L 26/14 ES Diario Oficial de la Unión Europea«e) en el caso de la leche desnatada en polvo: en el...

REGLAMENTO DE EJECUCIOacuteN (UE) 2018150 DE LA COMISIOacuteN

de 30 de enero de 2018

por el que se modifica el Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 en lo que se refiere a los meacutetodos para el anaacutelisis y la evaluacioacuten de la calidad de la leche y de los productos laacutecteos que

pueden optar a la intervencioacuten puacuteblica y a la ayuda para el almacenamiento privado

LA COMISIOacuteN EUROPEA

Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unioacuten Europea

Visto el Reglamento (UE) no 13062013 del Parlamento Europeo y del Consejo de 17 de diciembre de 2013 sobre la financiacioacuten gestioacuten y seguimiento de la poliacutetica agriacutecola comuacuten por el que se derogan los Reglamentos (CEE) no 35278 (CE) no 16594 (CE) no 279998 (CE) no 8142000 (CE) no 12902005 y (CE) no 4852008 del Consejo (1) y en particular su artiacuteculo 62 apartado 2 letra i)

Considerando lo siguiente

(1) El Reglamento Delegado (UE) 20161238 de la Comisioacuten (2) y el Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 de la Comisioacuten (3) establecen las normas sobre intervencioacuten puacuteblica y ayuda para el almacenamiento privado El Reglamento (CE) no 2732008 de la Comisioacuten (4) establece los meacutetodos que deben aplicarse para evaluar si la leche y los productos laacutecteos cumplen los requisitos de admisibilidad establecidos en esos Reglamentos para la intervencioacuten puacuteblica y la ayuda para el almacenamiento privado

(2) Teniendo en cuenta la evolucioacuten teacutecnica de la metodologiacutea empleada en el anaacutelisis y la evaluacioacuten de la calidad de la leche y de los productos laacutecteos deben efectuarse modificaciones importantes con el fin de simplificar y facilitar la actualizacioacuten de las referencias a las normas ISO En pro de la claridad y la eficiencia y habida cuenta del alcance y el caraacutecter teacutecnico de las modificaciones de las disposiciones del Reglamento (CE) no 2732008 procede incorporar las disposiciones pertinentes de dicho Reglamento en el Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240

(3) Con objeto de garantizar el cumplimiento uniforme de las nuevas normas y meacutetodos en todos los Estados miembros los laboratorios deben disponer de un espacio de tiempo suficiente para revisar los procedimientos y aplicar los meacutetodos actualizados

(4) Procede por tanto modificar el Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 en consecuencia

(5) En pro de la seguridad juriacutedica debe derogarse el Reglamento (CE) no 2732008

(6) Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comiteacute de la Organizacioacuten Comuacuten de Mercados Agrarios

HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO

Artiacuteculo 1

El Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 queda modificado como sigue

1) El artiacuteculo 4 se modifica como sigue

a) el apartado 1 queda modificado como sigue

i) la letra d) se sustituye por el texto siguiente

laquod) en el caso de la mantequilla en el anexo IV partes I y I bis del presente Reglamentoraquo

ii) la letra e) se sustituye por el texto siguiente

laquoe) en el caso de la leche desnatada en polvo en el anexo V partes I y I bis del presente Reglamentoraquo

3112018 L 2614 Diario Oficial de la Unioacuten Europea ES

(1) DO L 347 de 20122013 p 549 (2) Reglamento Delegado (UE) 20161238 de la Comisioacuten de 18 de mayo de 2016 que completa el Reglamento (UE) no 13082013 del

Parlamento Europeo y del Consejo en lo que atantildee a la intervencioacuten puacuteblica y la ayuda para el almacenamiento privado (DO L 206 de 3072016 p 15)

(3) Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 de la Comisioacuten de 18 de mayo de 2016 por el que se establecen disposiciones de aplicacioacuten del Reglamento (UE) no 13082013 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo que atantildee a la intervencioacuten puacuteblica y a la ayuda para el almacenamiento privado (DO L 206 de 3072016 p 71)

(4) Reglamento (CE) no 2732008 de la Comisioacuten de 5 de marzo de 2008 por el que se establecen disposiciones de aplicacioacuten del Reglamento (CE) no 12551999 del Consejo en lo que atantildee a los meacutetodos que deben utilizarse para el anaacutelisis y la evaluacioacuten de la calidad de la leche y de los productos laacutecteos (DO L 88 de 2932008 p 1)

b) el apartado 2 se sustituye por el texto siguiente

laquo2 Los meacutetodos utilizados para determinar la calidad de los cereales la mantequilla y la leche desnatada en polvo que pueden optar a la intervencioacuten puacuteblica contemplados en los anexos I IV y V respectivamente seraacuten los establecidos en las uacuteltimas versiones de las normas europeas o internacionales pertinentes seguacuten corresponda vigentes al menos seis meses antes del primer diacutea del periodo de intervencioacuten puacuteblica definido en el artiacuteculo 12 del Reglamento (UE) no 13082013raquo

2) Se inserta el artiacuteculo 60 bis siguiente

laquoArtiacuteculo 60 bis

Disposicioacuten especiacutefica sobre los controles relativos a la intervencioacuten puacuteblica y a la ayuda para el almacenashymiento privado de leche y productos laacutecteos

1 La admisibilidad de la mantequilla la leche desnatada en polvo y los quesos para recibir ayuda para el almacenashymiento privado se estableceraacute de conformidad con los meacutetodos establecidos en los anexos VI VII y VIII respectishyvamente

Esos meacutetodos se estableceraacuten por referencia a las uacuteltimas versiones de las normas europeas o internacionales pertinentes seguacuten corresponda vigentes al menos seis meses antes del primer diacutea del periacuteodo de intervencioacuten puacuteblica definido en el artiacuteculo 12 del Reglamento (UE) no 13082013

2 Los resultados de los controles efectuados aplicando los meacutetodos establecidos en el presente Reglamento se evaluaraacuten de acuerdo con el anexo IXraquo

3) Los anexos quedan modificados con arreglo a lo dispuesto en el anexo del presente Reglamento

Artiacuteculo 2

Queda derogado el Reglamento (CE) no 2732008

Artiacuteculo 3

El presente Reglamento entraraacute en vigor a los siete diacuteas de su publicacioacuten en el Diario Oficial de la Unioacuten Europea

El presente Reglamento seraacute obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro

Hecho en Bruselas el 30 de enero de 2018

Por la Comisioacuten

El Presidente Jean-Claude JUNCKER


ANEXO

Los anexos del Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 se modifican como sigue

1) El anexo IV queda modificado como sigue

a) en la parte I punto 2 el paacuterrafo segundo se sustituye por el texto siguiente

laquoCada muestra debe evaluarse por separado No se permite repetir la toma de muestra ni la evaluacioacutenraquo

b) se inserta la siguiente parte I bis

laquoPARTE I bis

Meacutetodos de anaacutelisis de la mantequilla sin salar para la intervencioacuten puacuteblica

Paraacutemetro Meacutetodo

Grasa (1) ISO 17189 o ISO 3727 parte 3

Agua ISO 3727 parte 1

Soacutelidos no grasos ISO 3727 parte 2

Aacutecidos grasos ISO 1740

Iacutendice de peroacutexidos ISO 3976

Grasa no laacutectea ISO 17678

Caracteriacutesticas organoleacutepticas ISO 22935 partes 2 y 3 y tabla de valoracioacuten siguiente

(1) El meacutetodo que se aplique deberaacute ser aprobado por el organismo pagador

Tabla de valoracioacuten

Aspecto Consistencia Olor y sabor

Puntos Comentarios Puntos Comentarios Puntos Comentarios

5 Muy bueno

Tipo ideal

Calidad sobresaliente

(uniformemente seca)

5 Muy buena

Tipo ideal


(uniformemente unshytable)

5 Muy buenos

Tipo ideal


(olor absolutamente puro y agradable)

4 Bueno

(sin defectos evidentes)

4 Buena


4 Bueno


1 2 o 3 Cualquier defecto 1 2 o 3 Cualquier defecto 1 2 o 3 Cualquier defectoraquo


2) En el anexo V se inserta la siguiente parte I bis

laquoPARTE I bis

Meacutetodos de anaacutelisis de la leche desnatada en polvo para la intervencioacuten puacuteblica


Proteiacutenas ISO 8968 parte 1

Grasa ISO 1736

Agua ISO 5537

Acidez ISO 6091

Lactatos ISO 8069

Prueba de la fosfatasa ISO 11816 parte 1

Iacutendice de insolubilidad ISO 8156

Partiacuteculas quemadas (1) ADPI

Microorganismos ISO 4833 parte 1

Suero de mantequilla Apeacutendice I

Suero de cuajo (2) Apeacutendices II y III

Suero aacutecido (3) ISO 8069 o inspecciones sobre el terreno

Controles organoleacutepticos (4) ISO 22935 partes 2 y 3

(1) Los anaacutelisis de partiacuteculas quemadas podraacuten realizarse de forma sistemaacutetica No obstante esos anaacutelisis se llevaraacuten a cabo siempre que no se realicen controles organoleacutepticos

(2) El meacutetodo que se aplique deberaacute ser aprobado por el organismo pagador (uno o los dos meacutetodos) (3) El meacutetodo que se aplique deberaacute ser aprobado por el organismo pagador (4) Los controles organoleacutepticos se llevaraacuten a cabo cuando se considere necesario tras la realizacioacuten de anaacutelisis de riesgos aprobashy

dos por el organismo pagador


Apeacutendice I

LECHE DESNATADA EN POLVO DETERMINACIOacuteN DEL CONTENIDO DE FOSFATIDILSERINA Y DE FOSFATIDILETANOLAMINA

Meacutetodo HPLC en fase inversa

1 OBJETO Y AacuteMBITO DE APLICACIOacuteN

El presente meacutetodo describe un procedimiento de determinacioacuten del contenido de fosfatidilserina (FS) y fosfatidishyletanolamina (FE) de la leche desnatada en polvo (LDP) y permite detectar en ella la presencia de soacutelidos de suero de mantequilla

2 DEFINICIOacuteN

Contenido de FS + FE porcentaje en de masa de la substancia determinada mediante la aplicacioacuten del presente procedimiento El resultado se expresa en miligramos de dipalmitoil-fosfatidiletanolamina- (DPFE) por 100 g de leche en polvo

3 PRINCIPIO DEL MEacuteTODO

Extraccioacuten de los aminofosfoliacutepidos por medio de metanol de la leche en polvo reconstituida Determinacioacuten del contenido de FS y FE en forma de derivados de o-Ftaldialdehiacutedo (OFA) mediante HPLC en fase inversa y deteccioacuten por fluorescencia Determinacioacuten del contenido de FS y FE en la muestra problema por referencia a una muestra patroacuten que contiene una cantidad conocida de DPEF

4 REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analiacutetica reconocida El agua utilizada debe ser agua destilada o de pureza al menos equivalente salvo que se indique lo contrario

41 Material de referencia DPEF de una pureza miacutenima del 99

Nota el material de referencia deberaacute almacenarse a ndash 18 degC

42 Reactivos para la preparacioacuten de la muestra patroacuten y de la muestra problema

421 Metanol de grado HPLC

422 Cloroformo de grado HPLC

423 Monoclorhidrato de triptamina

43 Reactivos para la obtencioacuten del derivado de o-ftaldialdehiacutedo

431 Hidroacutexido de sodio solucioacuten acuosa 12 M

432 Aacutecido boacuterico solucioacuten acuosa 04 M ajustada a pH 100 por medio de hidroacutexido de sodio (431)

433 2-Mercaptoetanol

434 o-Ftaldialdehiacutedo (OFA)

44 Disolventes de elucioacuten de HPLC

441 Los disolventes de elucioacuten deberaacuten prepararse con reactivos de grado HPLC

442 Agua de grado HPLC

443 Metanol de pureza fluorimeacutetrica comprobada

444 Tetrahidrofurano

445 Fosfato de sodio y dihidroacutegeno

446 Acetato soacutedico

447 Aacutecido aceacutetico


5 INSTRUMENTAL

51 Balanza analiacutetica capaz de pesar con una precisioacuten de 1 mg y con una legibilidad de 01 mg

52 Vasos de precipitados de 25 y 100 ml de capacidad

53 Pipetas que permitan medir entre 1 y 10 ml

54 Agitador magneacutetico

55 Pipetas graduadas que permitan medir 02 05 y 5 ml

56 Matraces aforados de 10 50 y 100 ml de capacidad

57 Jeringas de 20 y 100 μl de capacidad

58 Bantildeo ultrasoacutenico

59 Centrifugadora que funcione a 27 000 g

510 Frascos de vidrio de unos 5 ml de capacidad

511 Probeta de 25 ml de capacidad

512 pH-metro con una precisioacuten de 01 unidades de pH

513 Equipo HPLC

5131 Sistema de bombeo de gradiente capaz de funcionar a razoacuten de 10 mlmin a 200 bar

5132 Automuestreador con capacidad para formar derivados

5133 Calentador de columna capaz de mantenerla a 30 degC plusmn 1 degC

5134 Detector de fluorescencia capaz de funcionar con una longitud de onda de excitacioacuten de 330 nm y una longitud de onda de emisioacuten de 440 nm

5135 Integrador o programa de tratamiento de datos capaz de medir el aacuterea de los picos

5136 Columna de LiChrospherreg mdash 100 (250 times 46 mm) o una columna equivalente rellena de octadecilsilano (C 18) con una granulometriacutea de 5 μm

6 MUESTREO

El muestreo deberaacute realizarse con arreglo a la norma ISO 707

7 PROCEDIMIENTO

71 Preparacioacuten de la solucioacuten de patroacuten interno

711 Se pesan 300 plusmn 01 mg de monoclorhidrato de triptamina (423) en un matraz aforado de 100 ml (56) y se enrasa con metanol (421)

712 Se pasa con la pipeta (53) 1 ml de esta solucioacuten a un matraz aforado de 10 ml (56) y se enrasa con metanol (421) con el fin de obtener una solucioacuten de triptamina 015 mM

72 Preparacioacuten de la solucioacuten de muestra problema

721 Se pesa 1000 plusmn 0001 g de la muestra problema de LDP en un vaso de precipitados de 25 ml (52) Se antildeaden 10 ml de agua destilada a 40 degC plusmn 1 degC con una pipeta (53) y se agita con el agitador magneacutetico (54) durante 30 minutos para disolver los grumos

722 Se pasan con la pipeta (55) 02 ml de la leche reconstituida a un matraz aforado de 10 ml (56) se antildeaden 100 μl de solucioacuten de triptamina 015 mM (71) con una jeringa (57) y se enrasa con metanol (421) Se mezcla cuidadosamente por inversioacuten y se somete a ultrasonidos (58) durante 15 minutos

723 Se centrifuga (59) a 27 000 g durante 10 minutos y se recoge la solucioacuten sobrenadante en un frasco de vidrio (510)

Nota la solucioacuten de muestra problema debe almacenarse a 4 degC hasta que se proceda al anaacutelisis por HPLC


73 Preparacioacuten de la solucioacuten de patroacuten externo

731 Se pesan 554 mg de DPEF (41) en un matraz aforado de 50 ml (56) y se antildeaden unos 25 ml de cloroformo (422) con una probeta (511) Se calienta el matraz con tapoacuten a 50 degC plusmn 1 degC y se mezcla a fondo hasta que se disuelva el DPEF Se enfriacutea el matraz hasta 20 degC se enrasa con metanol (421) y se mezcla por inversioacuten

732 Se pasa con pipeta (53) 1 ml de esta solucioacuten a un matraz aforado de 100 ml (56) y se enrasa con metanol (421) Se pasa con pipeta (53) 1 ml de esta solucioacuten a un matraz aforado de 10 ml (56) se antildeaden con una jeringa (57) 100 μl de solucioacuten de triptamina 015 mM (71) y se enrasa con metanol (421) Se mezcla por inversioacuten

Nota la solucioacuten de la muestra de referencia debe almacenarse a 4 degC hasta que se proceda al anaacutelisis por HPLC

74 Preparacioacuten del reactivo de derivacioacuten

Se pesan 250 plusmn 01 mg de OFA (434) en un matraz aforado de 10 ml (56) se antildeaden con una pipeta graduada (55) 05 ml de metanol (421) y se mezcla bien hasta disolver el OFA Se enrasa con la solucioacuten de aacutecido boacuterico (432) y se antildeaden 20 μl de 2-mercaptoetanol (433) con una jeringa (57)

Nota el reactivo de derivacioacuten debe conservarse a 4 degC en un frasco de vidrio topacio permanece estable durante una semana

75 Determinacioacuten mediante HPLC

751 Disolventes de elucioacuten (44)

Disolvente A solucioacuten de fosfato de sodio y dihidroacutegeno 03 mM y de acetato de sodio 3 mM (ajustada a un pH de 65 plusmn 01 por medio de aacutecido aceacutetico) metanol tetrahidrofurano en una proporcioacuten de 5584402 (vvv)

Disolvente B metanol

752 Gradiente de elucioacuten preconizado

Tiempo (min) Disolvente A () Disolvente B () Caudal (mlmin)

Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0

Nota el gradiente de elucioacuten podraacute requerir una ligera modificacioacuten con vistas a la obtencioacuten de la resolucioacuten indicada en la figura 1

Temperatura de la columna 30 degC


753 Volumen de inyeccioacuten 50 μl de reactivo de derivacioacuten y 50 μl de solucioacuten de la muestra

754 Equilibrado de la columna

El sistema se pone en marcha a diario Se llena la columna con disolvente B al 100 durante 15 minutos y a continuacioacuten se regula la proporcioacuten a AB = 4060 y se equilibra a 1 mlmin durante 15 minutos Se efectuacutea un ciclo en blanco inyectando metanol (421)

Nota antes de su almacenamiento a largo plazo lavar la columna con metanol y cloroformo en una proporcioacuten de 80 20 (vv) durante 30 minutos

755 Determinacioacuten del contenido de FS y FE de la muestra problema

756 Se efectuacutea la secuencia de anaacutelisis cromatograacuteficos sin modificar el tiempo entre ciclos con el fin de obtener periacuteodos de retencioacuten constantes Se inyecta la solucioacuten de patroacuten externo (73) cada 5-10 soluciones de muestra problema a fin de calcular el factor de respuesta

Nota la columna debe lavarse con disolvente B al 100 (751) durante al menos 30 minutos cada 20-25 ciclos

76 Modo de integracioacuten

761 Pico del DPEF

El DPEF se eluye en forma de un solo pico Se determina el aacuterea del pico mediante la integracioacuten de valle a valle

762 Pico de la triptamina

La triptamina se eluye en forma de un solo pico (figura 1) Se determina el aacuterea del pico mediante la integracioacuten de valle a valle

763 Grupos de picos de FS y FE

En las condiciones descritas (figura 1) la FS se eluye en forma de dos picos principales parcialmente no resueltos precedidos de un pico menor La FE se eluye en forma de tres picos parcialmente no resueltos Hay que determinar la superficie total de cada grupo de picos estableciendo la liacutenea de base tal como se indica en la figura 1

8 CAacuteLCULO Y EXPRESIOacuteN DE LOS RESULTADOS

El contenido de FS y FE de la muestra problema se calcularaacute como sigue

C = 5536 times ((A2)(A1)) times ((T1)(T2))

siendo

C el contenido de FS o FE (mg100 g de leche en polvo) en la muestra problema

A1 el aacuterea del pico de DPEF de la solucioacuten de muestra patroacuten (73)

A2 el aacuterea del pico de FS o FE de la solucioacuten de muestra problema (72)

T1 el aacuterea del pico de triptamina de la solucioacuten de muestra patroacuten (73)

T2 el aacuterea del pico de triptamina de la solucioacuten de muestra problema (72)

9 EXACTITUD DEL MEacuteTODO

Nota los valores relativos a la repetibilidad se han calculado de acuerdo con la norma internacional FIL ()

91 Repetibilidad

La desviacioacuten tiacutepica relativa de la repetibilidad que expresa la variabilidad de los resultados de anaacutelisis indepenshydientes obtenidos por un mismo analista utilizando el mismo equipo en las mismas condiciones y con la misma muestra problema durante un breve lapso de tiempo no debe sobrepasar un 2 en valor relativo En caso de que se proceda a dos determinaciones en esas condiciones la diferencia relativa entre ambos resultados no deberaacute sobrepasar el 6 de la media aritmeacutetica de los resultados


92 Reproducibilidad

En caso de que se efectuacuteen dos determinaciones por parte de analistas de distintos laboratorios utilizando equipos distintos y en distintas condiciones para el anaacutelisis de la misma muestra problema la diferencia relativa entre ambos resultados no deberaacute sobrepasar el 11 de la media aritmeacutetica de los resultados

10 BIBLIOGRAFIacuteA

101 Resmini P Pellegrino L Hogenboom JA Sadini V Rampilli M ldquoDetection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipidsrdquo Sci Tecn Latt-Cas 39395 (1988)

Figura 1

Perfil de HPLC de los derivados OFA de la fosfatidilserina (FS) y de la fosfatidiletanolamina (FE) contenidos en el extracto metanoacutelico de la leche desnatada en polvo reconstituida Se indica el

modo de integracioacuten de los picos de FS FE y triptamina (patroacuten interno)


Apeacutendice II

DETECCIOacuteN DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO DESTINADA AL ALMACENAMIENTO PUacuteBLICO MEDIANTE DETERMINACIOacuteN DE LOS CASEINOMACROPEacutePTIDOS POR

CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)


Este meacutetodo permite detectar la presencia de suero de cuajo en la leche desnatada en polvo destinada al almaceshynamiento puacuteblico mediante determinacioacuten de los caseinomacropeacuteptidos (CMP)

2 REFERENCIA

Norma Internacional ISO 707 Leche y productos laacutecteos Directrices para la toma de muestras

3 DEFINICIOacuteN

El contenido en soacutelidos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacropeacuteptidos mediante el procedimiento descrito

4 PRINCIPIO

mdash Reconstitucioacuten de la leche desnatada en polvo eliminacioacuten de las materias grasas y las proteiacutenas con aacutecido tricloroaceacutetico y centrifugacioacuten o filtracioacuten

mdash Determinacioacuten de la cantidad de caseinomacropeacuteptidos (CMP) presentes en el sobrenadante por cromatoshygrafiacutea liacutequida de alto rendimiento (HPLC)

mdash Evaluacioacuten del resultado obtenido con las muestras en relacioacuten con muestras patroacuten constituidas por leche desnatada en polvo con o sin adicioacuten de un porcentaje conocido de suero de leche en polvo

5 REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analiacutetica reconocida El agua utilizada debe ser agua destilada o un agua de pureza al menos equivalente

51 Solucioacuten de aacutecido tricloroaceacutetico

Se disuelven 240 g de aacutecido tricloroaceacutetico (CCl3COOH) en agua y se completa hasta 1 000 ml La solucioacuten debe ser clara e incolora

52 Solucioacuten eluyente pH 60

Se disuelven 174 g de fosfato de hidroacutegeno y dipotasio (K2HPO4) 1237 g de fosfato de dihidroacutegeno y potasio (KH2PO4) y 2141 g de sulfato de sodio (Na2SO4) en unos 700 ml de agua Se ajusta si es necesario a pH 60 con ayuda de una solucioacuten de aacutecido fosfoacuterico o de hidroacutexido de potasio

Completar hasta 1 000 ml con agua y homogeneizar

Nota la composicioacuten del eluyente se puede modificar para ajustarla al certificado de los patrones o a las recomendaciones del fabricante del material de relleno de la columna

Antes de utilizarla se filtra la solucioacuten eluyente a traveacutes de un filtro de membrana con un diaacutemetro de poro de 045 μm

53 Solucioacuten de lavado

Se mezcla un volumen de acetonitrilo (CH3CN) con nueve voluacutemenes de agua Antes de utilizarla se filtra la mezcla a traveacutes de un filtro de membrana con un diaacutemetro de poro de 045 μm

Nota Puede utilizarse cualquier otra solucioacuten de lavado que tenga un efecto bactericida y que no altere la eficiencia de resolucioacuten de las columnas

54 Muestras patroacuten

541 Leche desnatada en polvo que responda a las exigencias del presente Reglamento o sea [0]

542 La misma leche desnatada en polvo adulterada con un 5 (mm) de suero tipo cuajo en polvo de composicioacuten normal o sea [5]


6 INSTRUMENTAL

61 Balanza analiacutetica

62 Centrifugadora optativa que pueda alcanzar una aceleracioacuten de 2 200 g provista de tubos de centriacutefuga con tapoacuten o capucha de unos 50 ml de capacidad

63 Agitador mecaacutenico


65 Embudos de vidrio de unos 7 cm de diaacutemetro

66 Filtros de papel de filtracioacuten media de unos 125 cm de diaacutemetro

67 Dispositivo de filtracioacuten de vidrio provisto de membrana filtrante de 045 μm de diaacutemetro de poro

68 Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648 clase A o ISO R835) o un sistema capaz de introducir 100 ml en 2 minutos

69 Sistema capaz de introducir 200 ml de agua a unos 50 degC

610 Bantildeo Mariacutea termostatizado a 25 plusmn 05 degC

611 Equipo de HPLC que comprenda lo siguiente

6111 Bomba

6112 Inyector manual o automaacutetico de 15 a 30 μl de capacidad

6113 Dos columnas en serie TSK 2 000-SW (30 cm de longitud 075 cm de diaacutemetro interior) o columnas equivalentes (por ejemplo una sola TSK 2 000-SWxl una sola Agilent Technologies Zorbax GF 250) y una precolumna (3 cm times 03 cm) rellena de I 125 o de un material de eficacia equivalente

6114 Horno de columna termostatizado a 35 plusmn 1 degC

6115 Detector por luz ultravioleta de longitud de onda variable que permita efectuar mediciones de 205 mm de una sensibilidad de 0008 Aring

6116 Integrador que pueda integrar de valle a valle

Nota Se puede trabajar con columnas mantenidas a temperatura ambiente pero su poder de resolucioacuten es ligeramente menor En este caso las variaciones de temperatura durante una misma serie de anaacutelisis deberaacuten ser inferiores a plusmn 5 degC

7 MUESTREO

71 Las muestras se tomaraacuten seguacuten el procedimiento establecido por la Norma Internacional ISO 707 No obstante los Estados miembros podraacuten utilizar otro meacutetodo de toma de muestras siempre que se atenga a los principios de la norma antes citada

72 La muestra se debe conservar en condiciones que eviten cualquier deterioro o modificacioacuten de su composicioacuten

8 PROCEDIMIENTO

81 Preparacioacuten de la muestra problema

Se pasa la leche en polvo a un recipiente de capacidad aproximadamente doble del volumen de la leche en polvo provisto de tapadera hermeacutetica al aire Se cierra el recipiente inmediatamente Se mezcla bien la leche en polvo invirtiendo varias veces el recipiente

82 Porcioacuten analiacutetica

Se pesan 2000 plusmn 0001 g de la muestra problema y se pasan a un tubo de centriacutefuga (62) o a un matraz apropiado con tapoacuten (50 ml)

83 Eliminacioacuten de la grasa y las proteiacutenas

831 Se antildeaden 200 ml de agua tibia (50 degC) a la porcioacuten analiacutetica Se disuelve el polvo agitando durante 5 minutos con ayuda del agitador mecaacutenico (63) Se coloca el tubo en el bantildeo Mariacutea (610) y se deja que se equilibre a 25 degC


832 Se antildeaden en 2 minutos 100 ml de la solucioacuten de aacutecido tricloroaceacutetico (51) a unos 25 degC agitando eneacutergicamente con el agitador magneacutetico (64) Se coloca el tubo en el bantildeo Mariacutea (610) y se deja durante 60 minutos

833 Se centrifuga (62) durante 10 minutos a 2 200 g o se pasa a traveacutes de un filtro de papel (66) desechando los primeros 5 ml del filtrado

84 Determinacioacuten cromatograacutefica

841 Se inyectan de 15 a 30 μl medidos con exactitud de sobrenadante o de filtrado (833) en el aparato de HPLC (611) regulado a un caudal de 10 ml de solucioacuten eluyente (52) por minuto

Nota 1 Puede utilizarse otro caudal en funcioacuten del diaacutemetro interior de las columnas empleadas o de las instrucciones del fabricante de la columna

Nota 2 En cada interrupcioacuten enjuagar las columnas con agua Nunca se debe dejar en ellas la solucioacuten eluyente (52)

Antes de toda interrupcioacuten superior a 24 horas enjuagar las columnas con agua y despueacutes lavarlas con la solucioacuten (53) durante por lo menos 3 horas con un caudal de 02 ml por minuto

842 Los resultados del anaacutelisis cromatograacutefico de la muestra problema [E] se obtienen en forma de un cromatograma en el que cada pico se identifica por su tiempo de retencioacuten RT de la forma siguiente

Pico II El segundo pico del cromatograma con un RT de unos 125 minutos

Pico III El tercer pico del cromatograma correspondiente a los CMP con un RT de 155 minutos

La calidad de las columnas elegidas puede influir mucho en los tiempos de retencioacuten de los diferentes picos

El integrador (6116) calcula automaacuteticamente la superficie A de cada pico

AII superficie del pico II

AIII superficie del pico III

Con el fin de detectar las eventuales anomaliacuteas debidas ya sea a un mal funcionamiento del equipo o de las columnas ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de pasar a la interpretacioacuten cuantitativa

En caso de duda ha de repetirse el anaacutelisis

85 Calibracioacuten

851 Se aplica exactamente a las muestras patroacuten (54) el procedimiento descrito desde el punto 82 al punto 842

Deben utilizarse soluciones recieacuten preparadas pues los CMP se degradan en medio con tricloroaceacutetico al 8 La peacuterdida se estima en 02 por hora a 30 degC

852 Antes de proceder a la determinacioacuten cromatograacutefica de las muestras se acondicionan las columnas mediante inyecciones repetidas de la solucioacuten (851) de la muestra patroacuten (542) hasta que la superficie y el tiempo de retencioacuten del pico corresshypondiente a los CMP sean constantes

853 Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrados (851) utilizado para las muestras

9 EXPRESIOacuteN DE LOS RESULTADOS

91 Modo de caacutelculo y foacutermulas

911 Caacutelculo de los factores de respuesta R

Pico II RII = 100(AII[0])

siendo

RII = los factores de respuesta de los picos II

AII [0] = las aacutereas de los picos II de la muestra patroacuten [0] obtenidas en 853


Pico III RIII = W(AIII[5] ndash AIII[0])

siendo

RIII = el factor de respuesta del pico III

AIII [0] y AIII [5] = Las aacutereas del pico III en las muestras patroacuten [0] y [5] respectivamente obtenidas en 853

W = la cantidad de suero presente en la muestra patroacuten [5] o sea 5

912 Caacutelculo del aacuterea relativa de los picos de la muestra [E]

SII[E] = RII times AII[E]

SIII[E] = RIII times AIII[E]

SIV[E] = RIV times AIV[E]

siendo

SII [E] SIII [E] SIV [E] = las aacutereas relativas de los picos II III y IV respectivamente en la muestra [E]

AII [E] AIII [E] = las aacutereas de los picos II y III respectivamente en la muestra [E] obtenidas en 842

RII RIII = los factores de respuesta calculados en 911

913 Caacutelculo del tiempo de retencioacuten relativo del pico III de la muestra [E]

RRTIII[E] = (RTIII[E])(RTIII[5])

siendo

RRTIII [E] = el tiempo de retencioacuten relativo del pico III de la muestra [E]

RTIII [E] = el tiempo de retencioacuten del pico III de la muestra [E] obtenido en 842

RTIII [5] = el tiempo de retencioacuten del pico III de la muestra testigo [5] obtenido en el punto 853

914 Por la experimentacioacuten se ha visto que existe una relacioacuten lineal entre el tiempo de retencioacuten relativo del pico III es decir RRTIII [E] y el porcentaje de suero en polvo antildeadido hasta el 10

mdash El RRTIII [E] es lt 1000 si el contenido de suero es gt 5

mdash El RRTIII [E] es ge 1000 si el contenido de suero es le 5

La incertidumbre admitida para los valores de RRTIII es plusmn 0002

Normalmente el valor de RRTIII [0] es poco diferente de 1034 Seguacuten el estado de las columnas el valor puede aproximarse a 1000 pero siempre seraacute superior a esta cifra

92 Caacutelculo del porcentaje de suero de cuajo en polvo presente en la muestra

W = SIII[E] ndash [1 3 + (SIII[0] ndash 0 9)]

siendo

W = el porcentaje (mm) de suero de cuajo en la muestra [E]

SIII [E] = el aacuterea relativa del pico III de la muestra problema [E] obtenida en 912

13 = el aacuterea media relativa del pico III expresada en gramos de suero de cuajo por 100 g determinada en leche desnatada en polvo no adulterada de distintos oriacutegenes esta cifra se ha obtenido experimentalmente

SIII [0] = el aacuterea relativa del pico III que es igual a RIII times AIII [0] estos valores se han obtenido en 911 y 853 respectivamente

(SIII [0] ndash 09) = la correccioacuten que debe hacerse al aacuterea media relativa 13 cuando SIII [0] no es igual a 09 experimentalmente el aacuterea media relativa del pico III de la muestra testigo [0] es 09


93 Exactitud del meacutetodo

931 Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultaacuteneamente o en un breve intervalo de tiempo por el mismo analista empleando los mismos aparatos y la misma muestra no debe exceder del 02 (mm)

932 Reproducibilidad

La diferencia entre dos resultados particulares e independientes obtenidos en dos laboratorios diferentes con la misma muestra no debe exceder del 04 (mm)

94 Interpretacioacuten

941 Se acepta que no existe suero si el aacuterea relativa del pico III SIII [E] expresada en gramos de suero de cuajo por 100 g de producto es le 20 + (SIII[0] ndash 09)

siendo

20 el valor maacuteximo permitido para el aacuterea relativa del pico III teniendo en cuenta el aacuterea media relativa del pico III es decir 13 la incertidumbre debida a las variaciones en la composicioacuten de la leche desnatada en polvo y la reproducibilidad del meacutetodo (932)

(SIII [0] ndash 09) la correccioacuten que debe hacerse cuando el aacuterea SIII [0] es distinta de 09 (veacutease el punto 92)

942 Si el aacuterea relativa del pico III SIII [E] es gt 20 + (SIII [0] ndash 09) y el aacuterea relativa del pico II SII [E] le 160 se determina el contenido en suero de cuajo como se indica en el punto 92

943 Si el aacuterea relativa del pico III SIII [E] es gt 20 + (SIII [0] ndash 09) y el aacuterea relativa del pico II SII [E] le 160 se determina el contenido en proteiacutenas totales (P ) se examinan luego los graacuteficos 1 y 2

9431 Los datos obtenidos tras el anaacutelisis de muestras de leches desnatadas en polvo no adulteradas con alto contenido en proteiacutenas totales se reuacutenen en los graacuteficos 1 y 2

La liacutenea continua representa la regresioacuten lineal cuyos coeficientes se calculan mediante el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados

La recta de trazo discontinuo determina el liacutemite superior del aacuterea relativa del pico III con una probabilidad de que no se sobrepasa en el 90 de los casos

Las ecuaciones de las rectas que aparecen con trazo discontinuo en los graacuteficos 1 y 2 son las siguientes

SIII = 0376 P ndash 107 (graacutefico 1)

SIII = 00123 SII [E] + 093 (graacutefico 2)

respectivamente siendo

SIII el aacuterea relativa del pico III calculada bien a partir del contenido en proteiacutenas totales bien a partir del aacuterea relativa del pico SII [E]

P el contenido en proteiacutenas totales expresado en porcentaje ponderal

SII [E] el aacuterea relativa de la muestra calculada en el punto 912

Estas ecuaciones son equivalentes a la cifra 13 mencionada en el nuacutemero 92

La diferencia (T1 y T2) entre el aacuterea relativa SIII [E] hallada y el aacuterea relativa SIII viene dada por las relaciones siguientes T1 = SIII[E] ndash [(0376 P ndash 107) + (SIII[0] ndash 09)]T2 = SIII[E] ndash [(00123 SII[E] + 093) + (SIII[0] ndash 09)]


9432 Si T1 yo T2 son iguales o inferiores a cero no puede determinarse la presencia de suero de cuajo

Si T1 y T2 son superiores a cero hay presencia de suero de cuajo

El contenido en suero de cuajo existente se calcularaacute mediante la foacutermula siguiente W = T2 + 091

siendo

091 la distancia sobre el eje vertical entre la liacutenea de trazo continuo y la recta de trazo discontinuo


Apeacutendice III

DETERMINACIOacuteN DE LOS SOacuteLIDOS DE SUERO DE CUAJO EN LA LECHE DESNATADA EN POLVO

1 OBJETO DETECCIOacuteN DE LA ADICIOacuteN DE SOacuteLIDOS DE SUERO DE CUAJO A LA LECHE DESNATADA EN POLVO

2 REFERENCIAS NORMA INTERNACIONAL ISO 707

3 DEFINICIOacuteN

El contenido en soacutelidos de suero de cuajo se define como el porcentaje en masa determinado por el contenido en caseinomacropeacuteptido mediante el procedimiento descrito

4 PRINCIPIO

Las muestras se analizan para detectar la presencia de caseinomacropeacuteptido A por el procedimiento de cromatografiacutea de liacutequidos de alto rendimiento en fase inversa (procedimiento HPLC) El resultado se evaluacutea por comparacioacuten con muestras patroacuten constituidas por leche desnatada en polvo con y sin un porcentaje conocido de suero en polvo Un resultado superior al 1 (mm) indica la presencia de soacutelidos de suero de cuajo

5 REACTIVOS

Todos los reactivos deben ser de pureza analiacutetica reconocida El agua utilizada debe ser agua destilada o agua de pureza al menos equivalente El acetonitrilo debe ser de calidad espectroscoacutepica o adecuada para HPLC



52 Eluyentes A y B

Eluyente A se introducen en un matraz aforado de 1 000 ml 150 ml de acetonitrilo (CH3CN) 20 ml de isopropanol (CH3CHOHCH3) y 100 ml de aacutecido trifluoroaceacutetico (TFA CF3COOH) Se enrasa con agua a 1 000 ml

Eluyente B se introducen en un matraz aforado de 1 000 ml 550 ml de acetonitrilo 20 ml de isopropanol y 100 ml de TFA Se enrasa con agua a 1 000 ml Antes de utilizarla se filtra la solucioacuten eluyente a traveacutes de un filtro de membrana con un diaacutemetro de poro de 045 μm

53 Conservacioacuten de la columna

Tras los anaacutelisis la columna se lava con el eluyente B (mediante un gradiente) y a continuacioacuten se lava con acetonitrilo (mediante un gradiente durante 30 minutos) La columna se conserva en acetonitrilo


541 Leche desnatada en polvo que se ajuste a los requisitos aplicables al almacenamiento puacuteblico (es decir [0])

542 La misma leche desnatada en polvo adulterada con 5 (mm) de suero tipo cuajo en polvo de composicioacuten normal o sea [5]


6 INSTRUMENTAL









68 Pipetas graduadas que permitan medir 10 ml (ISO 648 clase A o ISOR 835) o un sistema capaz de introducir 100 ml en 2 minutos




6111 Sistema de bombeo de gradiente binario

6112 Inyector manual o automaacutetico con capacidad de 100 μl

6113 Columna Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (25 cm de longitud 046 cm de diaacutemetro interior) o una columna equivalente de fase inversa de poro grueso a base de siacutelice


6115 Detector de luz ultravioleta de longitud de onda variable que permita tomar medidas a 210 nm (de ser necesario puede utilizarse una longitud de onda mayor hasta 220 nm) con una sensibilidad de 002 Aring

6116 Integrador que pueda efectuar la integracioacuten a una liacutenea base comuacuten o de valle a valle

Nota se puede trabajar con la columna a temperatura ambiente con tal de que esta no fluctuacutee en maacutes de 1 degC de no cumplirse esta condicioacuten se produce una variacioacuten excesiva del tiempo de retencioacuten del CMPA

7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO




Se pesan 200 plusmn 0001 g de la muestra problema en un tubo de centriacutefuga (62) o en un matraz apropiado con tapoacuten (50 ml)

Nota si se trata de una mezcla debe pesarse una cantidad de muestra problema tal que la porcioacuten de muestra desengrasada corresponda a 200 g



832 Se antildeaden en 2 minutos de forma constante 100 ml de solucioacuten de aacutecido tricloroaceacutetico a 25 degC (51) a la vez que se agita vigorosamente con el agitador magneacutetico (64) Se coloca el tubo en el bantildeo Mariacutea (610) y se deja durante 60 minutos




841 El meacutetodo HPLC en fase inversa excluye la posibilidad de falsos positivos debidos a la presencia de suero de mantequilla aacutecida en polvo

842 Antes de llevar a cabo el anaacutelisis por HPLC en fase inversa deben optimizarse las condiciones de gradiente Un tiempo de retencioacuten de 26 plusmn 2 minutos para el CMP A es oacuteptimo para sistemas de gradiente con un volumen muerto de unos 6 ml (volumen desde el punto en que confluyen los disolventes hasta el volumen del circuito de inyeccioacuten incluido este uacuteltimo) Para los sistemas de gradiente con un volumen muerto inferior (por ejemplo 2 ml) debe emplearse un tiempo de retencioacuten oacuteptimo de 22 minutos

Se toman soluciones de las muestras patroacuten (54) con y sin un 50 de suero de cuajo

Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (833) en el aparato de HPLC que deberaacute funcionar en las condiciones de gradiente de exploracioacuten que figuran en el cuadro 1

Cuadro 1

Condiciones de gradiente de exploracioacuten para la optimizacioacuten de la cromatografiacutea

Tiempo (min)

Caudal (mlmin) A B Curva

Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal

La situacioacuten del pico del CMPΑ se obtendraacute por comparacioacuten de los dos cromatogramas

Mediante la foacutermula indicada a continuacioacuten puede calcularse la composicioacuten inicial del disolvente que ha de utilizarse para el gradiente normal (veacutease 843) B = 10 ndash 25 + (135 + (RTcmpA ndash 26) 6) times 30 27 B = 75 + (135 + (RTcmpA ndash 26) 6) times 1101

Siendo

RTcmpA el tiempo de retencioacuten del CMPΑ en el gradiente de exploracioacuten

10 el B inicial del gradiente de exploracioacuten

25 B en el punto medio menos B en el punto inicial del gradiente normal

135 el tiempo correspondiente al punto medio del gradiente de exploracioacuten

26 el tiempo de retencioacuten requerido del CMPΑ

6 la proporcioacuten de las pendientes del gradiente de exploracioacuten y del normal

30 B en el punto inicial menos B a 27 minutos en el gradiente de exploracioacuten

27 tiempo de desarrollo del gradiente de exploracioacuten

843 Se toman soluciones de las muestras problema

Se inyectan 100 μl de sobrenadante o filtrado (833) medidos con exactitud en el aparato de HPLC que funcionaraacute con un caudal de 10 ml de solucioacuten de eluyente (52) por minuto

La composicioacuten del eluyente al iniciarse el anaacutelisis se obtiene de 842 Normalmente suele estar cerca de AB = 7624 (52) Inmediatamente despueacutes de la inyeccioacuten se inicia un gradiente lineal que da lugar al cabo de 27 minutos a un porcentaje de B superior en un 5 A continuacioacuten comienza un gradiente lineal por el cual la composicioacuten del eluyente alcanza el 90 de B en 5 minutos Esta composicioacuten se mantiene durante 5 minutos transcurridos los cuales la composicioacuten se modifica mediante un gradiente lineal para alcanzar en 5 minutos la composicioacuten inicial Dependiendo del volumen interno del sistema de bombeo la siguiente inyeccioacuten puede llevarse a cabo 15 minutos despueacutes de haberse alcanzado las condiciones iniciales

Nota 1 El tiempo de retencioacuten del CMPA debe ser de 26 plusmn 2 minutos Puede conseguirse variando las condiciones iniciales y finales del primer gradiente Sin embargo la diferencia de B entre las condiciones iniciales y finales del primer gradiente se mantendraacute en 5 B


Nota 2 Los eluyentes deben desgasificarse suficientemente y mantenerse desgasificados Ello es esencial para que el sistema de bombeo por gradiente pueda funcionar correctamente La desviacioacuten tiacutepica del tiempo de retencioacuten del pico del CMPA debe ser inferior a 01 minutos (n = 10)

Nota 3 Cada 5 muestras debe inyectarse la muestra de referencia [5] y emplearse para calcular un nuevo factor de respuesta R (911)

844 Los resultados del anaacutelisis cromatograacutefico de la muestra problema (E) se obtienen en forma de cromatograma en el que el pico del CMPA se identifica por su tiempo de retencioacuten de unos 26 minutos

El integrador (6116) calcula automaacuteticamente la altura H del pico del CMPA La situacioacuten de la liacutenea de base debe comprobarse en cada cromatograma Hay que repetir el anaacutelisis o la integracioacuten si la liacutenea de base estaacute situada incorrectamente

Nota si el pico del CMPA estaacute separado suficientemente de los otros picos debe aplicarse la asignacioacuten de la liacutenea de base valle a valle en caso contrario hay que trazar perpendiculares a una liacutenea de base comuacuten cuyo punto de inicio debe estar proacuteximo al pico del CMPA (por tanto iexclno a t = 0 min) Para el patroacuten y las muestras hay que utilizar el mismo tipo de integracioacuten y comprobar en el caso de una liacutenea de base comuacuten su coherencia en relacioacuten con las muestras y el patroacuten

Con el fin de detectar las anomaliacuteas eventuales debidas ya sea a un mal funcionamiento del aparato o de la columna ya sea al origen y naturaleza de la muestra analizada es fundamental observar el aspecto de cada cromatograma antes de efectuar la interpretacioacuten cuantitativa En caso de duda ha de repetirse el anaacutelisis

85 Calibracioacuten

851 Aplicar a las muestras patroacuten (541 y 542) el procedimiento desde el punto 82 al 844 exactamente tal y como se describe Hay que utilizar soluciones recieacuten preparadas pues los CMP se degradan en medio de aacutecido tricloroaceacutetico al 8 a temperatura ambiente A 4 degC la solucioacuten permanece estable durante 24 horas Cuando se realice una larga serie de anaacutelisis es recomendable emplear una bandeja refrigerada para las muestras en el inyector automaacutetico

Nota el punto 842 puede omitirse si el B en las condiciones iniciales se conoce por anaacutelisis previos

El cromatograma de la muestra patroacuten [5] deberiacutea ser anaacutelogo al representado en la figura 1 Aquiacute el pico del CMPA viene precedido por dos picos pequentildeos Es imprescindible obtener una separacioacuten similar

852 Antes de proceder a la determinacioacuten cromatograacutefica de las muestras se inyectan 100 μl de la muestra patroacuten sin suero de cuajo [0] (541)

El cromatograma no debe presentar ninguacuten pico al tiempo de retencioacuten del pico del CMPA

853 Se determinan los factores de respuesta R inyectando el mismo volumen de filtrado (851) utilizado para las muestras



911 Caacutelculo del factor de respuesta R

Pico del CMPA R = WH

Siendo

R = el factor de respuesta del pico del CMPA

H = la altura del pico del CMPA

W = la cantidad de suero de la muestra patroacuten [5]



W(E) = R times H(E)

Siendo

W(E) = el porcentaje (mm) de suero de cuajo en la muestra (E)

R = el factor de respuesta del pico del CMPA (911)

H(E) = la altura del pico del CMPA de la muestra (E)

Si W(E) es superior al 1 y la diferencia entre el tiempo de retencioacuten de la muestra y el de la muestra patroacuten [5] es inferior a 02 minutos se confirma la presencia de soacutelidos de suero de cuajo


931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad

Entre 0 y 16 de suero de cuajo debe obtenerse una relacioacuten lineal con un coeficiente de correlacioacuten gt 099


El liacutemite del 1 incluye la incertidumbre debida a la reproducibilidad

Figura 1

Patroacuten Nimdash46

() Norma internacional FIL 135B1991 Leche y productos laacutecteos Caracteriacutesticas de precisioacuten de los meacutetodos analiacuteticos Resumen de meacutetodo de anaacutelisis en colaboracioacutenraquo


3) Se antildeaden los anexos siguientes

laquoANEXO VI

Meacutetodos de anaacutelisis de la mantequilla objeto de almacenamiento privado




Soacutelidos no grasos (excluida la sal) ISO 3727 parte 2

Sal ISO 15648


ANEXO VII

Meacutetodos de anaacutelisis de la leche desnatada en polvo objeto de almacenamiento privado


Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII

Meacutetodos de anaacutelisis de los quesos objeto de almacenamiento privado

1 Para garantizar que el queso hecho exclusivamente de leche de oveja de cabra o de buacutefala o de una mezcla de estas leches no contiene caseiacutena de leche de vaca se utilizaraacute el meacutetodo de anaacutelisis establecido en el apeacutendice

Se considera que hay presencia de caseiacutena de leche de vaca si el contenido de caseiacutena de leche de vaca de la muestra analizada es igual o superior al contenido de la muestra de referencia que contiene 1 de leche de vaca seguacuten se establece en el apeacutendice

2 Podraacuten utilizarse otros meacutetodos para detectar la caseiacutena de leche de vaca en los quesos citados en el apartado 1 siempre que

a) el liacutemite de deteccioacuten sea como maacuteximo del 05 y

b) no haya falsos positivos y

c) la caseiacutena de leche de vaca siga siendo detectable con la sensibilidad exigida incluso tras largos periacuteodos de maduracioacuten como puede suceder en condiciones comerciales normales

Si no se cumple alguna de las condiciones citadas se utilizaraacute el meacutetodo establecido en el apeacutendice


Apeacutendice

MEacuteTODO PARA LA DETECCIOacuteN DE LECHE DE VACA Y DE CASEINATO DE LECHE DE VACA EN QUESOS DE LECHE DE OVEJA LECHE DE CABRA O LECHE DE BUacuteFALA O MEZCLAS DE LECHE DE OVEJA

CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO

Deteccioacuten de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca en quesos de leche de oveja leche de cabra o leche de buacutefala o mezclas de leche de oveja cabra y buacutefala mediante isoelectroenfoque de γ-caseiacutenas tras plasmishynoacutelisis

2 AacuteMBITO DE APLICACIOacuteN

El meacutetodo es adecuado para la deteccioacuten sensible y especiacutefica de leche de vaca y de caseinato de leche de vaca tanto crudo como con tratamiento teacutermico en quesos frescos y madurados elaborados con leche de oveja leche de cabra o leche de buacutefala o mezclas de leche de oveja cabra y buacutefala No es adecuado para la deteccioacuten de la adulteracioacuten de leche y queso con concentrados de proteiacutenas de suero de leche de bovino tratados teacutermicamente


31 Aislamiento de caseiacutenas de queso y patrones de referencia

32 Disolucioacuten de las caseiacutenas aisladas y ruptura con plasmina (EC34217)

33 Isoelectroenfoque de las caseiacutenas tratadas con plasmina en presencia de urea y tincioacuten de las proteiacutenas

34 Evaluacioacuten de las manchas tentildeidas de γ3 y γ2-caseiacutena (prueba de la presencia de leche de vaca) comparando las manchas obtenidas de la muestra con las producidas en el mismo gel por los patrones de referencia que contienen 0 y 1 de leche de vaca

4 REACTIVOS

A menos que se indique lo contrario se utilizaraacuten sustancias de grado analiacutetico Debe utilizarse agua bidestilada o de pureza equivalente

Nota los datos siguientes se refieren a geles de poliacrilamida con urea preparados en el laboratorio de unas dimensiones de 265 times 125 times 025 mm Si se utilizan geles de otro tipo o dimensiones es posible que deban modificarse las condiciones de separacioacuten

Isoelectroenfoque

41 Reactivos para la obtencioacuten de los geles de poliacrilamida con urea

411 Solucioacuten de gel madre

Se disuelven

485 g de acrilamida

015 g de NNprime-metilen-bis-acrilamida (BIS)

4805 g de urea

1500 g de glicerol (87 pp)

en agua se lleva a 100 ml y se guarda en un frasco de vidrio topacio en el frigoriacutefico

Nota puede utilizarse una solucioacuten de acrilamidaBIS premezcladas presente en el comercio en vez de los pesos fijos indicados de las acrilamidas neurotoacutexicas Si una solucioacuten de este tipo contiene un 30 pv de acrilamida y un 08 pv de BIS deberaacute utilizarse para la formulacioacuten un volumen de 162 ml en lugar de los pesos fijos El plazo de validez de la solucioacuten madre es como maacuteximo de 10 diacuteas si su conductividad es superior a 5 μS debe desionizarse agitando con 2 g de amberlita MB-3 durante 30 minutos y filtrarse despueacutes por una membrana de 045 μm


412 Solucioacuten de gel

Se prepara una solucioacuten de gel mezclando aditivos y anfolitos () con la solucioacuten de gel madre (veacutease 411)

90 ml de solucioacuten madre

24 mg de β-alanina

500 μl de anfoacutelito pH 35-95



Se mezcla la solucioacuten de gel y se desgasifica durante dos o tres minutos en un bantildeo de ultrasonidos o en vaciacuteo

Nota la solucioacuten de gel se prepara justo antes de verterla (veacutease 62)

413 Soluciones catalizadoras

4131 NNNprimeNprime-tetrametiletilendiamina (Temed)

4132 Persulfato amoacutenico al 40 pv (PER)

Se disuelven 800 mg de PER en agua y se completa hasta 2 ml

Nota debe utilizarse siempre una solucioacuten de PER recieacuten preparada

42 Liacutequido de contacto

Queroseno o parafina liacutequida

43 Solucioacuten anoacutedica

Se disuelven 577 g de aacutecido fosfoacuterico (85 pp) en agua y se diluye hasta 100 ml

44 Solucioacuten catoacutedica

Se disuelven 200 g de hidroacutexido soacutedico en agua y se diluye hasta 100 ml con agua

Preparacioacuten de la muestra

45 Reactivos para el aislamiento de las proteiacutenas

451 Aacutecido aceacutetico diluido (250 ml de aacutecido aceacutetico glacial llevados a 100 ml con agua)

452 Diclorometano

453 Acetona

46 Amortiguador de disolucioacuten de proteiacutenas

Se disuelven


2403 g de urea

250 mg de ditiotreitol

en agua y se completa hasta 50 ml

Nota se debe conservar en frigoriacutefico durante un plazo maacuteximo de una semana


47 Reactivos para la ruptura con plasmina de las caseiacutenas

471 Amortiguador de carbonato amoacutenico

Se ajusta a pH 8 una solucioacuten de hidrogenocarbonato amoacutenico 02 moll (158 g100 ml de agua) que contiene 005 moll de aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico (EDTA 146 g100 ml) con una solucioacuten de carbonato amoacutenico 02 moll (192 g100 ml de agua) que contiene 005 moll de EDTA

472 Plasmina bovina (EC 34217) con una actividad miacutenima de 5 Uml

473 Solucioacuten de aacutecido ε-aminocaproico para inhibicioacuten enzimaacutetica

Se disuelven 2624 g de aacutecido ε-aminocaproico (aacutecido 6-amino-n-hexanoico) en 100 ml de etanol del 40 (vv)

48 Patrones

481 En el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia de la Comisioacuten B-2440 Geel Beacutelgica pueden conseguirse patrones de referencia certificados de una mezcla de leche desnatada cuajada de oveja y de cabra con un 0 y un 1 de leche de vaca

482 Preparacioacuten de patrones provisionales de laboratorio de leche cuajada de buacutefala con un 0 y un 1 de leche de vaca

Se prepara la leche desnatada mediante centrifugacioacuten de leche cruda de vaca o de buacutefala a granel a 37 degC a 2 500 g durante 20 minutos Tras enfriar el tubo y su contenido raacutepidamente a 6-8 degC se elimina compleshytamente la capa grasa superior Para la preparacioacuten del patroacuten del 1 se antildeaden 500 ml de leche desnatada de vaca a 495 ml de leche desnatada de buacutefala en un vaso de 1 litro y se ajusta el pH a 64 mediante adicioacuten de aacutecido laacutectico diluido (10 pv) Se ajusta la temperatura a 35 degC y se antildeaden 100 μl de cuajo de ternero (actividad del cuajo 110 000 aprox 3 000 Uml) se agita durante 1 minuto y se deja el vaso en reposo cubierto con laacutemina de aluminio a 35 degC durante 1 hora para que se pueda formar la cuajada Una vez formada esta se liofiliza toda la leche cuajada sin que haya previamente homogeneizacioacuten ni eliminacioacuten del suero Tras la liofilizacioacuten se tritura bien para obtener un polvo homogeacuteneo Para la preparacioacuten del patroacuten del 0 se sigue el mismo procedimiento utilizando leche desnatada pura de buacutefala Los patrones deben conservarse a ndash 20 degC

Nota es conveniente comprobar la pureza de la leche de buacutefala mediante isoelectroenfoque de las caseiacutenas tratadas con plasmina antes de la preparacioacuten de los patrones

Reactivos de tincioacuten de proteiacutenas

49 Fijador

Se disuelven 150 g de aacutecido tricloroaceacutetico en agua y se lleva a 1 000 ml

410 Solucioacuten decolorante

Se diluyen 500 ml de metanol y 200 ml de aacutecido aceacutetico glacial hasta 2 000 ml con agua destilada

Nota la solucioacuten decolorante debe prepararse cada diacutea puede hacerse mezclando voluacutemenes iguales de soluciones madre de metanol del 50 (vv) y de aacutecido aceacutetico glacial del 20 (vv)

411 Soluciones colorantes

4111 Solucioacuten colorante (solucioacuten madre 1)

Se disuelven 30 g de azul brillante Coomassie G 250 (CI42655) en 1 000 ml de metanol del 90 (vv) utilizando un agitador magneacutetico (durante unos 45 minutos) y se filtra a traveacutes de dos filtros de pliegues de velocidad media


Se disuelven 50 g de sulfato de cobre pentahidratado en 1 000 ml de aacutecido aceacutetico del 20 (vv)

4113 Solucioacuten colorante (solucioacuten de trabajo)

Se mezclan 125 ml de cada una de las soluciones madre (4111 4112) justo antes de realizar la tincioacuten

Nota la solucioacuten colorante solo debe utilizarse el mismo diacutea en que se haya preparado


5 EQUIPO

51 Placas de vidrio (265 times 125 times 4 mm) rodillo de caucho (15 cm de ancho) mesa de nivelacioacuten

52 Hoja de soporte del gel (265 times 125 mm)

53 Hoja de cobertura (280 times 125 mm) Se pega una tira de cinta adhesiva (280 times 6 times 025 mm) a cada uno de los bordes largos (veacutease la figura 1)

54 Caacutemara de electroenfoque con placa de refrigeracioacuten (por ejemplo 265 times 125 mm) con fuente de alimentacioacuten adecuada (ge 25 kV) o equipo automaacutetico de electroforesis

55 Criostato de circulacioacuten termostatizado a 12 plusmn 05 degC

56 Centriacutefuga ajustable a 3 000 g

57 Tiras de electrodos (ge 265 mm de longitud)

58 Frascos de plaacutestico para el goteo de las soluciones anoacutedica y catoacutedica

59 Aplicadores de la muestra (10 times 5 mm papel de filtro de escasa adsorcioacuten de proteiacutenas o viscosa)

510 Placas de cristal o acero inoxidable para tentildeir y decolorar (por ejemplo bandejas de instrumentos de 280 times 150 mm)

512 Homogeneizador de varilla ajustable (10 mm de diaacutemetro del cilindro velocidad entre 8 000 y 20 000 rpm)



515 Soldador de peliacuteculas

516 Micropipetas de 25 μl

517 Concentrador a vaciacuteo o liofilizador

518 Bantildeo Mariacutea termostatizado a 35 y 40 plusmn 1 degC con agitador

519 Equipo de densitometriacutea capaz de medir a λ = 634 nm

6 PROCEDIMIENTO

61 Preparacioacuten de la muestra

611 Aislamiento de las caseiacutenas

Se pesa la cantidad equivalente a 5 g de peso seco de queso o de patroacuten de referencia en un tubo de centriacutefuga de 100 ml se antildeaden 60 ml de agua destilada y se homogeneiza con un homogeneizador de varilla (8 000- 10 000 rpm) Se ajusta el pH a 46 con aacutecido aceacutetico diluido (451) y se centrifuga (5 minutos 3 000 g) Se decantan la grasa y el suero se homogeneiza el residuo a 20 000 rpm en 40 ml de agua destilada [con el pH ajustado a 45 con aacutecido aceacutetico diluido (451)] se antildeaden 20 ml de diclorometano (452) se homogeneiza de nuevo y se centrifuga (5 minutos 3 000 g) Con una espaacutetula se extrae la capa de caseiacutena que se halla entre las fases acuosa y orgaacutenica (veacutease la figura 2) y se decantan ambas fases Se vuelve a homogeneizar la caseiacutena en 40 ml de agua destilada (veacutease maacutes arriba) y 20 ml de diclorometano (452) y se centrifuga Se repite esta operacioacuten hasta que las dos fases de extraccioacuten sean incoloras (2 o 3 veces) Se homogeneiza el residuo de proteiacutena con 50 ml de acetona (453) y se pasa a traveacutes de un filtro de papel de pliegues de velocidad media Se lava dos veces el residuo que queda en el filtro con 25 ml de acetona cada vez y se deja secar al aire o en corriente de nitroacutegeno despueacutes se pulveriza bien en mortero

Nota la caseiacutena aislada seca debe conservarse a ndash 20 degC

612 Ruptura de las β-caseiacutenas con plasmina para intensificar las γ-caseiacutenas

Se suspenden 25 mg de caseiacutenas aisladas (611) en 05 ml de solucioacuten amortiguadora de carbonato amoacutenico (471) y se homogeneiza durante 20 minutos por ejemplo con ultrasonidos Se calienta a 40 degC y se antildeaden 10 μl de plasmina (472) se mezcla y se incuba durante una hora a 40 degC sin dejar de agitar Para inhibir la enzima se antildeaden 20 μl de solucioacuten de aacutecido ε-aminocaproico (473) y se antildeaden despueacutes 200 mg de urea soacutelida y 2 mg de ditiotreitol

Nota para obtener mayor simetriacutea en las bandas de caseiacutena enfocada es conveniente liofilizar la solucioacuten tras antildeadir el aacutecido ε-aminocaproico y disolver despueacutes el residuo en 05 ml de solucioacuten amortiguadora de disolucioacuten de proteiacutenas (46)


62 Preparacioacuten de los geles de poliacrilamida con urea

Con ayuda de unas cuantas gotas de agua se extiende la hoja de soporte del gel (52) sobre una placa de vidrio (51) y se elimina el exceso de agua con toallas o pantildeuelos de papel Se extiende la hoja de cobertura (53) con espaciadores (025 mm) sobre otra placa de vidrio de la misma forma Se coloca la placa horizontalmente sobre una mesa de nivelacioacuten

Se antildeaden 10 μl de Temed (4131) a la solucioacuten de gel preparada y desgasificada (412) se agita y se antildeaden 10 μl de solucioacuten de PER (4132) se mezcla bien y se vierte de inmediato y uniformemente en el centro de la hoja de cobertura Se coloca un extremo de la placa de soporte del gel (con la cara de la hoja hacia abajo) sobre la placa de la hoja de cobertura y se baja lentamente de manera que se forme una peliacutecula de gel entre las hojas extendieacutendose de forma regular y sin burbujas (figura 3) Con una fina espaacutetula se hace bajar cuidadosa y completamente la placa de soporte del gel y se colocan otras tres placas de vidrio encima para que actuacuteen de peso Una vez completada la polimerizacioacuten (alrededor de 60 minutos) se extrae el gel polimerizado sobre la hoja de soporte del gel junto con la hoja de cobertura dando golpecitos en las placas de vidrio Se limpia cuidadosamente el reveacutes de la hoja de soporte para eliminar los residuos de gel y la urea Se suelda el ldquoemparedado de gelrdquo para formar un tubo de peliacutecula y se guarda en frigoriacutefico (durante 6 semanas como maacuteximo)

Nota la hoja de cobertura con los espaciadores puede volver a utilizarse El gel de poliacrilamida puede cortarse en trozos maacutes pequentildeos lo que es recomendable cuando hay pocas muestras o si se utiliza un equipo automaacutetico de electroforesis (dos geles de 45 times 5 cm)

63 Isoelectroenfoque

Se graduacutea el termostato de refrigeracioacuten a 12 degC Se frota el reveacutes de la hoja de soporte del gel con queroseno y despueacutes se dejan caer unas cuantas gotas de queroseno (42) sobre el centro del bloque de refrigeracioacuten Se extiende encima el ldquoemparedado de gelrdquo con la cara del soporte hacia abajo con cuidado para evitar la formacioacuten de burbujas Se enjuga el exceso de queroseno y se quita la hoja de cobertura Se empapan las tiras de los electrodos con las soluciones electroacutedicas (43 y 44) se cortan para ajustarlas a la longitud del gel y se colocan en los lugares previstos (a 95 cm de distancia de los electrodos)

Condiciones del isoelectroenfoque

631 Tamantildeo del gel 265 times 125 times 025 mm

Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)

Intensidad de corriente

(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)

1 Pre-enfoque 30 maacutexima

2 500

maacutexima

15

constante 4 aprox 300

2 Enfoque de la muestra (1) 60 maacutexima

2 500

maacutexima

15

constante 4 aprox 1 000

3 Enfoque final 60 maacutexima

2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000

(1) Aplicacioacuten de la muestra tras el pre-enfoque (etapa 1) se pipetean en los aplicadores de muestras (10 times 5 mm) 18 μl de la muestra y de las soluciones patroacuten se ponen sobre el gel a intervalos de 1 mm entre siacute y a 5 mm longitudinalmente respecto al aacutenodo y se presiona levemente Se efectuacutea el enfoque en las condiciones citadas retirando con cuidado los aplicadores de muestra tras 60 minutos de enfoque de la muestra

Nota si se modifica el espesor o la anchura de los geles habraacute que ajustar convenientemente los valores de intensidad y potencia (por ejemplo habraacute que duplicar los valores de intensidad de corriente eleacutectrica y de potencia si se utiliza un gel de 265 times 125 times 05 mm)


632 Ejemplo de programa de tensioacuten para un equipo automaacutetico de electroforesis (2 geles de 50 times 45 cm) cuyos electrodos sin tiras se aplican directamente al gel

Etapa Tensioacuten Intensidad de corriente Potencia Temperatura Voltios-hora

1 Pre-enfoque 1 000 V 100 mA 35 W 8 degC 85 Vh

2 Enfoque de la muestra 250 V 50 mA 25 W 8 degC 30 Vh

3 Enfoque 1 200 V 100 mA 35 W 8 degC 80 Vh


El aplicador de muestra se coloca en la etapa 2 a 0 Vh

El aplicador de muestra se retira en la etapa 2 a 30 Vh

64 Tincioacuten de las proteiacutenas

641 Fijacioacuten de las proteiacutenas

Se retiran las tiras de los electrodos inmediatamente despueacutes de cortar la corriente y se pone el gel inmediashytamente en un recipiente de tincioacutendecoloracioacuten con 200 ml de fijador (49) se deja durante 15 minutos agitando continuamente

642 Lavado y tincioacuten de la placa de gel

Se escurre totalmente el fijador y se lava la placa de gel dos veces durante 30 segundos cada vez con 100 ml de solucioacuten decolorante (410) Se retira la solucioacuten decolorante y se llena el recipiente con 250 ml de solucioacuten colorante (4113) se tintildee durante 45 minutos con agitacioacuten suave

643 Decoloracioacuten de la placa de gel

Se retira la solucioacuten colorante se lava la placa de gel dos veces con 100 ml de solucioacuten decolorante (410) cada vez despueacutes se agita durante 15 minutos con 200 ml de solucioacuten decolorante y se repite la etapa de decoloracioacuten al menos 2 o 3 veces hasta que el fondo se vea claro e incoloro A continuacioacuten se enjuaga la placa de gel con agua destilada (2 times 2 minutos) y se deja secar al aire (de 2 a 3 horas) o con un secador de pelo (de 10 a 15 minutos)

Nota 1 la fijacioacuten el lavado la tincioacuten y la decoloracioacuten se deben realizar a 20 degC No deben emplearse temperaturas elevadas

Nota 2 si se prefiere utilizar una tincioacuten de plata (por ejemplo Silver Staining Kit Protein Pharmacia Biotech Coacutedigo no 17-1150-01) de mayor sensibilidad las muestras de caseiacutena tratadas con plasmina deben diluirse a 5 mgml

7 EVALUACIOacuteN

La evaluacioacuten se realiza comparando las manchas de proteiacutenas de la muestra desconocida con los patrones de referencia en el mismo gel La deteccioacuten de leche de vaca en quesos de leche de oveja leche de cabra y leche de buacutefala o sus mezclas se realiza por medio de las γ3- y γ2-caseiacutenas cuyos puntos isoeleacutectricos se situacutean entre los pH 65 y 75 (figuras 4a 4b y 5) El liacutemite de deteccioacuten es inferior al 05

71 Estimacioacuten visual

Para la evaluacioacuten visual de la cantidad de leche de vaca es conveniente ajustar las concentraciones de las muestras y patrones para obtener el mismo nivel de intensidad de las γ2- y γ3-caseiacutenas de oveja cabra y buacutefala (veacutease ldquoγ2 EGBrdquo y ldquoγ3 EGBrdquo en las figuras 4a 4b y 5) A continuacioacuten podraacute evaluarse directamente la cantidad de leche de vaca (menor igual o mayor que el 1 ) en la muestra desconocida comparando la intensidad de las γ3- y γ2-caseiacutenas de vaca (veacutease ldquoγ3 Crdquo y ldquoγ2 Crdquo en las figuras 4a 4b y 5) con las de los patrones de referencia del 0 y el 1 (oveja cabra) o con los patrones provisionales de laboratorio (buacutefala)


72 Estimacioacuten densitomeacutetrica

Cuando sea posible se aplica la densitometriacutea (519) para determinar la relacioacuten de las aacutereas de los picos de las γ2- y γ3-caseiacutenas de vaca con respecto a las de oveja cabra y buacutefala (veacutease la figura 5) Este valor se compara con la relacioacuten de las aacutereas de los picos de las γ2- y γ3-caseiacutenas del patroacuten de referencia del 1 (oveja cabra) o del patroacuten provisional de laboratorio (buacutefala) analizados en el mismo gel

Nota el meacutetodo funciona satisfactoriamente si se encuentra una sentildeal positiva clara de las dos caseiacutenas de vaca (γ2 y γ3) en el patroacuten de referencia del 1 pero no en el del 0 En caso contrario deberaacute optimizarse el procedimiento respetando los detalles del meacutetodo con precisioacuten

Una muestra se consideraraacute positiva cuando las dos caseiacutenas de vaca (γ2 y γ3) o las relaciones de las aacutereas de los picos correspondientes sean iguales o superiores al nivel del patroacuten de referencia del 1

8 BIBLIOGRAFIacuteA

Addeo F Moio L Chianese L Stingo C Resmini P Berner I Krause I Di Luccia A Bocca A ldquoUse of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine andor caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2- caseinsrdquo Milchwissenschaft 45 708-711 (1990)

Addeo F Nicolai MA Chianese L Moio L Spagna Musso S Bocca A Del Giovine L ldquoA control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblottingrdquo Milchwissenschaft 50 83-85 (1995)

Krause I Berner I Klostermeyer H ldquoSensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte mdash and carrier ampholyteimmobilized pH gradient mdash isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifierrdquo En ldquoElectrophoresis-Forum 89rdquo (B J Radola ed) pp 389-393 Bode-Verlag Muumlnchen (1989)

Krause Ι Belitz H-D Kaiser K-P ldquoNachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw -kaumlse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelenrdquo Z Lebensm Unters Forsch 174 195-199 (1982)

Radola BJ ldquoUltrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester filmsrdquo Electrophoresis 1 43-56 (1980)

Figura 1

Esquema de la hoja de cobertura


Figura 2

Capa de caseiacutena flotando entre las fases acuosa y orgaacutenica tras la centrifugacioacuten

Figura 3

Teacutecnica de inclinacioacuten para moldear geles ultrafinos de poliacrilamida

a = cinta espaciadora (025 mm) b = hoja de cobertura (53) c e = placas de vidrio (51) d = solucioacuten de gel (412) f = hoja de soporte de gel (52)


Figura 4a

Isoelectroenfoque de caseiacutenas tratadas con plasmina de queso elaborado con leche de oveja y cabra con cantidades diferentes de leche de vaca

CM = porcentaje de leche de vaca C = vaca E = oveja G = cabra

Se muestra la mitad superior del gel de IEF

Figura 4b

Isoelectroenfoque de caseiacutenas tratadas con plasmina de queso elaborado con mezclas de leche de oveja cabra y buacutefala con cantidades diferentes de leche de vaca

CM = porcentaje de leche de vaca 1 + = muestra que contiene un 1 de leche de vaca en la que se ha inyectado caseiacutena pura de vaca a mitad del recorrido C = vaca E = oveja G = cabra B = buacutefala

Se muestra la distancia de separacioacuten total del gel de IEF


Figura 5

Superposicioacuten de densitogramas de patrones (STD) y muestras de quesos elaborados con una mezcla de leche de oveja y cabra tras el isoelectroenfoque

a b = patrones con 0 y 1 de leche de vaca c-g = muestras de quesos con 0 1 2 3 y 7 de leche de vaca C = vaca E = oveja G = cabra

La mitad superior del gel de IEF se leyoacute a λ = 634 nm


ANEXO IX

Evaluacioacuten de los anaacutelisis

1 Garantiacutea de calidad

Los anaacutelisis los realizaraacuten laboratorios designados de conformidad con el artiacuteculo 12 del Reglamento (CE) no 8822004 () o que designen las autoridades competentes del Estado miembro

2 Muestreo y controversias sobre los resultados de los anaacutelisis

1 El muestreo se efectuaraacute de acuerdo con la normativa aplicable al producto estudiado En caso de que no se prevean expresamente disposiciones sobre muestreo se utilizaraacuten las disposiciones establecidas en la norma ISO 707 Leche y productos laacutecteos Directrices para la toma de muestras

2 Los informes de laboratorio de los resultados de los anaacutelisis deberaacuten incluir suficiente informacioacuten para que se pueda hacer una evaluacioacuten de dichos resultados seguacuten el apeacutendice

3 Para los anaacutelisis exigidos por la normativa de la Unioacuten se tomaraacuten muestras por duplicado

4 En caso de controversia sobre los resultados el organismo pagador haraacute que se repita el anaacutelisis necesario del producto de que se trate debiendo correr con los costes la parte perdedora

El anaacutelisis antes mencionado se efectuaraacute siempre que se disponga de duplicados sellados de las muestras del producto que hayan sido conservados de forma adecuada por la autoridad competente El fabricante enviaraacute una solicitud al organismo pagador para realizar el anaacutelisis en el plazo de siete diacuteas laborables a partir de la notificacioacuten de los resultados del primer anaacutelisis El anaacutelisis deberaacute realizarlo el organismo pagador en el plazo de veintiuacuten diacuteas laborables a partir de la recepcioacuten de la solicitud

5 El resultado derivado del recurso seraacute el definitivo

6 Si el fabricante puede demostrar en el plazo de cinco diacuteas laborables desde la fecha del muestreo que este no se habiacutea efectuado de forma correcta se repetiraacute el muestreo siempre que sea posible Si no puede repetirse el muestreo se aceptaraacute el enviacuteo


Apeacutendice

Evaluacioacuten del cumplimiento de un enviacuteo respecto al liacutemite legal

1 Principio

Cuando la normativa aplicable al reacutegimen de intervencioacuten puacuteblica y al almacenamiento privado establezca procedishymientos de muestreo detallados deberaacuten seguirse esos procedimientos En todos los demaacutes casos se utilizaraacute una muestra formada por al menos tres unidades de muestra tomadas aleatoriamente del enviacuteo objeto de control Podraacute prepararse una muestra compuesta El resultado obtenido se compararaacute con los liacutemites legales calculando un intervalo de confianza del 95 como dos veces la desviacioacuten tiacutepica dependiendo la desviacioacuten tiacutepica corresponshydiente de si 1) el meacutetodo estaacute validado mediante colaboracioacuten internacional con valores de σr y σR o si 2) se ha calculado la reproducibilidad interna en caso de validacioacuten dentro del propio laboratorio Este intervalo de confianza se iguala entonces a la incertidumbre de la medicioacuten del resultado

2 El meacutetodo estaacute validado mediante colaboracioacuten internacional

En este caso se han establecido la desviacioacuten tiacutepica de la repetibilidad σr y la desviacioacuten tiacutepica de la reproducibilidad σR y el laboratorio puede demostrar el cumplimiento con las caracteriacutesticas de funcionamiento del meacutetodo validado

Se calcula la media aritmeacutetica x de las n mediciones repetidas

Se calcula la incertidumbre ampliada (k = 2) de x del modo siguiente

U frac14 2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi

σ2R minus n minus 1

n σ2

r

r

Si el resultado final x de la medicioacuten se calcula utilizando una foacutermula del tipo x = y1 + y2 x = y1 ndash y2 x = y1 y2 o x = y1y2 deberaacuten seguirse los meacutetodos normales para combinar desviaciones tiacutepicas en tales casos

Se considera que el enviacuteo no se ajusta al liacutemite superior legal UL si

x minus U gt UL

en caso contrario se considera que siacute cumple el UL

Se considera que el enviacuteo no se ajusta al liacutemite inferior legal LL si

x thorn U lt LL

en caso contrario se considera que siacute cumple el LL

3 Validacioacuten en el propio laboratorio con caacutelculo de la desviacioacuten tiacutepica de la reproducibilidad interna

En caso de que se utilicen meacutetodos no especificados en el presente Reglamento y no se hayan establecido medidas de la precisioacuten deberaacute efectuarse una validacioacuten en el propio laboratorio En las foacutermulas para calcular la incertidumbre ampliada U se utilizaraacuten la desviacioacuten tiacutepica de la repetibilidad interna sir y la desviacioacuten tiacutepica de la reproducibilidad interna siR en lugar de σr y σR respectivamente

En el punto 1 figuran las normas que deben seguirse para determinar la conformidad con el liacutemite legal Sin embargo si se considera que el enviacuteo no cumple el liacutemite legal habraacute que repetir las mediciones con el meacutetodo especificado en el presente Reglamento y el resultado se evaluaraacute seguacuten lo indicado en el punto 1

() Se ha visto que los productos Ampholinereg pH 35-95 (Pharmacia) y Resolytereg pH 5-7 y pH 6-8 (BDH Merck) son muy adecuados para conseguir la separacioacuten necesaria de las γ-caseiacutenas

() Reglamento (CE) no 8822004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificacioacuten del cumplimiento de la legislacioacuten en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud animal y bienestar de los animales DO L 165 de 3042004raquo


REGLAMENTO DE EJECUCIOacuteN (UE) 2018150 DE LA COMISIOacuteN de 30 de enero de 2018 por el que se modifica el Reglamento de Ejecucioacuten (UE) 20161240 en lo que se refiere a los meacutetodos para el anaacutelisis y la evaluacioacuten de la calidad de la leche y de los productos laacutecteos que pueden optar a la intervencioacuten puacuteblica y a la ayuda para el almacenamiento privado

b) el apartado 2 se sustituye por el texto siguiente

laquo2 Los meacutetodos utilizados para determinar la calidad de los cereales la mantequilla y la leche desnatada en polvo que pueden optar a la intervencioacuten puacuteblica contemplados en los anexos I IV y V respectivamente seraacuten los establecidos en las uacuteltimas versiones de las normas europeas o internacionales pertinentes seguacuten corresponda vigentes al menos seis meses antes del primer diacutea del periodo de intervencioacuten puacuteblica definido en el artiacuteculo 12 del Reglamento (UE) no 13082013raquo

2) Se inserta el artiacuteculo 60 bis siguiente

laquoArtiacuteculo 60 bis

Disposicioacuten especiacutefica sobre los controles relativos a la intervencioacuten puacuteblica y a la ayuda para el almacenashymiento privado de leche y productos laacutecteos

1 La admisibilidad de la mantequilla la leche desnatada en polvo y los quesos para recibir ayuda para el almacenashymiento privado se estableceraacute de conformidad con los meacutetodos establecidos en los anexos VI VII y VIII respectishyvamente

Esos meacutetodos se estableceraacuten por referencia a las uacuteltimas versiones de las normas europeas o internacionales pertinentes seguacuten corresponda vigentes al menos seis meses antes del primer diacutea del periacuteodo de intervencioacuten puacuteblica definido en el artiacuteculo 12 del Reglamento (UE) no 13082013

2 Los resultados de los controles efectuados aplicando los meacutetodos establecidos en el presente Reglamento se evaluaraacuten de acuerdo con el anexo IXraquo

3) Los anexos quedan modificados con arreglo a lo dispuesto en el anexo del presente Reglamento

Artiacuteculo 2

Queda derogado el Reglamento (CE) no 2732008

Artiacuteculo 3

El presente Reglamento entraraacute en vigor a los siete diacuteas de su publicacioacuten en el Diario Oficial de la Unioacuten Europea

El presente Reglamento seraacute obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro

Hecho en Bruselas el 30 de enero de 2018

Por la Comisioacuten

El Presidente Jean-Claude JUNCKER


ANEXO






laquoPARTE I bis














5 Muy bueno

Tipo ideal



5 Muy buena

Tipo ideal



5 Muy buenos

Tipo ideal



4 Bueno


4 Buena


4 Bueno





laquoPARTE I bis




Grasa ISO 1736

Agua ISO 5537

Acidez ISO 6091

Lactatos ISO 8069













Apeacutendice I





2 DEFINICIOacuteN




4 REACTIVOS






















5 INSTRUMENTAL













513 Equipo HPLC







6 MUESTREO


7 PROCEDIMIENTO























Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









ANEXO






laquoPARTE I bis














5 Muy bueno

Tipo ideal



5 Muy buena

Tipo ideal



5 Muy buenos

Tipo ideal



4 Bueno


4 Buena


4 Bueno





laquoPARTE I bis




Grasa ISO 1736

Agua ISO 5537

Acidez ISO 6091

Lactatos ISO 8069













Apeacutendice I





2 DEFINICIOacuteN




4 REACTIVOS






















5 INSTRUMENTAL













513 Equipo HPLC







6 MUESTREO


7 PROCEDIMIENTO























Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL










laquoPARTE I bis




Grasa ISO 1736

Agua ISO 5537

Acidez ISO 6091

Lactatos ISO 8069













Apeacutendice I





2 DEFINICIOacuteN




4 REACTIVOS






















5 INSTRUMENTAL













513 Equipo HPLC







6 MUESTREO


7 PROCEDIMIENTO























Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Apeacutendice I





2 DEFINICIOacuteN




4 REACTIVOS






















5 INSTRUMENTAL













513 Equipo HPLC







6 MUESTREO


7 PROCEDIMIENTO























Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









5 INSTRUMENTAL













513 Equipo HPLC







6 MUESTREO


7 PROCEDIMIENTO























Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL






















Inicial 40 60 0

01 40 60 01

50 40 60 01

60 40 60 10

65 40 60 10

90 36 64 10

100 20 80 10

115 16 84 10

120 16 84 10

160 10 90 10

190 0 100 10

200 0 100 10

210 40 60 10

290 40 60 10

300 40 60 0












761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL

















761 Pico del DPEF









siendo








91 Repetibilidad



92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









92 Reproducibilidad




Figura 1




Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Apeacutendice II





2 REFERENCIA


3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO




5 REACTIVOS
















6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









6 INSTRUMENTAL












6111 Bomba







7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL

























85 Calibracioacuten









siendo





siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL










siendo








siendo






siendo











siendo








931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL










931 Repetibilidad






siendo





















siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL












siendo



Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Apeacutendice III




3 DEFINICIOacuteN


4 PRINCIPIO


5 REACTIVOS




52 Eluyentes A y B









6 INSTRUMENTAL




















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL






















7 MUESTREO



8 PROCEDIMIENTO
















Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL














Cuadro 1


Tiempo (min)


Inicial 10 90 10

27 10 60 40 Lineal

32 10 10 90 Lineal

37 10 10 90 Lineal

42 10 90 10 Lineal



Siendo




















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL















85 Calibracioacuten











Siendo






W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL










W(E) = R times H(E)

Siendo






931 Repetibilidad



No determinada

933 Linealidad




Figura 1





laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL










laquoANEXO VI






Sal ISO 15648


ANEXO VII



Grasa ISO 1736


Agua ISO 5537


ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









ANEXO VIII










Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Apeacutendice


CABRA Y BUacuteFALA

1 OBJETO









4 REACTIVOS



Isoelectroenfoque



Se disuelven

485 g de acrilamida


4805 g de urea








24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL












24 mg de β-alanina




















452 Diclorometano

453 Acetona


Se disuelven


2403 g de urea











48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL















48 Patrones






49 Fijador














5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









5 EQUIPO



















6 PROCEDIMIENTO

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL

















Etapa Tiempo (min)

Tensioacuten (V)


(mA)

Potencia (W)

Voltios-hora (Vh)


2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

15



2 500

maacutexima

5

maacutexima

20

aprox 3 000

40 maacutexima

2 500

maacutexima

6

maacutexima

20

aprox 3 000

30 maacutexima

2 500

maacutexima

7

maacutexima

25

aprox 3 000





















7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL


























7 EVALUACIOacuteN









8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL













8 BIBLIOGRAFIacuteA






Figura 1



Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Figura 2


Figura 3




Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Figura 4a




Figura 4b





Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Figura 5





ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









ANEXO IX













Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









Apeacutendice


1 Principio








n σ2

r

r



x minus U gt UL



x thorn U lt LL









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