El inventor:

Kary Mullis, doctor en bioqumica, invent la tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimera (PCR en sus siglas en ingls) en 1985 mientras trabajaba como qumico en la Corporacin Cetus, una firma de biotecnologa situada en Emeryville, California.

Este descubrimiento, de gran valor en biotecnologa como herramienta de investigacin, le hace acreedora del Premio Nobel de Qumica en 1993, compartido con el canadiense Michael Smith. Mullis patent su idea y dirige la compaa californiana que la comercializa.

La PCR inspir el argumento de la novela Parque Jursico de Michael Crichton, llevada al cine en 1993 bajo la direccin de Steven Spielberg.

LA PCR: El descubrimiento. Sesin 4-Unidad I

Tener una base de datos del gen de inters. Hacer un sondeo en la base de datos para obtener secuencias consenso. Detectar las secuencias consenso dentro del gen para ser seleccionadas. Obtener las secuencias consenso de los primers Delantero (F) y Reverso (R). Revisar su especificidad en las bases de datos internacionales disponibles.

LA PCR: La eleccin de los primers. Sesin 4-Unidad I

La eleccin de los primers se realiza mediante programas de bioinformtica mediante la metodologa siguiente:

LA PCR: La Tm de los primers. Sesin 4-Unidad I

Despus de la eleccin de los primers se debe calcular la Tm:

La temperatura de hibridacin (Tm) entre el ADN o Templado y los primers se clcula con varias frmulas, la siguiente es un ejemplo: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Nota: Al resultado se le restan 5 C.

Ejemplo: Primer delantero: 5-TTACCGCGCTGCTGGCAC-3 (19 mers, 19 bases) Tm = 2(A+T) + 4(G+C) = 2 (2+4) + 4(6+7) = 12 + 52 = 64 C En la prctica: 64 5 = 59 C Primer reverso: 5-ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3 (20 mers, 20 bases) Tm = 2(A+T) + 4(G+C) = 2 (4+3) + 4(6+7) = 14 + 52 = 66 C En la prctica: 66 5 = 61 C

LA PCR: La reaccin. Sesin 4-Unidad I

La reaccin requiere de los siguientes reactivos:

Una cantidad pequea de ADN o templado (gen a amplificar). Una mezcla saturada de desoxiribonucleotides (dNTP). Dos iniciadores o primers (delantero y reverso). La enzima ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) o alguna otra. Un tampon especfico para la enzima usada. Agua para PCR o destilada. Su utiliza un tubo eppendorf de 200 a 500 l. El volumen de reaccin va de 25 a 100 l generalmente.

LA PCR: El procedimiento. Sesin 4-Unidad I

Etapa 1: Desnaturacin

Etapa 2: Hibridacin

Etapa 3: Elongacin

2 minuto a 94-97 C

1 minuto a 56 C,

10 minutos a 72 C

Temperatura variable segn la Tm.

PCR de 35 ciclos

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Primer (F) Primer (R)

Templado

Taq Polimerasa

LA PCR: La dinmica de los ciclos. Sesin 4-Unidad I

Etapa 1: Desnaturacin

Etapa 3: Elongacin

Etapa 2: Hibridacin

Ciclo 3 Ciclo 2 Ciclo 1

72 C

56 C

94C

La grfica de los ciclos de la PCR:

Esta grfica muestra la dinmica de la temperatura durante cada ciclo de la PCR, la mxima temperatura se tiene durante la etapa de desnaturalizacin de la molcula duplex del ADN; despus la temperatura desciende hasta aquella asignada para la Tm, es decir, la temperatura de hidridacin; y finalmente la temperatura asciende hasta la temperatura de elongacin, que siempre es de 72 C.

LA PCR: El procedimiento (amplificacin exponencial). Sesin 4-Unidad I

Gen a amplificar

1er ciclo

2do ciclo

3er ciclo

Templado (ADN)

35avo ciclo

4to ciclo

22 = 4 copias

23 = 8 copias

24 = 16 copias 25 = 32 copias

235 = 68 billones de copias

LA PCR: La visualizacin del ADN amplificado. Sesin 4-Unidad I

Verificacin de los fragmentos del gen amplificado en gel de agarosa

Amplicones

Escala

Marcador

Peso molecular

M P1 P2 P3 P4 P5

La compaa biotecnolgica CETUS alcanza una marca histrica en Wall Street en su

primera oferta pblica al accionario.

150 000 000 de Dolres

LA PCR: Algunos tipos de PCR clsica

Etapa

PCR sobre ADN PCR sobre colonia bacteriana PCR para secuenciacin Temperatura Tiempo Temperatura Tiempo Temperatura Tiempo

Desnaturalizacin inicial 94 C 2 min 94 C 10 min --- ---

Ciclo

Desnaturalizacin 94 C 1 min 94 C 1 min 96 C 10 s

Hibridacin 56 C 1 min 55 C 1 min 50 C 5 s

Elongacin 72 C 1 min 72 C 1 min 60 C 4 min

Elongacin final 72 C 10 min 72 C 10 min --- ---

Nmero total de ciclos 25 a 35 30 25

Algunos parmetros cambian dependiendo del tipo de la PCR: