koneman

CAPTULO

Introduccin a la microbiologaParte I: El papel del laboratorio de microbiologa en el diagnstico de las enfermedades infecciosas: gua para la prctica y el tratamientoIntroduccinLineamientos del libro El mundo de las enfermedades infecciosas

1

Fases del ciclo diagnsticoFase preanalticaRecoleccin de la muestra Transporte de la muestra Recepcin de la muestra y observaciones preliminares Criterios para el rechazo de las muestras Relacin costo-eficacia en la fase preanaltica

La trada de las enfermedades infecciosasEl agente infecciosoClases de agentes infecciosos Interacciones entre huspedes y agentes infecciosos Funcin de los agentes infecciosos en la naturaleza Virulencia

Fase analticaExamen microscpico Procesamiento de las muestras Interpretacin de los cultivos Procedimientos para la identificacin preliminar de las bacterias aisladas Identificacin de microorganismos diferentes de las bacterias Antibiograma Relacin costo-eficacia en la fase analtica

El ambiente El husped infectadoDefensa humoral innata (no celular) Defensa celular innata Tipos de inflamacin Defensa celular inmunitaria adaptativa Defensa no celular inmunitaria adaptativa (humoral) Signos y sntomas clnicos de infeccin Efectos indirectos de los agentes infecciosos en seres humanos

Fase posanalticaInforme de los resultados Interaccin con los epidemilogos Anlisis de los resultados Conservacin de las muestras y de los registros

1

2 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte I

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiologaRegulacin estatal Gestin de riesgos Seguridad del laboratorioNormas y reglamentaciones generales de seguridad Precauciones habituales de seguridad Agentes biolgicos Precauciones universales

Envo de muestras y de agentes etiolgicos Peligros no biolgicos

Bioterrorismo Aseguramiento de la calidad Control de calidadComponentes de un programa de control de calidad Control de los aparatos del laboratorio Control de los medios de cultivo, reactivos e insumos

IntroduccinLineamientos del libro

Hay casi tantas formas de observar el mundo de las enfermedades infecciosas como cantidad de agentes que las provocan. En este libro nos centraremos en la deteccin e identificacin de los agentes infecciosos en el laboratorio clnico, seguido de la determinacin de la sensibilidad a los antibiticos cuando corresponda. Desde el punto de vista conceptual, el libro se divide en tres secciones. Los primeros dos captulos cubren los principios generales de las enfermedades infecciosas y el laboratorio diagnstico. En la segunda seccin, se presentan las tcnicas inmunolgicas y moleculares que tienen aplicacin casi universal. Por ltimo, la tercera y ms amplia seccin es un extenso anlisis de los grupos de agentes infecciosos y las enfermedades que generan. En un captulo separado se explican los principios generales de la bacteriologa debido a la diversidad de los organismos en este gran grupo de patgenos humanos.El mundo de las enfermedades infecciosas

tanto agentes infecciosos como depredadores; por ejemplo, los artrpodos. Tampoco pudieron vislumbrar las consecuencias negativas inesperadas de los principales avances mdicos que prolongan la vida, a veces con efectos devastadores sobre los mecanismos de defensa del husped. Lejos estuvieron tambin de apreciar los efectos de la incursin humana en el medioambiente o las consecuencias de los desplazamientos irrestrictos de plantas y animales, incluidos los seres humanos, alrededor del mundo. Como resultado, la lista de nuevas enfermedades infecciosas o de enfermedades reactivadas que han resultado una plaga para la humanidad a partir de aquellas predicciones errneas es larga y sigue creciendo. En el cuadro 1-1 se presenta una enumeracin parcial.

La trada de las enfermedades infecciosasPara entender las enfermedades infecciosas el estudiante debe considerar las interacciones entre las tres partes que intervienen: 1. El husped infectado. Este husped ser casi siempre un ser humano, en nuestra perspectiva antropocntrica. Los veterinarios se ocuparn de los huspedes animales, mientras que un botnico se ocupar de las plantas. El husped infectado puede, incluso, ser un agente infeccioso. 2. Un agente infeccioso. Esta designacin es la descripcin ms amplia para diversas formas de vida que interactan ntimamente con otras. 3. El ambiente. El ambiente natural, inanimado y animado, es esencial para el mantenimiento de la mayora de los agentes infecciosos y para su transmisin de un husped a otro. Una entretenida y muy educativa visin de estas relaciones que merece la pena leer ha sido presentada por E. W. Koneman,54 en El otro extremo del microscopio: las bacterias cuentan su historia, donde el autor hace un relato fantstico sobre una asamblea de bacterias que se reunieron para exponer sus quejas respecto del giro que los seres humanos impusieron a sus relaciones y pone patas arriba nuestra visin tradicional del mundo. Cedric Mims, el distinguido microbilogo britnico, prepar un relato ms tradicional, tambin muy interesante, sobre la

Durante la mayor parte de la existencia de la humanidad, las enfermedades infecciosas han sido la causa predominante de enfermedad y de muerte, que no slo han restringido el bienestar de las personas sino que, adems, han cercenado la prosperidad social. Recin en el siglo XX las mejoras en las condiciones de vida, la sanidad y las intervenciones mdicas lograron que las sociedades desarrolladas emergieran de la devastacin provocada por las enfermedades infecciosas. Lamentablemente, los beneficiarios de estos progresos se concentraron en los pases ms ricos. El desafo para la comunidad mundial es hacer extensivos estos logros a todo el gnero humano. Hacia la dcada de 1950, los avances de la medicina moderna y de la salud pblica parecan tan impresionantes que muchos cientficos prominentes se vieron impulsados a predecir el control de las enfermedades infecciosas y la erradicacin de plagas como causas de miseria en toda la Tierra. William H. Stewart, un cirujano general de los Estados Unidos, afirm en 1969: Es tiempo de concluir el captulo de las enfermedades infecciosas. Es lamentable que muchos hombres sabios subestimaran la capacidad de adaptacin de las diversas y numerosas formas de vida que comparten el planeta con nosotros,

La trada de las enfermedades infecciosas 3

Cuadro 1-1 Enfermedades infecciosas recin reconocidas y patgenos identificados desde la conquista de las enfermedadesinfecciosas*AO 1977 Virus bola Especies de Legionella Virus Hantann Campylobacter jejuni 1982 Escherichia coli 0157 (productora de verotoxina) Borrelia burgdorferi 1983 Helicobacter pylori Virus de la inmunodeficiencia humana 1989 1991 Virus de la hepatitis C Ehrlichia chaffeensis Virus Guanarito 1993 Virus Sin nombre Bartonella henselae 1994 Herpesvirus humano 8 Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum 1995 1996 1997 1999 Virus Hendra Lyssavirus australiano Virus influenza H5N1 Virus Nipha Virus influenza H9N2 2001 2003 Metapneumovirus humano Coronavirus del SARS AGENTE ENFERMEDADES Fiebre hemorrgica del bola Enfermedad de los legionarios Fiebre hemorrgica con sntomas renales Gastroenteritis Colitis hemorrgica; sndrome urmico hemoltico Enfermedad de Lyme lcera gstrica/duodenal Sndrome de inmunodeficiencia adquirida Hepatitis no A, no B Ehrlichiosis monoctica humana Fiebre hemorrgica venezolana Sndrome pulmonar por hantavirus Enfermedad del araazo de gato; angiomatosis bacilar Sarcoma de Kaposi Anaplasmosis (ehrlichiosis) granuloctica humana Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis Rabia humana Gripe aviar en seres humanos Enfermedad respiratoria; meningoencefalitis Nueva variante de la gripe aviar en seres humanos Enfermedad respiratoria Sndrome respiratorio agudo grave

* Con las contribuciones de Joseph McDade.

dilucidacin de las complejas interconexiones entre los seres humanos y los agentes infecciosos. Esta obra ha sido actualizada por sus colegas y es un excelente modo de explorar el fascinante tema de la patogenia.69El agente infeccioso CLASES DE AGENTES INFECCIOSOS

Los agentes infecciosos pueden dividirse en un nmero finito de tipos. La mayora de ellos viven en forma libre, contienen todo lo necesario para el mantenimiento de su especie y son conocidos como microbios. Los agentes infecciosos tradicionales son las bacterias, los hongos, los parsitos y los virus. 1. Las bacterias comprenden el mayor nmero de especies patgenas para los seres humanos. Son organismos unicelulares y contienen DNA y RNA, pero no estn diferenciadas en ncleo y citoplasma; se reproducen por fisin binaria. Existen unas pocas familias de bacterias que carecen de algunas estructuras necesarias para la replicacin y deben interactuar con la clula del husped para reproducirse, las ms sobresalientes son Rickettsiaceae, Anaplasmataceae y Chlamydiaceae. 2. Los hongos son agentes unicelulares o multicelulares que presentan un ncleo y un citoplasma definidos. Las levadu-

ras son hongos unicelulares que se reproducen por fisin binaria. Los mohos u hongos filamentosos son organismos multicelulares ms complejos que se reproducen en forma sexuada y asexuada. Algunos hongos tienen fases levaduriforme filamentosa y se denominan hongos dismrficos. 3. Los parsitos son un grupo grande y complejo de microbios. Entre ellos se incluyen los animales unicelulares, como los protozoos, y los organismos multicelulares muy complejos que tienen rganos y tejidos bien definidos, como el tracto gastrointestinal y los sistemas genitales. Algunos de estos parsitos son, en efecto, pequeos animales. Otros, por lo general los protozoos, carecen de las estructuras necesarias para una reproduccin independiente y deben obtener del husped las sustancias que necesitan. 4. Los virus comprenden un gran nmero de agentes infecciosos que, hablando estrictamente, no son microbios porque carecen del equipamiento gentico completo para su propia propagacin. Salvo raras excepciones contienen DNA o RNA, pero no ambos. Por lo tanto, deben infectar otra forma de vida, como seres humanos, animales, plantas, bacterias e incluso, otros virus. Representan la forma ms simple de un agente infeccioso. Los microbios se reproducen por multiplicacin; despus de la divisin de su material gentico se dividen en dos formas nuevas idnticas. Por el contrario, los virus se reproducen por replicacin, hacen copias de sus ci-

4 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte I dos nucleicos, luego de lo cual los nuevos genomas se empaquetan en forma individual dentro de los lmites de la clula infectada. Adems de los agentes infecciosos tradicionales, miembros ms evolucionados del reino animal, como los insectos, pueden considerarse una forma de parsitos si su existencia est relacionada en forma ntima con un husped. En el otro extremo, los priones, completamente no convencionales, no contienen cidos nucleicos y, por consiguiente, no pueden replicarse de acuerdo con las leyes establecidas de la naturaleza. No obstante, su estructura proteica anormal deriva en un proceso similar a una infeccin con un ciclo de replicacin.INTERACCIONES ENTRE HUSPEDES Y AGENTES INFECCIOSOS

ten en forma extracelular y pueden crecer in vitro en ausencia de clulas. Los microbios intracelulares facultativos pueden crecer in vitro en ausencia de clulas; in vivo crecen en forma intracelular o extracelular, pero a menudo tienen una relacin especial con los macrfagos. Los agentes infecciosos intracelulares estrictos carecen de algunas estructuras necesarias para una vida extracelular; por eso requieren una clula husped que les suministre los elementos requeridos. Estas relaciones se resumen en el cuadro 1-2.FUNCIN DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN LA NATURALEZA

Si un agente infeccioso y su husped coexisten y ninguno de ellos se beneficia o se perjudica, el proceso se denomina comensalismo y el agente, comensal. Si el agente infeccioso obtiene un beneficio de su husped, pero no le causa dao, el agente infeccioso se denomina saprfito. Si el agente infeccioso y el husped obtienen un beneficio del encuentro, el proceso se denomina simbiosis o mutualismo. Por otro lado, si el husped es daado por el agente infeccioso con beneficio de este ltimo el proceso se denomina parasitismo y el agente infeccioso, parsito (un uso general de la palabra ms all de la clase de los agentes infecciosos conocidos como parsitos). Todos los tipos de agentes infecciosos pueden ser parsitos. Cuando los microorganismos viven en la superficie externa (piel o cabello) o interna (vas respiratorias altas y tubo digestivo) del cuerpo, se describen como flora colonizante. La relacin entre la flora colonizante y el husped puede ser comensal, saprfita o parsita. Incluso, puede cambiar de un momento a otro si se altera la virulencia del microbio o disminuye la capacidad de resistencia del husped a la infeccin. Un microorganismo capaz de ocasionar infecciones se denomina patgeno. Si el microbio produce enfermedad en forma ocasional, es un patgeno potencial. Un patgeno potencial se describe como un agente oportunista si produce infecciones slo en las personas que tienen comprometidos los mecanismos de defensa. Los agentes infecciosos tambin establecen numerosos tipos de relaciones con sus huspedes a nivel celular. Los microbios de vida libre (algunas bacterias, los hongos y los parsitos) exis-

Aunque las vctimas de los efectos nocivos de los agentes infecciosos tengan una visin diferente, stos no tienen la funcin de hacer penosa la vida de los seres humanos. Las bacterias son carnvoras y un componente esencial en la degradacin de los tejidos muertos. Adems, desempean un papel principal en muchas reacciones qumicas en la naturaleza y han sido utilizadas para tareas tan desagradables como la descontaminacin de los derrames txicos. Por el contrario, los hongos son vegetarianos. Cumplen una funcin principal en la eliminacin de la vegetacin en descomposicin. Nadie a quien le guste el pan, la cerveza, el vino o el queso necesita que le recuerden la importancia de las levaduras en nuestra sociedad. Y, por supuesto, los hongos superiores sirven como fuente de alimento, desde los championes hasta las trufas.VIRULENCIA

La virulencia es la suma de las caractersticas que le dan al agente infeccioso una ventaja en la batalla contra sus huspedes elegidos (o vctimas). No es un fenmeno de todo o nada; existen grados muy variables de virulencia. La mayora de los anlisis sobre la virulencia se centran en los factores microbianos, pero, en realidad, lo ms importante es el balance entre los tres miembros de la trada.11 El organismo ms virulento no causar enfermedad si no tiene acceso a un husped vulnerable debido a una de estas dos razones: 1. El organismo existe en un compartimento ambiental diferente del husped potencial. Despus de que se interrumpi el ciclo del virus de la fiebre amarilla en los mosquitos urbanos, la transmisin de la enfermedad se detuvo hasta que los

Cuadro 1-2 Relaciones entre los agentes infecciosos y sus huspedes a nivel celularRELACIN Independencia AGENTES INFECCIOSOS La mayora de las bacterias, hongos y parsitos EJEMPLOS Staphylococcus, Enterobacteriaceae, Candida, Aspergillus, protozoos, helmintos Legionella, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, hongos dismrficos Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma; Toxoplasma gondii; virus influenza

Intracelulares facultativos

Ciertas bacterias, micobacterias, ciertos hongos Ciertas bacterias, hongos y protozoos; virus

Intracelular estricto


seres humanos ingresaron en un ciclo de fiebre amarilla, hasta entonces desconocido, con especies de mosquitos que vivan en la selva. 2. Todos los huspedes disponibles han desarrollado una inmunidad protectora. Por ejemplo, muchas infecciones virales que generan inmunidad protectora, como la del virus del sarampin, se consumen luego de que todas las personas susceptibles han sido infectadas. Slo despus de que crezca una nueva generacin de individuos no infectados, y por lo tanto vulnerables, puede ocurrir una nueva epidemia. Por el contrario, un organismo que no causa enfermedad o que lo hace slo en forma leve en personas inmunocompetentes (esencialmente de baja virulencia) puede provocar una enfermedad devastadora en alguien cuyo sistema inmunitario est comprometido. Se podra argumentar que los agentes infecciosos ms exitosos son los que tienen las mejores estrategias de supervivencia, que incluyen una virulencia mnima o ausente. Sobre todo para los patgenos intracelulares estrictos, un agente que destruya rpidamente a su husped pronto quedar excluido. Como ejemplo, se ha establecido una hiptesis acerca de que el virus de Epstein-Barr est diseado para permanecer en los linfocitos de memoria y ha desarrollado estrategias para reducir los efectos negativos sobre su husped.113 Sin embargo, un organismo puede ser virulento para su husped humano, pero sobrevivir porque tiene una relacin permisiva con otros huspedes. En otras palabras, los seres

humanos pueden infectarse en forma letal, pero otros huspedes vertebrados pueden no enfermarse o hacerlo slo de manera leve. La virulencia puede ser el resultado de factores que virtualmente operan en cualquier etapa del proceso infeccioso. Si se piensa en trminos ms amplios, la virulencia debe incluir caractersticas ms all de las que propician el desarrollo de la enfermedad en un husped infectado. En el cuadro 1-3 se resumen algunos ejemplos. Los lectores que deseen informacin ms detallada pueden encontrar referencias excelentes.36,41,53,55,62,100,101El ambiente

El espectro de huspedes de algunos agentes infecciosos se limita a los seres humanos. El mantenimiento de estos organismos requiere el acceso a un nuevo husped vulnerable y la capacidad de sobrevivir durante la transferencia. Por lo tanto, los factores ambientales son relativamente de poca importancia. No obstante, la mayora de los agentes infecciosos tienen una fase en la cual viven libres en el medioambiente, infectan huspedes no humanos o pasan a travs de un vector, casi siempre un artrpodo, entre varios huspedes vertebrados. Algunas de estas interacciones pueden ser extremadamente complejas, con mltiples transferencias a travs de diferentes fases del ambiente; por ejemplo, los numerosos estadios de desarrollo de un parsito en una serie de huspedes animales. El ambiente es el vnculo entre el agente infeccioso y el husped final. La transferencia a un nuevo husped requiere

Cuadro 1-3 Factores de virulencia seleccionadosCATEGORA Supervivencia en el medioambiente FACTOR DE VIRULENCIA Replicacin intracelular en amebas de vida libre Resistencia a la desecacin Transferencia/transmisin eficaz Formas mviles que pueden buscar un husped sensible Adaptacin a un vector que puede transmitir la infeccin Evasin de las defensas del husped Lisis de clulas polimorfonucleares inflamatorias Destruccin de tejidos Destruccin de tejidos Destruccin de linfocitos Modulacin antignica para subvertir la inmunidad humoral (anticuerpos) Localizacin intracelular en macrfagos Confinamiento en un sitio inaccesible Resistencia a los antibiticos Localizacin intracelular en neuronas de los ganglios espinales Resistencia a los desinfectantes Resistencia a los fijadores Resistencia a los agentes antiinfecciosos Resistencia a los agentes antivirales Especies de Legionella Virus de la viruela Cercaria de esquistosoma Rickettsia rickettsii en las garrapatas Leucocidinas de Streptococcus pyogenes Proteasas de Pseudomonas aeruginosa Invasin de los vasos sanguneos por Aspergillus fumigatus Virus de la inmunodeficiencia humana Deriva y cambio antignico del virus influenza; variacin antignica de Borrelia recurrentis o de Trypanosoma brucei Mycobacterium tuberculosis Virus varicela-zster o virus del herpes simple Pseudomonas aeruginosa y antispticos Priones y formaldehdo Staphylococcus aureus y meticilina Virus de la inmunodeficiencia humana; citomegalovirus EJEMPLO


Cuadro 1-4 Vas de transmisin y puertas de entrada comunes de los agentes infecciososFUENTE DEL AGENTE Ser humano infectado Ser humano infectado Ser humano infectado Ser humano infectado o paciente Ser humano infectado Ambiente contaminado Ambiente contaminado Animal infectado Garrapata infectada Paciente Paciente Paciente Aerosoles Contacto directo Relaciones sexuales Secreciones orales o nasofarngeas hacia el ojo Transfusin de productos de la sangre Alimentos o agua Acondicionadores de aire Mordeduras de animales Picadura de garrapatas Aspiracin de la flora endgena Diseminacin de la flora intestinal a travs de la pared intestinal daada Migracin de las bacterias desde la orofaringe hacia el odo medio a travs de la trompa de Eustaquio MECANISMO DE ENTRADA PUERTA DE ENTRADA Respiratoria Cutnea Genital Ocular Intravascular Gastrointestinal Respiratoria Cutnea Cutnea Respiratoria Gastrointestinal Odo EJEMPLO Virus influenza Virus del herpes simple en los luchadores Sfilis; gonorrea Conjuntivitis bacteriana o viral Virus de la hepatitis Patgenos entricos bacterianos y virales Enfermedad de los legionarios Rabia Enfermedad de Lyme Neumona bacteriana Peritonitis bacteriana Otitis media bacteriana

una puerta de entrada. En el cuadro 1-4 se resumen las vas de transmisin y las puertas de entrada ms comunes. En el recuadro 1-1 se definen algunos de los trminos utilizados para describir enfermedades infecciosas en la poblacin.El husped infectado

Una vez que un individuo ha sido infectado, se producen diversas respuestas en el husped. La respuesta puede ser localizada en el sitio de la infeccin o generalizada (sistmica). La reaccin local a la infeccin toma la forma de inflamacin. Inflamacin es un trmino general que hace referencia a la

Recuadro 1-1 Categoras de las enfermedades infecciosasEnfermedad transmisible: afeccin que un individuo puede adquirir de una fuente externa, animada o inanimada Enfermedad contagiosa: afeccin que puede ser transmitida de un paciente a otro Infeccin iatrognica: infeccin que se produce como consecuencia de la intervencin mdica Enfermedad infecciosa: afeccin causada por un agente externo que se replica o multiplica Infeccin intrahospitalaria: infeccin que se adquiere en un centro de salud Infeccin oportunista: infeccin en un paciente con las defensas comprometidas causada por un agente de baja virulencia que no producira infeccin en una persona sana Infeccin subclnica: infeccin que produce respuesta inmunitaria pero no sntomas clnicos (tambin llamada infeccin asintomtica)

alteracin anormal de los tejidos u rganos causada por el dao o la destruccin del tejido. La inflamacin tiene componentes inmunitarios y no inmunitarios. En cada caso, la defensa puede ser celular o no celular (humoral). El sufijo -itis se utiliza para indicar inflamacin; cuando se lo asocia con un sitio anatmico, describe un proceso de enfermedad. Por ejemplo, la apendicitis es un proceso inflamatorio que afecta el apndice, mientras que la hepatitis es la inflamacin del hgado y la endocarditis es la inflamacin del endocardio (el revestimiento de las cmaras del corazn). La inmunidad innata y la inmunidad adaptativa son los dos brazos principales de la respuesta inmunitaria.104,27,28,63 La respuesta innata es la ms primitiva de ambas. Proporciona una respuesta inmediata contra los microbios invasores, sin tener en cuenta su carcter inmunitario. Los receptores que hacen contacto entre el invasor y la clula defensora son compuestos denominados lectinas que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. La respuesta innata est limitada por la falta de un sistema de amplificacin de defensas especficas. En su lugar, las defensas innatas envan seales que activan el segundo brazo: la inmunidad adaptativa. Para utilizar una analoga militar, la respuesta inmunitaria innata es comparable con una patrulla de frontera con poca dotacin de armamentos que enva seales a los rangos superiores del ejrcito regular cuando detecta que un invasor ha cruzado los lmites nacionales. La respuesta inmunitaria adaptativa es inmunolgicamente especfica. Responde a componentes que detecta como no propios o extraos mediante la multiplicacin del nmero de defensores con armas especficas dirigidas contra un determinado enemigo. Es decir, se adapta para combatir contra una amenaza muy definida, en vez de reaccionar en forma universal a todas las amenazas. Una vez que se activ, la respuesta inmunitaria adaptativa sirve como misin de control para el resto de la campaa hasta la victoria, la derrota u, ocasionalmente, un empate.


DEFENSA HUMORAL INNATA (NO CELULAR)

La defensa ms bsica en esta categora es el muco que reviste todas las superficies mucosas (p. ej., el muco gstrico o la sustancia tensioactiva [surfactante] que reviste la membrana pulmonar) y los lquidos que barren los potenciales patgenos hacia afuera (p. ej., el flujo del lquido biliar, las lgrimas y la orina). Adems, ciertos compuestos antibacterianos, como la lisozima, pueden ayudar a disminuirle el nmero de bacterias. Por ltimo, algunas defensas primitivas o preinmunitarias desempean un papel importante en la defensa del husped. Estos compuestos se denominan en forma general reactantes de fase aguda.36 El primero que se identific, en 1930, fue la protena C reactiva, que reaccionaba con el polisacrido del neumococo C. La va alternativa del sistema del complemento es una defensa temprana contra algunas infecciones bacterianas antes de que se desarrollen los anticuerpos especficos. Finalmente, las defensas celulares innatas producen diversos moduladores inflamatorios entre los que se encuentran los quimioatractantes para otras clulas inflamatorias. Estos compuestos son el medio por el cual una clula se comunica con otra y se denominan citocinas (a veces mencionadas como quimiocinas o linfocinas).25 La primera citocina que se descubri (interleucina 1 o IL-1), el principal mediador responsable para la respuesta febril, es sintetizada por los monocitos y los macrfagos.30 Como se describe ms adelante, las citocinas tambin cumplen una funcin preponderante en la respuesta inmunitaria adaptativa.DEFENSA CELULAR INNATA

Las clulas primarias no inmunitarias son los macrfagos fijados a los tejidos (histiocitos), sus contrapartes circulantes (monocitos) y los neutrfilos polimorfonucleares. Los macrfagos de tejido son las defensas primarias contra algunos agentes infecciosos invasores. Por ejemplo, los macrfagos alveolares son muy efectivos para desechar las bacterias invasoras; mientras que los organismos que pueden sobrevivir en los macrfagos (p. ej., micobacterias o especies de Legionella) tienen una ventaja competitiva. Los macrfagos tisulares del hgado, el bazo y los ganglios forman el sistema reticuloendotelial; son crticos para la eliminacin de partculas circulantes, como los agentes infecciosos de la sangre. Los pacientes a quienes se les ha eliminado el bazo o cuyo hgado est daado tienen un mayor riesgo de contraer infecciones bacterianas serias. Una segunda defensa celular es un sistema efector constituido por las clulas natural killer (NK). Este sistema es activo principalmente contra los microorganismos. Por ltimo, pero no menos importante, las barreras fsicas de la piel, el aparato respiratorio, el tubo digestivo y el aparato genitourinario tienen un importante papel en la resistencia a las infecciones. Las terribles consecuencias de los procesos infecciosos en las heridas por quemaduras son el testimonio de la eficacia de la piel. La barrera fsica del aparato respiratorio se complementa con la accin de los cilios ubicados en su superficie que eliminan de l los materiales extraos. Esta defensa en forma conjunta con el revestimiento no celular se denomina escalador mucociliar.TIPOS DE INFLAMACIN121 Inflamacin aguda supurativa (o purulenta). Una infeccin aguda

supurativa evoca una respuesta en la cual se forma pus. El pus

es un material lquido que contiene gran nmero de clulas inflamatorias y que tiene una densidad que excede 1,013. La clulas combatientes iniciales y dominantes son los neutrfilos polimorfonucleares.61 Luego, los macrfagos ingresan en el rea para ayudar en la limpieza de los desechos y los fibroblastos pueden activarse en el proceso de cicatrizacin (fibrosis o tejido cicatrizal). El trmino celulitis se utiliza a menudo para describir la afectacin del tejido conectivo subcutneo laxo en el cual se dispersa el exudado purulento entre las capas del tejido involucrado. Necrosis hace referencia a la muerte celular o a la disolucin del tejido, la cual puede ser ocasionada por la accin de enzimas destructivas o por la restriccin de nutrientes en ese sitio, debido casi siempre al bloqueo del flujo sanguneo. Absceso es el trmino que se utiliza cuando los neutrfilos segmentados se ubican en un rea no delimitada de inflamacin supurativa, con la resultante destruccin del tejido. La inflamacin purulenta es un marcador de las infecciones causadas por las bacterias y algunos hongos, aunque ciertos virus y parsitos tambin pueden provocar una respuesta inflamatoria supurativa o aguda. Sin embargo, los abscesos son casi exclusivamente causados por bacterias y algunas levaduras. La respuesta inmunitaria humoral suele ser importante en las infecciones supurativas. Inflamacin granulomatosa. La infeccin granulomatosa es un subtipo de infeccin crnica en la cual se forman granulomas. Un granuloma puede definirse como la concentracin focal de macrfagos o histiocitos grandes activados que tienen una capacidad aumentada de fagocitosis y digestin de partculas extraas. Estas clulas tambin se denominan epitelioides porque en ocasiones se alinean de manera que se asemejan a las clulas epiteliales escamosas. Los macrfagos suelen agregarse para formar clulas gigantes multinucleadas. Otros componentes celulares del granuloma son los linfocitos y los fibroblastos. La activacin de los macrfagos se produce por medio de los productos de los linfocitos inmunolgicamente especficos. Ciertos granulomas contienen un tipo particular de necrosis, la necrosis caseosa, en la cual el tejido tiene una consistencia similar al queso. (Cabe destacar cun a menudo los patlogos han utilizado las analogas con los alimentos para describir los procesos de las enfermedades). La presencia de clulas gigantes multinucleadas y la necrosis caseosa son caractersticas de la tuberculosis, pero tambin pueden verse en otras infecciones, sobre todo en las provocadas por hongos dismrficos. Si el granuloma es slido y las clulas estn intactas, se lo describe como no necrosante o no caseoso. Los granulomas se encuentran en las infecciones por micobacterias y hongos y en algunas infecciones bacterianas y parasitarias. El correlato inmunitario de los granulomas es la inmunidad mediada por clulas. Inflamacin linfohistioctica. Algunas infecciones, en especial las causadas por virus, desencadenan una respuesta inflamatoria compuesta por linfocitos y macrfagos. Estn involucradas las respuestas inmunitarias humoral y celular. Inflamacin atpica. Las reacciones alrgicas estn mediadas por un grupo diferente de clulas: los eosinfilos, los basfilos y los mastocitos (basfilos fijados a los tejidos). El alergeno estimulante puede ser qumico, como la hierba y el polen, que afectan a las personas alrgicas durante los diferentes perodos estacionales.52 Ciertos patgenos, sobre todo los parsitos, desencadenan una respuesta inflamatoria mediada por los eosinfilos.

8 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte IDEFENSA CELULAR INMUNITARIA ADAPTATIVA

La estacin central de las defensas inmunitarias es el linfocito, del cual existen dos clases principales. Los linfocitos B y las clulas plasmticas son responsables de producir anticuerpos inmunolgicamente especficos y componen el sistema inmunitario humoral. Sin embargo, el intimidador del sistema inmunitario es el linfocito T, que conforma la inmunidad celular. Los linfocitos T se dividen en 1) linfocitos helper (fenotipo CD4), responsables de la memoria inmunitaria y de la secrecin de las citocinas que modulan la respuesta inmunitaria, y 2) los linfocitos supresores (fenotipo CD8), que son citotxicos y responsables de la eliminacin del material celular extrao (p. ej., las clulas infectadas por virus). Los linfocitos supresores a veces se los menciona en forma alarmante como linfocitos T asesinos. A su vez, los linfocitos CD4 se dividen en clulas de tipo 1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) de acuerdo con las citocinas que secretan.DEFENSA NO CELULAR INMUNITARIA ADAPTATIVA (HUMORAL)

El sistema inmunitario es el resultado del control de los agentes infecciosos y la vigilancia de los cambios neoplsicos de las clulas. No podemos sobrevivir sin l y nos encontramos frente a un gran riesgo cuando est comprometido, ya sea por defectos naturales o por productos qumicos. Estos ltimos pueden provenir del ambiente o pueden administrarse en forma teraputica, dado que son necesarios para la atencin mdica. El ejemplo clsico es el husped receptor de un rgano trasplantado. Para evitar que el cuerpo rechace el rgano extrao, el sistema inmunitario debe suprimirse, al menos en forma temporaria. Durante este proceso, las defensas contra los microbios invasores y las clulas tumorales se encuentran comprometidas, a veces con consecuencias imprevisibles.88 La complejidad del sistema inmunitario es muy admirable. Su complicacin es asombrosa y an no se comprende por completo. El lector interesado puede referirse a varias revisiones excelentes sobre este tema.104,27,28,63SIGNOS Y SNTOMAS CLNICOS DE INFECCIN

Estas defensas humorales son conducidas y producidas por clulas inmunitarias especficas. El sofisticado sistema de comunicacin que coordina la actividad de todas las defensas del husped se compone de sustancias qumicas producidas por los linfocitos denominadas citocinas.25 Las citocinas tambin actan como efectores moleculares de los linfocitos citotxicos. Otra defensa humoral importante es el sistema del complemento, que consiste en una cascada de enzimas que da como resultado un grupo de compuestos (C7-C8-C9) conocido en forma conjunta como complejo de ataque.117,116 Estos compuestos son molculas efectoras crticas en la defensa contra ciertos patgenos, como los meningococos. El sistema del complemento funciona en forma similar al sistema de la coagulacin. Los componentes intermediarios del sistema, en particular C3a y C5a, son extremadamente importantes como quimioatractantes, es decir, reclutan las diversas clulas inflamatorias hacia el sitio de la infeccin. El sistema del complemento tiene dos ramas que convergen en C3; ms all de ese punto, la va es la misma. La rama clsica es inmunolgicamente especfica; los complejos de antgenos y sus correspondientes anticuerpos desencadenan su activacin. La rama alternativa (antes conocida como sistema de la properdina) y el sistema de unin a las lectinas, ms recientemente reconocido, no son inmunolgicamente especficos y forman parte de la respuesta inmunitaria innata. En ocasiones, la respuesta inmunitaria se puede desviar. Durante el desarrollo normal el sistema inmunitario reconoce los constituyentes del husped como propios, fenmeno denominado tolerancia.31 El problema surge cuando los componentes normales del tejido se consideran por error extraos o no propios y son atacados. La fiebre reumtica es el ejemplo clsico de un dao no intencional, que ocurre cuando la respuesta inmunitaria confunde la miosina de las fibras del msculo cardaco con la protena M de Streptococcus pyogenes, que es muy similar.93 Adems, a menudo hay un dao colateral cuando el tejido normal se daa o incluso se destruye durante el proceso de eliminacin del agente invasor o del tumor. Esta respuesta anmala se conoce como autoinmunidad.26 Los defectos en el sistema inmunitario innato tambin pueden causar enfermedades serias y respuestas inflamatorias anmalas.57

Los signos y sntomas de infeccin pueden ser generales o sistmicos o bien, focales o localizados en un rgano o un sistema determinado. Los primeros mdicos griegos y romanos reconocan cuatro signos principales de la inflamacin: 1. Dolor 2. Calor 3. Rubor (enrojecimiento) 4. Tumor (tumefaccin) Los mecanismos subyacentes que predisponen a estos signos no se han dilucidado an por completo. El mecanismo fisiopatolgico inicial es la dilatacin de los vasos sanguneos causada por una compleja cascada de aminas vasoactivas y otros mediadores qumicos.23 La liberacin local de mediadores qumicos da como resultado 1) aumento del flujo sanguneo con congestin capilar y venosa (calor y rubor) y 2) aumento de la permeabilidad de los vasos que lleva a la extravasacin de los lquidos, la sangre y las protenas hacia los espacios extracelulares (dolor y tumor). Los neutrfilos segmentados son atrados por las sustancias quimiotcticas hacia el rea de irritacin y se escapan a travs de la vasculatura permeable hacia los espacios extracelulares (formacin de pus). Signos y sntomas generales o sistmicos de infeccin. En la fase aguda de la infeccin, el paciente puede presentar fiebre (a menudo alta y en picos), escalofros, ruborizacin (vasodilatacin) y pulso rpido. Los pacientes con infecciones subagudas o crnicas pueden padecer sntomas mnimos o vagos, como fiebre leve intermitente, prdida de peso o fatiga y cansancio. Las reacciones txicas a los productos bacterianos pueden producir eccemas o reacciones hemorrgicas en la piel o bien diversos signos y sntomas neuromusculares, cardiorrespiratorios o gastrointestinales, que son los primeros indicadores de una infeccin subyacente. Las radiografas muestran infiltrados pulmonares, engrosamiento fibroso del revestimiento de las cavidades, presencia de gas y tumefaccin de los tejidos blandos, masas radiopacas o acumulacin de lquido dentro de las cavidades o los rganos. Los parmetros de laboratorio que sugieren infeccin en los pacientes con sntomas mnimos o incipientes son elevacin de la velocidad de sedimentacin globular (eritrosedimentacin), leucocitosis o monocitosis en sangre perifrica y alteraciones en las protenas plasmticas. Otros indicadores pueden ser la elevacin de las -globulinas; la presencia de ciertas protenas

La trada de las enfermedades infecciosas 9 EFECTOS INDIRECTOS DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN SERES HUMANOS

reactivas, como la protena C reactiva, o la produccin de anticuerpos tipo-especficos. Signos locales de infeccin. Los signos principales de inflamacin son una manifestacin inequvoca de infeccin local. Puede observarse enrojecimiento localizado, calor y tumefaccin o una masa tumorosa si se presentan en las superficies externas, o se detectan en las radiografas con otras tcnicas no invasivas (ecografa, tomografa computarizada, resonancia magntica, etc.). Si las terminaciones nerviosas estn irritadas o estiradas por la masa que se expande o por sustancias qumicas irritantes, se puede sentir dolor en el rea inmediata o en otros sitios a travs de las vas eferentes complementarias (conocido como dolor referido). Un seno con secreciones y los exudados purulentos son tambin indicadores de un proceso inflamatorio o infeccioso localizado. Cualquiera de estos signos y sntomas sealan al mdico la necesidad de obtener material para examen microscpico directo y cultivo. En el captulo 2 se detallan los signos y los sntomas especficos de infeccin que se manifiestan en diversos aparatos (respiratorio, gastrointestinal, urinario, genital y otros).

Las luchas que los seres humanos hemos librado contra los agentes infecciosos han generado muchos cambios en nuestra impronta gentica. El desarrollo del sistema inmunitario es el ejemplo ms espectacular e importante, pero se pueden encontrar otros. El paludismo es una de las infecciones ms prevalentes y devastadoras del mundo, aunque no es comn en los Estados Unidos. Es posible que la aparicin de la hemoglobina S, que redunda en una infeccin menos grave por Plasmodium falciparum,58 sea un cambio adaptativo. Lamentablemente, cuando desaparece la exposicin a la infeccin, las consecuencias negativas de esta hemoglobina, puestas de manifiesto como anemia drepanoctica, son relevantes. De manera similar, la entrada de merozotos de P. vivax a los eritrocitos requiere el antgeno Duffy de grupo sanguneo. A pesar de que es un antgeno prevalente, el reconocimiento de este fenmeno biolgico proporcion las herramientas para la creacin de vacunas que bloquean la entrada de los parsitos causantes del paludismo en sus clulas diana.65

CICLO DE DIAGNSTICO El paciente con signos y sntomas de enfermedad infecciosa consulta al mdico Fase preanaltica El mdico examina al paciente y hace diagnstico clnico tentativo El mdico interpreta los informes e instituye el tratamiento apropiado

Se recolecta(n) la(s) muestra(s) apropiada(s) para cultivo. Todos los recipientes se rotulan debidamente

Se prepara el informe final del cultivo y se enva al consultorio mdico, clnica u hospital Fase posanaltica

Se transcriben las rdenes escritas a un formulario de solicitud de laboratorio. El formulario y las muestras se transportan al laboratorio

Se pueden emitir informes preliminares o no

Se examinan los subcultivos y los resultados de los sistemas de identificacin

Luego de la recepcin en el laboratorio, los datos del formulario de solicitud se ingresan en un archivo en el ordenador o en el cuaderno de registro del laboratorio

Luego de la incubacin, se examinan los cultivos. Se establecen los sistemas de identificacin definitiva

Fase analtica La muestra se examina directamente. Pueden implementarse o no los montajes para microscopia, los frotis y las tinciones Se pueden emitir informes presuntivos o no

Las muestras se procesan. Se seleccionan los medios de cultivos, se inoculan e incuban

Figura 1-1 Diagnstico clnico y de laboratorio de las enfermedades infecciosas: revisin esquemtica del ciclo de diagnstico.

10 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte I incluso perjudiciales en el caso de que el tratamiento se dirija contra un microorganismo comensal o contaminante. Por ejemplo, presuponer que Klebsiella pneumoniae, un reconocido agente causal de la neumona, como su nombre de especie lo indica, se aisl del esputo de un paciente con neumona clnica. Se sabe que Klebsiella pneumoniae tambin coloniza la nasofaringe. Si el esputo de este caso hipottico fue mal recolectado y consiste principalmente en saliva, el aislamiento de K. pneumoniae podra no reflejar la verdadera causa de la neumona, sino simplemente la colonizacin de la nasofaringe. El tratamiento podra ser inadecuado o slo eficaz por causalidad si la especie bacteriana que causa la neumona tiene el mismo patrn de sensibilidad a los antibiticos que K. pneumoniae. Si el agente causal hubiera sido Pseudomonas aeruginosa, el tratamiento hubiese sido equivocado. Esta situacin terica ocurri realmente en Pensilvania en 1976. Los concurrentes a la convencin anual de la Legin Americana de Pensilvania se infectaron en el hotel de la convencin en Filadelfia, pero se enfermaron luego cuando regresaron a sus hogares. Fueron tratados con antibiticos ineficaces contra bacilos entricos que colonizaban las vas areas altas. El patgeno real, Legionella pneumophila, no se conoca en ese entonces y, lamentablemente, se utiliz un enfoque teraputico equivocado sobre la base de los inconducentes resultados de laboratorio.33 A continuacin se enumeran los principios que hay que tener en cuenta para la recoleccin de la muestra:1. El material debe provenir del sitio real de la infeccin y recolectarse con un mnimo de contaminacin de los tejidos, rganos y secreciones adyacentes. Por ejemplo, los hisopados de garganta

Fases del ciclo diagnsticoEs til considerar los exmenes de laboratorio como una secuencia de diversos sucesos (fig.1-1). Tradicionalmente, los microbilogos, al igual que otros bioqumicos, se concentraron en las mediciones cientficas, la fase analtica. En la actualidad, est claro que los sucesos que ocurren antes de la medicin (fase preanaltica) y luego de que la determinacin cientfica se haya completado (fase postanaltica) son tan importantes como la exactitud de la medicin. El control del funcionamiento a travs del ciclo completo es parte del aseguramiento de la calidad para el laboratorio,84 como se analizar ms adelante en este captulo.Fase preanaltica RECOLECCIN DE LA MUESTRA

Una vez que se sospecha una enfermedad infecciosa deben ordenarse las pruebas apropiadas. Los enfoques diagnsticos posibles son: el cultivo, la deteccin serolgica de antgenos o anticuerpos, o la deteccin molecular de cidos nucleicos. Como se analizar en los captulos 3 y 4, se utiliza cada vez con mayor frecuencia la deteccin directa de los antgenos y los cidos nucleicos en las muestras clnicas, como tambin la aplicacin de este enfoque para la identificacin de los microorganismos aislados. En la mayora de las instituciones y comunidades, los patlogos, los microbilogos y los auxiliares de laboratorio colaboran con los mdicos en la seleccin de las muestras adecuadas para el cultivo y en la eleccin de las pruebas apropiadas para lograr la mxima eficiencia de aislamiento y deteccin de los microorganismos. Los adecuados recoleccin y transporte de una muestra al laboratorio para su anlisis es un paso crtico y principal en la confirmacin de que determinado microorganismo es responsable de una enfermedad infecciosa.68 Una muestra mal recolectada puede impedir el aislamiento de los agentes infecciosos importantes; ms an, puede conducir a terapias incorrectas e

para la bsqueda de estreptococos deben tomarse de la fosa peritonsilar y de la pared posterior de la faringe, evitando el contacto del hisopo con otras reas de la boca. Debe tambin reducirse al mnimo la contaminacin del esputo o de las muestras de las vas areas bajas con secreciones orofarngeas. Otras situaciones en que una muestra recolectada en forma inadecuada puede conducir a un resultado errneo son: a. No cultivar la zona ms profunda de una herida o el drenaje de una cavidad sin tocar la piel adyacente. b. Limpieza incorrecta del tejido periuretral y perineal antes de recolectar una muestra de orina del chorro medio de la miccin obtenida en condiciones adecuadas de higiene en una mujer. c. Contaminacin de una muestra de endometrio con secreciones vaginales. d. No acceder a la parte profunda de un absceso con agujas o cnulas de aspiracin. En general, los hisopados no constituyen un mtodo adecuado de recoleccin de muestras en la mayora de los casos; debera alentarse la utilizacin de punciones y aspiracin a travs de agujas y catteres. Los recipientes protectores para descartar los objetos cortopunzantes deben estar accesibles y ser aptos para la eliminacin de las agujas con el fin de reducir el riesgo de accidentes.2. Se deben establecer los tiempos ptimos de recoleccin de muestras para proporcionar la mejor oportunidad de recuperar los microorganismos que son agentes causales. El conocimiento de la evo-

100 Porcentaje de pacientes con cultivos positivos 90 80 Sangre 70 60 50 Heces 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Semanas de infeccin Figura 1-2 Diagnstico de fiebre tifoidea por cultivo y serologa. Orina Aglutininas sricas

lucin natural y de la fisiopatologa de los procesos infecciosos es importante para determinar el momento correcto de la recoleccin de muestras. A pesar de que la fiebre tifoidea es ahora poco comn en los Estados Unidos, la progresin del proceso infeccioso en esta enfermedad es un ejemplo ilustrativo de la importancia de recolectar las muestras adecuadas en diferentes

Fases del ciclo diagnstico 11

momentos (fig. 1-2). La bacteria causal puede aislarse en forma ptima en muestras de sangre durante la primera semana de enfermedad. El cultivo de heces o de orina es casi siempre positivo durante la segunda y la tercera semanas. Las aglutininas sricas comienzan a aumentar durante la segunda semana, alcanzan un pico a la quinta semana, y se pueden detectar durante varias semanas despus de la remisin clnica de la enfermedad, pero no se las suele utilizar con fines diagnsticos en los laboratorios modernos. No deben recolectarse muestras clnicas para cultivo durante 24 horas, en especial esputo u orina, porque el riesgo de contaminacin o de sobrecrecimiento de las bacterias comensales de rpido crecimiento es mayor que si se toma una muestra nica y se enva al laboratorio.3. La muestra debe obtenerse en una cantidad suficiente para la realizacin de los anlisis requeridos. Se deben establecer guas

Aspirado

Hisopado

para definir el volumen de material requerido para los anlisis. En la mayora de las infecciones bacterianas activas se produce suficiente cantidad de pus o secrecin purulenta de modo que el volumen no debera significar un problema. Sin embargo, muchas veces, un mdico que no lo sabe puede enviar una muestra pequea y descartar el resto del material. En las formas crnicas o leves de infeccin, puede ser difcil obtener material suficiente. El envo al laboratorio de un hisopo seco o de una muestra escasa de secreciones con la esperanza de poder aislar algn patgeno es a menudo un ejercicio intil y, posiblemente, de un costo considerable para el paciente. O lo que es peor an, se puede considerar de manera incorrecta que la lesin no estaba infectada basndose en un cultivo falso negativo. En forma frecuente se enva al laboratorio una muestra de 0,5 mL o menos de un material rotulado como esputo o lavado bronquial y se solicitan pruebas de rutina, tinciones para bacterias cido-alcohol resistentes y cultivo para hongos. Estas muestras pueden no representar las secreciones pulmonares del sitio de la infeccin y el pequeo volumen puede resultar insuficiente para permitir la realizacin de todos los procedimientos requeridos. Se pueden suministrar tubos que contienen medios de transporte como solucin fisiolgica (no nutritivo) o caldo de fosfato, levadura y glucosa (PYG) (nutritivo). El mdico puede inocular directamente cualquier cantidad de material que pueda recolectar. As, la muestra puede dividirse en el laboratorio para inocularla en numerosos medios de aislamiento primario. En algunas instituciones, se proveen varios tubos cada uno de los cuales contiene los medios de cultivo ptimos para el aislamiento de micobacterias, hongos y virus. Si las secreciones que se obtuvieron son mnimas, el mdico deber elegir el tubo basndose en las consideraciones clnicas. Cuando el tamao de la muestra es demasiado pequeo para cumplir con los requisitos en forma apropiada, es conveniente comunicarse con el mdico para establecer las prioridades de cultivo. El informe debe indicar que el material enviado para anlisis era escaso.4. Para asegurar la recuperacin ptima de los microorganismos se deben utilizar dispositivos de recoleccin de muestras, recipientes y medios de cultivo apropiados. Se deben utilizar recipientes est-

Figura 1-3 Comparacin de muestras de una articulacin infectada, obtenidas por aspiracin (pus) e hisopado. La aspiracin dio origen a un cultivo puro de Staphylococcus coagulasa positivo. El estafilococo tambin se aisl en la muestra recolectada con el hisopo, pero estaba mezclado con otras bacterias de la flora contaminante. La interpretacin con el aspirado fue inmediata; la determinacin del significado del cultivo del hisopado es problemtica, aun en presencia de un patgeno potencial.

riles para la recoleccin de la mayora de las muestras. Es importante que estn diseados para facilitar esa recoleccin, sobre todo si el paciente debe tomar su propia muestra. Los frascos de boca angosta no son tiles para muestras de esputo o de orina. Los recipientes tambin deben tener tapas que cierren en forma ajustada para evitar los derrames o la contaminacin durante el transporte.

Los hisopos se utilizan para obtener diferentes tipos de muestras para cultivo; sin embargo, suelen ser menos convenientes que otros mtodos para la recoleccin de muestras, por lo tanto, en la medida de lo posible, se debe desalentar su uso. Si se los utiliza, hay que tomar ciertas precauciones. Los hisopos de algodn pueden tener cidos grasos residuales y el alginato de calcio puede liberar productos txicos que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias con requerimientos nutricionales especiales (fastidious). En general son preferibles los hisopos con puntas de polister de Dacron o de Rayon. No se debe permitir que las muestras estn en contacto con el hisopo ms tiempo que el necesario. Adems de la toxicidad, la capacidad de los hisopos de absorber y luego liberar las muestras vara con el material utilizado en su fabricacin. Los hisopos deben colocarse en un medio de transporte o en un recipiente hmedo para evitar que las bacterias se sequen y mueran. Se ha demostrado un buen aislamiento de la mayora de las especies bacterianas en estos tubos hasta 48 horas o ms luego de la recoleccin de la muestra. La utilizacin de tubos que contienen medio de transporte semislido de Stuart o de Amies, con carbn o sin l, tambin son tiles para mantener los hisopos de cultivo durante el transporte. Existen algunas excepciones a esta normativa. Las muestras de raspado de piel o de cortes de uas para el aislamiento de hongos dermatofticos deben enviarse secas en un recipiente limpio para evitar el sobrecrecimiento de las bacterias. Los hisopados de garganta para aislamiento de Streptococcus pyogenes pueden enviarse en medio de transporte, pero el aislamiento de esta bacteria resistente a la sequedad mejora si se enva el hisopo seco porque mueren otras bacterias que colonizan la orofaringe. La capacidad para recolectar casi cualquier muestra con un hisopo es un problema an mayor que la toxicidad y la retencin de material. Mientras un aspirado o una biopsia garantizan una muestra que puede generar resultados interpretables, positivos o negativos, un hisopo puede haberse utilizado para tomar una muestra de un proceso inflamatorio o de la flora que colo-


Sistema con un hisopo

Sistema con dos hisopos

Figura 1-4 Sistemas de transporte de hisopos. El sistema ms simple consta de un nico hisopo en un tubo de transporte que contiene un medio sin nutrientes para mantener la humedad (arriba). Se comercializa un sistema similar con dos hisopos en un nico tubo de transporte (abajo); en este caso uno de los hisopos puede utilizarse para cultivo y el segundo hisopo, para realizar un frotis directo.

niza. A veces, el verdadero patgeno puede estar escondido en una mezcla de bacterias que se tomaron con un hisopo, pero es casi imposible estar seguro. Se puede llegar a interpretar en el caso de un microorganismo que es un patgeno documentado y nunca coloniza a seres humanos, pero esos criterios se cumplen rara vez. En la figura 1-3 se comparan los resultados del cultivo de un aspirado y de un hisopo del mismo sitio. Es posible hacer un frotis y un cultivo a partir de un nico hisopo si el portaobjetos se flamea para esterilizarlo antes de que se prepare el extendido. Sin embargo, muchos laboratorios requieren que se enven dos hisopos, uno para el frotis y otro para el cultivo, de modo que haya material adecuado para ambos. En ese caso es importante proveer sistemas de

transporte con dos hisopos al personal auxiliar para evitar que enven un nico hisopo en un pedido de extendido y de cultivo (fig. 1-4). En particular, se desaconseja la obtencin de muestras con hisopos para el aislamiento de bacterias anaerobias; en cambio, para este fin se recomiendan la aspiracin con aguja y jeringa. Las muestras recolectadas deben siempre protegerse de su exposicin al oxgeno ambiental y evitar que se sequen hasta que puedan procesarse en el laboratorio. Los sistemas de transporte seleccionados para las muestras anaerobias se enumeran en el cuadro 1-5. Se requiere educacin continua para impedir la utilizacin errnea de los hisopos, que constituye un hbito muy arraiga-

Cuadro 1-5 Recipientes para el transporte de muestras anaerobiasRECIPIENTE Jeringa y aguja para aspiracin FUNDAMENTO O DESCRIPCIN Los exudados frescos o las muestras lquidas pueden transportarse al laboratorio luego de expeler con cuidado las burbujas de la jeringa e insertar la punta de la aguja en un tapn estril. Este procedimiento es vlido slo si la muestra puede ser transportada al laboratorio sin demora. Esta prctica est bajo discusin dada la probabilidad de transmisin de HIV por heridas con la aguja Tubos o frascos ampolla que contienen un medio semislido, una atmsfera con 5% de CO2, un agente reductor y el indicador resazurina para dar una seal visual de anaerobiosis. El tubo se utiliza principalmente para la insercin de muestras en hisopos; los frascos ampolla se utilizan para la inoculacin de las muestras lquidas El tubo o cubierta plstica incluye un hisopo y contiene el medio Cary-Blair, Amies de transporte o prerreducido (PRAS). El sistema Culturette tambin incluye un frasco ampolla o cmara separada por una membrana que contiene sustancias qumicas que generan catalizadores de CO2 y desecantes para atrapar el O2 residual que pueda quedar dentro del sistema Bolsas de plstico transparentes para materiales biolgicos que contienen un sistema generador de CO2, un catalizador de paladio y un indicador anaerobio. La bolsa es lo suficientemente grande como para guardar una placa de Petri inoculada que contiene un medio prerreducido o una bandeja de microtubos de identificacin bioqumica, como las utilizadas para realizar las pruebas Minitek. La bolsa para materiales biolgicos o bolsa de plstico se sella luego que se introdujo en ella la placa inoculada y se activ el sistema generador de CO2. La ventaja de estos sistemas es que las placas pueden observarse directamente a travs del plstico transparente y delgado de la bolsa para efectuar la visualizacin del crecimiento temprano de las colonias

Tubo o frasco ampolla

Hisopo con sistema de cubierta plstica

Bolsa para materiales biolgicos o bolsa de plstico


do. La educacin se puede realizar mediante instrucciones de recoleccin de muestras impartidas por la direccin de los servicios del laboratorio, a travs de boletines informativos o comentarios en los informes de muestras que se han enviado en hisopos. En el quirfano no existen motivos que justifiquen la obtencin de muestras con hisopos. Se debe llevar a cabo una campaa para eliminarlos del quirfano y evitar su reingreso. Un medio til para lograr este objetivo es la comunicacin con los enfermeros del quirfano. En la Vermont University diseamos un mtodo propio para la recoleccin de muestras en el quirfano, porque no estn disponibles comercialmente los recursos adecuados. En el laboratorio se preparan frascos ampolla estriles que contienen una rosca en la parte superior con un diafragma de goma. En el fondo del frasco se coloca una capa delgada de agar no nutritivo para mantener la humedad. Luego se lo coloca en un envase adecuado para ponerlo en el autoclave; de este modo, un asistente puede colocar el envase estril sobre la bandeja de instrumentacin en el quirfano. El cirujano puede inyectar el material a travs del diafragma de goma o colocar el tejido dentro del frasco ampolla luego de desenroscar la tapa. El tejido se encuentra en un ambiente lo suficientemente anaerobio y, por lo tanto, el sistema es perfecto para el aislamiento de microorganismos anaerobios y facultativos. Sin la proteccin del envoltorio, el frasco ampolla sirve como medio general de transporte (fig. 1-5). Cualquiera que sea el sistema de transporte utilizado, la principal tarea es reducir al mnimo la demora entre la recoleccin de la muestra y su inoculacin en el medio. Por ejemplo, si se utilizan los hisopados rectales para el aislamiento de Shigella de pacientes con disentera bacilar, el material recolectado debe inocularse directamente sobre la superficie del medio de MacConkey o en un caldo para enriquecimiento de gramnegativos. La utilizacin de un medio de mantenimiento o de transporte puede poner en peligro el aislamiento de ciertas cepas. Las secreciones uretrales o cervicales que se obtienen para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae tambin deben ser inoculadas en una superficie de agar chocolate y en uno de los numerosos medios de cultivo selectivos. En su defecto, se puede utilizar un sistema de transporte comercial que incluye una tableta de la generacin de CO2 (BD BBL Jembec system; BD, Franklin Lakes, NJ) para el aislamiento de N. gonorrhoeae. En forma similar, las muestras de las vas areas altas para el aislamiento de Bordetella pertussis deben inocularse sobre agar Bordet-Gengou, carbn Regan-Lowe94 recientemente preparado, o un medio equivalente a la cabecera del paciente o en la clnica, a menos que se utilice un medio de transporte adecuado (como el medio Regan-Lowe).5. Cuando sea posible, deben obtenerse los cultivos antes de la administracin de los antibiticos. Se recomienda la obtencin de

C

B

A

Figura 1-5 Sistema de transporte para cultivos aerobios o anaerobios. Se cierra un frasco ampolla con una tapa a rosca que contiene un diafragma de goma. Una capa de agar en el fondo del frasco ampolla mantiene la humedad; un indicador de oxidorreduccin en el agar indica visualmente la oxigenacin de la atmsfera. El frasco ampolla A contiene un lquido aspirado que ha sido inoculado a travs del diafragma de goma. El frasco ampolla B contiene un fragmento de tejido que se coloc dentro del frasco ampolla destapado en la ciruga. El frasco ampolla C ha sido esterilizado dentro de un envoltorio fabricado para instrumentos quirrgicos; est listo para abrirse sobre un campo estril.

los cultivos antes de prescribir los antibiticos, sobre todo para el asilamiento de los microorganismos que son muy sensibles a ellos, como los estreptococos -hemolticos de las muestras de hisopado de garganta, N. gonorrhoeae de las muestras del aparato genitourinario o Haemophilus influenzae o N. meningitidis del lquido cefalorraqudeo. La administracin de antibiticos no impide siempre el aislamiento de los microorganismos de las muestras clnicas; en estas circunstancias, obtener una muestra puede ser mejor que no hacerlo, en tanto y en cuanto los mdicos entiendan que los resultados deben analizarse con cierto reparo.6. En muchas instancias, adems de los cultivos se deben realizar frotis. Los frotis proporcionan una informacin extremadamen-

tis es mucho ms til que el cultivo, como en el caso del esputo expectorado. Los extendidos permiten la determinacin de la naturaleza inflamatoria de una muestra e indican si los resultados del cultivo tienen significado clnico. Por ejemplo, la muestra de una herida que no contiene neutrfilos polimorfonucleares y da un cultivo positivo de flora bacteriana mixta no puede considerarse vlida. Es muy probable que los mdicos que confan en los resultados de este cultivo se sientan decepcionados. Adems, las tinciones de Gram indican la flora microbiana presente. Un frotis que tiene muchos bacilos gramnegativos que no pueden crecer en un cultivo aerobio clsico indica que las condiciones del cultivo no eran las ptimas o que los microorganismos no eran viables. Las condiciones de cultivo subptimas incluyen una atmsfera incorrecta de incubacin (anaerobios) o un medio incorrecto (organismos con requerimientos nutricionales especiales como Legionella o Bordetella). Los microbios pueden no ser viables como consecuencia de una terapia antimicrobiana apropiada o de una respuesta inflamatoria eficaz. Las reglamentaciones estatales sobre fraude y abuso exigen que un laboratorio realice slo los anlisis que le han sido solicitados. Ms adelante se comentarn los mecanismos para intensificar el uso apropiado del laboratorio en la fase preanaltica. 7. El recipiente de cultivo debe estar rotulado en forma adecuada. Cada recipiente de cultivo debe tener una etiqueta legible, con la siguiente informacin mnima: Nombre del paciente Nmero de identificacin del paciente Fuente de la muestra Mdico Fecha y hora de la recoleccin

te til que complementa al cultivo. En ciertas situaciones el fro-

14 CAPTULO 1 Introduccin a la microbiologa: Parte I Utilice el nombre completo del paciente y evite las iniciales. El nmero de identificacin debe ser el nmero del hospital, del consultorio o de la clnica, la direccin de su casa o el nmero del seguro social, segn las circunstancias. El nombre del mdico o del contacto en el consultorio es necesario por si se requiere alguna consulta o adelantar un informe. El origen de las muestras debe anotarse para que, si es necesario, se seleccione un medio especial de cultivo. La fecha y hora de la recoleccin deben aparecer en la etiqueta para determinar su procesamiento a tiempo. Otra informacin til es el diagnstico clnico y la historia de tratamiento con antibiticos del paciente.TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Recuadro 1-2 Medio de transporte de StuartCloruro de sodio Cloruro de potasio Fosfato disdico Fosfato monopotsico Tioglicolato de sodio Cloruro de calcio, 1% en agua Cloruro de magnesio, 1% en agua Agar Agua destilada cantidad suficiente para pH = 7,3 3g 0,2 g 1,25 g 0,2 g 1g 10 g 10 g 4g 1L

El objetivo principal del transporte de la muestra para diagnstico, ya sea dentro del hospital, desde la clnica o su envo por correo hacia un laboratorio de referencia, es mantenerla, dentro de lo posible, de la manera ms parecida a su estado original. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)85 ha creado diversas guas para los fabricantes de los dispositivos para la recoleccin y el transporte de muestras. Los peligros para las personas que manipulan las muestras se reducen si los dispositivos de recoleccin cierran en forma ajustada y se colocan dentro de recipientes de proteccin adecuados. Para mantener la integridad de la muestra se deben evitar las condiciones ambientales adversas, como la exposicin al fro o al calor extremos, los cambios rpidos de presin (durante el transporte areo) o el secado excesivo. Si se estima una demora prolongada hasta el procesamiento de la muestra (p. ej., ms de 4 das), es preferible congelarla a 70 C. Para perodos cortos de almacenamiento, un congelador con temperaturas de 20 C puede ser til para algunas muestras siempre que el aparato no sea del tipo que no produce escarcha. Muchos virlogos creen que las muestras para cultivo de virus (y los aislamientos virales) nunca deben almacenarse a 20 C. Las muestras de esputo que se recolectan principalmente para el aislamiento de micobacterias y hongos en recipientes de propileno o polietileno pueden enviarse sin ningn acondicionamiento posterior. No se deben utilizar recipientes de vidrio para evitar roturas durante el transporte. La mayora de las muestras lquidas deben ser transportadas al laboratorio lo antes posible. En un hospital, se recomienda un mximo de 2 horas entre la recoleccin y el envo de la muestra.5,49 Este lmite de tiempo resulta un problema para las muestras que se toman en el consultorio mdico. Si no es posible su transporte rpido, se pueden utilizar recipientes con una pequea cantidad de cido brico para el transporte de orina. De manera alternativa, las muestras de orina pueden refrigerarse hasta 24 horas antes de su cultivo. Para la mayora de las otras muestras se puede utilizar un medio de mantenimiento o transporte, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los medios de transporte empleados con mayor frecuencia son Stuart, Amies y Carey-Blair (recuadro 1-2). Estos medios son esencialmente soluciones amortiguadoras (buffers) con hidratos de carbono, peptonas y otros nutrientes, sin factores de crecimiento, diseados para mantener la viabilidad de las bacterias durante su transporte pero sin permitir su multiplicacin. Se les agrega tioglicolato de sodio como reductor para mejorar el aislamiento de las bacterias anaerobias y la pequea cantidad de agar les proporciona una consistencia semislida que evita la oxigenacin y el derrame durante el transporte. Para enviar a laboratorios distantes muestras en las que se sospecha la presencia de micobacterias, se recomienda

una solucin de borato de sodio como conservante.98 Para el aislamiento de ciertos virus, como los del herpes, un buen medio buffer de transporte es sacarosa-fosfato-glutamato. En algunos centros tambin se utilizan con xito los hisopos Culturette para el transporte de muestras para aislamientos virales.107RECEPCIN DE LA MUESTRA Y OBSERVACIONES PRELIMINARES

En la mayora de los laboratorios clnicos se designa un rea para la recepcin de las muestras. Las observaciones iniciales y la manipulacin deben realizarse en una cabina de seguridad biolgica (vase ms adelante) debido al riesgo de que el personal pueda sufrir una infeccin adquirida en el laboratorio a partir de muestras que contienen patgenos. El personal debe vestirse con indumentaria de proteccin adecuada, bata, guantes de goma y, en ciertos casos, mscaras de proteccin. Estas precauciones se tomaban antes slo con las muestras que llevaban etiquetas de peligro. Sin embargo, es imposible determinar si un paciente est infectado con un agente transmisible o si una muestra contiene un patgeno muy contagioso. Por lo tanto, es prudente tener un cuidado especial cuando se manipulan todas las muestras (cuidados universales). El procesamiento de las muestras incluye: 1) el registro de los datos fundamentales en un cuaderno o base de datos de ordenador, 2) el examen visual y la evaluacin de si se cumplen todos los criterios para aceptarla (vase la seccin inmediata adelante sobre los criterios para el rechazo de una muestra) y 3) para ciertas muestras, el examen microscpico de los montajes directos o las tinciones de los frotis para establecer un diagnstico presuntivo.CRITERIOS PARA EL RECHAZO DE LAS MUESTRAS

En todos los laboratorios se deben establecer los criterios para el rechazo de las muestras que no son adecuadas para el cultivo.112 A pesar de que existen normas generales y de que las agencias acreditadas han establecido los estndares, cada director de laboratorio debe decidir los parmetros por utilizar, segn las condiciones locales. Se deben verificar los formularios de pedido y las etiquetas de las muestras para corroborar que se incluya toda la informacin fundamental y que sta sea coherente. Ante un problema, la recoleccin de una nueva muestra es lo ms recomendable. Si la muestra no puede tomarse nuevamente, se debe buscar a una persona responsable para adoptar las medidas pertinentes. Se debe incluir un comentario en el informe final en el cual se indique que la muestra fue recibida con un problema (especfico) y agregar el


nombre de quien resolvi ese problema. Si es posible determinar el tipo de muestra, puede aceptarse que en ciertos casos se incluya en el informe: la muestra parece ser...; de lo contrario, se la debe rechazar. Siempre que haya discrepancia, se debe hacer un informe escrito de cmo se manej la situacin y de los nombres de las personas que se contactaron, en la parte de atrs de la solicitud del estudio, en el cuaderno de registro o en la base de datos del ordenador. En el recuadro 1-3 se enumeran los tipos de muestras y los pedidos de cultivos que deben aparecer en una lista de rechazos y que no deben procesarse. Cuando se rechaza una muestra, debe contactarse a la persona que la envi y ponerla al tanto sobre la situacin. Se debe intentar en lo posible no rechazar las muestras difciles de recolectar nuevamente, como el lquido cefalorraqudeo o los lavados bronquiales. Si no se puede resolver un problema en forma expeditiva, se deben realizar los cultivos para evitar la prdida de la integridad de la muestra. La decisin sobre informar o no los resultados se puede tomar con posterioridad. Si corresponde, las condiciones de la muestra se deben incluir en el informe. Luego, el mdico tendr la responsabilidad sobre la interpretacin del informe a la luz de los datos disponibles.

Los criterios de rechazo deben enumerarse en forma clara en las directivas de los servicios del laboratorio. Se debe instruir al personal del hospital sobre la importancia del envo de muestras aptas para el cultivo. Adems, se deben publicar los problemas recurrentes y sus soluciones en los boletines del laboratorio y en otras publicaciones que estn al alcance del personal del hospital y de los mdicos de planta.RELACIN COSTO-EFICACIA EN LA FASE PREANALTICA

Recuadro 1-3 Tipos de muestras o solicitudes de cultivoque deben rechazarse1. Cualquier muestra recibida en formol. La nica excepcin podran ser las muestras grandes con un corto tiempo de exposicin al formol (menos de 1 hora). En estas circunstancias, el tejido deber ser cortado en dos con una cuchilla o tijera estril y se tomar una muestra de la porcin ms interna para su cultivo 2. Los esputos recolectados durante 24 horas. Es difcil evitar la contaminacin y las muestras individuales que contienen una alta concentracin de microorganismos se diluirn por las muestras siguientes menos concentradas 3. Los frotis de secreciones del cuello interno, del canal vaginal o de ano para la deteccin de Neisseria gonorrhoeae por tincin de Gram 4. Hisopado nico enviado para mltiples solicitudes, por ejemplo; aerobios, anaerobios, hongos y tuberculosis 5. El envo en un recipiente inadecuado, no estril u obviamente contaminado, en el cual parte de la muestra se ha derramado. Cualquier recipiente con filtraciones que tenga un rtulo de peligro biolgico debe ser manipulado con extremo cuidado 6. Las placas de cultivo que estn sobrecrecidas o resecas. Una excepcin podra ser una placa de cultivo de un aislamiento de uno de los hongos patgenos (vase cap. 19). A veces, uno de los hongos patgenos de crecimiento ms lento puede an crecer por encima de bacterias u otro hongo filamentoso. Puede ser adecuada la consulta con el mdico 7. Las muestras que estn obviamente contaminadas como lo pone en evidencia la presencia de materiales extraos, como bario, colorantes coloreados o sustancias qumicas oleosas 8. Las siguientes muestras no son aceptables para cultivos anaerobios: lavados gstricos, orina del chorro medio, secreciones prostticas por recoleccin transuretral, heces (excepto para el aislamiento de especies de Clostridium asociadas con enfermedad gastrointestinal como C. difficile, C. perfringens, C. septicum), hisopados de ileostoma o colostoma, muestras de faringe, nariz u otras zonas orofarngeas (excepto las muestras obtenidas de un tejido profundo durante una ciruga bucal), piel superficial y cultivos del ambiente

La relacin costo-eficacia fue una mala palabra durante muchos aos en microbiologa clnica. Los microbilogos tradicionales consideraban este tema antiacadmico, impuro e incluso peligroso. Sin embargo, otro punto de vista es la aplicacin de lo que es clnicamente relevante al diagnstico microbiolgico. El objetivo no es identificar todo microorganismo que pueda ser aislado o hacer el antibiograma a cada uno que crece en el laboratorio. La idea es proporcionarle a los mdicos la informacin que les permita brindar la mejor atencin a los pacientes. Desde este enfoque, el trabajo del microbilogo puede ser usualmente ms econmico que hacer todo lo que sea posible. Es decir, el criterio de relevancia clnica iguala a la relacin costo-eficacia. La relacin costo-eficacia no significa barato: significa el mejor valor para el dinero. Raymond Barlett, un distinguido patlogo y director durante muchos aos del laboratorio de microbiologa del Hartford Hospital de Connecticut, es reconocido como el padre del criterio de relevancia clnica en los laboratorios de diagnstico microbiolgico. An hoy es importante que los microbilogos lean su libro original sobre el tema.5,6 Todos los que siguieron al doctor Barlett tienen con l una deuda de gratitud. En cada paso del procesamiento de laboratorio debe informarse la relevancia clnica y la relacin costo-eficacia. En el cuadro 1-6 se detallan algunas sugerencias para la fase preanaltica. Se pueden lograr ahorros sustanciales de materiales y tiempo.70 Las condiciones varan en cada institucin, por lo tanto, cada director de laboratorio debe decidir sobre las opciones ms adecuadas.Fase analtica EXAMEN MICROSCPICO

Se han enfatizado las razones por las cuales se debe realizar el examen microscpico de los materiales clnicos.5,7 1. El nmero y el porcentaje de neutrfilos segmentados que estn presentes indican la magnitud y el tipo de respuesta inflamatoria. La calidad de la muestra se puede validar. 2. La observacin de bacterias, elementos miceliales, formas de levaduras, estructuras de parsitos o inclusiones virales puede proporcionar informacin suficiente para la elaboracin de un diagnstico presuntivo inmediato. 3. El examen microscpico directo puede tambin proporcionar evidencia presuntiva inmediata de la presencia de bacterias anaerobias. Con estos datos en la mano, el mdico puede tomar una decisin ms racional sobre el tratamiento antimicrobiano inicial. El examen por microscopia de contraste de fase o de campo oscuro de material sin tincin de muestras hmedas es til para demostrar movilidad y la resistencia de espiroquetas y endosporas. Las tinciones de Giemsa, de Wright o naranja de acridina pueden ser de ayuda para la observacin de formas bacteria-


Cuadro 1-6 Relacin costo-eficacia en la fase preanaltica de las pruebasACCIN FUNDAMENTO COMENTARIOS Cryptococcus neoformans puede causar infeccin crnica sin pleocitosis en el LCR En las poblaciones con bajo riesgo de tuberculosis el rendimiento puede ser an menor

Cultivo selectivo de LCR para hon- Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes que gos70 tienen valores normales en las pruebas qumicas y en el recuento de clulas en el LCR Cultivo selectivo de LCR para micobacterias70 Cultivo selectivo de heces para patgenos bacterianos o anlisis para huevos y parsitos70,105 Cultivo selectivo de aspirados endotraqueales o esputos expectorados70 Bajo rendimiento en pacientes inmunocompetentes que tienen valores normales en las pruebas qumicas y en el recuento de clulas en el LCR Bajo rendimiento en pacientes que han sido hospitalizados durante ms de 3 das

Incremento en el aislamiento de flora orofanngea conta- Los investigadores han aplicado varios criterios diferentes minante si se observan ms de 10 clulas epiteliales pavimentosas por campo de bajo aumento

Utilizacin selectiva de caldos de Utilidad cuestionable excepto para biopsias de tejidos y Los caldos de cultivo pueden utilizarse en otras situaciones cultivo de apoyo para los cultivos ciertos lquidos, como pacientes con desvos de LCR o si se examinan slo cuando un microorganismo presente bacterianos que son sometidos a dilisis peritoneal crnica en frotis no se recupera en las placas. stos nunca deben aplicarse a muestras de las superficies mucosas No utilizar pruebas de antgenos bacterianos en LCR70,111 Cultivo selectivo de lquido peritoneal Cultivo selectivo de muestras de faringe Escasa sensibilidad y especificidad que limitan su utilidad Patrn de aislamiento de patgenos y perfiles de sensibi- Cultivos indicados en peritonitis primaria (peritonitis bactelidad predecibles en pacientes con peritonitis secundariana espontnea) y en peritonitis adquirida en el hospital ria (adquirida en la comunidad) Streptococcus pyogenes es el principal agente etiolgico de la faringitis: el cultivo de rutina con mltiples medios probablemente proporcione informacin falsa Los cultivo para Corynebacterium diphteriae, Neisseria gonorrhoeae o virus del herpes simple deben solicitarse especficamente si es apropiado. Arcanobacterium hemolyticum causa faringitis en nios mayores y adolescentes, pero se asla en medios aptos para Streptococcus pyogenes Nunca realizar cultivos de anaerobios en muestras de sitios que pueden estar contaminadas con flora de las mucosas o heces Se debe sugerir el cultivo con una frecuencia no menor de 48 a 72 horas (tiempo requerido para evaluar la primera muestra) Para otros parsitos intestinales probablemente sea adecuado realizar menos de tres exmenes

Cultivo selectivo de bacterias anae- Los cultivos de anaerobios deberan realizarse en forma sistemtica slo en tejidos o lquidos aspirados/pus robias Limitar la frecuencia del cultivo Las muestras de faringe, orina y heridas se limitan a una cada 24 horas; las muestras de sangre se limitan a dos o tres cultivos (10 a 20 mL por cultivo) cada 24 horas El rendimiento a partir de los exmenes de Giardia como mnimo luego de tres muestras, las cuales debern recolectarse en das alternos Rendimiento luego de dos exmenes negativos como mnimo Rendimiento mnimo si el recuento de clulas en LCR es normal y no hay evidencias de lesiones focales por resonancia magntica

Limitar la frecuencia de los exmenes de huevos y parsitos Limitar la frecuencia de pruebas para C. difficile96 Limitar las pruebas de DNA para virus del herpes simple en LCR106,110 Limitar el envo de muestras duplicadas del mismo sitio en el mismo da

Se describieron excepciones, especialmente en nios

Unificar las muestras o seleccionar la mejor muestra (ba- Si existe cualquier incertidumbre en lo que se refiere a la sado en la tincin de Gram o el tiempo de transporte) equivalencia de las muestras, consultar con el mdico antes del procesamiento; cuando sea dudoso, procesarlas de inmediato en forma separada y consultar en el tiempo libre; preservar las muestras al menos por 24 horas Enviar las muestras siguientes a la evaluacin previa; si la muestra siguiente ha sido inoculada en un medio y se presentan diferencias sustanciales con la muestra original, consultar con el mdico acerca de las acciones futuras Rechazar la muestra para cultivo Preservar las muestras al menos por 24 horas; preservar las placas inoculadas que son evaluadas de manera incompleta por un perodo definido (p. ej., 7 das)

Limitar la repeticin de muestras de un sitio no estril dentro de un perodo definido

No cultivar puntas de catteres urinarios permanentes114

Informar al mdico que debe remitirse la orina

LCR = lquido cefalorraqudeo. Para ms informacin el lector puede consultar las referencias48,67.


Recuadro 1-4 Sistema de clasificacin de Bartlett para laevaluacin de la calidad de las muestras de esputoNmero de neutrfilos por campo de bajo aumento (10 ) < 10 1025 > 25 Presencia de moco Nmero de clulas epiteliales por campo de bajo aumento (10 ) 1025 > 25 Total* Grado 0 +1 +2 +1

1 2

* Promedie el nmero de clulas epiteliales y neutrfilos de alrededor de 20 o 30 campos separados de observacin a 10 y calcule el total. Un resultado final de 0 o menos indica ausencia de inflamacin activa o contaminacin con saliva. Debe pedirse una nueva muestra de esputo.

nas que se tien dbilmente o que tienen poco contraste con el material de fondo. Tambin se puede utilizar la tincin de Gram directa sobre los materiales clnicos para determinar si una muestra es representativa del sitio de infeccin. Esta tcnica se aplica para la evaluacin de las muestras de esputo. A partir del nmero de clulas epiteliales escamosas y de neutrfilos segmentados de las muestras de esputo teidas con Gram en forma directa, Barlett5 dise un sistema de graduacin para evaluarlas (recuadro 1-4). En este sistema se le asignan nmeros negativos a un frotis en el que se observan clulas epiteliales escamosas, lo cual indica la contaminacin con secrecin orofarngea (saliva). Cuando se observa la presencia de neutrfilos segmentados se le asignan nmeros positivos, que indican la presencia de inflamacin activa. La magnitud de esta calificacin negativa y positiva depende de la cantidad relativa de clulas epiteliales y neutrfilos segmentados, como se observa en el esquema del sistema de graduacin de Barlett. Un puntaje final de 0 o menor indica la ausencia de respuesta inflamatoria o la presencia de contaminacin significativa con saliva y, por lo tanto, invalida la muestra. En la lmina en color 1-1 se observan microfotografas que ilustran este sistema de graduacin en preparaciones de esputo con tincin de Gram. Murray y Washington72 propusieron un sistema similar (recuadro 1-5). El nmero elevado de clulas epiteliales en los grupos 1 a 4 de este sistema indica contaminacin con secreciones orofarngeas e invalida la muestra. Slo las muestras del

Recuadro 1-5 Sistema de clasificacin de Murray yWashington para la evaluacin de la calidad de las muestras de esputoClulas epiteliales por campo de bajo aumento 25 25 25 1025 < 10 Leucocitos por campo de bajo aumento 10 1025 25 25 25

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

grupo 5 se consideran clnicamente relevantes. En un estudio clnico, Van Scoy115 recomend que las muestras de esputo que contuvieran ms de 25 neutrfilos se acepten para el cultivo aun si tenan ms de 10 clulas epiteliales (grupo 4). Este criterio sugerido de evaluacin ha sido valorado mediante su aplicacin a muestras apareadas de secreciones respiratorias obtenidas por expectoracin y por aspiracin transtraqueal, una tcnica que evita la contaminacin con la flora de la orofaringe.39 El sistema de graduacin de los esputos no puede aplicarse si se sospechan infecciones pulmonares causadas por micobacterias, la mayora de los hongos, especies de Legionella y virus. Adems, el significado de la presencia de neutrfilos polimorfonucleares se altera en algunas situaciones: 1) cuando el paciente est neutropnico a causa de una enfermedad o de un tratamiento, 2) cuando el paciente no presenta una respuesta inflamatoria eficaz y 3) cuando un cuerpo extrao causa irritacin de la superficie de la mucosa. La neutropenia puede ser el resultado de una deficiencia hereditaria o de que las clulas inflamatorias o sus precursores se destruyen por un proceso de enfermedad o por la quimioterapia para el tratamiento de una enfermedad. En ciertas condiciones, la capacidad de los neutrfilos de migrar hacia el sitio de la infeccin est disminuida. Es poco probable que el microbilogo clnico pueda determinar si un paciente est neutropnico a partir de la informacin que le proporcionan los mdicos. Una de las excepciones, que an no se comprende con claridad, es la movilizacin deficiente de los neutrfilos observada en la infancia.24 La edad exacta a la cual se puede instalar una respuesta de neutrfilos completa no est bien definida, pero en el caso de nios muy pequeos (menores de 2 meses) las decisiones de rechazar una muestra o de evaluar un aislamiento en forma incompleta no debe basarse en la ausencia de neutrfilos en la muestra. Las dos situaciones en las que un cuerpo extrao modifica la interpretacin acerca de los neutrfilos son la presencia de un catter endotraqueal en las vas areas bajas o la de un catter permanente, como un catter de Foley, en el tracto urinario inferior. En cada una de estas situaciones la aparicin de neutrfilos en la muestra puede reflejar irritacin causada por el catter en lugar de un agente infeccioso (a pesar de que ambos factores pueden estar presentes). En las vas areas, la inflamacin puede originarse de una infeccin local (traquetis) en vez de una neumona, incluso si hay un elemento infeccioso. En el tracto urinario inferior, la presencia de leucocitos no puede utilizarse como indicador de infeccin clnica importante si se ha colocado un catter en el lugar,108 o incluso, si se realizaron cateterismos en forma intermitente.40 La infeccin sintomtica es el factor determinante para el tratamiento de una infeccin del tracto urinario en el paciente con cateterismo crnico (vase cap. 2). La presencia de neutrfilos en muestras respiratorias no puede utilizarse como indicador de neumona; este diagnstico se realiza en forma clnica y radiogrfica, como se analiza en el captulo 2. Tcnicas de microscopia. Se pueden utilizar diversas tcnicas en el examen microscpico directo de la muestra clnica para demostrar la presencia de microorganismos o para observar ciertas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas o serolgicas. Las tcnicas ms comunes en los laboratorios de microbiologa clnica se enumeran en el cuadro 1-7. Como el ndice de refraccin de las bacterias y de otros microorganismos es similar al del medio de montaje, stos no son visibles cuando se los examina con luz brillante. En consecuencia, se puede necesitar cierta manipulacin de la fuente de luz. A menudo, es de gran ayuda reducir la cantidad de luz que ingresa en el campo a travs del cierre del iris del diafragma, lo cual aumenta el con-


Cuadro 1-7 Tcnicas para el anlisis directo de muestras no teidasMTODOS Y MATERIALES PROPSITO TCNICAS Dispersar una pequea cantidad de la muestra para ser examinada dentro de una gota de solucin fisiolgica en un portaobjetos de vidrio. Cubrir con un cubreobjetos y examinar directamente con un objetivo (de inmersin) del microscopio de 40 o 100 , mientras se cierra el iris del diafragma para reducir la cantidad de luz transmitida. Para evitar que se seque, se realiza un crculo sobre el cubreobjetos con una pequea cantidad de parafina-vaselina antes de cubrir la gota de muestra que se encuentra en el portaobjetos Se coloca una pequea cantidad de mezcla parafina-vaselina alrededor del reborde del pocillo en la superficie inferior del portaobjetos para gota gruesa. Se colocan las bacterias de una colonia que se va a examinar en el centro del cubreobjetos, dentro de una pequea gota de agua o solucin fisiolgica. Se invierte el portaobjetos y se presiona sobre el cubreobjetos, guiando la gota de la suspensin bacteriana dentro del centro del pocillo. El portaobjetos se lleva con cuidado a la posicin d

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