C m rbltiia al tinlo

JNlVERSlDAD AU'lONOiMA METROPOLITANA &VISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DR. TOMÁS MORATO CARTAGENA SECRETARIO ACADEMIC0

A QUIEN CORRESPONI),\:

Por nicdio de la prcsciitc sc iixc mistar qiic el (la):

del Departaminto dc: Cieririas dc l a Salud de la División de Ciciicins I3itili\~icns 1' dc la Salud, asesoro el siguiente Servicio Social:

Obtención de una cepa de Eschericia coli (DHSa)

1 / ? ~ F M & : bl. en C. Hértor F. Serrano

J . TITULO:

1 ALUMNO: Armando V:ilriicia Hernández

MATRICULA: 922?ítJ I 2

LICENCIATURA: i ~ i ~ l i l l ~ i ~ l Experimental

Si~~iticiiilire S, 1396 a Mano 5, 1997 i .., . . /PERIODO:

Se extiende la prcsciitc p x i his Iiiics (IIK al interesado convengan, en la Ciudad de Mexico, D.F. a dos de Mayo de mil novccicntos t i w c i l h y sictc.

A T E N T A M E N T E

.

INDICE

ANTECEDENTES .......................................................................... I.

MATERIALES Y METODOS ........................................................... 3

RESULTADOS ............................................................................... 4

DISCUSIONES Y PERSPECTIVAS .................................................. '7

APENDICE A: PLASMIDOS ........................................................... (3

APENDICE B : ESTRUCTURA DEL HW ........................................ 10

APENDICE C : METODOLOGIAS ................................................... 1:2

APENDICE D : REACTNOS Y SOLUCIONES ................................. 18

REFERENCIAS ............................................................................. 2 1

.

OBTENCION DE CEPA DE Escherichia coli (DH5a) COMPETENTE Y SU EVALUACION POR METODOS

ELECTROFORETICOS

Durante la obtención de células competentes” se utilizaron los buffers de transformación TFB standard y TFB modificado. Un análisis de varianza de la eficiencia de transformación nos indica que no existe diferencia significativa alguna (a >0.05) en la misma. Mediante la transformación bactenana, utilizando los plásmidos pBR322-HWl1, pUC19-HPV16 y pUC19-HW18 en E. coli (üH.5~); se obtuvo el genoma del Vinis del papiloma humano tipos 1 1 , 1 6 y 18 para su análisis mediante un estudio de PCR con los primers LlCl/LlC2; los resultados no mostraron evidencia de que la calidad o integridad del genoma viral se modificara. Es decir, el genoma viral se obtuvo en condiciones óptimas * para estudios con técnicas tan exigentes y sensitivas como lo es PCR.

ANTECEDENTES

CANCER Y VIRUS DEL PAPILOMA H ü ” 0

El cáncer representa un seno problema de salud, y en México ha pasado a ocupar el segundo lugar de muerte de la población en general. En particular, el cáncer cérvicouterino en mujeres y las leucemias en niíios y jóvenes son frecuentes (Garigiio,1995). En la década de los se establece una clara relación entre la infección con el virus del papiloma humano y cáncer cérvicouterino; así mismo, se h a establecido una clasificación (ver tabla 5, apéndice B) del H W en tipos de alto, mediano y bajo riesgo de acuerdo con el grado de asociación oncogénica que se presenta con la lesión.

La precisa y eficiente detección y tipificación del HPV tanto en lesiones como en tejidos normaies son utilizados para tratar de determinar el papel que estos desempeñan en el origen y progresión del &cer y, de igual forma, para la prognosis y control del paciente ( Fujinaga, et ai; 1991).

80s

DETECCION

Dentro de las técnicas utilizadas actualmente para la detección y tipificación del HW. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es la más sensitiva, ya que es capaz de detectar (teóricamente) una simple molécula de DNA de HFV, después de los niveles apropiados de amplificación. En segundo lugar encontramos la técnica de DOT-BLOT, capaz de detectar alrededor <‘e 10,000 .

a 2a

2 i

moléculas virales; mientras SOUTHERN BLOT puede detectar aproximadamente 100,000 moléculas virales. La HIBRIDACION INSJTU puede, teóricamente, ser capaz de detectar una copia de DNA de H W en una célula, pero en la práctica el nivel de sensibilidad es de entre 50 y 100 copias por célula; Sin embargo, mediante esta técnica se pueden contaminar muestras que se detectaron negativas ( Rangel, et al; 1994).

Uno de los propósitos de este proyecto de investigación, era la obtención y transformación de células competentes de Escherichia wh' (DHSa) con los plásmidos pBR322-HPV11, pUC19-HPV16 y pUC19-HW18; lo cual nos permitiría obtener el genoma completo del HPV tipos 11,16 y 18 ( ver tabla 3). para su posterior detección especiika mediante otro tipo de FCR como puede ser PCR MULTIPLEX.

A principios de los 90s se han reportado sistemas para la detección de HPV basados en PCR tipo-específico; posteriormente estos sistemas de detección ampliaron su espectro de detección utilizando primers consenso para secuencias especificas de los genes E6 y E7 (ver Fujinaga, et al; 1991). En uno de estos sistemas se diseñó un par de primers consenso (LlCl/LlC2) para la región altamente conservada del gen L1 (Snijders,1990); con este par de primers se obtiene la detección de HPVs de bajo, mediano y alto riesgo. Sin embargo, el control positivo para la reacción (B-globina ) tiene que ser realizado en una reacción independiente; lo cual es un impedimento técnico y de reproducibilidad del experimento. Es por esto que la técnica de PCR MULTIPLEX es el método de elección para poder realizar, en el mismo ensayo, tanto controles positivos y negativos internos como externos, y la detección con otro@) juego(s) de primers. Lo cual facilitaría y confirmaría de manera significante la detección y tipificacibn de un amplio espectro de tipos de HPV en un tiempo relativamente corto.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENETIC0

Existen básicamente tres procesos a través de los cuales se lleva a cabo la transferencia de DNA recombinante: Transducción, Conjugación Y Transformación.

La transducción es el proceso por el cual una fracción del DNA de una bactnia se transfiere a otra por medio de un bacteriófago transductor. En la conjugación, la transferencia de DNA de una célula donante ( macho ) a una célula receptora ( hembra ) se realiza mediante la formación de un puente intercelular que se establece al ponerse en contacto el citoplasma de ambas bacterias. El mecanismo de transformacion implica la transferencia unidireccional del material genético de una célula donadora a una célula receptora. Es decir, el DNA de una célula se pone en contacto directamente con la bacteria receptora "competente"; esto es, que la membrana de la bacteria receptora sea capaz de permitir la penetración del DNA extraño (Serrano, 1993; Primrose Bb Old,1991).

Los primeros intentos por conseguir la transformación de E. coli fracasaron, a tal grado que se llegó a creer que este microorganismo era refractario a la transformación. Hasta inicio de los 70s fue cuando Mande1 8a Higa demostraron por primera vez la transferencia de DNA en E. coli. Esto fue posible gracias a la implementación de un pre-tratamiento con cloruro de calcio.

. < < ,

3

Posteriormente se demostró que estas condiciones inducen a un estado general de competencia para la transferencia del DNA. Es decir, permitió a estas bacterias “absorber“ el DNA. Anos más tarde, Cohen y colaboradores, en 1972, demostraron que las células de E. coa tratadas con cloruro de calcio son también receptoras eficaces de DNA plasmídico ( Hanahan,1983; Primrose 86 Old, 1991).

es un paso crucial en muchos experimentos de clonauón, es muy conveniente que esta sea lo más eficiente posible; esto hace necesario la preparación de células de E. mfi altamente transformables (competentes) para que la transferencia del DNA extraño sea exitosa ( Sambrook,1989).

Las bacterias tratadas de acuerdo al protocolo original de Mande1 & Higa producen entre lo5 y 106 colonias transformadas por pg de DNA plasmídico superenrollado. Esta eficiencia puede ser incrementada de LOO a 1000 veces por la exposición a cepas de E. wti mejoradas por combinaciones de cationes divalentes por largos periodos de tiempo y tratamiento de las bacterias con dimetilsulfóxido (DMSO), agentes reductores y cloruro de hexadnocobalto. Como actúan estos agentes se desconoce, así como el mecanismo a traves del cual el DNA del plásmido penetra en la bacteria competente. Estos mejoramientos en la frecuencia de transformación han ocurrido solamente como una consecuencia de la experimentación empirica.

Actualmente se dispone de dos opciones para la obtención de una cepa competente de E. coli La primera opción es el obtenerla de una fuente comercial, estos productos son muy seguros y generalmente presentan una frecuencia de transformación superior a 108 colonias transformadas por pg de DNA plasmídico superenrollado. Sin embargo, estas son mucho más costosas que las células competentes preparadas en el laboratorio. La segunda opción es el preparar las células competentes en el laboratorio; existen diversas metodologias para la preparación y almacenamiento de las células competentes, las de uso común son:

Dado que la transformación de E. wli

I . Preparación de células competentes de E. coli frescas usando cloruro de calcio (Sambrook, 1989).

2. Preparación de células competentes de E. coli frescas o congeladas que producen células aitamente transfomables (Sambrook, 1989; Brown, 1993; Miller, 1992).

El 2’ método se ha empleado exitosamente para diversas cepas de E. coli como son DH1, DH5 y MM294 obteniéndose cultivos competentes que pueden ser utilizados de h e d i a t o , g bien almacenarse a -70°C hasta ser requeridas. Bajo condiciones de estandarización, estas bacterias competentes pueden llegar a producir hasta 109 colonias transformadas por pg de DNA plasmídico superenrollado.

.

<... .

4

OBJETIVOS

Obj. GENERAL,.

Obtener células competentes de E. coli DH5a por incubación en medio TFB modificado.

Objs. PARTICULARES.

o Determinar las condiciones que permiten mantener en estado competente cultivos de E. coli DH5a.

Comparar la eficiencia de transformación de E. coli DH5u competentes con sus an tecesoras.

Determinar las características de los plásmidos transformantes aislados de las células competentes.

Detección específica de insertos mantenidos dentro de los plásmidos para un estudio de PCR multiplex.

MATERIALES Y METODOS

J Cuitivo bacteriano. Cultivo de E. coli (DH5u) en medio LB. Proporcionado por la M. en C. Mónica Salas.

Piásmidos. Los plásmidos pBR322 y pUC19 son utilizados como vectores para transportar el genoma completo de los virus HPV 11 para el primero y Hw16 y Hw18 en el segundo. La inserción del genoma viral se realizó en el sitio único de restricción de Barn Hi, en las posiciones 375 y 417 respectivamente. Estos fueron donados por el M. en C. Jesús Aguirre. Información más detallada se muestra en el apéndice A.

2)

\-

3

s L3

4-.

La preparación de las células competentes se realizó mediante el protocolo 3 de Hanahan con algunas modificaciones ( Miller,1992; Sambrook,1989;

Brown,1993) . El ensayo constó de 10 repeticiones. En la transformacibn de E. coli (DH5a) con los plásmidos pBR322-HWl1, pUC19-HPV16 y pUC19-HPV18 se empleó el protocolo de Miller, 1992. La mini-preparación del DNA de los plásmidos se realizó mediante lisis alcaiina ’ ( Miller,1993; Sonbrook,l989); seguida de su purificación con el Kit Quiaex I1 ( QUiAGEN ). El anáiisis con la endonucleasa de restricción se realizó de acuerdo a los protocolos de Sambrook y Brown. Finalmente el protocolo para el ensayo de PCR original se tomó de (Snijders,l990), pero utilizamos el protocolo optimizado, de rutina, que se utiliza en el laboratorio. Los protocolos detallados se encuentran en el apéndice C.

3

3 3

3

4

. w

RESULTADOS

5

EFICIEACU DE TRMSFORIYLACIOH.

La eficiencia de transformación que se obtuvo con cada buñer se resume en la siguiente tabla:

Tabla 1: Número de colonias observadas que expresan el marcador de selección ampr, "colonias transformadas".

I (TFB'modificado I 2.6~106 I 2.4~106 I 2 . 4 ~ 1 0 ~ I L I I I I J

1 : Colonias transformadas por pg -de DNA plamidim empleando a E. di (DHSa) como cepa hospedera. 2 : El protocolo empleado p ~ a la obtcnciW de cornptentri-transformadas es de Hanahan 19x3, con d6"inas modificaciones. 3 y 4 : Buffers de transformación utillados, como se dacribe en el apendice D.

La diferente eficiencia de transformación es ligeramente distinta, pero no significativa (-0.05) para los buffers empleados; por lo tanto, proponemos que ambos buffers presentan la misma eficiencia de transformación. Sin embargo, la metodología que se utüizó presenta algunas ventajas técnicas. '

Una vez que se obtienen las traníormantes, se realiza la extracción del DNA de los pksmidos mediante una minipreparación utilizando el método de lisis alcaiina ( Miiier, 1992; Sambmk,1989). Ver fig 1.

En la tabla 2 se muestran pksmidos obtenidos.

las características principaies del DNA de los

Tabla 2: Cuantificación del producto de la mini-preparación.

empieado, i i h de DNA. ..

6

pUC 19-HW16

pUC19-HW18

Fig I : La f o t d í nm muatrn las bandas de DNA pLarmidico. El orden de ba pam es el ug 1) CUI -; 2) H W 11: 31 186: 41 I&& 5) 16: 6) H W I ~ A : 711% 8)16: 9) 11. Se uLiliEó I d de DNA plasmidro por faml en la electrofaresir y Y rwolvio en gel de egamsa al I% am TEE 1X.

pBR322 4,361

2 HW16 -- 8,000

puc19 2,286

2 HW18 E 8,000

puc19 2,286

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ya que se obtuvo el DNA plasmídico; se proce-._ a purificarlo. No sr muestran resultados.

Los fragmentos del DNA de los plásmidos, producidos por la digestion ron Barn Hi, se muestran en la figura 2 y en la tabla 3.

Tabla 3: Digestión de los piásmidos pBR322-HWl1, pUC19-HW16 y pUC19- HPV18 con la enzima Bam HI.

El marcador de peso molecular, utiiizado para la identificación del peso de los fragmentos de la digestión, es iambdo - Hind iii &-Hind 111) cuyos fragmentos de peso molecular conocido se muestran en la tabla 4.

.

Fig 2: Esta fo twa l i nor muestra c w b wc los úppmmtm de la aestión con Barn HI. comparndm con el patrón producida por )i-Hind 111 , cormspasden perfectamente a los de los pksmidas utilizada (w tabla 3 y 41.

Carriles: Forma sin digenry digcnda.l,2: p ~ ~ Z - H W l l . 3.4 : pUC19-HW1.5. 5 : *-Hind 111 y 6.7 : pUC19- H W I E .

1 2 3 4 5 6 7

En estos resultados se muestra que el DNA de los plásmidos obtenidos corresponden ai de los piásmidos utilizados en la transformación de E. wli (DH5a).

Tabla 4: Fragmentos producidos por el marcador de peso molecular A-Hind 111

1 I 23.130 2 19.416 1

13 16.557 I 14 14.361 I

2.322 2.027

12s

A parih del DNA purificado se realizó la amplificación de un segmento de la region L1 (= 260 bp) del genoma vimi, que es altamente conservada ( ver apéndice B), para comborar la integridad física del DNA de los distintos HPVs. Los resultados se muestran en la figura 3; donde observamos un control negativo, seguido del control positivo interno y los H W s 11.16 y 18, y finalmente un 2" control interno. Dado que utüizamos 2 controles internos distintos, no se requirio

.

8 4

del marcador de peso molecular pam identificar el tamaño del producto de L1 C 1/IzIC2 obtenido.

1 2 3 4 5 6

Es adecuada la defrnición de las bandas; por lo que podemos a f i a r que e1 DNA de los plásmidos obtenidos es de suficiente calidad para análisis posteriores de PCR MULTIPLEX.

DISCUSIONES Y -PERSPECTIVAS

A pesar de que no existe diferencia signiíicativa entre las distintas eficiencias de transformación de los buffers empleados; al utilizar TFB modificado se obtiene la gran ventaja de obtener bacterias competentes para uso inmediato y para p.0 a larga p W . En muchos de los experimentos realizados en Biología Molecular, como por ejemplo: ensayos de activación, ensayos de retardamiento, rnonitoreo de la actividad de promotores, e&., existe una muy clara dependencia de los resultados obtenidos en función del control de las variables involucradas, por lo tanto, es necesario disponer de lotes de bacterias transformadas para repetir ensayos en distintos tiempos, el preparar bacterias competentes para su uso inmediato implica obtener bacterias competentes para cada ensayo, lo cual podría significar una fuente de variación. Si bien es cierto que en la mayoria de los laboratorios de Biología Molecular, se tiene particular cuidado con la pureza de los =activos; las variaciones entre los lotes del mismo fabricante o de fabricantes distintos esta fuera del contml del investigador. Ai producirse bacterias competentes que pueden ser utilizadas con la misma eficiencia en iapsos cortos, medianos y largos se podría asegurar una reproducibiüddad del experimento o bien la estandarización de metodologías o incluso del personal que ingrese al laboratorio. Así mismo, el utilizar lotes de reactivos distintos podría significar

. I ”, . - .I

I

4 9

fuente de variación. Adicional a estos factores, está involucrado el costo económico, ya que al preparar ‘competentes” para cada ensayo implica el gasto adicional de reactivos en comparación con el metodo aquí descrito. Es importante también mencionar el tiempo que se invierte en la preparación de ”competentes”, que se puede llevar hasta 2 días. Es decir, emplear hasta 2 días, para la obtención de competentes, previos a la realización de aigun experimento contra los escasos minutos que implicba el descongelarlas utilizando el TFB modificado.

Un aspecto muy importante es el rendimiento de DNA producido ( ver tabla 2) , y de igual forma la integridad con la que se obtiene. El DNA del HPV obtenido de las bacterias transformadas, se analizó mediante tecnicas tan exigentes y sensitivas como lo son PCR (ver fig. 3) y secuenciación ( no se muestran resultados), observándose resultados “óptimos” que nos indican la integridad del DNA obtenido.

o

P ”’

i

1 I O

APENDICE A : PLASMIDOS

Como se menciono anteriormente, la transformación se realizó con los plásmidos pBR322-HWl1, pUC19-HPV16 y pUC19-HW18 . Ver estructura de los plásmidos, figura 4.

pBR322.

Es uno de los vectores más ampliamente utilizados, su tamaño comprende 4363 bp. En la secuencia del plásmido encontramos diversos sitios únicos de restricción, en el esquema se seíializa únicamente el de Bam Hi (Bacillus amyloliquefacieris id), que corta en la posición 375 . Este sitio de restricción fue utilizado para la inserción del genoma completo del HPVl1.

Los constituyentes básicos del vector son: el origen de replicación del PMB1, que bajo condiciones normales de crecimiento presenta un mínimo de 15 a 20 copias del plásmido; también presenta 2 marcadores genéticos de selección 1) resistencia para ampicilina (ampr)* y 2) resistencia a tetraciclina (tetr) del transposón Tn3 del plásmido pRSF2124 y del pSClOl respectivamente. Para una explicación más detallada de la estructura, incluyendo la secuencia de nucleótidos, y propiedades del plásrnido ver Balbas,P., et al, 1986.

puc19

La estructura de los plásmidos pUC 18 y 19 es la misma, lo único que varia es la orientación del polilinker. Dentro del polilinker se presentan diversos sitios únicos de restricción, entre ellos encontramos a Barn HI en la posición 417 de pUC19. Es en este sitio de restricción donde se insertó el genoma completo de los tipos de HPV 16 y 18. Existen además otros sitios de restricción fuera de esta región. Estos plásmidos presentan un tamaño de 2686 bp.

Los plásmidos pUC carecen del gen rop , que normalmente esta localizado muy cerca del origen de replicación del DNA y está involucrado en el control del número de copias, como resultado, este plásmido se replica muchas más veces, de tal manera que se llegan a encontrar de 500 a 700 copias por célula, a diferencia de otros plásmidos que llevan el origen de replicación de PMBl (Sambrook,1989). Estos vectores expresan el fragmento lac z, que contiene la región promotor- operador y el gen lacZ. PUC contiene el marcador genético de selección amp1 (Yanisch- Perron,l985).*

* Nosoms uolizamos este gen dc resisienaa para ampialuia para poder seleccionar nuestras colonias hansforrnadas.

.

=L

k

t APENDICE B

ESTRUCTURA DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

A la fecha se conocen más de 73 genotipos de HPVs que pueden ser clasificados en tipos de alto, mediano y bajo riesgo de acuerdo con el grado de asociación oncogénica que se presenta con la lesión ( Rangel, et al, 1994), como se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 5: clasificación del virus del Dadoma humano .

1 con lesiones maiignas INTERMEDIO 131,33,35 /Se han encontrado tanto

en malignas como en

Asociadas frecuentemente benignas

con lesiones benignas BAJO 6,11

El genoma viral presenta las siguientes características ( Ver figura 5) : Génova circular de doble cadena Tamaño aproximado de 8000bp Consta de 8 genes ( codificados por la misma cadena ) y una región reguladora:

GENES DE EXPRESION TEMPRANA: El - E2 E2 E4 E5 E6 Y E7 Transformación celular.

Relacionados con la repiicación extracromosomal. involucrado en la activación o represión transcripciond. Asociado a la liberación de partículas Wales. Involucrado, indirectamente, en la transformación celular.

GENES DE EXPRESION TARDIA: L1 y L2 productivas, pero no en células transformadas.

Codifican para proteínas de la cápside; son expresodos en lesiones

REGION REGULADORA LCR o URR ( Long Control y Upstream Regulatory Region).

Tamaño aproximado 1000 bp.

CONTIENE: 1.Secuencias estimuladoras y represoras de la transcripción viral.

2 . h ~ principales elementos &-acting que controlan la transcripción viral. 3.E1 origen de replicación.

(Rangel, et al, 1994; Garcia-Caranca y Garigiio, 1993)

FIG 4. PLASMID0 pBR322-HWll

- -

í E - I <. .

FIG 5: PLASMID0 pUC19-HW 16 y la.

13 4

E2

FIG 6: Esquema reprcscntativo del genoma del virus del papiloma humano t i p 18.

.

4

APENDICE C : METODOLOGUS

PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE CELULAS COMPETENTES

14

Al protocolo de Hanahan 1983 se le han realizado algunas modificaciones:

Todo el procedimiento deberá reaiizarse bafo condicithes de esterilidad.

PIE DE CULTIVO

1.

2. 3.

De un stock de E. coli ( cepa DH5u) tomar directamente una azada y sembrar en una caja petri con medio SOB. Incubar el cultivo a 37°C durante toda la noche. Picar* una colonia, con diámetro de entre 2 y 3 mm , de un cultivo fresco y dispersar las células en 5ml de SOB complementado a 20mM de MgS04 (SOB/MgS04) e incubar a 37°C durante toda la noche con agitación moderada. Utilizar la flama del mechero para esterilrzar el asa de inoculacion y evitar raspar la superúcie del agar.

CULTIVO DE TRABAJO

Inocular 500p 1 del pie de cultivo anterior en un Matraz Erlenmeyer de 250ml que contiene 50mi de SOB JMgS04.

hasta un IWh del vnlUmen del irasco. Una buena regia es utiluar 1 colonia por cada loml de SOB y ufilizar un volumm que comprenda

Incubar el cultivo a 37°C con agitación moderada hasta que se encuentre a media via a través de la fase logaritmica de crecimiento; en esta fase a una D.O.= 0.5 existen aproximadamente 4-9x107 células viables por mililitro.

mantenerlo en hielo durante l0min.

U tiempo de hcubadón se encuentra entre 1 y 1.5 hrs. Colectar el cultivo en un tubo Falcon de 50ml ‘estéril y pre-enfriado”,

Empastillar las células por centrifugación a 3000rpm durante 15min a 4“. Eiiminar el sobrenadante por decantación y/o vacio y las trazas con papel

absorbente. Resuspender la pastiila, con vortex suave, en 1/3 ( 16.66ml) del volúmen del buffer de transformación pre-enfriado ( utilizamos ‘tanto TFB standard como TFB modificado - tíbl-). Incubar en hielo durante l O m i n . Empastiliar las células por centrifugación a 3000rpm durante 15min a 4°C. Eliminar el sobrenadante por decantación y/o vacio y las trazas con papel

absorbente. 10) Resuspender la pastilla en una fracción de volúmen de 1/12.5 ( 4ml ), del

volúmen del cultivo original, de buffer de transformación (TFB standard y con -2 3 TFB modificado -tíb2-). .,

Asi, 2.5 ml de cuitivo son concentrados en 200p 1 de TFi3, que representa la unidad estándar de volumen * de transformación.

1.

‘3

15 I

11) Distribuir el concentrado en alícuotas de 200p 1 en tubos de microcentrífuga

Si las células van a ser utilizadas de inmediato, mantenerlas en hielo y proceder con la transformación del protocolo siguiente.

Eppendorf de 1.5mi.

Si las células se van a almacenar:

12) Congelar de inmediato los tubos con las alícuotas, introduciéndolos en

13) Almacenar en nitrógeno Líquido o a -70°C. nitrógeno líquido o en su defecto alcohol-hielo seco, por varios minutos.

TRANSFORMACION DE LA CEPA DH5a DE E. Coli

El siguiente protocolo fue tomado de Miller, 1992

1) Remover el tubo que contiene las células competentes del congelador o del nitrógeno y colocarlas en hielo hasta que se descongelen y la suspencion celular se vuelva líquida.

2) A 200pi de bacterias competentes se les adiciona la solución del DNA, de 1 a 10 ng en un volúmen no mayor de 20 jd; resuspender suavemente.

3) Incubar en hielo durante 20min, y despues: 4) Dar un SHOCK TERMICO a las células, colocar el tubo en agua a 42°C por 90

seg únicamente. 5) De INMEDIATO, regresar las bacterias al hielo e incubarlas durante 2min. 6) Adicionar 800 pl de medio SOC, agitar suavemente. 7) Incubar durante 45min a 37°C con agitación moderada.

CULTIVO DILUIDO:

8) Tomar 50 pi del cultivo y espatular en cajas con LB-Amp (100 hg/ml).

CULWO CONCENTRADO:

9) Centrifugar el resto de la muestra durante 5min en una microcentrifuga. 10) Desechar el sobrenadante por decantación y resuspender la pastilla en las

trazas del sobrenadante restante. 11) Espatular, utilizando todo el concentrado, en cajas con LB-Amp (100 pg/ml). 12) Incubar las cajas espatuladas a 37°C toda la noche. 13) Revisar las bacterias transformadas (contar el número de colonias por caja),

14) Una vez que se obtuvieron las cajas con bacterias transformadas, se tomar una colonia y volver a sembrar.

almacenan a 4°C.

. . - . ,, ..,,.. , , . .

4 16

PREPARACION EN PEQUEÑA ESCALA DEL DNA PLASMIDICO

Esta minipreparación utiliza el método de lisis alcalina ( Milier,1993; Sambrook, 1989).

PIE DE CULTIVO:

1) De la cepa bacteriana que contiene el plásmido, se pica una colonia y se dispersan las células en 2 d de LB-Amp (100 pg/ml).

2) Incubar durante toda la noche a 37°C con agitación moderada, 3) Tomar 1.5ml de este cultivo saturado en un tubo para microcentrifuga, y

centrifugar 2min a máxima velocidad (e 12.000-14.000 rpm). 4) Eliminar todo el sobrenadante con vacío, procurar eliminar ai maxim0 las

trazas del sobrenadante.

LISIS ALCALINA.

5) Resuspender la pastilla (obtenida en el paso anterior) en 100 pl de la SOL-1 @re-enfriada) por agitación vigorosa en vortex.

6) incubar en hielo 10 min. 7) Adicionar 200 pl de la SOL-I1 (prepara al momento) y mezclar gentilmente por

inversión del tubo. 8) Incubar en hielo durante 10 min. 9) Adicionar 1504 de la SOL-I11 (pre-enfriada) y mezclar gentilmente por

inversión del tubo. 10) Incubar en hielo durante 10 min. 11) Centrifugar 5 min a 4’C en microcentrifuga.

OPCIONAL:

Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentxífuga.

resupender con vortex vigoroso. Centrifugar durante 5 min a 4°C.

Adicionar un volúmen (= 400d ) de feno1:cloroformo:aicohol isoamíiico;

12) Transferir la capa superior del sobrenadante a un tubo nuevo y adicionarle un

13) Centrihgar durante 5 min a 4°C. 14) Recuperar la fase superior acuosa del sobrenadante en un tubo nuevo. 15) Precipitar con etanol:

Adicionar 0.1 volúmen (- 40$ ) de aceiato de sodio 3M a pH5.2 y 2.5 volúmenes (m lOOO$ ) de etanol al 100% a -2O’C. y homogeneizar pOr inversión.

16) Incubar , por lo menos, de 15-3Omin a -70°C para que se precipite el DNA. 17) Centrifugar durante 5 min a 4’C.

volúmen (.: 400d ) de c1oroformo:alcohol isoamílico.

.

17

18) Desechar el sobrenadante. 19) Enjuagar la pastilla, muy gentilmente, con 100 pi de etanol ai 70% @re-

enfriado a -20°C) por pipeteo e inmediatamente después remover el etanol. 20) Secar la pastilia utilizando un SpeedVac por I lmin. 2 1) Resuspender la pastilla en 20-50 pi de TE o H20 ( de ampolleta ) y guardar a -

20°C. 22) Correr en una electroforesis z 0.2 volúmenes de la preparación del plásmido a

través de un gel de agarosa con TBE 1X; para observar la calidad, pureza y cantidad aproximada del plásmido o bien cuantificar en el espectrofotómetro.

DIGESTION CON LA ENDONUCLEASA (Barn HI)

La digestión se realizó utilizando la endonucleasa de restricción Bam HI (Biolabs). Protocolo tomado de Brown, 1993 y Sambrook,1989.

Mezcla de reacción de 15pi :

1. Incubar durante 1-2hrs a 37°C. 2. Anaiizar los fragmentos de DNA producto de la digestión, por electroforesis en

En este caso, se resolvieron 3 pi del producto de la digestión en un gel de gel de agarosa:

agarosa al 1% con TBE 1 X .

El producto de la digestión se resolverá junto con el marcador de peso molecular adecuado ( Lambda Hind m).

c

L

a

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (DNA THERMAL CYCLER PERKIN ELMER CETUS MOD-9600)

Condiciones de PCR para la región L1 con los primers LlCl/LlC2 ( 5. CGTAAACGTTTICCCTATTTT'MT 3' ; 5' TACCC"AAATACTCTGTA?TG 3', respectivamente). El producto comprende un tamaílo de entre 244 a 256 bp entre los diversos tipos Wales de papiioma humano.

Mezcla de reacción de 25 pl con 73 ng de DNA blanco ( El kit de amplificación que se utiliza es de PERKiN ELMER) :

MgClz 50.0mM 0.75 15pM L l C l 50 ng/d 0.5 l.Ong/jd L1C2 50 ng/pl 0.5 l.Ong/pl Taq Polimerasa 5u/N 0.1252 0 . 6 2 5 ~ H703 Morara 22111 17.25 Taq Polimerasa 0 . 6 2 5 ~

_ _ ~ ~. ~ ~~ ~ - DNA blanco I25 ng/pl 13.0 I3.0ng0i1 TOTAL: 125pl 1: Este volúmen (,,I) esta en función de un tubo o muestra, habra que ajustar el volúmen para el numero de mucStraS de cada ensayo. 2: Dado que el volúmen que se adiciona de la e h a es muy pequeño, para hies pra&cos, en la me& general no altera las concentraciones de los demas componentes, por lo tanto no induimos su volúmen en el cálculo general. 3: El agua que se uolua deberá ser de ampolleta o bidestilada, estcril y dcsionizada.

PROCEDRdiENTO:

1. Sacar del congelador (-20°C) los reactivos antes mencionados y colocarlos en welo hasta que se descongelen. La enzima no deberá ser retirada del congelador, cuando se utilice, entonces se tomara la cantidad adecuada y se adicionara a la mezcla general.

2. Rotular los tubos EppendorfT para PCR (0.5mi) según el número de muestras. Rotular un Eppendorf de 1.5 mi para la mezcla general cuando el número de muestras sea muy grande, de tal manera que el volúmen final exceda los 400p1.

MEZCLA GENERAL: En el área y con el equipo exclusivo de PCR.

3. Adicionar ai tubo indicado los siguientes reactivos: Buffer PCR dNTPs MgC12 H20

Cuando se adiciona cada componente hay que asegurame de homogeneizar pcrlectamente la mezcla, por pipctco suave, asegurándose de no formar burbujas.

4. Adicionar la enzima, homogeneizar suavemente y a continuación dar un spin hgero, en microcentrifuga a 4"C, para recuperar toda la mezcla general .

19 I

5. Repartir en cada uno de los tubos rotulados, para cada una de las muestras, 27 pl de la mezcla general.

FUERA DEL AREA DE PCR.

6. Adicionar el volúmen correspondiente, según los d c u l o s , de DNA blanco.

7. Adicionar 50 pl de aceite mineral (grado biología molecular) a cada tubo y darle

8. Colocar los tubos en el termociclador con el siguiente PERFIL TERMICO:

Homogeneizar suavemente; evitar la formación de burbujas.

un spin en microcentrifuga a 4°C.

PERFIL TERMICO:

I 95 120 I

94 15 48 30 40 72 60

72 600

Una vez realizado el PCR, se toman 2 pl del producto y se resuelven por electroforesis en gel de agarosa ai 1.5% en TBE 1X.

t

1

a

.

.. APENDICE D

REACTWOS Y SOLUCIONES

i, .<.. I

20

Medio LB: Para un litro adicionar: -bacto triptona 10 g -bacto yeast extract 5 g -NaCl 10 I3 Aforar con HzO y disolver perfectamente y esterilizar en autoclave.

Ampicilina :

Se prepara una solución stock ( 50mg/d) , esterilizada por filtración y se adiciona ai medio 'estéril" inmediatamente antes de ser utilizado.

Ma01 :

Preparar una solución stock 1 M, autoclavear y adicionar a el medio 'estéril" antes de utilizarse.

Medio SOB ( 1L): A 950ml de HzO desionizada adicionar:

W bacto yeast extract 5.0g NaCl 0.5g

Disolver perfectamente y adicionar l O d de KCl250mM. Ajustar el pH a 7.0 con NaOH 5 N . Acorar. Esterilizar en autoclave 20min a 15 lb/in en ciclo liquido: Justo antes de usarse: Adicionar 5 d de MgClz 2M y homogeneizar Perfectamente.

Medio 8OC :

B bacto-triptona 20.0g

Medio SOB con 20mM de glucosa. Preparar un stock de glucosa 2M. Esterilizada por filtración. Adicionar justo antes de utilizar y almacenar a 25°C.

BufTer TE -Tns.HCl 1 OmM -EDTA (PH 8.0) 1mM El pH de el Tris-HC1 determina el pH del buffer TE.

Buffer TBE 5 X

Tris base 50.0 g Ac. Bórico 27.5 g

HzO aforaraun LITRO. La solución de trabajo para geles de agarosa es TBE 0.5 o 1.X.

EDTA 0.5 M @H 8.0) 20.0 ml

,i ... < ,

21

Buffer TFB:

MES @H 6.3) MnCl CaC12 KC1 Cloruro de hexaminocobalto

Buffer TFB modincado:

tm 1:

KCH3COO 30mM RbClz lOOmM CaCh 50mM Glicerol 15 %

lOmM 45mM lOmM

lOOmM 3mM

HzO Morara 150 ml Ajustar el pH a 5.8 con ac. Acético 0.2N y esterilizar por filtración , almacenar a 4°C.

Tm 2:

Pipes ( tambien se puede utilizar MOPS] CaC12 75mM RbClz 1 OmM Glicerol 15 % Hz0 Aíorara 200 ml Ajustar el pH a 6.5 con KOH. Esterilizar por fdtración y almacenar a 4°C

lOmM

SOLI : Glucosa 50mM Tris. C1 @H 8.0 ) 25mM EDTA @H 8.0 ) lOmM La solución I puede ser preparada en alicuotas de 100 ml, esterilizar en autoclave en ciclo liquido y almacenar a 4°C.

SOL II : NaOH ( sol. Fresca diiuída de un stock ION) SDS 1 Ya Adicionar los componentes en un tubo, mezclar gentilmente por inversión y almacenar el tubo en hielo.

SOL m : CH3COOK 5M 60.oml CHJCOOH glacial 11.5ml Hz0 28.2d

La solución queda a una concentración 3 M con respecto al potasio y 5 M

0.2N

cnn respecto ai acetato. .

LL I

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