Casa abierta al tiempo ( J N I V E R S I U A D AU.TONOhAA M E T R O P O L I T A N A

SEMINARIO DE IN VESTIGACION CBS

Departamento de Biotecnologia I I

ASESOR: M.C. Rafael Campos Montiel

ALUMNA: Jimener GonrBler Angelica

225754

TI TUL O

OBJETI VO

Determinar la estabi Iidad de un reactor UASB a Iimentado

con un medio de carboximetilcelulosa e inoculado con

I iquido rumina I, para ser uti Iizado como bioensayo para

probi 6 t i cos.

INTRODUCCION

Un bioreactor se define como un "sistema", en el

cúal se pone en contacto una fase biótica y una abiotica,

cualqui&ra que sea el tipo de microorganismo, el

bioreactor debe permitir ufil contacto tan bueno como sea

posible entre las dos fases, manteniendo la población en

condiciones controladas de temperatura, pH, concentración

de nutrientes etc.

El uso de reactores continuos se llevó acabo a

principios de este siglo, los cultivos continuos

favorecen los estudios fisiológicos, esto se debe a que

pueden guardar condiciones constantes, en contraste con

los cui tivos intermitentes donde el microorganismo estA

sujeto a cambios constantemente. (Aiba y ~01,1972; Bailey

y ~01,1977).

El reactor UASB, es u17 reactor anAerobio de flujo

ascendente con lecho de Iodos, la caracterización del

reactor, permite tener un sistema controlado, en el cual

se pueda reproducir el ambiente caracteristico del rumen,

y p o r lo tanto de la fermentación ruminal, todo esto con

la finalidad de poder determinar el efecto que tienen los

cultivos fúngicos, ta les como A s p e r p i I I us oryzae

(AMAFERM I , S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e YEA-SACC 1 y

Asuerpil Ius niaer en la flora microbiana del rumen

(Windschit y ~01,1992)

En diferentes experimentos realizados "in vivo"

(Czerkawski, Christie, Breckenridge y Hunter, 19751 se

mostraba inhibicicin en la producción de metano provocando

cambios en el metabolismo t9eI rumen, causando dificultad

en la interpretación de resultados.

Por lo tanto f u e necesario obtener una tBcnica que

mantuviera las condiciones del rumen a largo plazo, en un

principio se realizó un procedimiento simple de cultivo

continuo, pero fue eliminado, porque no simulaba las

condiciones del rumen. (Isaacson Hinds y Bryant 1975)

En 1977 J.W. Czerkswski y Grace Breckenridge

realizaron el diseño y desarrollo de una tgcnica de

simulación de rumen (Rusi tee).

Muchos tipos de aparatos artificiales del rumen

fueron descritos por Czerkawski (19761, estos fueron

diseñados especificamente para periodos cortos de

trabajo, cuando se requtsrfa rea lizar estudios del

mecanismo de producción de metano y su inhibicidn,

diversos estudios "In v i v o w mostraron que estos cambios

vienen gradualmente alrededor de semanas, por lo tanto se

vieron en la necesidad para tener tgcnicas a largo plazo

del rumen artificial.

La unidad completa consiste en 4 reactores, con una

capacidad de un litro cada uno, la temperatura fue

mantenida a 39°C.

El & x i to del reactor UASB depende de la alta formación de

flóculos. (Crawford y coI,l980).

Pdgina 2

L o s lodos ó agregados: se compactan y se obtienen

grAnulos, la formación de grdnulos permite mantener

act i va la biomasa bacteriana en el reactor

independientemente del cambio de f l u j o , manteniendo un

buen ni v e I de con versi ón, eficiente a cambios

relativamente altos de flujo.

A s i los grAnulos es una reunión dinAmica, capaz de *

responder a cambios del medio ambiente

La habilidad de floculación de los lodos depende en parte

de los catiónes divalentes por ejemplo magnesio, que a

una concentración de 100 m M los microorganismos crecen

como paquetes agregados de cglulas únicas /grAnulosl, no

hay crecimiento bacteriano a una concentración alrededor

de 400 mM, otros factores que intervienen en la

floculación es el pH, ademds del tipo de microorganismo.

FAgina 3

ME TODLIL OG I A

1 .- P r e p a r a r m e d i o d e c u l t i v o como se m u e s t r a e n l a t a b l a

I .

T A B L A I

m g / L * NaffCO3 4000

* NaZ PO4 . 7ff2.30 600

* K C L 580

* Na C L 480

* MgS04 . 7ffZO 1 O 0

* Ca CL2 64

* ( NH4 ) ,32504 480

* P e p t o n a d e C a s e i n a 1 O00

* E x t r a c t o d e LevaduJ-a 490

* C a r b o x i - m e t i l - c e I u I o : ~ a 6000

uta: se debe esterilizar el rpediu

2. - Montar el r e a c t o r U A S B , c o m o se m u e s t r a e n l a

f i g u r a I . E s un r e a c t o r c i I i n d r i c o d e un volumen de 2 .5 ,

1 i t r o s , c o n a l t u r a d e 4 3 . 5 c m . y d i d m e t r o d e 9 . 4 cm. E l

r e a c t o r f u e i n o c u l a d o ( c u l t i v o m i x t o d e b a c t e r i a s

c e l u l o l i t i c a s ) c o n a p r o x i m a d a m e n t e O . 5 l i t r o s d e

f l u i d o r u m i n a I , e x t r a i d o d e una vaca h o l s t e i n

f i s t u i a d a , d e un p e s o d e a p r o x i m a d o d e 4 5 0 K g , el r e a c t o r

se a l imentaba con un f l u j a d e 0.25 m l / h , e n o p e r a c i d n

c o n t i n u a . 3 . - A d q u i r i r p r a c t i c a e n l a s t e c n i c a s

4 . - R e c o l e c t a r m u e s t r a s ( t r e s ) d i a r i a m e n t e .

5. - Tomar 5 m l . d e c a d a m u e s t r a , C e n t r i f u g a r 20

m i n u t o s a 10,000 rpm, al s o b r e n a d a n t e se l e d e t e r m i n ó

(AGV y c e l u l a s a s ) , y a l o q u e p r e c i p i t a b a se l e

Pdgina 4

". O 5 . x

8

O G 4

P A , g i n a 5

determinaba L o w r y .

6. - Determinar la estabilidad del reactor UASB, cada

semana se cuantifico lo siguiente:

- Biomasa por el metodo de Lowry.

- Biomasa por densidad óptica.

- Acidos grascls voldtiles por

cromd togra f ia de gases

- pH con potenciómetro

- Enzimas celulolíticas por el metodo

celulasas.

METUDO DE LOWRY

Existen diferentes m.Btodos para la determinación de

proteína, uno de estos es el metodo de Lowry, el

fundamento es el siguiente?:

Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-

Cionalteu, para dar un complejo de color azul, debido a

la reacción de cobre alcalino con la proteina, la

intensidad del color depelnde del niimero de aminodcidos

aromrlticos presentes y enlaces peptidicos, la solución

azul muestra una absorbancia mAxima de 750 nm.

La variación de este m&todo se debe al cambio de pH,

tiempo de reacción, concentraci6n de los reactivos.

En este metodo las razones que se tiene para el uso

del reactivo de Folin son las siguientes: referencia)

al,- Se puede medir el contenido de proteinas en

fracciones enzimAticas

P&gina 6

bl.- Se p u e d e n h a c e r m e d i c i o n e s en m e z c l a s d e t e j i d o c o n

p r o t e i n a s

c 1 . - Se p u e d e n h a c e r m e d i c i o n e s d e so luc iones d i l u i d a s .

L a s v a r i a c i o n e s d e este m e t o d o p u e d e n deberse a l pH,

t i e m p o d e r e a c c i b n , c o n c e n t r a c i ó n d e l o s r e a c t i v o s ,

i n t e r f e r e n c i a d e s u s t a n c i a s como a z d c a r e s . E l r a n g o d e

l i n e a l i d a d es d e O a 300 m g / L .

MATERIAL:

t u b o s d e e n s a y e

g r a d i l l a

p r o p i p e t a

m a t r a z a f o r a d o 100 ml.

p i p e t a d e 1 m l .

p i p e t a d e 5 ml . p i c e t a

p r o b e t a s

e s p e c t r o f o t o m e t r o (SHINADZU 84001.

ce l d a s d e c u a r z o

vasos d e p r e c i p i t a d 0

A g i t a d o r d e tubos ( v o r t e x 1

R E : A C T I VOS:

Solución A : d i l u i r 20 g . de b i c a r b o n a t o d e s o d i o en 1

l i t r o d e u n a s o l u c i ó n 0 . 1 normal d e h i d r ó x i d o d e s o d i o

SuJuciBn 8: d i l u i r 1 g . d e a ; u l f a t o d e cobre en 100 m l . d e

agua des t i l a d a .

PAgina 7

S o l u c i ó n C: d i l u i r 2 g . d e t a r t r a t o d e s o d i o y p o t a s i o en

100 ml. d e a g u a d e s t i l a d a .

S o l u c i t i n e s t a n d a r d e albúmina: d i s o l v e r 15 m i l i g r a m o s en

50 m1 d e agua des t i I ada .

P r o c e d i m i e n t o :

1 .- Preparar . l a c u r v a e s t d n d a r c o n l a s o l u c i ó n e s t d n d a r

d e a l b f i m i n a r e a l i z a r l a s i k f u i e n t e c u r v a d e c a l i b r a c i 6 n

T a b l a 1 1

tubo O 1 2 3 4 5

s l n . e s t A n d a r ( m 1 I O o. 2 O . 4 0 . 6 0 .8 1 . 0

H20 d e s t i l a d a ( m 1 . ) 1 0.8 O . 6 0.4 0.2 O

conc. (mg/l I O t i 0 120 180 240 300

' a b l a 11. P r e p a r a c i ó n d e l a c u r v a e s t d n d a r L o w r y .

2.- Tomar 1 ml. d e l a s o l u c i ó n que se va a a n a l i z a r

3.- A d i c i o n a r 1 m1 .) d e hsidrrixido de sod io 1 N a todos

los t u b o s , c a l e n t a r a b a ñ o m a r i a a t e m p e r a t u r a d e

e b u l l i c i ó n d u r a n t e 5 m i n .

4 . - P r e p a r a r u n a s o l u c i t i n d e l a s i g u i e n t e m a n e r a . 50

ml. s o l u c i ó n A , 1 ml. d e l a solucirin 3 y 1 ml. d e

l a s o l u c i ó n C

5.- A g i t a r en v o r t e x y r e p o s a r en l a o s c u r i d a d 30 m i n .

6.- A d i c i o n a r 1 ml. d e Ja s o l u c i ó n d e f o l i n

( d i l u i d a 1 : 1 ) , a g i t a r y r e p o s a r en l a o s c u r i d a d 30

m i n

PAgina 8

7. - Leer en un espectrofótometro (Shimatzu), a 750

nm.

CALCULOS PARA LA DETERM1NAC:IUN DE B I O M A S A ( L o w r y )

La curva patrón para la determinación de protefna

utilizando el mgtodo de Lowry, se muestra en la Tabla I I I

y GrAfica No.1.

CONC. ABSORB . (mg/L I

O 0

60 0. 056

120 0. 136

180 0.263

240 0. 376

300 O . 506

- Tabla I I I . Curva Estanda r.

Realizando una regresión lineal se encuentra la ecuación

de la recta siguiente.

absorbancia = m {concentración) + b

donde :

m= pendiente

b= ordenada al origen

abs. = 1 . 722 x lo-== {conc. - 0.03552

coef. de correlacidn = r = O . 991 054

Reordenando la ecuación ds? la recta en terminos de la

concentracijn

Concentración = {Absorbancia + 0.035521/1. 72.2 x 1 O-= Sustituyendo las absorbancias leidas de las muestras se

Curva Pat r6n metodo de lowry

absor bancia

O 5 o

grafica 1

1 O0 150 200 250 300 350 conc mg/L

encuentra la concentración de proteina.

DENSIDAD OPTICA:

La densidad dptica es una tkcnica rApida y se basa

en el hecho de que la turbidez en una suspensión de

cklulas es proporcional a la biomasa t cklulas en

suspensión l.

La densidad óptica se realizó en un espectrofótometro

t Shimadzu 8400 I a una longi tud de 600 nm.

METODO DE CEL UL A S A S

El reactivo DNS tdcido dinitrosalici licol, fue

descubierto por Summer, se emplea para la determinación

de azúcares reductores, .este mktodo proporciona una

estimación rdpida y simple, el principio de esta

determinacidn es: El reactivo y el azúcar forman una

"especie" ópticamente medible. La reacción es de oxido-

reducción, el dcido 3,5-dinitrosalicílico es reducido a

Bcido 3-amino-5-nitrosaiciJico, mientras que los grupos

aldebídos son oxidados a grupos carboxilo.

La sal de Rochelle es introducida previamente al reactivo

para disolver el oxígeno, el fenol aumenta la cantidad de

color producido, y el bi'sulfito estabiliza el color

obtenido en la presencia del fenol, el alcali es

requerido para reducir la acción de la glucosa sobre el

DNS . MATERIAL;

tubos de ensaye

pipetas de 2 ml.

225'754

PAgina 11

propipeta

probeta

gradi I la

matraz aforado de 1 O 0 m i .

bafio marfa

termómetro

piceta

espectrofótometro / S H I I Y A T Z U I .

celdas de cuarzo

vórtex

REACT1 V O S :

1.- - Solución de carboximetilcelulosa (1%)

- Solucidn estdndar de Dextrosa anhidra, de una

conc. de O.Zg/L.

- Solucidn de DNS, que esta compuesto de:

dcido dinitrosalicflico

s a l de Roche1 le

feno I

bisul fi to de sociio

hidrdxido de sociio

2.- Con la solución estdndar de dextrosa, realizar la

siguiente curva de calibracidn, ver Tabla IV.

tubo 1 2 3 4 5

s i n . estAndar(ml. 1 O 0.5 1 .o 1.5 2

N20 desti lada (m1 (. 1 2 1.5 1 . o 0 . 5 o Cnnc. fmg/l) O 62.5 125 187.5 250

-3

PAgina 1 2

3. - Tomar 2 m l . d e l a s o l u c i ó n a a n a l i z a r .

4 . - A d i c i o n a r 1 m l . d e l a s o l u c i ó n d e

c a r b o x i m e t i l c e l u l o s a a t o d o s los t u b o s , i n c l u y e n d o

c u r v a e s t a n d a r .

5.- C o l o c a r l o s e n un baño maria a una temp. d e 50-55" C

d u r a n t e 1 /2 h o r a .

6.- A d i c i o n a r 3 ml. del r e a c t i v o d e DNS.

7 . - C a l e n t a r d u r a n t e 5 min. a t e m p . d e e b u l l i c i ó n .

8 . - D e j a r e n f r i a r y a g i t a r e n v ó r t e x .

9 . - L e e r e n el e s p e c t r o f c j t o m e t r o t s h i m a t z u ) a 5 7 5 n m .

CALCULOS PARA LA DETERJYINACION DE CELULASAS.

La c u r v a p a t r ó n p a r a d e t e r m i n a c i ó n d e c e l u l a s a s se

m u e s t r a e n l a T a b l a V y l a G r d f i c a No. 2.

ABS.

0

0 . 1 1 0

0 . 1 96

0.31 9

0.420

0. 5 3 1

Tabla V . Curva Estandar

Rea 1 i z a n d o una r e g r e s i ó n l i n e a l se e n c u e n t r a l a e c u a c i ó n

de l a r e c t a s i g u i e n t e .

a b s o r b a n c i a = m ( c o n c e n t r a c i ó n 1 + b

PAsgina 13

donde :

m= pendiente

b= ordenada al origen

abs. = 1 . 6 6 5 x 10-= (conc.) + 7.096 x 10

coeficiente de correlación = r = 0.994958

Reordenando la ecuación de la recta en termino de la

concentracidn:

Concentración = /Absorbancia - 7.096 x 1 0 -=/l. 665 x lo-=

Sustituyendo las absorbancias leídas de las muestras se

encuentra la concentración de Azúcares.

En Celulasas para determinar la unidad definida como

la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol

de glucosa por minuto a las condiciones del bioensayo

( U I I , se tiene:

Ul= [ {azúc. reductores- azúc. reductores ,? /Pfl(p~UCP.. I -7 /30 x fOO0 aicromol

iniciales fina 1 mol.

DETERMINACION DEL. pH

MATERIAL

potenciómetro

agua desti lada

solución buffer

vaso de precipitado

El pH se determinó mediante un potenciómetro usando

una solución buffer de fosfatos a pH=7. Para la

PAgina 14

. ..

Curva Estandar (celulasas)

Absor bancia 0#6

005

004

003

0#2

0*1

O O 5 o 1 O0 150 200 250 300 350

Conc' (mg/L)

Graf lca 2

P&g.ina 1 5

p o r lo t a n t o s i el volumen d e l a s o l u c i ó n b u f f e r es d e 1

I t se t i e n e q u e :

WHP044-a = T H P 0 4 - 2 ~ . p ~ H P 0 4 - 2 - I t s o l u c = O . 5 M ~ l 4 l g / m o l ~ l l t =

7 0 . l g

PAgina 16

DETERHINACION DE ACIDOS GRASOS VOLATILES:

La determinación de los A G V producidos durante la

prueba, se realizo mediante un cromatogr-dfo de gases

V A R I A N 3400, con un integrador tambien V A R I A N 4400. El

procedimiento fue el siguiente:

al Se preparo una solución estandar, con una mezcla de

0.2ml de Acid0 acgtico, 0 , l m l de dcido propidnico y O.lml

de Acid0 butírico, por 100 m1 de agua destilada.

bl 5 m1 de esta sol ucidn estandar se l levo a un volumen

final de 20 m1 (dilución) con agua destilada.

cl Se aplicaron inyecciones de 5 A I de la solución

estandar di I uida al cromatogr-dfo de gases V A R I A N 3400,

desde un niimero de 5 a 1 0 aplicaciones, esto con la

finalidad de calibrar el comatrogr-dfo.

Las condiciones del cromatogr-dfo eran:

- I N Y E C T O R : 2 70" C

- DETECTOR: 260°C

- COLUMNA : 1 70" C-235" C

- T I E M P O T O T A L DE C O R R I D A : 4.62 min

dl Desputjs de calibrado el cromatogr-dfo, por duplicado se

aplicaron las muestras con volumenes constantes de 5 A I .

En cada uno de los cromatogrBmas obtenidos en cada

corrida (como el que se muestra en la Fig 2 1 , mediante un

in tegrador V A R I A N 4400, previamente programado, se

estimaron los tiempos de retencidn y el &rea bajo la

curva, en la solución patrón y en las muestras para

determinacibn en Amol/ml y % molar de A G V .

P-dgina 2 7

CALCULOS PARA L A DETERNINACZON DE ACIDOS GRASOS

VOLATZLES. AGV l

L o s tiempos de retención caracteristicos, en la columna

empleada para los picos de los AGV fueron: .. l e m p o s d e r e t e n c i ó n d e AGV

tr t m i n l d c i d o a c a t i c o 1 . 8

d c i d o p r o p i h n i c o 2.9

dcido b u t í r i c o 4 . 1

La determinación de H m c l l / l de AGV se estimo a partir

de la ecuación:

pmol/l AGV = A t m X C t s p A t s p

donde :

A t m : Suma de las Areas de los picos obtenidos para &c.

acgtico, propiónco y butirico en la muestra (el subfndice

m significa que fue determinado a partir de la muestra)

Atm = Aacm + Apropm + Abutm

A t s p : Suma de las areas de los picos obtenidos para dc.

acgtico, propiónico y butfrico en la solución patrón (el

subfndice sp significa que fue determinado a partir de la

solución patrón).

Atsp = Aacsp + Apropsp + Abutsp

Ctsp: Suma de las concentraciónes de los Ac. acetico,

propiónico y butirico de la: solución patrón.

Ctsp = Cacsp + Cpropsp + Cbutsp

Para determinar el % molar de cada uno de los AGV,

Pdg.ina 1 8

se emplearon l a s siguientes relaciones:

%molar &c. acBtico = IAacm/Aacspl X Cacsp X 100 N m o l / I A G V

%molar Ac. propicjnico = / A p r o p m / A p r o p s p l X CproDsp X 100 f i m o I /I A G V

Pdgina 1 9

Determinacidn de AGV

SOLUCION ESTANllARD DE AQV

MUESTRAS

2 2 5 7 5 4

Pdlgina 20

RESUL TADOS Y ANAL I S I S Proteína

140

120

1 O0

80

60

Concentraci6n (mg/L)

conc.

88.3 62.2 68.2

c ::I , , , O I I

O 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (mes)

Grhflca 3. Determinacidn de Proteins (promedio mensual durante 6 meses)

L o s resultados sobre prote€na se muestran en la

Grdfica No. 3, el cua l es un promedio mensual. Como se

observa existe una variabilidad del sistema pero sin

haber diferencias significativas l P > U . U 5 1 entre los

da tos mues treados.

Celulasas

250 -

200 -

160 -

mea 300T UI/I

1001 1 I I I I I

O 1 2 3 4 5 6 7 Tierrlpo(mes)

Qr6flca 4. Determinacl6n de Celulasas (Promedio mensual durante 6 meses)

En l a p r o d u c c i ó n d e Selulasas como se m u e s t r a e n l a

G r b f i c a No. 4 t a m p o c o e x i s t e d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a (

p>0.05 I e n t r e los t r a t a m i e n t o s e n c o n t r a n d o s e un p r o m e d i o

d e 185.6 U / / L .

Pbg'ina 22

Acidos Grasos Volatiles Concentracl6n (pmol/L)

50

40

30

20

10

O

----2+----"-""/

38. 1 sa. 3 7.5 se. 4 11.2 38.6 8.2

O 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (mes)

- Ac. Ac6tlco -" Ac. Propl6nlco

GrBfica 6. Determinacl6n de AGV (promedio mensusi durante 6 meses)

En la producción de A G V solo se detectaron la

producci6n de Acido acBtico y propiónico. A l realizar

anBiisis estadistico se encontro que no habia diferencias

significativas ( P>O.O5 1 en el semestre, la produccicin

total fue aproximadamente de 46.65 Amol/L, siendo en un

80% la producción de Acido ac&tico (GrBfica No 5)

Densidad Optica

0.3 -

0.2 -

0.1 -

meu Abuorb. O. 187 O. 170 o. 180 O. 188 O. 160 o. íes

O a 4 T

Absor bancla

OL"--I I I 1 I I

O 1 2 3 4 5 6 7 Tlempo (mes)

Qr6fica 6. Determinacl6n de Densidad Optica(promed1o mensual durante 6 meses)

En l a d e n s i d a d ó p t i c a se o b s e r v o una c i e r t a

v a r i a b i l i d a d p e r o al r e a l i z a r a n z i l i s i s e s t a d i s t i c o se

e n c o n t r o q u e n o h a b í a d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a s ( P,bO.O5

I e n este p e r í o d o e n c o n t r a n d o s e un p r o m e d i o d e 0 . 1 7 2 d e

a b s o r b a n c i a ( G r A f i c a No.6)

PBgina 24

14

12

10

8

6

4

2

O O 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (mes)

Grdfica 7 . Determinacidn de pH (promedio mensual durante 6 meses)

L o s ~esultados sobre €21 ,@ se m u e s t r a n e n l a G r d f i c a

N o . 7 , y se o b s e r v a n q u e n o e x i s t e n d i f e r e n c i a s

s i g n i f i c a t i v a s e n t r e los meses p o r lo q u e s u g e r i m o s q u e

p o r l o s d a t o s m o s t r a d o s el r e a c t o r se e n c u e n t r a e n e s t a d o

e s t a c i o n a r i o .

CONCL us1 ON

En este servicio se determino la estabilidad de un

reactor continuo tipo U A S B , alimentado con un medio

sintetico de carboximetilcelulosa, puesto en operación

con microorganismos del rumen de una vaca Holstein

fistulada para ser utilizado como un bioensayo para

probióticos. Se utilizo el reactor U A S B de 2.5 litros con

un f I u30 de 0.25 ml /min operando por 3 meses.

Determinando su estabilidad por seis meses por la

cuantificación de A G V , densidad optica, celulasas y

biomasa.

Los resul tados obtenidos demuestran estabi I idad en

el reactor t P>O,O5 1 con una producción de 60.03 mg/l de

biomasa, 185.6 U I / L de celulasas y 46.65 Hmol/l de A G V .

Por lo que puede ser utilizado como fuente de

microorganismos anaerobios celulolfticos para bioensayos

con aditivos que estimulen el crecimiento microbian0 dei

rumen.

Este trabajo sirvió como base para realizar un bioensayo

de compuestos fungicos, estimulantes del crecimiento de

bacterias celuloliticas anaerobias. (R. G. Campos Montiel

y G. Viniegra Gonz&lezl, publicada por la revista

Biotechnology Techniques, Volumen 9 No. 1, p. 65 a 68.

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REFERENCIA

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