La degradación de tolueno por las enzimas de escisión en orto

Burkholderia fungorum FLU100

Daniel Dobslaw y Karl-Heinrich Engesser *

Departamento de Residuos Biológico de purificación de aire, Instituto

de Ingeniería Sanitaria y Calidad del Agua Residuos Sólidos

Gestión de la Universidad de Stuttgart, Bandtäle 2,

Stuttgart, D-70569, Alemania.

Sumario

Burkholderia fungorum FLU100 oxida simultáneamente

cualquier mezcla de tolueno, benceno y monohalogen

bencenos a (3-sustituido) con catecoles

una selectividad de casi el 100%. Metabolismo más

producido a través de las enzimas de las vías de escisión orto

con la mineralización completa. Durante la transformación

de 3-metilcatecol, 4-carboximetil-2-

metilbut-2-en-4-olida (2-metil-2-enelactone, 2-ML)

acumulada transitoriamente, siendo aún más mineralizada

sólo después de una fase de retardo de 2 h en el caso de las células pre-adultos

el benceno o mono-halógenas bencenos. No lag

fase, sin embargo, se produjo después de un crecimiento en tolueno.

Los cultivos inhibidos por cloranfenicol después del crecimiento

en benceno o mono-halógeno bencenos fueron incapaces

para metabolizar 2-ML suministra externamente, incluso después de

incubación prolongada. Una cultura de control cultiva con

tolueno no mostró ninguna fase de latencia y se usa 2-ML como

un sustrato. Esto significa que 2-ML es un intermediario

de la degradación de tolueno y convertida por específica

enzimas. La conversión de 4-metilcatecol como una

muy menor subproducto de la degradación del tolueno en

cepa FLU100 resultó en la acumulación de

4-carboximetil-4-metilbut-2-en-4-olida (4-metil-

2-enelactone, 4-ML) como un producto sin salida, excluyendo

su naturaleza como un posible intermedia. Por lo tanto, 3-

metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 3-metilcatecol,

Muconate 2-metilo y 2-ML fueron identificados como

intermedios centrales de escisión orto productiva

vías para el metabolismo de tolueno en B. fungorum

FLU100.

Introducción

Debido al uso generalizado de alquilo, así como halógeno

bencenos como reactivos y disolventes en la industria química,

pertenecen al top ten de las más frecuentes que aparecen

contaminantes en el agua y el suelo (UBA, 2013). Biológica

descontaminación de estos sitios es altamente interesante

debido a sus bajos costos y carácter "baja tecnología"

(Christodoulatos et al., 1996; Johnson y Odencrantz,

1,999; Kao y Borden, 1999; Smul Sachsen, 2000; Kao

y Prosser, 2001; Kao et al., 2006; Farhadian et al.,

2008). En contraste, la degradación de cócteles de contaminantes

todavía es problemática (Corseuil et al., 1998; Lovanh

et al., 2002), particularmente con respecto a las mezclas de chloroand

compuestos aromáticos sustituidos con metilo.

El clorobenceno es el mono-halógeno más ampliamente utilizado

benceno. Se convierte en primer lugar (cloro-) catecoles

como intermediarios centrales vía dioxigenación del

anillo aromático que forma chlorocyclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles

(Reineke y Knackmuß, 1984;. Beil et al, 1997), a través de dos

sucesivas monooxygenations producen clorofenoles

como productos intermedios, o por medio inicial (Yen et al., 1991)

formando fenol deshalogenación (Zhang et al., 2011).

Chlorocatechols generalmente se transforman adicionalmente por

intradiol (orto) la escisión del anillo formando cloro-cis / cismuconates

(Dorn y Knackmuß, 1978; Schlömann,

1994; Reineke, 1998; Zerlin, 2.004; Gröning et al.,

2012). La posterior conversión se lleva a cabo por una

chloromuconate cycloisomerase formando directamente dienelactone

Con intermediario (-en-4-olides 4-carboxymethylenebut-2)

deshalogenación (Schmidt et al, 1980;. Kuhm

et al., 1990; Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlömann,

1995; Reineke, 1998), o indirectamente a través de chloromuconolactones

y la subsiguiente deshalogenación (Vollmer et al.,

1994; Moiseeva et al., 2002; Skiba et al., 2002; Nikodem

et al., 2003; Gröning et al., 2012). Los dienelactones son

más escindido hidrolíticamente a maleílo ser acetato

reducida en el siguiente paso para 3-oxoadipate, un centro de

metabolito de la vía 3-oxoadipate (Reineke, 1998).

La degradación de fluorobenceno, bromobenceno y

yodobenceno procede de una manera similar a la degradación

de clorobenceno (Strunk, 2000; 2007;. Carvalho et al,

2006; 2007; 2009; Strunk et al., 2006; Moreira et al.,

2013; Strunk y Engesser, 2013).

Tolueno como ampliamente utilizado aromático sustituido con alquilo

ya sea compuesto se convierte en methylcatechols, catecol o 3,4-dihidroxibenzoato como productos intermedios centrales.

Formación de methylcatechols - similar a

chlorocatechols - se lleva a cabo ya sea a través de dioxigenación

el anillo aromático formando metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-

diolefina (Gibson et al, 1974;. Zylstra et al., 1988; Warhurst

et al., 1994; Cho et al., 2000; Kim et al., 2002; Cafaro

et al., 2005; Chaikovskaya et al., 2008) oa través de dos sucesivos

monooxygenations con cresoles como intermedios.

En segundo lugar, el tolueno puede ser transformada a través de la cadena lateral catecol

oxidación formando alcohol bencílico, benzaldehído y

benzoato como productos intermedios (Worsey y Williams, 1975;

Harayama, 1994). Por último, la transformación de tolueno para 3,4-

dihidroxibenzoato a través de p-cresol y 4-hidroxibenzoato

También se ha descrito (Richardson y Gibson, 1984;

Escudos et al., 1989; Kaphammer et al., 1990; Yen et al.,

1.991). Posteriormente, methylcatechols suelen ser mineralizada

por extradiol (meta) la escisión del anillo (Hou et al., 1977;

Taeger et al., 1988; Reineke, 1998).

Mientras que la mineralización de alquilarse o halogenado

aromáticos como sustratos únicos es no crítica con la mayoría

bacterias, mezclas de esos compuestos son difícilmente biodegradable,

basado preferentemente en la incompatibilidad de

itinerarios individuales con potencial de formación de reactivo

intermedios en caso de la vía de escisión meta

(Klecka y Gibson, 1981; Knackmuß, 1981; Bartels

et al., 1984; Rojo et al., 1987; Pettigrew et al., 1991). Sólo

unas pocas cepas son capaces de hacer frente a sustituido cloro-

catecoles través de la vía de escisión de meta. No obstante, en

la mayoría de estas cepas, la inactivación de la meta

pyrocatechase solamente se compensa parcialmente por la reactivación

o caro continuar la síntesis de novo (Oldenhuis

et al., 1989; Haigler et al., 1992; Arensdorf y Focht,

1994; 1995; Hollender et al., 1994; 1997; Wieser et al.,

1994; Heiss et al., 1997; Marte et al., 1997; 1,999;

Franck-Mokross y Schmidt, 1998; Kaschabek

et al., 1998; Riegert et al., 1998; 1,999; Göbel et al.,

2004).

La segunda alternativa para mineralizar mezclas de alkyland

compuestos aromáticos sustituidos con halógeno es degradar no sólo

los catecoles halogenados, sino también-alquilo sustituido

compuestos aromáticos como el tolueno a través de vías orto. El orto

la escisión de methylcatechols como una reacción individual

fue descrito colector en la literatura. Por ejemplo,

4-metilcatecol se convirtió en 4-carboximetil-4-

metilbut-2-en-4-olida (4-metil-2-enelactone, 4-methylmuconolactone,

4-ML) es un metabolito sin salida en

la mayoría de las cepas que poseen vías de escisión orto

(Catelani et al, 1971;. Rojo et al, 1987;. Sovorova

et al., 2006; Marín et al., 2010). Sin embargo, Cupriavidus

necator JMP134 (Pieper et al., 1985; 1,988; 1,990;

Bruce et al., 1989), Rhodococcus opacus 1CP

(Sovorova et al., 2006) y Pseudomonas knackmussii

B13 FR1 (pFRC20p), una cepa genéticamente modificada

(Rojo et al., 1987), fueron capaces de eludir esta botella

cuello por una enzima isomerasa, cambiando el metilo

grupo de 4-posición a la posición 3 con el fin de conseguir

3-methylmuconolacton (4-carboximetil-3-metilbut-2-

en-4-olida), que era un sustrato de crecimiento para cada

cepa.

Sin embargo, el principal obstáculo para la degradación de

tolueno a través de reacción de escisión orto es el hecho de que

principalmente 3-metilcatecol se forma como un intermedio de

la oxidación del anillo. Este intermedio es mayor

transformado a 2-metil-cis, ácido cis-mucónico seguido de

formación de 4-carboximetil-2-metilbut-2-en-4-olida

(2-metil-2-enelactone, 2-methylmuconolactone, 2-ML),

que con frecuencia se ha descrito a ser un callejón sin salida

metabolito.

Hasta ahora, sólo unos pocos autores describieron una productiva

mineralización de 2-ML. Taeger et al. 2-ML utilizado como sustrato

para enriquecimientos obtención de cepas bacterianas totalmente

mineralización 2-ML. Sin embargo, la exposición de estas cepas

a 3-metilcatecol, enzimas de escisión de la meta

vía fueron inducidos (Taeger et al., 1988). Pettigrew

et al. encontrado un mutante de Pseudomonas sp. JS150, llamado

JS6, que tenía un defecto en la catecol-2,3-dioxigenasa

y por lo tanto era incapaz de escindir 3-metilcatecol por

vía meta (Pettigrew et al., 1991). Además,

3-metilcatecol era mineralizada por un orto modificado

Camino con 2-ML como intermedio. Sin embargo, tolueno

hubo inductor de esta vía orto y la cepa nativa

mineralización preferido de tolueno por escisión meta

vía. Resultados similares fueron encontrados con Ralstonia sp.

PS12 (Lehning, 1998). Franck-Mokross y Schmidt

informó acerca de la cepa de Pseudomonas sp. D7-4

siendo capaces de degradar m-toluato productivamente a través

3-metilcatecol y 2-ML mediante el uso modificado orto

enzimáticos (Franck-Mokross y Schmidt, 1998).

Sin embargo, 2-ML acumula temporalmente y era aún más

mineralizado después de una fase de latencia que dura unos pocos horas.

Consistentemente, esta cepa no fue capaz de mineralizar

tolueno.

Hemos descrito previamente la cepa Burkholderia

fungorum FLU100 poder mineralizar todas monohalogenado

bencenos, benceno y tolueno como pura

sustancias por una vía de escisión orto (Strunk, 2000;

2007; Dobslaw, 2003; Strunk et al., 2006; Strunk y

Engesser, 2013). Hemos postulado 2-ML como intermedio de

la vía de degradación tolueno.

En el presente artículo, mostramos los datos claramente demostrando

2-ML como el principal producto intermedio en la producción

degradación de tolueno por escisión orto modificado

enzimas así como la capacidad de la cepa para FLU100

degradar mezclas de benceno, tolueno y monohalogen

bencenos simultáneamente. Para nuestro conocimiento,

esta es la primera descripción de una funcional, no ingenieril

orto vía para la degradación total de

tolueno.

Resultados y discusión

La degradación simultánea de mezclas de

compuestos aromáticos

Fungorum Burkholderia FLU100 fue capaz de degradar cualquier

mezcla de los compuestos aromáticos benceno, tolueno,

fluorobenceno, clorobenceno, bromobenceno, así como

yodobenceno simultáneamente presentado como suela de carbono

fuente sin observar una fase de latencia. El aumento de la

número de compuestos, la transformación-sustrato específico

tasas disminuyeron. Sin embargo, la suma de la específica

tasas de transformación se quedaron casi constante durante cada

serie de pruebas. Por lo tanto, la transformación de cada sustrato parece

para ser llevada a cabo por el mismo dioxigenasa inicial previamente

descrito (Strunk y Engesser, 2013).

Los extractos de medios de cultivo con 0,25% FLU100

dimetilformamida (DMFA) y 2 a 3 mmol l-1 aromático

compuestos como concentraciones de inicio mostraron transformación

tasas de entre 90 y 120 mg l-1 C-1 h-1 OD

Y

180 mg l-1 C-1 h-1 OD al máximo en caso de óptima

condiciones de inducción (Apoyo a la Información Tabla S1).

Muestras acuosas sin DMFA, analizados por un alto

cromatografía líquida - sistema con

UV / detector de luz visible (HPLC-UV / VIS), reveló tasas de hasta

a 280 mg l-1 C-1 h-1 OD en el caso de tolueno como suela de carbono

fuente que muestra el efecto tóxico de DMFA. Sin embargo, el

tasas de transformación-sustrato específico reflejan diferencias

en la afinidad de la enzima por diferentes sustratos

(en mg l-1 C-1 h-1 OD

: Tolueno, 280; benceno, 178;

fluorobenceno, 127; clorobenceno, 159).

Como se muestra, la máxima velocidad de transformación específico para

tolueno con FLU100 en caso de concentraciones variables de

tolueno fue 280 mg l-1 C-1 h-1 OD y se mantuvo estable

con la disminución de las concentraciones de tolueno a 60 mg

tolueno · l-1

. De esta manera, un valor de Ks de 30 mg tolueno · l-1 podía

ser calculado.

Influencia del valor del pH en el comportamiento de la mineralización

de tolueno

La transformación de altas cantidades de tolueno, benceno o monohalogen

bencenos como sustratos únicos, así como en cualquier

mezcla, los sobrenadantes de cultivo y las células se tiñeron de FLU100

negro. Esto es debido a una polimerización dependiente del pH bien conocida

de (sustituido) catecoles tan pronto como que están siendo

acumulada. Por lo tanto, la tasa de escisión de catecoles es una

cuello de botella en la vía de degradación de estos compuestos aromáticos

impidiendo arriba-escala para aplicaciones a gran escala. La cantidad

de productos polimerizados fotométricamente fue analizado

reducida mediante la reducción del valor del pH del medio de cultivo

a partir de 7.15 a 5.0. En consecuencia, HPLC correspondiente

análisis mostraron un incremento en la concentración de

2-methylmuconate (Apoyo a la Información Fig. S1) como

así como un metabolito siendo desconocido con mayor lipofilia

de 3-metilcatecol. Obviamente, bajo este régimen,

mayores cantidades de metilcatecol podrían ser enzimáticamente

metabolizado sin sufrir autooxidación química.

Relaciones de captación de oxígeno-sustrato específico

Strain FLU100 degrada un amplio espectro de compuestos aromáticos,

favoreciendo una amplia aplicación en la biorremediación posible.

El potencial de oxidación de las enzimas iniciales se caracterizó

mediante la medición de las tasas específicas para la absorción de oxígeno

diferentes fuentes de carbono en dependencia de fluorobenceno,

tolueno y benceno como sustratos pre-cultivo, permitiendo

para juzgar el número de enzimas iniciales mediante el análisis de

las tasas de transformación máximas relativas. El correspondiente

Los resultados se muestran en la información de apoyo

Tablas S2 y S3. Todos los resultados están estandarizados para el tolueno

o catecol como 100%, respectivamente. Estos datos están dando

el resultado promedio de varios experimentos independientes

cada uno realizado por doble.

Con la excepción del valor de fluorobenceno en

fluorobenceno células cultivadas, las actividades específicas relativas

para cada sustrato fueron casi independiente de la precultivo

condiciones. Por lo tanto, la misma inicial oxigenasa

parece estar inducida independientemente de la naturaleza de

diferentes derivados de benceno. Como únicas actividades bajo posible

medirse con los derivados de fenol probados, así como

con alcohol bencílico y benzoato, la enzima inicial más

probablemente es una dioxigenasa oxidante directamente con el aromático

anillo. No hay actividad para la oxidación de la cadena lateral, que es una posible

, no se observó reacción en el caso de tolueno. Actualmente,

no tienen ninguna prueba para explicar la mayor actividad de fluorobenceno

después del crecimiento en fluorobenceno. La existencia de una especial

sistema de transporte para fluorobenceno en las células inducidas

por fluorobenceno es la explicación más probable.

En contraste con la dioxigenasa inicial, la absorción de oxígeno

los valores de las enzimas de escisión dependen fuertemente de catecol

el tipo de sustrato de crecimiento. La captación absoluta de oxígeno

de casi 2.100 U en el caso de las células pre-cultivan en

fluorobenceno era 10 veces mayor que el medido para

células tolueno y 20 veces mayor que la de las células crecidas con anterioridad

en benceno (ver información de apoyo Tabla S3).

Esto intensifica la expresión de la escisión catecol

enzimas en caso de fluorobenceno pueden reflejar y compensar

las actividades relativas más bajas para la escisión del anillo de

3-fluorocatechol con el fin de evitar su acumulación y

autooxidación.

En general, muconates se describen como inductores de

catecol vías de escisión orto (Feist y Hegeman,

1969). De acuerdo a la literatura, a 2 halomuconates son

inductores fuertes de la vía chlorocatechol modificado

de 2-methylmuconate o no sustituido muconate

(Reineke, 1998). Sin embargo, la comparación de la relación

actividades para muconates en células pre-cultivan en fluorobenceno

o tolueno, respectivamente, mostraron una alta similitud. En Por el contrario, se encontraron las células cultivadas en benceno a fuertemente

desviarse de este patrón, lo que indica la presencia de una

vía orto adicional, ser demasiado específico para tolerar

sustituyentes voluminosos en los sustratos. Por lo tanto, es tolueno

transformado principalmente por la vía orto modificado con

chlorocatechol-1,2-dioxigenasa como la enzima inicial, seguido

por una enzima de amplio especificidad como chloromuconate

cycloisomerase.

La prueba de la naturaleza de la enzima dioxigenasa inicial

acumulación de sus productos

La existencia de una enzima dioxigenasa inicial fue también

a prueba por un transposón mutante de la cepa FLU100, llamado

FLU100 P2R5 (Strunk, 2007), donde el transposón

se insertó dentro del elemento de benceno dihydrodioldehydrogenase

que codifica la secuencia del gen. Durante el volumen de negocios

de tolueno, la 3-metilciclohexa-3,5- correspondientes

dieno-1,2-diol acumulada en el sobrenadante. Esta

diendiol se puede volver a aromatizado también químicamente por el calor

tratamiento para 5 min en condiciones ácidas produciendo el

o-cresol correspondiente cuantitativamente. Para todos monohalogen

bencenos, tolueno y benceno, el correspondiente

diendiols se transformaron en compuestos fenólicos,

que fueron identificados y verificado por comercial

normas.

En segundo lugar, se produjeron las mismas estructuras diendiol

por Escherichia coli pST04, un análogo de la cepa

pSTE44, que contenía regulado operón lac un

dioxigenasa tetraclorobenceno. Esta cepa, así como

los productos de la transformación fue anteriormente descritos en

literatura con más detalle (Pollmann et al., 2003). Esta

establece claramente la naturaleza de 3-metilciclohexa-3,5-

dieno-1,2-diol para ser el director intermedia del

oxidación de tolueno en FLU100 después del crecimiento con

tolueno.

Por otra parte, el uso de FLU100 P2R5, hemos sido capaces de

producir y aislar estas estructuras diendiol para los seis

sustratos aromáticos (para estructuras diendiol de benceno,

tolueno y fluorobenceno, ver información de apoyo

Fig. S2) y, además, los utilizaron como sustratos en la conversión

experimentos. Se siguió el proceso de conversión

por análisis de HPLC. Durante la conversión de la

3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, por ejemplo, un temporal

acumulación de otros intermedios de tolueno

la degradación, a saber, 3-metilcatecol, 2-metil-cis, cismuconic

ácido, así como 2-ML se observó, de nuevo proponer

el camino del metabolismo de tolueno para seguir la ruta

para-halo benceno degradación hasta el nivel de metilo

lactona.

La tasa de conversión del compuesto en comparación diendiol

con tasas de conversión de 3-metilcatecol,

Ácido 2-methylmuconic y 2-ML era extremadamente alta. En

caso de 3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, casi

0,6 mmol l-1 del sustrato, equivalentes al 50% de la

concentración suministrado, se convirtió biológicamente a la

catecol correspondiente dentro de 5 min (Fig. 1). Porque

retrasos de HPLC análisis, la tasa de conversión de

diendiol entre la segunda y tercera mediciones

fue trasladado a la Tabla 1, que muestra la conversión absoluta

tarifas de todos los sustratos y productos intermedios relevantes para las células

pre-crecido en tolueno.

GRAFICAIdentificación de 3-metilcatecol y 2-metil-cis /

ácido como otros intermedios cis-mucónico del tolueno

vía de degradación

Catecoles correspondientes se formaron fuera de la

intermedios diendiol por deshidrogenación utilizando viable

las células (Fig. 1). La identificación se realizó utilizando una

cromatógrafo de gases con un espectrómetro de masas como detector

(GC-MS) y el análisis del concentrado orgánico

fase después de una extracción con acetato de etilo tres veces

así como la metilación de la fase orgánica con

diazometano. Para tolueno, 3-metilcatecol (antes

metilación) y 2-metoxi-3-metilfenol (después de

metilación) se identificaron mediante el uso disponible comercialmente

compuestos estándar (información de apoyo

Tabla S4).

Los catecoles de los seis sustratos se escindieron por una

orto vía escote y sin actividad de escisión meta

fue observado. Medición de la absoluta y relativa

actividades de conversión de células enteras, así como el crudo

extractos de FLU100 cepa mostraron un patrón de actividad

con una baja similitud con el patrón en la conversión

P. knackmussii B13 (Dorn y Knackmuß, 1978). En

Por el contrario, el patrón de actividad de FLU100 reveló alta

similitud con el patrón de actividad típico para chlorocatechol-

1,2-dioxigenasa de B13 readoptado por los autores

(Dobslaw, 2003).

A pesar de que la cepa FLU100 es capaz de metabolizar

4-sustituidos catecoles, el principal, casi exclusivamente

productos de transformación formados de los derivados del benceno

examinados en este estudio son los correspondientes

Catecoles 3-sustituido. Estos catecoles son más

escindido a los correspondientes (2-sustituido) cis-cismuconic

ácidos. Estos ácidos mucónico fueron identificados por

comparación de tiempos de retención y espectros de longitud de onda

con sustancias de referencia producidas por E. coli Klon 4,

llevar plásmido pBBRCI, a partir del correspondiente

catecoles. Este mutante expresó chlorocatechol-1,2-

dioxigenasa regulado por un operón lac y anteriormente fue

descrito (Pérez-Pantoja et. al, 2003).

La naturaleza intermedio de 2-en methylmuconolactone

la vía de degradación de tolueno de FLU100

Mientras 2-halogenados mucónico ácidos se pueden transformar

de trans-dienlactone durante la formación del anillo de lactona /

eliminación de haluro por muconate-cycloisomerases (ver

por ejemplo Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlömann,

1995; Reineke, 1998; Moiseeva et al., 2.002), 2-

ácido methylmuconic como intermedio de tolueno no puede ser

transformado de esta manera, debido a que el grupo metilo no es

grupo saliente en absoluto. Se observó que la cycloisomerase

transformado ácido 2-methylmuconic a

2-methylmuconolactone (2-ML), que era más mineralizado.

No había indicios de la existencia de un

exocíclico 5-methylmuconolactone, un posible producto de

cicloisomerización alternativa de ácido 2-methylmuconic.

En contraste con la cepa Pseudomonas sp. D7-4 (FranckMokross

y Schmidt, 1998; Taeger et al., 1988;) y

otras cepas obtenidas por el enriquecimiento, el 2-ML y

3-metilbenzoato de metilo (Taeger et al., 1988), que también eran

capaces de mineralizar 2-ML, cepa FLU100 fue capaz de crecer

en tolueno como única fuente de carbono y energía.

Sin embargo, la transformación de 3-metilcatecol por las células de

FLU100 tensión pre-cultiva en benceno o monohalogen

bencenos, casi el 55-65% de la prevista

3-metilcatecol acumula temporalmente como 2-ML.

Además transformación se observó después de una fase de latencia de

2-3 horas (Fig. 2). Por el contrario, no hay o sólo pequeñas concentraciones

de 2-ML acumulado en caso de tolueno-inducida /

células en crecimiento (Fig. 3). Esto significa que las enzimas clave para

degradación de 2-ML solamente fueron inducidos después de la adaptación

en tolueno, pero no en benceno o mono-halógeno

bencenos.

Para probar esta interpretación y para evitar la inducción de

nuevas enzimas, los mismos experimentos se realizaron después

adición de cloranfenicol (CAP) como un inhibidor de

síntesis de proteínas. Las células inducidas con benceno o monohalogen

bencenos mostraron concentraciones similares de

2-ML acumular en el sobrenadante en comparación con

células no inhibido. Sin embargo, ninguna otra transformación

GRAFICAaparecido, incluso después de una incubación prolongada (Fig. 2). En

Por el contrario, no se detectó acumulación de 2-ML cuando

células utilizadas fueron inducidos previamente con tolueno (Fig. 3).

En un segundo experimento, una solución acuosa de

2-ML fue producido por la transformación completa de

3-methycatechol por las células de FLU100 crecido en benceno,

seguido de la posterior separación de las células. El final

concentración de 2-ML se ajustó a aproximadamente 1,7 mmol l-1

.

Esta solución se dividió y se añade a dos cultivos líquidos de

FLU100 tensión pre-cultiva en tolueno. Una de estas culturas

se ha complementado con la PAC. Ambos cultivos

transformado 2-ML sin mostrar fase de latencia en la transformación

tasas de 0,35 mmol l-1 h-1 OD-1 (cultivo sin PAC) y

0,17 mmol l-1 h-1 OD-1 (con CAP), respectivamente. La transformación

tarifa sin CAP fue dos veces mayor, porque

la formación de nuevas enzimas era posible (Fig. 3). Los

resultados de ambos conceptos experimentales confirmaron la

inducción de enzimas que transforman 2-ML-específicas en caso

de las células de FLU100 tolueno-metabolizar.

2-ML como metabolito se identificó por HPLC-MS y

GC-MS análisis e identidad estaba a prueba por comparación

con los datos de Knackmuß y colegas (1976) y

Pieper y sus colegas (1985), dan en la Tabla 2.

Una ruta alternativa teórica para dioxigenación tolueno

en posición 3,4, es decir, en meta y posición para la formación

4-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 4-metilcatecol,

3-metil-cis, ácido cis-4-mucónico y ML como productos intermedios,

se encontró que era no productiva. Metabolismo de ácido 4-

metilcatecol, añadido a las células enteras de FLU100, conducir a

acumulación estequiométrica de 4-ML como un callejón sin salida

metabolito (datos no mostrados). 4-ML en sí, así como

Metil éster de 4-methylmuconolactone como producto de reacción

después de metilación fueron identificados por GC-MS análisis (ver

Tabla 2).

GRAFICAPara identificar otros intermedios de 2-ML degradación

vía, los análisis se realizaron mediante el uso de HPLCs con

un detector de dispersión de luz por evaporación (HPLC-ELSD) o

un espectrómetro de masas (HPLC-MS). Sin embargo, ni

metabolitos de degradación de 2-ML eran reproducible

identificación detectable ni de compuestos detectados era

posible. Succinato de 2-metilo como hipotética intermedia

de la vía de degradación 2-ML, sin embargo, se utilizó como

un sustrato en experimentos de conversión. Considerando que la referencia

succinato de sustrato se transformó sin

mostrar ninguna fase de latencia, metilo sustituido succinato era

no se convierte en absoluto por las células enteras de FLU100 (ver Apoyo

Tabla de Información S5). Por lo tanto, la revelación de la

completa vía de degradación aguas abajo del intermedio

2-ML no tuvo éxito. Conversión máxima

las tasas de los intermedios identificados de la degradación de tolueno

por FLU100 pre-crecido en tolueno se dan en la Tabla 1.

La vía de degradación de la correlación se muestra en la Fig. 4.

Observaciones finales

Cepa fungorum Burkholderia FLU100 demostró mineralizar

tolueno sola y simultáneamente en cualquier mezcla

con benceno y bencenos mono-halógeno, incluso incluyendo

fluorobenceno. El ataque inicial en todos estos sustratos

por una dioxigenasa atacar el anillo aromático

producido en el correspondiente 3-sustituido cyclohexa-

3,5-dien-1,2-dioles, que se metabolizan a través de una deshidrogenasa

a las correspondientes 3- (sustituidos) catecoles.

Estos catecoles se escindieron casi exclusivamente por un

chlorocatechol-1,2-dioxigenasa al ácido mucónico

derivados. Sobre la base de la falta de actividad de escisión meta,

tolueno se atípicamente escindido por esta enzima orto resultante

en la formación de ácido 2-methylmuconic, seguido de

2-metil-2-eno-lactona (2-ML) como los siguientes pasos. En contraste

a la literatura, este último intermedio no es un callejón sin salida

metabolito. La mayor degradación de 2-ML by hasta ahora

enzimas desconocidas, inducidas por el crecimiento con tolueno,

queda aún por esclarecer.

Procedimientos experimentales

Las condiciones de cultivo de FLU100 (tipo salvaje

y mutantes)

Wild tipo de FLU100 cepa se cultivó a 30 ° C en 500 ml

frascos de vidrio que contienen 200 ml de un medio de sal mineral previamente

descrito (Dobslaw, 2003). Cerca de 20 l de tolueno,

benceno o mono-halógenas bencenos se añadió directamente a

este medio y los matraces se incubaron durante 48-72 h. Después

añadiendo 10-15 l de sustrato, los cultivos se incubaron adicionalmente

durante la noche y se recogieron por centrifugación. El sedimento se

se resuspendieron en medio fresco.

El P2R5 mutante de FLU100 cepa se obtuvo a través de

transposón mutagénesis por apareamiento con el destinatario FLU100

la cepa donante de E. coli pCro2a (ONACA et al., 2007) y

proyección de casi 16 800 mutantes. El plásmido lleva una

gen de resistencia a ampicilina para la detección de falsos positivos,

mientras que la pieza de inserción Tn5 lleva un gen de resistencia a kanamicina

y una secuencia ori. Los mutantes se seleccionaron por difusión

las células en placas de medio minerales que contienen 10 mmol l-1

glucosa y 100 mg l-1 de kanamicina. Colonias crecido eran

transferido a cultivos líquidos (20 ml de volumen) con el mismo

medio. La acumulación de los productos intermedios de la degradación aromático

se comprobó mediante la adición de 10 l de tolueno u otro

compuesto aromático y 200 l de una solución de glucosa 1 M

después de 48 h. Formación de intermedios se verificó la siguiente

día a través de análisis por HPLC.

Para la cuantificación de las concentraciones de compuestos aromáticos restantes

en el medio líquido a través de la extracción y el análisis de CG posteriores,

mezclas de compuestos aromáticos se suministran en DMFA

con concentraciones finales de 2 a 3 mmol l-1 y compuestos aromáticos

0,25% DMFA en el medio de cultivo. Se realizó extracción

usando diclorometano.

En el caso de experimentos de absorción de oxígeno, el sedimento se

resuspendieron en medio mineral fresca y de cultivo se

se agita a 30 ° C durante la noche sin suministro de sustratos. Como

preparación, el cultivo se airea, muestras de 3 ml de

la suspensión se introdujeron en un agitador templado 30 ° C y

la captación de oxígeno se registró. Para la medición de la

la absorción de oxígeno-sustrato específico, 30 l de una solución de sustrato

(c = 0,1 mol L-1

) fue añadido.

En el caso de experimentos extracto crudo, el centrifugado

pellets de FLU100 cepa, P. knackmussii B13 o E. coli

Klon 4, se lavaron dos veces con solución salina y

re-suspendido en 15 ml de una solución tampón Tris (8 gl-1

Tris, pH 8,0). Las células fueron rotas por la liberación de presión en

dos o tres carreras en una celda de presión francesa con 10 000 psi.

El extracto se centrifugó durante 10 min a 14 000 rpm a 4 ° C

y el sobrenadante libre de células se almacenó en hielo. En la conversión

pruebas de catecoles, 100 l de extracto crudo se

añadió a 1 ml de tampón Tris pH 8,0, y 900 l de desionizada

de agua y 26 l de ácido etilendiaminotetraacético

(c = 0,1 mol L-1

) En unos 4 ml fusionados cubeta de sílice. Después de la aireación

durante 1 min, 20 l de la catecol probado (c = 0,1 mol L-1

)

se añadió y el cambio en la extinción a 260 nm era

determinar. En caso de alta rotación, las muestras fueron

medido por análisis de HPLC a 210 nm y 260 nm

longitudes de onda. La cuantificación de las tasas de conversión (mol

l

-1 Min-1 mg proteína-1

) Se realizó a través de la medición fotométrica

en ola de extinción máximo longitudes usando extinción

coeficientes dados por (Dorn y Knackmuß 1978). Los

concentración de proteínas se midió por el método de

Bradford.

Pruebas de conversión de catecoles en células enteras de la cepa

FLU100 se realizaron utilizando cultivos con densidades ópticas

de OD546nm = 1,5-2,5. Los cultivos se cultivan en primer lugar pre-en una

sustrato aromático, se centrifugó y resuspendió en nueva

medio mineral. Catecoles relevantes se añadieron en concentraciones finales

de 3 mmol l-1

. Las concentraciones de catecoles

y los intermedios correspondientes con el tiempo fueron observados por

HPLC análisis.

2-ML como se obtuvo sustrato para las pruebas de transformación a través de

conversión de 3-metilcatecol por células enteras de la cepa

FLU100 pre-crecido en benceno. Directamente después de transformación total

de 3-metilcatecol a 2-ML, mezclas de reacción se

centrifugó y el sobrenadante se utilizó directamente en la posterior

experimentos de conversión como solución de sustrato acuoso.

La solución puede ser almacenada a 4 ° C aproximadamente 1 semana. Evitar

la inducción de nuevas enzimas durante la transformación de 2-ML,

Se añadió la PAC como fármaco citostático (10 mg por 50 ml de reacción

volumen). Concentraciones reales de 2-ML en los matraces de reacción

se midieron por análisis de HPLC.

Las condiciones de cultivo de las cepas de E. coli

Todas las cepas de E. coli fueron pre-cultivan en medios de caldo lysogeny

que contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de

cloruro de sodio por litro de agua desionizada. El medio se

en autoclave a 121 ° C durante 30 min. Con la excepción de la cepa

pCro2a, se añadieron 2,5 mmol l-1 de la lactosa. Para el cultivo de

pCro2a, 100 mg l-1 de ampicilina y 50 mg l-1 de kanamicina

fueron agregados. En el caso de E. coli Klon 4, 100 mg l-1 de kanamicina

y en caso de E. coli pST04, 100 mg l-1 de ampicilina y

Se añadieron 10 mmol l-1 de glucosa. Los cultivos se cultivaron

a 37 ° C durante la noche. Después, los gránulos de pST04 y

Klon 4 se recogieron y se resuspendieron en nuevas LB-media

con los aditivos correspondientes y adicional 0.25-

0,4 mmol l-1 IPTG y 5-10 mmol l-1 de sustrato aromático

(pST04) o 1 mmol l-1 de catecol (Klon 4). Después de 4 h, una significativa

de color azul apareció muestra la expresión del lacregulated

secuencias de genes. La producción de sustituido

ciclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles se midió directamente por

HPLC analiza a 260 nm. Para la producción de ácidos mucónico,

Klon 4 se preparó análogamente como FLU100 para el crudo

mediciones de extracto.

Las condiciones de cultivo de las cepas de P. knackmussii B13

B13 cepa se cultivó a 30 ° C en un medio mineral

que contiene benzoato o 3-clorobenzoato como sustrato. Mientras

un catecol-1,2-dioxigenasa se indujo en caso de la

ex sustrato, un chlorocatechol-1,2-dioxigenasa era

inducida en el caso de este último sustrato. La preparación

fue similar a la de las mediciones de extracto crudo de

FLU100.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer con gratitud la

extremadamente valiosa contribución de DH Pieper, Helmholtz

Centro de Investigación de Infecciones en Braunschweig, para

Agradecimientos

Los autores desean reconocer con gratitud la

extremadamente valiosa contribución de DH Pieper, Helmholtz

Centro de Investigación de Infecciones en Braunschweig, para útiles

150 D. Dobslaw y K.-H. Engesser

© 2014 The Authors. Biotecnología Microbiana publicado por John Wiley & Sons Ltd y Sociedad para Microbiología Aplicada, Microbiana

Biotechnology, 8, 143-154

comentarios, así como el suministro de Escherichia coli pST04

y E. coli Klon 4. Un agradecimiento especial a J. Altenbuchner,

Instituto de Genética Industrial, Universidad de Stuttgart

la oferta de E. coli pCro2a. Finalmente agradecemos a P. Fischer,

Instituto de Química Orgánica de la Universidad de Stuttgart, por

GC-MS y HPLC-MS análisis.