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Cuadro 1. Evolución del uso de la SOTE en el mundo en los últimos 30años. Embriones transferidos en cada una de las épocas menciona­

das.

1980 1995 2008

EEUU 10000 124000 276000 (+122%)

EUROPA 110000 97300 (-12%)

BRASIL 24000 107000 (+345%)

ARGENTINA 500 9200 14000 (+52%)

TOTAL 10500 267200 494000

En nuestros países y particularmente en Brasil, este cre­cimiento estuvo de la mano de un fuerte crecimiento de laactividad ganadera que no solo aumentó en aspectos cuan­titativos sino también en los cualitativos. También estuvie­ron asociados a este crecimiento factores ligados a la tec­nología propiamente dicha desarrollados en la década del'90 tales como:1· Implementación de la transferencia directa: la modifica­ción del tipo de crioprotector utilizado en la criopreservaciónde embriones permitió que la transferencia propiamentedicha fuese realizada en forma muy similar a la insemina­ción artificial facilitando en forma muy marcada su posibi­lidad de uso2· Simplificación de todas las etapas de la técnica y eldesarrollo de insumas destinados directamente a la mis­ma lo cual también facilitó su aplicación3· La purificación de las hormonas utilizadas así como eldesarrollo de protocolos de superovulación más eficien­tes, que repercutieron tal vez sin mejoras significativas enlo cuantitativo pero si en una reducción muy marcada en loreferente a la variabilidad de las respuestas4· La estandarización en los sistemas de sanidad de losembriones y la ingerencia técnica cada vez mayor de laIETS (lnternational Embryo Transfer Society) en estos as­pectos, con normas aceptadas internacionalmente por or­ganismos tales como la OlE.5- Finalmente, también en la década del '90 se produce unincremento significativo en la cantidad de los profesiona­les actuantes dándole a la misma una carácter de mayormasividad de aplicación, dentro de las limitaciones que la

Introducción

LA PRODUCCiÓN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS. ASPECTOS TÉCNICOS EIMPLEMENTACiÓN EN SISTEMAS PRODUCTIVOS

Ricardo AIberio.

INTA EEA Balcarce; Fac. Cs. Agrarias UNMdP

ración.La SOTE es una técnica cuyo uso se desarrolla en elmundo en forma intensa a partir de la década del '80 delsiglo XX. En el Cuadro 1 podemos observar cómo fue evo­lucionando en los principales países del mundo esta tec­nología así como en algunos países sudamericanos. En ellapso analízado se observó un importante incremento deluso de la técnica en EEUU. Curiosamente en el mismoperíodo, la misma tuvo un estancamiento en Europa peroun fuerte crecimiento en países emergentes como Argenti­na y, particularmente Brasil

Biotécnicas reproductivas son aquellas que a lo largo prin­cipalmente del siglo pasado, han sido desarrolladas paralograr mejorar de la potencialidad reproductiva y productivade los animales domésticos o no domésticos, con el des­tino final de mejorar el bienestar de la humanidad. En laevolución de las mismas, ha habido un gran cambio con­ceptual en cuanto a su posible uso y/o aplicación. Estasya no son solo consideradas como herramientas para losprogramas de mejora genética sino también como herra­mientas para la mejora productiva en si mismas, han pa­sado a ser elementos trascendentes para la conservacióny recuperación de especies y constituyen herramientasde posible aplicación para la salud humana. Otro cambioimportante que se comienza a manifestar, particularmenteen los países desarrollados, es que las biotécnicasreproductivas deberían prescindir, en buena medida, decomponentes considerados contaminantes, tales como laaplicación de hormonas que fueron de amplio desarrollodurante muchos años.El desarrollo de estas biotécnicas abarca lo que se hadado en llamar la secuencia de sucesivas generacionestecnológicas que a lo largo del tiempo han permitido llegara la situación actual en la que se dispone de un ampliorango de opciones. Estas generaciones biotecnológicasincluyen:• 1era. Generación- Inseminación Artificial (lA). Másde 100 millones de animales inseminados en el mundo/año y más de 3 mili/año en América Latina. En uso inten­sivo desde 1945,• 2da. Generación- Control del ciclo estral e Insemi­nación a Tiempo Fijo. A partir de la década del 70. Ennuestro país con uso explosivo a partir del 2000• 3era. Generación- Superovulación y Transferenciade embriones. Más de 600 mil transferencias/año. En usocomercial desde 1975.• 4ta. Generación- Sexado de embriones (1990), yembriones producidos in vitro (PIV) (1992), varios milespor año• 5ta. Generación- Clonado y transgénesis. Usoincrementado a partir de fines del siglo XX

En esta presentación nos focalizaremos particularmenteen la producción in vitro de embriones, técnica que en losúltimos 20 años ha tenido un desarrollo y aplicaciónexponencial en los sistemas productivos, particularmentecon la incorporación de la misma por parte de algunospaíses en los cuales su uso ha sido explosivo.Sin embargo, antes de pasar a la descripción de los em­briones producidos in vitro, considero de interés realizaralgunas reflexiones referidas al uso de embriones produci­dos in vivo por medio de superovulación y transferencia deembriones (SOTE), lo que ha constituido la etapa previa yque explica los posteriores avances de la siguiente gene-

Pago N° 69

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Cuadro 2: Evolución en el mundo en miles de embriones PIV transferidos. Fuente IETS

AÑOS

97 99 01 03 05 06

ASIA 10.5 12 12 23 150 127

EUROPA 18.3 14 13 11 6.6 6

S. AMER. O 0.056 12 49 80 130

N.AMER O 4.8 2 0.5 2 15

TOTAL 30.5 31.3 41 83 240 266

técnica tiene por sí misma.

Esta evolución marca evidentemente una demanda cre­ciente del uso de este tipo de tecnología como un elemen­to de importancia en la mejora de los sistemas producti­vos, en este caso a través de su contribución a la mejoragenética.A pesar de todo, esta técnica sigue contando aún con res­tricciones que hacen que su crecimiento sea cada vez máslimitado, sobre todo por aspectos ligados al impacto cuan­titativo que se puede lograr con la misma y en segundolugar a las limitantes económicas que sus costos impri­men con frecuencia a su aplicación.

Producción in vitro de embriones bovinos

Aspectos generales

A partir de la década del '90 comienza a incorporarse almercado tecnológico mundial la producción in vitro deembriones que tiende a cambiar en forma marcada algu­nos de los conceptos precedentes.Esta técnica se basa en el uso del mismo material genéticoya descrito, el embrión, pero cuyo origen es diferente y deallí las particularidades de interés de la misma. El elemen­to central es que ya no se depende más de la producciónde embriones a partir de ovarios sobreestimulados, con locual se le quita a la técnica original uno de los principalesfactores Iimitantes de su uso. Esta técnica pasa a ser unametodología de fertilización asistida en la cual disponien­do de las dos gametas, masculina y femenina, se es ca­paz de unirlas en el laboratorio y lograr su posterior desa­rrollo temprano en similares condiciones.En su definición más básica, la producción in vitro de em­briones implica la obtención de ovocitos, su maduración,fertilización y desarrollo en laboratorio hasta que los em­briones producidos son transferidos o criopreservados.Su uso en sistemas productivos durante la década del '90tuvo una evolución muy significativa que obliga a pensar enla misma de manera muy particular. En el Cuadro 2, esposible ver la evolución en el uso de los embriones PIV endiferentes partes del mundo y el significado que la incorpo­ración de esta tecnología ha tenido en los sistemas pro­ductivos-comerciales. Doce años atrás, a mitad de la dé­cada del '90, las cifras denunciadas no representaban másque un 10% del total de embriones producidos porsuperovulación que habían sido transferidos. Pero rápida­mente en años siguientes la evolución de estas cifras indi-

ca una explosión en el uso de la técnica ya que en laactualidad, la cifra de embriones PIV transferidos superael 50% de los embriones producidos in vivo transferidos.Visto este fenómeno, es imposible no detenerse a reflexionaren las razones del mismo y las posibilidades que la técni­ca nos da y que no se están aprovechando en su máximaexpresión.En la reflexión sobre el problema es conveniente incluiralgunos aspectos relativos a la técnica propiamente dichay en segundo lugar a las formas en que la misma puedeser aplicada para sacar de ella los máximos beneficios.

Breves aspectos técnicos de la PIVLa técnica consiste en lograr embriones producidos a par­tir de óvulos de ovarios de vacas de matadero, de vacascastradas o de vacas vivas que posteriormente son fertili­zados y cultivados en el laboratorio hasta el estadio enque van a ser transferidos o congelados.El proceso de producción in vitro de embriones bovinospuede dividirse en tres pasos fundamentales, los cuales,independientemente del protocolo utilizado, en ordencronológico son:

Maduración de ovocitosFecundación de ovocitos madurosCultivo de embriones

Estos tres pasos, comprenden una compleja serie de pro­cesos fisiológicos, muchos de los cuales son aún desco­nocidos, condicionando cada uno per se el éxito o el fraca­so del siguiente. Luego de la maduración in vitro, aproxi­madamente el 90% de los ovocitos inmaduros puestos acultivar, alcanzan la metafase 11 y expulsan el primer cuer­po polar entre las 16 y 24 hs de comenzada la madura­ción. De estos, aproximadamente el 80% son fecundadosy comienzan a dividir, al menos, hasta el estadio de 2 a 4células. Sin embargo, sólo un 25-40% alcanzan el estadiode blastocisto (B) o blastocisto expandido (Bex) luego delcultivo durante 6-7 dias. Esto indica que el cultivo embrio­nario, correspondiente al paso más prolongado dentro delproceso de producción in vitro, es el período en el que seestablece el mayor porcentajes de pérdidas del sistema. Asu vez, durante esta etapa, se define en gran medida lacalidad de los embriones obtenidos.Todos estos procesos transcurren en el laboratorio, en con­diciones controladas de temperatura, concentraciones degas y humedad y en condiciones de higiene y esterilidadimportantes para evitar las contaminaciones frecuentes enlos cultivos celulares.La producción de embriones a partir de esta metodologia

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tiene algunas limitantes con respecto a los otros sistemasposibles. Por lo general, del total de ovocitos colocadosen cultivo entre el 80 y 90% alcanzan la maduración comopara poder posteriormente ser fertilizados (Fig. 1). De es­tos, en términos promedio se admite que el 80% puedeser fertilizado y otro tanto comienza el proceso de división.Hasta esta etapa del proceso in vitro, el rendimiento decada etapa no difiere mayormente del que es posible lo­grar en sistemas naturales de fertilización. Pero es partirde este punto que se comienza a producir el desarrollotemprano del embrión lo que implica un cultivo en condi­ciones de laboratorio durante 6 a 8 días. En este períodotan largo en condiciones de desarrollo in vitro, el sistematiene imposibilidades importantes de copiar en su totali­dad las condiciones que se mantienen in vivo. Durante esteperíodo entonces la pérdida de embriones es grande lle­gando al final del proceso (7 días más tarde) aproximada­mente un 20 a 30% de aquellos fertilizados. Es decir quesi se han puesto a madurar 100 ovocitos en el primer díadel proceso, será posible contar con 20 embriones 7 díasmás tarde. Estas cifras pueden ser mejoradas en la actua­lidad con la mejora de los sistemas de cultivo pero lascifras rondan no más de un 30-35% de embriones a partirde los ovocitos puestos en cultivo. La última etapa, la ges­tación a lograr con estos embriones, es ligeramente infe­rior a la que es posible lograr con un embrión producido invivo pero no inferior al 40% cuando los embriones transfe­ridos sin criopreservación.

100 .....-------------------.¡90SO70605040302010

OMaduración Fertilización División Blastocistos Preñez a

nuclear término

Figura 1. Reducción de la eficiencia en cada paso del proceso de PIV

en bovinos

Origen del material a procesarEl material utilizado en su origen es el ovocito bovino que,como se dijo más arriba, podrá provenir de diferentes tiposde hembras• Animales que se envían a faena: se trata por lo ge­neral de vacas que ya han cumplido su ciclo en el estable­cimiento y que por diferentes razones, en general de tipoproductivo, son reemplazadas por las nuevas camadas.Estos animales pueden aún representar individuos de ni­veles genéticos interesantes ya sea para el propio produc­tor como eventualmente para otros productores con menordesarrollo genético. De allí que la recuperación de gametasde estos animales pueda significar en alguna medida res­catar esta genética que por lo general ha tomado añosobtener y que de no ser recuperada terminará sin ningúnvalor agregado dentro de un digestor.• Hembras castradas. Puede tratarse de las mismas

vacas del grupo anterior pero que en lugar de que sus ova­rios sean recuperados en el matadero, los mismos sonobtenidos por castración previo al envío al mismo. Estotiene algunas ventajas tales como obtener una mejor iden­tificación de las madres, obtener un material en condicio­nes más higiénicas y controladas y poder realizar el pro­cesamiento de los ovarios en tiempos y formas más ajus­tados.• Vacas vivas por medio de la punción ovárica guiadapor ultrasonografía. Esta alternativa constituye una varian­te diferente a las dos anteriores. En este caso se parte deuna vaca de interés genético predefinido, que en un siste­ma clásico tal vez hubiese estado destinada a un progra­ma de superovulación o que lo ha estado y el mismo no hadado resultados. La PIV brindará en este caso una nuevaalternativa u oportunidad a animales que no fueron capa­ces de producir embriones por medio de la SOTE. Tam­bién se recurre a esta modalidad cuando lo que se quierees producir embriones a partir de vacas gestantes ya quehasta el tercero o cuarto mes de gestación es posible rea­lizar la punción ovárica sin dificultades. Finalmente tam­bién puede ser una alternativa a vacas que, previo a suenvío a matadero, son enviadas a un centro de producciónde embriones en el cual una a dos veces por semana se­rán sometidas a punción ovárica por medio deultrasonografía. En la medida que produzcan embriones,los animales siguen siendo punzados y en la etapa final,sus ovarios podrán ser recuperados por alguna de las dosmodalidades anteriores y procesados en consecuencia.

Estas variantes son las de más frecuencia en nuestrospaíses y constituyen la mayor parte de las formas de ac­cionar con esta metodología. Sin embargo, cuando lo quese quiere es multiplicar un ganado de alto valor comercial,como lo ha sido el ganado Nelore en Brasil, la estrategiatiene variantes diferentes que no dejan de ser de interés demencionar. En estos casos, se dispone de grandes ro­deos de hembras de la raza seleccionada y diariamentelas mismas van siendo seleccionadas por medio deultrasonografía por su población folicular. Aquellas conmayor número de folículos son entonces puncionadas, losovocitos obtenidos y procesados como fue mencionadomás arriba e inseminados con semen del mayor valorgenético. Mediante esta modalidad es posible dar grandessaltos en mejora genética, en períodos muy cortos y concostos que lo hacen totalmente rentable dentro del siste­ma en que se encuentra instalada la técnica.

Rendimiento de la técnicaEn términos generales, por cada vaca faenada o castradason recuperados 2 ovarios de los que es posible obtenerentre 15 a 20 ovocitos en total, lo que permitirá obtener de4 a 6 embriones para transferir.En un trabajo realizado hace algunos años se pudo de­mostrar que la técnica tiene una buena eficiencia en gene­ral (Cuadro 3) que puede ser mejorada cuando se trabajacon animales individuales en donde la manipulación estácentrada en poco número de ovarios con lo que la obten­ción de ovocitos por ovario es aumentada. En el trabajomencionado fue posible producir cerca de 5 embriones porvaca ovariectomizada con los cuales será posible obtener

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Cuadro 3. Eficiencia de la producción in vitro de embriones a partir de vacas ovariectomizadas.

Establecimientos Vacas ovariectomizadas Embriones producidos Pajuelas de semenutilizadas

Vacas lecheras 98 529 5

Vacas lecheras 20 304 3

Vacas de cría 23 58 1

Total 191 891 (4.7/vaca) 9

dos gestaciones al ser transferidos a vacas receptoras.

En el caso de la punción de ovarios de vacas vivas (opera­ción que puede ser repetida varias veces con un lapso de3-4 dias entre punción), consiste en la aspiración de losfóliculos ováricos con ayuda de la ultrasonografía y unabomba de vacío (sistema OPU). Con este sistema, la can­tidad de ovocitos obtenidos es inferior, en una misma razao tipo de animal, que la mencionada para ovarios prove­nientes de matadero o castración (5 a 10 vs 15 a 20). Sinembargo, esta técnica resulta más eficiente en la produc­ción de embriones que la técnica de superovulación, en unperíodo de tiempo determinado.El rendimiento de ovocitos por ovario en vacas colectadaspor OPU (Cuadro 4) Ypor vaca es muy variable entre razassiendo el más bajo en razas británicas (2 a 12), intermedioen razas lecheras (8 a 16) y alto en razas índicas o cruzas(20 a 40). Incluso en razas índicas de animales seleccio­nados por población folicular como se ha mencionado másarriba se ha descripto la obtención de más de 200 ovocitosen sola sesión de aspiración folicular. Esta técnica estáasociada además a una gran destreza técnica del opera­dor de manera que a las limitaciones normales que la téc­nica tiene, se suma de forma marcada el impacto del ope­rador.

Los ovocitos obtenidos por cualquiera de estos métodos,son fecundados en el laboratorio con semen seleccionadoy cultivados durante 7 días. En caso de la punción ováricade animales vivos, esta maniobra se puede repetir dos ve­ces por semana lo que permitirá producir cantidades varia­bles de embriones según las características raciales men­cionadas antes. En razas de tipo británico y continentalen punciones continuas (una o dos veces por semana) sehan logrado producir entre 1 a 2 embriones por semana.En el caso de las razas índicas se han descripto produc­ciones de hasta 40 embriones a partir de una sola sesiónde aspiración. En nuestro laboratorio, a partir de ovariosde una vaca Hereford cerca de la muerte de la que se ex­trajeron los ovarios, se obtuvieron 42 ovocitos y 15 embrio-

nes que fueron congelados.Una vez producidos, los embriones pueden ser transferi­dos a una vaca receptora preparada para tal fin, o congela­dos y conservados en termos con nitrógeno líquido. Lastasas de gestación obtenidas con este tipo de embrionesvarían si estos se transfieren congelados (30-40%) o nocongelados (40-50%). Aunque los porcentajes son relati­vamente bajos respecto de los embriones producidos invivo por superovulación, el número de embriones produci­dos por dosis de semen es mayor y su costo es menor.El caso del rendimiento del semen es un aspecto que debeser remarcado particularmente en el uso de esta técnica.Si bien existen grandes diferencias en las capacidades delos toros para producir embriones PIV, ya sea entre indivi­duos de una misma raza como de individuos de diferentesrazas, existen alternativas de la técnica para corregir enalguna medida estas diferencias. También algunas mani­pulaciones del semen, como el sexado, producen deterio­ro en los espermatozoides que limitan su capacidad deproducir embriones PIV. También para estas situacioneses posible encontrar alternativas con las que se puedemejorar la performance de la técnica. Pero en todos loscasos, lo cierto es que una dosis de semen de buena ca­lidad en las evaluaciones corrientes, es capaz de fecundarentre 200 y 400 ovocitos (dependiendo del sistema de se­lección de semen que se utilice) a partir de los cuales seráposible producir entre 40 y 80 embriones (Cuadro 5). Estesemen puede ser de un costo extremadamente alto yasea por su calidad genética, ya porque ha sido sexado.Aunque asumiéramos un costo por dosis de 200 dólares(imposible de ser utilizado en cualquier otro sistemareproductivo en forma rentable), su incidencia en el costode cada embrión estaría en el orden de los 5 dólares porembrión. Este mismo semen utilizado en un embrión pro­ducido por superovulación, en donde se usara solo unadosis para inseminar a la vaca tratada y se produjeran 5embriones, tendría un peso en el costo del embrión 10veces más alto que en el caso anterior (solo de semencada embrión costaría aproximadamente 40 dólares).

Cuadro 4. Número de folículos aspirados, ovocitos recuperados, tasa de división y desarrollo embrionario de vaquillonas de las razasHolando Argentino y Criollo Argentino en cada sesión de aspiración folicular

Kaza rOl. UVOCltoS UVOCllOS Ulvlslon MorUlas yAspirados totales aptos (%) Blastocistos (%)

HA 8.0±3.4 2.5±1.8 48a 39.7 13.8

Criollo 7.9±3,2 2.8±2.3 32b 39.1 8.7

.b Letras diferentes en la misma columna Indican diferenCias Significativas (p<0,05). Martln et al. 2005

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Cuadro 5. Cantidad de inseminaciones que es posible realizar con dosis de semen tratadas de manera diferente.

Toro Tratamiento de N° de dosis Motilidadselección de semen inseminantes

1 Swim up 5.9a 76.6a

Percoll 7.6b 90.Ob

2 Swim up 7.8a 68.3a

Percoll 13.5b 81.7b

·Cada dosis inseminante permite inseminar 50 ovocitos con lo cual, en el ejemplo, se están inseminando entre 300 y 700ovocitos con una pajuela

Cuadro 6. Efecto del sistema de criopreservaci6n en la sobrevida de embriones producidos in Vitro evaluada mediantecultivo in vitro (adaptado de Mucci y col, 2005).

Reexpansión Protrusión48 hs. 72 hs.

Sistema de Embriones N° embriones (%) N° embriones (%)criopreservación totales

Congelación 275 54 19,6a 33 12a

Vitrificación 265 136 51,3b 114 43b

a b Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (P<O,01).

Cuadro 7. Efecto de la criopreservaci6n en la sobrevida de embriones PIV evaluada en sistemas in vitro, evaluadamediante cultivo in vitro (adaptado de Rios, 2006)

ESTADO Número de Protrusión (72 hs)embriones n (%)evaluados

No vitrificado (control) 101 92 (91,09)

Vitrificado 214 170 (79,4)

Criopreservación de embriones PIVUna de las limitantes que podría ser adjudicada a la trans­ferencia de embriones es que requiere de infraestructuramayor a la necesaria para la lA, mayores cuidados que losque requiere el semen y sistemas de criopreservación queno resuelven el problema como ha sido resuelto con elsemen. Estos aspectos han sido bien superados ya enlos embriones obtenidos por superovulación como se men­cionó más arriba ya que existe una metodología simple,que provee buenos resultados biológicos y sin mayoresrequerimientos que los necesarios para una lA. El embriónproducido in Vitro tiene aspectos cualitativos inferiores alos producidos por superovulación soportando con mayo­res dificultades los procesos de la criopreservación clási­ca, la congelación. Por ello se han debido desarrollar alter­nativas de criopreservación que superasen estas limitantesy, en la actualidad, otro avance importante que se ha con­cretado es la mejora del sistema de criopreservación deembriones producidos in vitro. Particularmente se ha de­sarrollado una nueva técnica, la vitrificación, que aplicadaa embriones PIV, les permite una mejor sobrevida que lacongelación clásica. Con el uso de esta técnica es posi­ble esperar resultados de gestación con embriones PIVvitrificados que superen el45 a 50%. En el laboratorio de

Biotecnología de la Reproducción dellNTAde Balcarce seha desarrollado esta técnica desde comienzos de la déca­da del 90 que ha sido mejorada en la actualidad (Cuadro6). Los niveles de sobrevida de embriones producidos inVitro que han sido vitrificados no difieren de manera mar­cada de la sobrevida de embriones que no han sidocriopreservados (Cuadro 7).

Aplicaciones productivas de la tecnologíaDesde un punto de vista productivo, se han considerado almenos dos estrategias en las cuales este tipo de embrio­nes podría llegar ser utilizado

Aumento cuantitativo de la producción individualProgramas de mejora genética para aumento cualitativo de la producción

Aumento cuantitativo de la producción individualEl bovino es una especie monovolutaria y como tal su pro­ducción en cada gestación no pasa normalmente de unternero. Numerosas estrategias se han estudiado para in­tentar aumentar esta productividad, fundamentalmente através de la producción de mellizos. De todas las alterna­tivas estudiadas, la única que ha presentado posibilidadesreales es aquella técnica que posibilite producir salamen-

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te mellizos. Lo único que posibilita esto, es la colocaciónde dos embriones a hembras en condiciones de recibirloso agregar un embrión suplementario a hembras que hayantenido un servicio previo. Los primeros trabajos estudiandoesta alternativa fueron realizados con embriones produci­dos por superovulación mostrando que era posible aumen­tar la productividad de un rodeo en cerca del 50% al aplicaresta modalidad. (Cuadro 8).Sin embargo, el costo de los embriones producidos porsuperovulación es demasiado alto como para ser utiliza­dos de esta manera en la cual la parte genética puede serperdida por el hecho de existir gestaciones dobles(Freemartin).

Cuadro 8. Preñez de vacas inseminadas y transferidas con un em­

brión 7 días más tarde

Preñez 1er. Preñez con Temerosservicio mellizos (%) totales

60 28(47) 88 (+ 46 %)

Adaptado de Gordon, 1994

En años más recientes, con la puesta a punto de la pro­ducción in vitro de embriones, con costos por embrión muyinferiores a los producidos por SO, esta técnica puede lle­gar a transformarse en una alternativa no desdeñable des­de el punto de vista de la producción cuantitativa de kg decarne por una vaca determinada (Cuadro 9). En este cua­dro, que resume información obtenido de diferentes partesdel mundo, se ve que es posible reducir el servicio a nomás de una semana (lA + segundo embrión 7 días mástarde) alcanzando tasas de producción de terneros que

pueden superar el 70%. En trabajos realizados en nuestropaís determinamos productividades similares en cantida­des menores de animales estudiados (Cuadro 10)Una alternativa que no puede dejarse de lado disponiendode embriones de bajo costo, es la de mejorar la tasa depreñez de un establecimiento después de realizar una IATF.Procediendo de la misma manera que antes, ha sido posi­ble determinar que cuando se transfiere un embrión suple­mentario, la proporción de vacas preñadas después de unaIATF puede aumentar en niveles de 50 al 70% (Cuadro 11).En recientes trabajos realizados sobre cantidades mayo­res de animales, hemos observado que esto no se repiteen todos los casos y que puede haber variabilidad debidoa diferentes formas de reacción de los rodeos ante la trans­ferencia del nuevo embrión.

Programas de mejora genética para aumento cualitativode la producciónDesde el punto de vista del uso de los embriones PIV enprogramas de mejora genética, es necesario visualizar va­rias de las alternativas posibles en la actualidad las quepor sí mismas no excluyen otras, ya que esta es una tec­nología de reciente aplicación y no conoce aún límites.Las dos vías principales del uso de la tecnología con estefin son:• Recuperación de la genética de vacas que han cum­plido su ciclo en un establecimiento y obtención de criassuplementarias con una genética superior.• Producción de terneros de vacas vívas de altagenética en mayor cantidad que los que se obtienen pormedio de la superovulación.

Cuadro 9. Productividad de terneros en rodeos inseminados y transferidos 7 días más tarde con

embriones producidos in vitro en el mundo.

Tipo de embrión Receptoras (n) Preñez Preñez con Terneros(%) mellizos (%) x vaca

In vitro fresco 478 59 42 0,83

In vitro congel 132 49 47 0,7

Autores varios. Citados en Aller y col. 1998

Cuadro 10. Productividad de terneros en rodeos inseminados y transferidos 7 dias más tarde con embriones producidos in vitro enArgentina.

Tipo de embrión Recep Preño Preño Terneros Terneros(n) (%) mell (%) x vaca x vc. Preñ

Fresco 26 12(46) 5 (19) 0.65 1.4

Congel. 20 10(50) 5 (25) 0.75 1.5

Alberio y Aller. 1997

Cuadro 11. Mejora de la eficiencia de la lA por agregado de un embrión suplementario

Tratamiento N° Vacas Preñadas (%) Terneros producidos (%)

IATF +TE 29 51.7 17 (58.6)

IATF 132 30.3 40 (30.3)

I ATF a 72 hs después de doble PGF2 alfa. a dif. de b (P<O.01). Alberio y col. 1997

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Recuperación de la genética de vacas que han cumplidosu ciclo en un establecimiento y obtención de crías suple­mentarias con una genética superior.

Esta alternativa surge como una de las salidas de mayorimpacto tanto a nivel de establecimiento como de región yeventualmente país. Si analizamos el problema particular­mente en cuanto al rodeo lechero, este se trata de un sis­tema en que la tasa de rechazo anual es muy alta y nonecesariamente debido a problemas de nivel productivo.Por el contrario, es muy frecuente que una buena propor­ción (tal vez el 50%) de los animales descartados cadaaño lo sea por problemas no productivos como lesionespodales, mamarias o simplemente por edad. Estos ani­males suelen tener un buen nivel productivo potencial peropor alguno de los factores anteriores ya no interesa sumantenimiento en el sistema. Estos animales son por logeneral fruto de años de mejoramiento genético llevado enel establecimiento por lo que su valor agregado es muyalto. Sin embargo, este valor agregado es totalmente per­dido cuando el animal es enviado al matadero en que loúnico que se va a pagar son los kg de carne producidos,que por otra parte no constituye la carne mejor paga denuestros sistemas. Es precisamente en estos casos endonde la producción in vitro de embriones tiene un impactomuy importante. Los ovarios de estas vacas son recupera­dos y procesados en el laboratorio. Por la baja incidenciaque tiene el semen en la producción de estos embriones,es posible utilizar en la fecundación de los ovocitos el se­men del mayor interés o costo del mercado. Con lo cualno solo se va a recuperar la genética producto de años detrabajo (y de inversión) sino que ese material va por suparte a ser revalorizado de manera tal que esos embrionespodrán dar lugar a las crías de mayor valor genético yeco­nómico del establecimiento. Si a ello se suma la posibili­dad de realizar esta fertilización con semen sexado, lamultiplicación de los beneficios es de niveles poco espera­dos. A título de ejemplo, una vaca Hosltein de 600 kg en­viada al matadero podrá tener un rendimiento de alrededorde los 240 dólares. A partir de una hembra que ha sidoenviada al matadero es posible obtener como mínimo 15ovocitos, 5 embriones y dos crías nacidas. Si son produci­dos con semen sexado, las dos terneras hijas de esa vacasacrificada cuyos ovocitos han sido inseminados con se­men del toro de mayor valor de mercado tendrán un valorno inferior a los 2000 dólares cada una. Con lo cual, con elsimple hecho de recuperar los ovarios y llevarlos al lugarpara su procesamiento, hemos multiplicado por cerca de20 veces el valor de la vaca original. Este es un cálculomuy simple y directo que es real pero que puede ser a suvez, multiplicado a una gran cantidad de situaciones deinterés. En el cuadro 12 se muestra un ejemplo de recupe­ración de genética en un establecimiento lechero yen el

cual los embriones fueron transferidos en vacas para car­ne. Con la estrategia utilizada en este caso,- las vacas del propio tambo no fueron utilizadas comoreceptoras sino que fueron inseminadas como siempre,- los embriones fueron transferidos en vacas para carnecon lo cual,- se preservaron las vacas de alta genética del tambo y porotro lado,- se aumentó el valor agregado de la producción de lasvacas de cría que produjeron terneros de un valor variasveces más alto que el que hubiesen producido estas va­cas.

En algunos casos, no ya de producción lechera sino deproducción de animales para carne, ha sido hecho inclusoel análisis de reemplazar la lA por esa metodología. Cuá­les son las diferencias entre una y otra metodología encuanto a su impacto, que analizó el productor para tomaresta decisión.

Los embriones PIV tendrán como origen vacas debuena genética y semen del mejor nivel posible del merca­do que permita los mayores avances genéticos y que nopodría usar en lA. Con el nacimiento de esta generaciónse lograría en una vez lo que solo seria posible lograr en 5generaciones por medio de la lA. Para obtener 20 ternerosde esta genética (incluso podrán ser sexados), el costopor animal nacido será de 300 dólares

Con lA, para obtener 20 terneros de la mismagenética, harán falta 5 generaciones. Se debería partir de2000 vacas inseminadas de las que se van a preñar 1660crías (mitad machos y mitad hembras). Las 830 hembrasF1 serán inseminadas de nuevo produciendo 344 hembrasF2. Estas serán inseminadas produciendo 143 hembrasF3. Se producirán 60 hembras F4 que nuevamenteinseminadas darán lugar a 25 hembras F5 de las que seobtendrán 10 crías puras de alta genética, El proceso llevómás de 7 años y con un costo por hembra (aproximado)de 3000 dólares. En síntesis, este proceso duró más de 7años y el costo de cada individuo fue como mínimo 10veces más costoso que la producción de embriones.

Producto de que existen ganaderos que han realizado unrazonamiento de este tipo es que en la actualidad nosencontramos elaborando sendos proyectos en el país yextranjero que tiene por objetivo reemplazar la lA en ro­deos de más de 4000 vacas.

Producción de terneros de vacas vivas de alta genética enmayor cantidad que los que se obtienen por medio de lasuperovulación

En hojas anteriores fue mencionado que la última alterna­tiva de uso de la técnica implica la recuperación de ovodtos

Cuadro 12. Recuperación de genética de vacas que han cumplido su ciclo y obtención de crías con genética superior

Vacas Ovarios Embriones Embriones! Embriones Vacasovariectomizadas congelados vaca transferidos preñadas(%)

120 237 631 5.2 228 106 (46.5)

Aller et al.. 2000

Pago N° 75

XXXVII Jornadas Uruguayas de Buiatría

por medio de la ultrasonografía. Por medio de esta moda­lidad es posible producir embriones tal como se hace conla superovulación con las siguientes ventajas:

Es posible hacerlo de vacas que no superovulanSe puede obtener material de animales muy jóve-

nesldem de vacas gestantes hasta el cuarto a quinto

mes de gestación

El costo de producción de estos embriones es similar alde los producidos por superovulación con la salvedad quees posible aumentar significativamente lo que se puedelograr por superovulación.

Requerimientos para el uso de esta técnicaA diferencia de la mayoría de las otras biotécnicasreproductivas, la implementación de la producción in vitrode embriones tiene algunos requerimientos un poco parti­culares.1- Laboratorio de producción de embriones. Este es el re­querimiento central que puede llegar a ser la mayor limita­ción en la instalación de la técnica. Este laboratorio re­quiere una inversión mínima en equipamiento de alrededorde 20000 dólares que le permitirá procesar, cuando estéfuncionando regularmente, entre 200 y 400 ovarios diarioslo que significará una producción diaria de alrededor de200 a 400 embriones. Un requerimiento importante para ellaboratorio es encontrarse ubicado en un lugar estratégicoen cuanto a la disponibilidad de mataderos que puedanser fuente de este material para ser procesado. En un paíscomo Uruguay, en que las distancias no constituyen unproblema y las comunicaciones son muy buenas, la ubi­cación de un laboratorio como el mencionado no deberíaconstituir una limitante para un proyecto de estas caracte­rísticas.2- Personal entrenado y de permanencia a tiempo comple­to en el laboratorio. Para un nivel de procesamiento dematerial como el antes mencionado, se requerirán dos pro­fesionales (biólogo, veterinario) para el laboratorio y al menos

un personal técnico para ayuda de laboratorio. Este puedeconstituir el mayor costo de funcionamiento ya que estepersonal debe estar en forma permanente, aún cuando nose procesen ovarios comerciales. El entrenamiento sepuede realizar en cualquier laboratorio de la región quepueda darlo a profesionales y que a su vez también puedadar apoyo en los primeros tiempos para la puesta a puntodel funcionamiento del laboratorio.3- Organizar la logística de recuperación de ovarios, sutransporte, la transferencia de embriones, la organizacióncon productores y profesionales participantes en un pro­grama de este tipo4· Dependiendo del nivel de producción, el costo por em­brión no debería superar los 10 dólares. Este nivel de cos­to por embrión de alta genética (inferior a muchas de lasdosis de semen utilizadas corrientemente de un valorgenético mediano), permitiría un incorporación al mercadogenético nacional e internacional sin demasiados proble­mas

Conclusiones

Nos encontramos frente a la posibilidad del uso de unatecnología que promete dar aún una gran posibilidad dedesarrollo tecnológico y productivo, con enorme potencia­lidad para una región y aún para un país y que requiere dela decisión empresarial o política de instalación de un la­boratorio para ello así como la organización del sistemaen el cual va a ser aplicado. En el mundo ya es una tecno­logía de gran aplicación y una de las formas para las quese está utilizando con mayor frecuencia, es para la pro­ducción de embriones de alta genética para su exporta­ción a países demandantes de la misma. A pesar que hacemás de 10 años que venimos promoviendo el uso de estatecnología. en nuestros países aún no se despega con suaplicación en forma sistemática lo que está significando lapérdida de un mercado con demandas para el material pro­ducto de la misma.