 l de capacidad, está fabricada en poli carbonato transparente la tapa y cuerpo de acero quirúrgico ; incorpora tapa con junta de silicona de cierre hermético, y gradilla en acero inoxidable. Compatible con todos los reactivos habituales en microbiología. Capacidad: 06 placas petri standard de 100 x 15 mm de diamétro., adicional gradilla para tubos prueba 13x100 mm .Exclusivo para laboratorio privados.

Normas para el cuidado del microscopio

Al ser el microscopio un aparato de precisión y, por lo tanto, delicado, es muy conveniente asegurar un buen funcionamiento atendiendo siempre a las siguientes normas:

1. Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre las dos manos, sujetándolo por el brazo con una mano y por el pie con la palma de la otra.2. Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe moverse hasta que finalice la práctica. Cuando se vaya a cambiar de observador se debe mover él y no el microscopio.3. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del microscopio.4. Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del objetivo. Si se ensucian dichas lentes se limpiarán con un paño suave de algodón, sin utilizar ningún disolvente.5. No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que vayan a ser sustituidos, en cuyo caso la operación debe realizarse lo más rápidamente posible, para evitar la entrada de polvo.6. Asegurarse de que el portaobjetos está bien seco cuando va a ser colocado sobre la platina.7. Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor aumento, hay que evitar que el extremo del objetivo choque con la preparación. Para ello acercaremos el objetivo a la preparación mirando lateralmente y luego, mirando ya a través del ocular, enfocamos alejando el objetivo.

MICROSCOPIA DE INMUNOFLUORESCENCIA.

En 1941 coons intentó conjugar los anticuerpos con colorantes fluorescentes y en 1942 publicó la primera aplicación de esta técnica inmunológica. La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica inmunohistoquímica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina b de lisamina o ácido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfónico) con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia (1,2) (ver figura 1b). Http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html

Descripcion del microscopio de inmunofluorescencia

consta de una fuente de luz (lámpara de mercurio o halógena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de filtros, el de excitación o selección de luz ubicado entre la fuente de luz y el preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. Es segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación en los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz incidente. El tercer tipo de filtro es de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico (3).

Funcionamiento la luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.

Clases de técnicas utilizadas para la preparación de las muestras

directa : es una técnica que consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del microorganismo productor del antígeno en un modelo animal (2,3,4,5,6). Indirecta : es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo (4). El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido específico (células que contiene virus, t. Gondii, t. Pallidum, etc.) Sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la

reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado (7). En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene así: de una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo), están globulinas son inoculadas a un organismos (conejos, cabras), el organismo producirá antiglobulinas humanas que se marcan con fluoresceína o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta momento se puede considerar como un antígeno, dando reacción positiva de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unión entre el antígeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando (4,7). La técnica indirecta tiene ventajas: la inmunofluorescencia es más brillante que la detección directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las moléculas de antígeno-anticuerpo presentes en la primera capa, además dado que el proceso de conjugación es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros para la determinación de anticuerpo ya que sólo es necesario prepara un único reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina (4).

Sandwich : este es un procedimiento de doble capa diseñado para visualizar anticuerpos específicos. El nombre de la determinación deriva de la observación que el antígeno se ubica entre el anticuerpo presente en el sustrato de la célula y el agregado como segunda capa (4).

Preparación de la muestra (1) a. Métodos de conjugación : es posible conjugar las proteínas en el suero completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos. Se debe añadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de ph (9.0), se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo en un período de 15 minutos, se debe permitir una agitación toda la noche ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.

B. Purificación del conjugado : se logra mediante eliminación por diálisis de las sales amortiguadoras y los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona). Se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar las sustancias fluorescentes que. No reaccionaron lo cual puede ocasionar tinción inespecífica.

C. Concentración del anticuerpo : se logra mediante tratamiento con sales de amonio saturado. El almacenamiento es el solución salina amortiguada con fosfato a ph 7.1.

D. Preparación de anticuerpos : se obtienen mediante inmunización en animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos y el suero se recoge 7-10 días luego de la última inyección.

E. Manejo de cortes y tejidos : los frotis y cortes montados que no se estudien de inmediato se pueden proteger por sumersión en carbowax y almacenamiento a -20°c. Los cortes liofilizados protegidos con resina de poliester se pueden conservar varios meses en un desecador a 0°c sin que pierda sus antígenos. Es preferible trabajar con cortes fijados ya que.la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del antígeno además se reduce la autoinmunofluorescencia tisular (vesículas y partículas). Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, el más empleado es alcohol etílico al 95% entre 4-30°c, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación.

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia.

El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.

El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partículas más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado por transparencia.

Los condensadores que se emplean en Microscopía de campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numérica mayor al del objetivo.

Microscopio de contraste de fasesEl microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial.

Su inventor fue el físico neerlandés Frits Zernike que junto al método de contraste de gases le valió para ganar el Premio Nobel de Física en 1953.